CN103013991A - 控制水稻株高和穗颈长的基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明“控制水稻株高和穗颈长的基因及应用”属于植物基因工程技术领域。与植物转基因技术和水稻分子育种技术领域相关。本发明通过植物基因克隆技术得到一种减弱人工microRNA干涉eui-1基因功能的target mimic基因MIMb，其核苷酸序列如序列表SEQ NO：5所示。用长穗颈的水稻材料eZS97A与MH63-MIMb进行杂交，得到株高和穗颈长恢复到野生水平的水稻材料。本发明还公开了其制备方法与应用。

Description

控制水稻株高和穗颈长的基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及利用一个人工microRNA(artificial microRNA，amiRNA)和人工target mimic基因所构成的双因子系统来控制水稻不育系及其杂种的株高和穗颈长。本发明利用amiRNA技术在转基因水稻不育系中特异性的沉默赤霉素(GA)合成代谢途径中的Eui1(elongated uppermost internode 1)基因的表达。Eui1基因的产物可以失活具有生物活性的赤霉素GA4。抑制Eui1的表达就可以提高水稻内源GA4的含量，从而提高其株高和穗颈长，缓解水稻不育系的包穗特性。Target mimicry是植物中天然存在的一种抑制特定miRNA作用的机制。利用人工设计的target mimic基因，转化水稻恢复系。当含有amiRNA的水稻不育系和含有人工target mimic的水稻恢复系杂交，在其所配的杂种一代(F₁)中，人工target mimic可以特异性抑制amiRNA的效果，使得杂交种的株高和抽穗性恢复到接近野生型杂种的水平。 

背景技术

杂交水稻的发明使水稻增产20％左右(袁隆平，1996)，为保障中国乃至世界粮食的安全做出了巨大贡献。目前，中国的杂交水稻种植面积占总水稻种植面积的50％左右(张红林等，2009)。杂交水稻的雄性不育系具有“包穗”(即穗子大部分被包裹在叶鞘内)的特性，因而在杂交水稻制种时难以受粉。水稻不育系的包穗特性是生产上制约杂交水稻发展的重要障碍之一(张红林等，2009)。Yin等(2007)对水稻不育系ZS97A包穗现象机理的研究表明，当水稻细胞质雄性不育发生时，其最上部茎间GA1水平的降低是导致不育系包穗的主要原因。在杂交水稻制种的过程中，育种家需要通过外施“920”(有效成分为GA3)来解除或缓解不育系的包穗现象。然而，920的施用不仅导致一系列的问题如增加了制种成本、降低了种质量并导致环境污染；其效果还要取决于喷施者的技术、施用的时期以及施用时的天气状况(张红林等，2009)。 

Rutger和Carnahan(1981)在粳稻杂交的后代中发现了一株节间伸长，高秆的突变体，命名为76：4512。遗传分析表明，该节间伸长性状由隐性单基因控制，并将该隐性突变基因命名为eui(elongated uppermost internode)。Eui突变基因可以导致水稻最上部节间的长度增加约一倍，穗长增加12％。Rutger和Carnahan(1981)提出，利用eui隐性突变基因来培育杂交水稻的高秆恢复系。因为高秆的株型对于作为父本的恢复系可以利于其花粉的传播以及杂交种的商业化制种。恢复系的高秆性状为隐性基因，因而不影响杂交组合的半矮杆性状。Eui基因也被称为杂交水稻生产中除了不育系、保持系和恢复系外的第4遗传因子(Rutger和Carnahan 1981)。 

