CN101942451B

CN101942451B - 水稻OsAPI5基因在育性控制中的应用

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Publication number: CN101942451B
Application number: CN2010102230673A
Authority: CN
Inventors: 吴昌银; 李兴旺; 张启发
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-07-05
Filing date: 2010-07-05
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-07-05
Also published as: CN101942451A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种水稻育性控制基因OsAPI5及应用。具体涉及一个调控水稻育性基因OsAPI5的分离克隆、功能验证和应用。所述OsAPI5基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本发明克隆的基因及其编码蛋白可应用于调控水稻育性及培育杂交水稻不育系，具有重要的应用价值。

Description

水稻OsAPI5基因在育性控制中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一个控制水稻育性的基因OsAPI5的克隆、功能验证和应用。本发明利用T-DNA标签技术，通过正向遗传学方法，从水稻T-DNA插入突变体库中得到了一个控制水稻育性的基因OsAPI5，并通过转基因互补实验及等位突变体分析证明了OsAPI5基因的功能。本发明还涉及利用该基因通过基因工程技术有目的地对水稻的育性控制进行遗传改良。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，它养活了全球近半数的人口，如何提高水稻的产量是关系到国计民生的重要问题。目前，我国绝大部分的稻米由杂交水稻产生，通过控制花粉育性培育不育系是杂交水稻生产的关键。杂交水稻的生产使用的一些核基因或细胞质雄性的不育系，在水稻杂交育种和增产中起了重要作用。

遗传和环境因素都会影响水稻的花粉育性，而以遗传因素为主。水稻的花粉在其雄性生殖器官雄蕊中起始发育、成熟和释放，这一系列配子发育过程包括雄蕊的孢子体组织的发育受到严密准确的遗传调控，任何一个环节的遗传缺陷都可能导致花粉的败育。

被子植物的雄蕊一股由花药和花丝两部分组成，花丝富含维管结构，将花药和花托相连，具有运输水和营养物质的功能。每个花药包括四个相同的花粉囊和连接花粉囊的药隔组织；发育完成的花药由四层二倍体的孢子体壁细胞：表皮、药室内壁、中层、绒毡层(从外到内依次)和其包围着的单倍体配子体细胞组成。近些年，通过对拟南芥和水稻等模式植物的分子遗传学研究，克隆鉴定了一系列的控制植物花药发育的基因，建立了调控花药发育的分子机理的框架(Ma，等.2005.Molecular genetic analyses ofmicrosporogenesis and microgametogenesis in flowering plants.Annu.Rev.plants Biol.56：393-434.)。在花药的四层壁细胞中，最内层的绒毡层细胞的发育分化对于小孢子的发育至关重要，绒毡层在小孢子发育的后期会降解，细胞降解后的组分为小孢子的后期发育提供必要的营养(Papini，等.1999.Programmed-cell-deathevents during tapetum development of angiosperms._Protoplasma 207(3)：213-221.)。绒毡层的降解过程被认为是细胞程序性死亡(PCD)的过程，其降解发生的时间与小孢子的发育时期高度吻合，提前或推迟降解都会引起花粉的败育(Goldberg，等.1993.Anther development：basic principles and practical applications.ThePlant Cell 5(10)：1217-1229.)。目前，控制绒毡层降解的PCD机制还不是很清楚，但是，近些年来，通过分子遗传学的手段，科学家们还是克隆了一些控制植物花药绒毡层降解的基因(Wilson，Z.and D.Zhang.2009.From Arabidopsis to rice：pathways in pollen development.Journal of Experimental Botany 60(5)：1479.)，这为研究其分子机制提供了线索。

Api5是一个保守的基因家族，广泛存在于动植物中。目前，在动物研究中有一些有限的关于Api5基因功能的报道。Api5基因也被称为AAC-11/FIF/MIG8，最早的关于该基因的报道是在缺失生长因子的环境下，该基因(AAC-11)的超量表达会抑制由此引起的细胞程序性死亡(Tewari，等.1997.AAC-11，a novel cDNAthat inhibits apoptosis after growth factor withdrawal._Cancer Res 57(18)：4063-4069.)。后续的研究发现该基因的上升表达与肿瘤发生是相关的，并且在肝癌细胞中作为miR224的特异靶基因其表达受到miR224的调控(Kim，等.2000.AAC-11 overexpression induces invasion and protects cervical cancer cells from apoptosis.LabInvest 80(4)：587-594；Wang，等.2008.Profiling microRNA expression in hepatocellular carcinoma revealsmicroRNA-224 up-regulation and apoptosis inhibitor-5 as a microRNA-224-specific target.J Biol Chem 283(19)：13205-13215.)。但是Api5参与的这些肿瘤相关的分子机制还不清楚。最近，AAC-11基因编码产物能和Acinus蛋白互作并抑制其介导的细胞程序性死亡(Rigou，等.2009.The antiapoptotic protein AAC-11 interacts withand regulates Acinus-mediated DNA fragmentation.EMBO J 28(11)：1576-1588.)。在果蝇中，Api5基因能特异抑制由E2F-1基因功能失调引起的细胞程序性死亡(Morris，等.2006.Functional identification of Api5 as asuppressor of E2F-dependent apoptosis in vivo.PLoS Genet 2(11)：e196.)。从动物中的研究来看，APi5的主要功能是作为细胞死亡抑制蛋白参与调控细胞程序性死亡。

与动物中API5基因的研究相比，在完成水稻和拟南芥全基因组测序后，显示在水稻和拟南芥中分别有一个和两个API5基因的同源基因，但是没有它们功能的任何相关报道。本发明利用OsAPI5的突变体详细研究了该基因在绒毡层降解的PCD过程中的作用，为深入了解水稻花药绒毡层降解的PCD分子机制提供重要线索，同时为人工控制水稻的育性培育不育系提供了新的途径。

发明内容

本发明的一个目的是克隆一个控制水稻育性的新基因OsAPI5，利用该基因的失活能导致水稻绒毡层推迟降解有助于我们了解控制绒毡层降解过程的分子机制，为创建水稻不育系材料奠定基础。

本发明的另一个目的是利用水稻育性的基因OsAPI5的转基因植株在水稻育性控制的应用，具体的说就是利用分子设计的方法，将该基因与其它器官或组织特异表达的调控元件组合，抑制该基因在雄配子的表达从而得到雄性不育植株，创造新的雄性不育系材料，这些不育系可以用于水稻杂交种的生产。

OsAPI5基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，也包括与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。本发明也包括SEQ ID NO：2所示的OsAPI5蛋白的氨基酸序列，及与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％同源性以上的氨基酸序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个氨基酸而产生的功能类似物。

本发明克隆的水稻OsAPI5基因的T-DNA插入失活突变体osapi5-1表现为花粉败育(见实施例1)，其等位突变体osapi5-2具有与osapi5-1相同的突变表型(见实施例3)，并且突变表型也与在OsAPI5基因内的T-DNA插入共分离(见实施例1)。正常功能的OsAPI5基因转化该突变体后植株恢复正常的表型(见实施例4)。

本发明还提供了一种利用OsAPI5基因进行高效植物遗传转化的方法。具体地说，本发明提供了一种含有SEQ ID NO：1所示序列的基因或该基因的部分类似功能片段的载体，如图5A所示的互补载体pC2301-OsAPI5(见实施例4所示)。本发明还有一种含有以上表达载体的宿主细胞。该宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。

本发明利用RNAi技术，抑制水稻内源OsAPI5基因的表达，造成水稻不育，可以培育水稻不育系材料(见实施例5)。具体的说就是将OsAPI5基因与其它调控元件，如组成型启动子(如CaMV35S启动子)或器官特异性启动子融合构建基因抑制表达载体，通过转基因技术(如反义RNA或RNAi)人为控制水稻的育性，创造新的雄性不育系，用于水稻杂交种的生产。