Yang等(1999)通过辐射诱变协青早B，获得两种不同的高秆隐性突变体协青早eB1和协青早eB2。等位试验证明，协青早eB1的隐性基因与Rutger发现的eui突变体为等位基因，命名为eui1；而协青早eB2中的隐性基因与eui1不等位，命名为eui2(Yang et al.1999)。eui1和eui2的显性等位基因EUI1和EUI2已经被分离，其基因功能也已经被阐明。EUI1的基因组序列为9804bp，由2个外显子和1个内含子组成，其全长cDNA为1931bp，包含110bp的5’-UTR，87bp的3’-UTR和1734bp的读码框(open reading frame，ORF)(Ma et al.，2006)。EUI1编码一个含有577个氨基酸的细胞色素CYP714D1蛋白，可以使GA4失活(Luo et al.，2006；Zhu et al.，2006)。EUI2的基因组序列为1576bp，包含5个外显子，4个内含子。其ORF长为933bp，编码310个氨基酸，同源性分析初步认为该基因产物与环氧化物 酶有关(朱宏波，2003；马洪丽，2007)。 

eui突变体主要有两种用途：一种是Rutger和Carnahan最初设想的利用eui突变体来培育隐性高秆恢复系，提高其传粉能力；另一种是利用eui突变体培育长穗颈的不育系，免除或减少在杂交中制种过程中920的使用。但是，在Rutger和Carnahan发现eui突变体后的20多年里，eui基因并没有在杂交水稻生产上被大规模应用。因为优良组合的亲本与eui突变体经过杂交和回交转育后，原有杂交组合的部分优良性状往往会丢失(张书标和杨仁崔，2004)。因此，Yang等(2002)提出直接人工诱变接杂交组合的保持系和恢复系，从而培育长穗颈不育系(eA系)或高秆恢复系(eR系)。利用eA或eR配制的杂交水稻组合称为e-杂交水稻(张书标和杨仁崔，2004)。采用直接诱变的方法，e-杂交水稻的研究获得了一定的进展，少量e-杂交水稻组合在生产上获得了应用。e-杂交稻的制种不需要外施920，且其产量要显著高于相应的非eui杂交组合(张红林等，2009)。但是，由于可用的eA和eR系种质资源还比较少，且受知识产权的限制，目前e-杂交水稻在生产上的应用十分有限(张红林等，2009)。 

在eui突变体的遗传背景和分子机理都清晰的前提下，通过转基因策略发展e-杂交水稻成为了一种可能的选择。MicroRNA(miRNA)是一类动、植物中普遍存在的21-24nt大小的小分子RNA。miRNA通过序列互补的方式特异性介导特定的作用因子识别目标基因的mRNA，然后以“翻译阻遏(translational repression)”或“位点特异性切割(site-specific cleavage)”的机制抑制目标基因的表达。在植物中，miRNA的序列与目标mRNA上的识别位点几乎完全互补，并主要通过mRNA位点特异性切割的方式发生作用(Ambros 2004；Bartel 2004；Bushati和Cohen 2007)。研究发现，在植物体内的表达人工设计的miRNA(artificial microRNA，amiRNA)序列可以同天然miRNA一样抑制特定基因的表达活性(Schwab et al.2006；Khraiwesh et al.2008；Warthmann et al.2008；Molnar et al.2009)。Warthmann等(2008)报道，通过表达amiRNA抑制水稻中EUI1基因的表达，可以增加水稻的株高及穗颈长，使转基因植株表现出eui1突变体类似的表型。然而，和自然突变或诱变产生的隐性eui表型不一样，amiRNA是通过RNA之间的反式作用来抑制EUI1基因的表达，其产生的表型为显性性状。转基因不育系的杂交后代理论上会表现出高秆的特性而不是eui杂种所表现出来的半矮杆的特性。转基因杂交后代的高秆特性会降低其抗倒伏能力，从而影响产量。因此需要在杂交组合中引入一个新的因子来抑制amiRNA的活性从而使杂交组合恢复半矮杆的特性。 

Target mimicry是在拟南芥中发现的一种抑制miRNA作用的机制。IPS1是拟南芥中发现的一种不编码蛋白质序列的基因。IPS1上有一段序列与miRNA miR-399的序列互补，但是在miRNA预期发生切割的位置存在4碱基的错配。这个4碱基的错配使得IPS1不能被miR-399切割(Franco-Zorrilla et al.2007)。这种特殊的机制使得IPS1不被miR-399切割，且能抑制miR-399对其靶标基因的调控作用。利用target mimicry机理，设计人工的target mimic基因可以特异性的抑制特定miRNA分子的功能(Franco-Zorrilla et al.2007)。 