实现本发明的具体技术步骤如下：

1.利用已有的水稻T-DNA插入突变体库(突变体库的创建方法已经公开发表论文，见Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.Plant J，2003：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library.Plant J，2007：947-959)筛选得到一个雌雄不育的突变体材料03Z11RO53，我们将其命名为osapi5-1，突变体的筛选鉴定方法见实施例1第1部分中详细描述。

2.本发明分析了野生型和突变体osapi5-1不同发育时期的花药的半薄切片，结果显示突变体的花粉败育是由于其绒毡层的推迟降解导致的(见实施例2)。

3.采用TAIL-PCR方法(Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of thegenome hierarchy as revealed by analyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutantlibrary.Plant J，2007：947-959)分离osapi5-1突变体的侧翼序列，通过序列分析显示T-DNA插入OsAPI5基因的编码序列中(实施例1第2部分)。

4.通过对突变体osapi5-1及其等位突变体osapi5-2(原始编号：3A-10121，来自韩国浦项科技大学)的T-DNA插入与突变性状的共分离验证(实施例1第3和第4部分及实施例3)及功能互补实验(见实施例4)证明本发明获得的候选基因OsAPI5的失活是引起osapi5突变表型的原因。

5利用RNAi技术抑制水稻内源OsAPI5基因的表达培育水稻不育系材料(见实施例5)

更详细的技术发明细节将由《具体实施方式》给出。

本发明的优点是：

1.本发明利用T-DNA标签法分离克隆基因快速、高效。

2.虽然OsAPI5基因成员的功能在动物中有过研究，但是在植物中的功能没有任何报道。本发明提供了调控水稻育性基因OsAPI5及其编码蛋白。该基因对于水稻育性分子机理等理论研究具有重要的价值。

3.将含有SEQ ID NO：1所示序列的基因或该基因的部分类似功能的DNA片段进行改造，导入植物体，可以人工控制水稻的育性，创建不育系材料，对水稻的遗传改良具有深远的实际应用意义。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的OsAPI5基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明的OsAPI5基因的编码序列对应的核苷酸。

图1：水稻不育突变体osapi5-1的突变表型。

图1A：成熟期水稻野生型植株与不育植株形态比较：左为野生型，右为不育突变体。

图1B：野生型植株开花后的稻穗，有大量雄蕊伸出散粉。

图1C：突变体植株开花后的稻穗，很少有雄蕊伸出散粉。

图1D：抽穗时野生型花药与突变体花药形态比较，左边为野生型花药，右边为突变体花药。

图1E：野生型植株(WT)的花粉在经淀粉-碘化钾染色后观察。

图1F：突变体花粉在经淀粉-碘化钾染色后观察。

图2：野生型和突变体花药半薄切片的比较。

图2A、图2C、图2E和图2G分别表示野生型花药在小孢子时期、液泡化花粉时期、有丝分裂时期和成熟花粉期的花药横切片。

图2B、图2D、图2F和图2H分别表示突变体花药在小孢子时期、液泡化花粉时期、有丝分裂时期和成熟花粉期的花药横切片。

英文字母分别表示花药的结构。E，表皮细胞；En，药室内壁；ML，中层；T，绒毡层；Ms，造孢细胞；Msp，小孢子；PG，花粉粒Bars＝25μm.

图3.osapi5-1的等位突变体osapi5-2的突变表型也是不育。

图3A：野生型植株开花后的小花(剥去3/4颖壳)。

图3B：突变体植株开花后的小花(剥去3/4颖壳)。

图3C：抽穗时野生型花药。

图3D：抽穗时突变体花药。

图3E：野生型植株(WT)的花粉在经淀粉-碘化钾染色后观察。Bars＝30μm

图3F：突变体植株的花粉在经淀粉-碘化钾染色后观察。Bars＝30μm

图3G：野生型植株(WT)成熟花粉期的花药横切片。Bars＝25μm.

图3H：突变体植株成熟花粉期的花药横切片。Bars＝25μm.

英文字母分别表示花药的结构。E，表皮细胞；En，药室内壁；ML，中层；T，绒毡层；PG，花粉粒。

图4.OsAPI5基因与突变表型的共分离验证。

图4A：OsAPI5基因的结构和T-DNA插入位点分析。起始密码(ATG)和终止密码(TGA)已经标出，方框表示OsAPI5基因的单外显子，横线表上基因的内含子；两个到三角形分别表示osapi5-1和osapi5-2中T-DNA插入的位置。P1，P2，表示跨T-DNA的两条基因组引物，P3表示位于osapi5-1突变体中T-DNA上的边界引物，P4，P5表示位于等位突变体osapi5-2中T-DNA插入位点两端的两条基因组引物，P6表示T-DNA边界引物。

图4B：是一个osapi5-1 T-DNA插入杂合植株后代的基因型检测。植株基因型的确定当P1和P3配对时才可以扩增出目标产物，由于T-DNA插入片段太大，P1与P2配对扩增的产物无法得到；野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以P1和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P2配对扩增得到目标产物；而OsAPI5杂合T-DNA插入转基因植株则P1和P2配对以及P1和P3配对时都可以扩增得到产物。植株表型：20个T1代单株中第1、4、6、15、17株为突变表型(以M表示)。由图可知突变植株的基因型均为OsAPI5纯合T-DNA插入，而正常植株的基因型为野生(以W表示)或杂合型(以H表示)，这一结果表明突变表型与OsAPI5基因内的T-DNA插入共分离。

图4C：是等位突变体osapi5-2的一个T-DNA插入杂合植株后代的基因型检测。

图4D：是RT-PCR分析OsAPI5在野生型(WT)和突变体osapi5-1和osapi5-2中的表达，结果表明OsAPI5在突变体中的表达被完全敲除。以GAPDH做为内标。

图5.OsAPI5基因功能互补实验。

图5A：互补载体pC2301-OsAPI5结构示意图，该载体的构建说明见实施例2中的第1部分，即将含有基因OsAPI5的完整的编码区和其启动子区域用BamHI从BAC克隆(OSJNBa0019G21)酶切后克隆到载体pCAMBIA2301(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)上形成的新质粒。以pCAMBIA2301空载体转化植株作为阴性对照。

图5B：所有互补植株的3个穗育性的平均值，数值代表平均值+/-标准差；

图5C：用pCAMBIA2301载体上一段特异的片段做探针检测了部分育性恢复单株的拷贝数，并挑选了2个单拷贝单株(第2和第4号单株)考察其T₁代的育性。

图5D：第4号单株T₁代植株的育性分离情况，成熟期转基因阳性植株(Posi)与转基因阴性植株(Neg)形态比较：左为转基因阳性植株(Posi)，右为转基因阴性植株(Neg)。

图5E：转基因阳性植株(Posi)的小花，显示为正常小花。

图5F：转基因阴性植株(Neg)的小花，显示花药形态异常。

图5G：转基因阳性植株(Posi)与转基因阴性植株(Neg)花药形态比较，左为转基因阳性植株(Posi)的花药，右为转基因阴性植株(Neg)的花药，显示转基因阴性植株(Neg)的花药较转基因阳性植株(Posi)的花药瘦小。

图5H：转基因阳性植株(Posi)的花粉经淀粉-碘化钾染色后观察，其花粉都着色，说明花粉可育。

图5I：转基因阴性植株(Neg)的花粉经淀粉-碘化钾染色后观察，很少有花粉可以着色，说明花粉败育。

图5J：全部第4号单株T₁代植株的育性分离情况，总计36株，图中所示为3个穗子育性的平均值+/-标准差，胶图表示的是相对植株是否为转基因植株，PCR阳性代表转基因阳性植株(Posi)；PCR阴性代表转基因阴性植株(Neg)，结果显示所有转基因阳性植株的育性都恢复，而所有转基因阴性植株还是不育的。