本发明拟采用基因工程的方法，通过构建一个“双因子”的系统替代人工诱变的方法，培育转基因的e-杂交水稻。本发明的策略在于利用amiRNA技术在水稻保持系中敲除EUI1基因的表达，获得转基因长穗颈的保持系。将转基因保持系与相应不育系杂交和回交，育成转基因长穗颈的不育系。在水稻恢复系中导入人工target mimic基因。由于target mimic基因不编码蛋白，因此不干扰转基因恢复系的正常生长。表达amiRNA的不育系与含有target mimic的恢复系所配置的杂种中，由于target mimic抑制了amiRNA 的活性，杂交种的表型仍然为半矮杆。 

目前水稻转基因技术已经臻于成熟，和直接突变杂交组合的保持系、恢复系以及不育性的策略比较起来，转基因操作更加直接和精确，因而具有可控性好、筛选工作量小，育种时间短等优点。此外人工诱变往往会造成EUI1基因的表达活性彻底丧失，而转基因的方法由于不同转化子外源基因的插入位置效应，其导致的基因失活效果不同，因而可以根据需要筛选表型强度合适的转化子，从而更加灵活。此外由于整个策略都是基于RNA水平的调控，不产生新的蛋白因而在转基因安全性方面也非常的可靠。 

水稻不育系的还存在“包穗”缺陷，在杂交水稻的生产上为了解决“包穗”现象，往往过多使用920(又称赤霉素)，因而增加了水稻制种成本，影响制种质量，导致环境的污染，且效果易受外界因素(喷施者的技术、施用的时期以及施用时的天气状况)的影响。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用基因工程的方法将外源基因MIMb导入水稻受体，以调控水稻株高和穗颈长性状，解除水稻不育系的“包穗”缺陷。 

本发明的具体技术方案如下： 

申请人克隆了一种减弱人工microRNA干涉eui-1基因功能的target mimic基因MIMb，该基因能够调控水稻株高和穗颈长性状，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO：5所示。 

该基因的具体应用方法包括如下步骤： 

(1)将干涉水稻eui-1基因的microRNA基因构建到pC1300-Ubi-nos载体上，得到重组质粒pEUI-amiRNA，用该重组质粒转化水稻ZS97B，得到转基因材料eZS97B； 

(2)将转基因材料eZS97B与水稻材料ZS97A杂交得到长穗颈的水稻材料eZS97A，其保藏号为CCTCC NO P201111； 

(3)设计扩增MIMb基因的引物MIMIII、MIMIV、EuiMIMIb和EuiMIMIIb，然后用两轮PCR合成MIMb基因，并将MIMb基因构建到pC1300-Ubi-nos载体上，得到重组质粒pC1300-MIMb，用该重组质粒转化水稻材料MH63，得到转基因水稻材料MH63-MIMb，其保藏号为CCTCC NO P201113； 

(4)用长穗颈的水稻材料eZS97A与MH63-MIMb进行杂交，得到株高和穗颈长恢复到野生水平的水稻材料；其中：步骤(1)所述的microRNA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示； 

步骤(1)所述的重组质粒pC1300-Ubi-nos含有序列表SEQ ID NO：1所示的microRNA基因； 

步骤(3)所述的MIMIII、MIMIV、EuiMIMIb和EuiMIMIIb引物序列的核苷酸序列如下所示： 

MIM-III CCCTGCCTTCATACGCTATT(5′-3′)； 

MIM-IV ATTGCCAAATGTTTGAACGA(5′-3′)； 

EuiMIM-Ib atTTGAGAACTAAACCGCACGGGCGCccttagtagaggtaaaagtc(5′-3′)； 

EuiMIM-IIb ggGCGCCCGTGCGGTTTAGTTCTCAAattattcggtggatgtctgt(5′-3′)； 

其中步骤(3)所述的重组质粒pC1300-Ubi-nos含有序列表SEQ ID NO：5所示的MIMb基因； 

其中步骤(3)所述的PCR方法如下所述： 

使用引物组合EuiMIMIb+MIMIII和EuiMIMIIb+MIMIV进行第一轮PCR反应，反应体系为：5×phusion HF reaction Buffer 10μl，2μM dNTPs 5μl，50ng/μl MT375质粒2μl，10μM左、右引物各2μl，phusion DNA polymerase 0.5μl，补灭菌超双蒸水至50μl； 