图6.利用RNAi技术抑制野生型水稻内源OsAPI5的表达可以降低水稻育性。

图6A.从104株独立转化子中随机选取5株育性极低的单株(分别为S10、S11、S14、S24、S105)和1株正常育性的单株(S92)检测内源OsAPI5基因在这些植株中的表达量。

图6B.随机考察6个单株的结实率。

图7.创建水稻T-DNA插入突变体库所以载体pFX-E24.2-15R的载体图谱。

图8.抑制OsAPI5基因表达的RNAi载体pDS-OsAPI5的载体示意图。

具体实施方式

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

实施例1：OsAPI5基因的分离克隆

1.osapi5-1突变体的获得

所用的水稻T-DNA插入突变体库由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室利用载体pFX-E24.2-15R(该载体图谱见图7)构建而成(突变体库的创建方法已经公开发表论文，见Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis ofthe rice genome.2003，Plant J，35：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed byanalyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library.2007，Plant J，49：947-959)。2005年，从T0代突变体库(见http://rmd.ncpgr.cn/，Zhang等，RMD：a rice mutant database for functionalanalysis ofthe rice genome.2006.Nucl Acids Res，34：D745-D748)挑选出2000份水稻转基因品种“中花11号(为中国农业科学院培育的常用水稻品种)”的种子，经浸种、催芽后播于秧田，20天后移栽至大田。每份材料种两行，每行10株，为一个家系。种植密度为5寸×8寸，种植地点为中国湖北省武汉市洪山区狮子山地区华中农业大学的试验田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。经过大田筛选共获到56个不育或育性低的突变家系。其中，一个原始编号为03Z11RO53的突变体表型为育性极低(结实率为1％，如图1)，申请人将这个突变体命名为osapi5-1。

2.分离OsAPI5突变体T-DNA插入位点的侧翼序列

利用Tail-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)技术(Liu等，Thermal symmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosomalwalking.1995，Genomics，25：674-681；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at variouslevels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trapmutant library.2007，Plant J，49：947-959)我们分离了这个突变体的T-DNA侧翼序列。根据侧翼序列与水稻基因组的匹配位置确定插入位点，结果显示该侧翼序列位于水稻的第2染色体上，插入位点对应于水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上的一个基因(登录号：LOC_Os02g20930)，命名为OsAPI5。T-DNA插入到该基因的最后一个外显子中(见图2A)。

TAIL-PCR方法分离得到的OsApi5突变体T-DNA插入位点的侧翼序列如下：

CGGTTTAATTATTAGTAGGTAGGGTCTTGCGCAGTTTAACTATCAGTGTTTGGATAACCCTTCACAAGCTCTGTTCACAAGTTGATTCCGGGCTGCTCCCTCTCCCCGCCCCTTCTTGCTCGCAGGGGTGTTCCCATTTGTAGCAGGCTGGGACCTCTTCCCTCTAAAAGATCCACAAAGCAGACTTAACTATAATGAAATGCAAAGTCTGAGGGGGAAATGGAATATTAGGTAATAGAAATCTAACCCTGTTGTTGTAGGTGCTGGTTTCTTTGGCTGCTCCATCCATGAGAGAGTGATTTTCTTGTCACCAATAAATAAAGGGGATTTCGCACGCAACGGCTGAAATGAACATTCATCACGTTTAGTTAGAAAGCATAAACATTTAGGTAGGTTAGTATTATTAGTATACACAAGCAGTATATTTCATACATTGCCGTGTACTTATGCTTCCTCCAGCAGTAGAATAAGATGTGTTTTAGACATTAACACATGCAACTTTTCCATTGTACAAATTAATACAACTACAATGGAATTTTTTGACACAACCTACTCGTCATTTTCATATATCTAAGGTAATTCGTAGAGATTGGTAGCCCAAAGTTGAATTCGGTTGTGTACATGCAATTATAAAAGGCCACTTTAACTTTTTACTTAAGATAGTCCTGCAGTTCCTTCACAGGCCTCAAAAAGCATAGTGCAAAACTCAAACCAGCATGTGAACTATTTCACTCAAATCAGTCCTCGGTTCGCTGATTCAAACATGGTTTGACAGTGAGCCAGACAGTTCAGAGTTATTAATTTTTGAATTAAACCCCAAGGCCTTGTTATAAAAAATAAAAGGCTCATATTGAAAACTTCCTTGAATGAATCACATGCCCAATCTTCAAACACCAGTTGGCTTTATCAGCACAATCTAACACATGCAATATTAAGCCCTCAGATAAAAAGGGGATTCGGACTTCCAAGGGCGGGAATAAAAAATTGTACCAGAAAAGGTTTAAACATTCCAGTTTTTTCTCACTATCAATTGGTTTTCATTTTAAAACTGCCGA

3.T-DNA插入侧翼序列与突变表型的共分离检测

为了证实花粉败育的突变表型是由于OsAPI5基因内的T-DNA插入引起，本发明对20个T1代转基因植株(其中，第1、4、6、15、17株为突变单株)进行了T-DNA插入位点侧翼序列与突变表型的共分离检测。共分离检测的具体步骤为：(1)在OsAPI5基因T-DNA插入位点两侧设计一对基因组引物P1(5′GATGGCAGATGGACCTGAAAA 3′)和P2(5′AGCGAACCGAGGACTGATTT 3′)，在T-DNA上设计一条载体引物P3(5’-TGCAGGTTCTCTCCAAATGA-3’)，如图2A。在T1代植株中，OsApi5纯合T-DNA插入植株只有当P1和P3配对时才可以扩增出目标产物；而由于T-DNA插入使P1与P2配对扩增的产物达到10.5kb，在申请人设定的PCR反应程序无法得到相应PCR产物(这样鉴定植株基因型的方法是领域内的通用方法)。野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以P1和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P2配对扩增得到目标产物。而OsAPI5杂合T-DNA插入转基因植株则P1和P2配对以及P1和P3配对时都可以扩增得到产物。(2)应用CTAB法(参照Liu等，A genome-wide analysis of wide compatibility in rice and the preciselocaion of the S 5 locus in the molecular map.1997，TAG，95：809-814)从20株T₁代单株中分别抽提总DNA作为模板，用(1)中引物组合P1+P3和P1+P2进行PCR扩增。反应体系为20μL，具体包含：DNA模板1μL；10倍体积的Taq酶反应缓冲液2μl；2mM dNTP 1.5μL；25mM镁离子1.2μL；10μM引物0.2μL；0.3单位Taq酶，加双蒸水至20μL。反应参数设置如下：94℃ 5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃1.5min，28cycles；72℃5min，25℃1min。(3)将反应产物经琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶上的带型判定各个单株的基因型。实验结果显示，20株T₁代单株中，5株突变体表型植株的基因型均为OsAPI5纯合T-DNA插入，而其他15株表型正常的植株基因型为野生或杂合型(如图2B)。这表明osapi5突变体的突变表型是由于OsAPI5基因内的T-DNA插入造成，且该突变体表现为隐性纯和突变体。

实施例2：野生型和突变体不同时期花药的半薄切片观察

取不同发育时期的来源于野生型和突变体的花药在50％FAA固定液(50％dH₂O，40％乙醇，10％醋酸)固定24小时(花药发育分为8个时期，详情参考Feng，等.2001.Pollen development and its stages in rice(Oryzasativa L.).Chinese J.Rice Sci 15(1)：21-28.)。固定后的材料在系列酒精中脱水(70％酒精、90％酒精、95％酒精、无水酒精总各顺序放置30分钟)。脱水后的材料用包埋剂Technovit 7100树脂(购自德国HeraeusKulzer公司)包埋(详细方法参考试剂说明书)，37℃放置3-5天后，包埋块作半薄切片(1微米，切片机型号为LEICA EM UC6，方法参考仪器使用说明)。材料用苯胺蓝染色(试剂购自德国Merck公司)，显微镜观察，拍照(所用观察拍照系统为Leica DFC480 Digital Camera system)。

结果显示，突变体和野生型花药的前5个时期没有明显差异(注：前4个时期的没有差异，图片没有列出)，从花药发育的第6个时期开始，野生型的花药绒毡层开始降解，到最后完全消失，产生正常的花粉(图2C、图2E和图2G)。而突变体的花药绒毡层在应该降解的时候没有降解，直至发育的最后时期，最终导致花粉的败育(图2B、图2D和图2H)。由此可见，目的基因OsAPI5的失活引起绒毡层的推迟降解，导致花粉的败育。

实施例3：osapi5-1的一个等位突变体osapi5-2的鉴定

Osapi5-1的一个等位突变体osapi5-2的T-DNA插入位点位于该基因的第13个外显子内(图2A)。2008年在中国湖北省洪山区狮子山地区华中农业大学的试验田种植21株osapi5-2突变体T1代植株，其中第17、18共2个单株具有突变表型，即育性极低。共分离检测的原理如图2A，所用的引物为P4(5’-GCCCATAAGGTTTGATGACAGA-3’)、P5(5’-CATGAGAAGCCCAAGCAGAG-3’)和载体引物P6(5’-GTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3’)。由图4B可知，osapi5-2家系的突变表型与OsAPI5基因内的T-DNA插入是共分离的。这进一步表明osapi5-2的突变表型也是由OsAPI5基因的插入突变引起。

实施例4：互补实验

1.互补载体的构建

互补载体pC2301-OsAPI5的构建方法如下：以pCAMBIA2301载体为骨架载体(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)。用BamHI酶切水稻“日本晴“BAC克隆OSJNBa0019G21，得到一系列将酶切片段，其中包括目的片段：含整个OsAPI5基因编码区及ATG前约1.6kb和终止密码后约4.4kb。将酶切片段与BamHI酶切的去磷酸化的的载体质粒pCAMB1A2301连接(图5A)(所使用的内切酶、碱性磷酸酶均购自Takara公司，连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加600ul LB复苏45分钟，取250ul涂于含卡那霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-β-gal)及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LA平板，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑白色单克隆，扩大培养并抽提质粒，酶切验证及测序验证后得到目的克隆。把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(购自CAMBIA公司)中。转化后的菌株命名为EHA105-p2301-OsAPI5。

2.遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(参照文献：Wu等，Development of enhancer trap lines for functionalanalysis of the rice genome.2003，Plant J.35：418-427)将菌株EHA105-pC2301-OsAPI5导入osapi5-1突变体的愈伤组织，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有G418(用于筛选真正的转基因愈伤的一种抗生素)(购自北京原平皓生物技术有限公司)抗性的愈伤组织(请注意后面的语序)、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方参见申请人在先的专利文献，公开号为：CN1995346；专利名称为：水稻木质素合成基因FC1及应用)。按照相同的遗传转化方法将空载体pCAMBIA2301导入osapi5-1突变体的愈伤组织，得到的转基因植株作为阴性对照。

本发明结果显示，将互补载体pC2301-OsAPI5通过农杆菌介导的方法转化导入osapi5-1突变体的愈伤组织，共获得独立互补转化苗51株，其中39株阳性植株全部恢复正常育性；获得空载体转化苗12株，全部表现不育的突变表型(见图5B)。以上结果表明osapi5-1不育突变表型是由于OsAPI5基因突变而造成。为了检测T₀代互补转基因植株的转基因拷贝数，随机选取40株互补转基因植株，利用Southern杂交(具体操作参考：Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.2003，Plant J，35：418-427)分析了这些互补转基因植株的拷贝数。结果显示，其中有16份互补转基因植株为单拷贝插入。大田种植来源于2份单拷贝T₀家系的下一代植株(见图5C中的第2和第4号植株)，其中转基因阳性植株育性均为正常，而转基因阴性植株均表现为不育(图5D到图5J)。这些研究结果进一步表明osapi5-1突变体的突变表型确定是由于OsAPI5基因的突变而造成的。

实施例5：抑制OsAPI5的表达培育水稻不育材料

根据OsAPI5基因结构，在OsAPI5基因编码区的3’末端设计一对RNAi引物RNAi-F(5’-CTCactagtggtaccCAGCCAAAGAAACCAGCACC-3’；)和RNAi-R(5’-CTAgagctcggatccGGATGTAAATGAACTAGGGCGTAC-3’，下划线表示酶切位点)。以OsAPI5基因的全长cDNA克隆J033050C22(Maruyama and Sugano 1994.Oligo-capping：a simple method to replace the capstructure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides.Gene 138：171-174；Suzuki，等.1997 Constructionand characterization of a full length-enriched and a 5′-end-enriched cDNA library.Gene 200：149-156)为模板扩增出长度为469bp的构建RNAi载体的OsAPI5 cDNA片段，分两步构建到载体pDS1301上，构建好的载体命名为pDS-OsAPI5(载体图见附图8)(方法参照Chu，等.2006.Promoter mutations of an essential gene forpollen development result in disease resistance in rice.Genes Dev 20：1250-1255)。PCR反应体系的总体积为20μL，cDNA质粒模板0.1μL(约50ng)、10倍体积的Taq酶反应缓冲液2μL、25mM MgCL₂ 1.2μL、2mMdNTP 1.5μL、10uM引物0.2μL、0.3单位rTaq酶(购自Takara公司)。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、56℃40s、72℃40s 28cycles。构建好的载体电转入(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，转化后的菌株命名为EHA105-pDS-OsAPI5。用该菌株转化水稻粳稻品种中花11号种子诱导的愈伤。(转化方法同实施例4中第2部分)。

通过本例申请人得到110株独立转化苗，其中转基因阳性单株104株。育性小于30％的共有54株(其中完全不育的有17株)，占总数的51.9％。申请人选取了部分单株检测其内源OsAPI5的表达量，如图6A和6B所示，定量RT-PCR结果显示在内源OsAPI5的表达量明显下降的植株，其结实率也非常低。结果表明，这些单株的低育性和OsAPI5的表达量是共分离的。

由此可见，通过RNAi技术抑制野生型水稻中内源OsAPI5基因的表达后造成了水稻植株的育性的明显降低，进一步证明了OsAPI5基因为控制水稻育性的基因，并由此方法可以调控植物的育性，用于实际生产。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-苄基腺嘌呤(6-BA)；激动素(KT)；萘乙酸(NAA)；吲哚乙酸(IAA)；2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)；乙酰丁香酮(AS)；水解酪蛋白(CH)；潮霉素(HN)；二甲基亚砜(DMSO)；N6大量成分溶液(N6max)；N6小量成分溶液(N6min)；MS大量成分溶液(MSmax)；MS微量成分溶液(MSmin)

(2)主要溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

室温下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 2.23g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.86g

钼酸钠(Na2MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.0025g

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

(3)培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6mix母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50ul

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmix母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 20g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蛋白胨 2.5g

酵母粉 1.25g

氯化钠 2.5g

琼脂粉 3.2g

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度26±1℃。

农杆菌培养

(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20℃。

愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5-7周。

生根

(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载大田。

Claims

1.OsAPI5基因在控制水稻育性中的应用，其特征在于，所述OsAPI5基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示。