反应条件为：98℃ 30s；98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 15s重复循环35次；72℃ 5min。将PCR产物于0.8％琼脂糖胶电泳，挖胶后回收PCR产物，最后溶于30μl elution buffer；用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR；反应体系为：10x ExTaqE Buffer 5μl，2μM dNTPs 5μl，两种第一轮PCR产物各2μl，10μM的引物MIMIII和MIMIV各2μl，Ex Taq 0.5μl，补灭菌双蒸水至50μl； 

反应条件为：94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min重复循环35次；72℃ 5min；最终PCR产物克隆于T载体pGEM-T上，然后测序验证；利用BamH I和Kpn I酶切含有MIMb的T体释放出MIMb基因，并将MIMb克隆于中间载体pC1300-Ubi-Nos上获得最终表达载体pC1300-MIMb。 

具体地，本发明还公开一些步骤： 

根据Warthmann等(2008)的报道构建了针对水稻Eui1基因的amiRNA表达载体，转化水稻保持系ZS97B获得长穗颈的保持系eZS97B。通过eZS97B和不育系ZS97A杂交获得长穗颈的水稻不育系ZS97A。构建一个抑制amiRNA的target mimic表达载体，并转化到水稻恢复系MH63，获得转基因恢复系MH63-MIM。在eZS97A和Mh63-MIMb的杂交种中，由于target mimic基因抑制了amiRNA的功能，从而使得杂交种的株高和穗颈长基本回复到野生型的水平。 

申请人于2011年9月27日将本发明涉及的生物材料，即水稻eZS97A和MH63-MIMb，送至湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号分别为CCTCC NO P201111和CCTCC NO P201113。 

本发明的优点在于，本发明获得水稻株高和穗颈长性状改良的转基因水稻，可以避免在杂交种生产上过度使用920，从而可以降低水稻制种的成本，提高种子质量，而且有利于保护环境。 

附图说明：

序列表SEQ ID NO：1是人工microRNA eui-amiRNA前体序列，长度为245nt。 

序列表SEQ ID NO：2是人工microRNA eui-amiRNA的DNA序列，长度为21nt。 

序列表SEQ ID NO：3是人工target mimic基因MIMa序列，长度为656nt。 

序列表SEQ ID NO：4是MIMa基因中人工设计和替换的DNA序列，长度为24nt。 

序列表SEQ ID NO：5是人工target mimic基因MIMb序列，长度为656nt。 

序列表SEQ ID NO：6是MIMa基因中人工设计和替换的DNA序列，长度为24nt。 

图1：本发明的具体流程。 

图2：本发明所涉及的质粒载体pC1300-Ubi-nos示意图。 

图3：本发明所涉及的表达载体pEUI-amiRNA示意图。 

图4：本发明所涉及的质粒MT375示意图。 

图5：MIMa和MIMb的序列。除24nt的序列为人工设计外，其余的序列同OsIPS1。 

图6：本发明所涉及的表达载体pC1300-MIMa示意图。 

图7：本发明所涉及的表达载体pC1300-MIMb示意图。 

图8：转eui-amiRNA基因水稻不育系ZS97B植株的表型性状和分子检测。A)不同T₀代转基因植株的整株表型状况。左一为野生型对照，另外三株为转基因植株。转基因植株的株高明显高于对照，且不同转基因植株的表型性状的强弱不一。B)不同T₀代转基因植株的最上部节间的长度的比较。左一的节间来自野生 型对照，其余三个节间来自转基因植株。转基因植株的最上部节间长度高明显长于于对照，且不同转基因植株的表型性状的强弱不一。C)两个表型最强转基因植株eZS97B-11和eZS97B-20的分子检测。通过stem loop RT-PCR，eZS97B-11和eZS97B-20均可检测到eui-amiRNA的表达，而野生型对照中检测不到。与之对应的，转基因植株eZS97B-11和eZS97B-20中eui-amiRNA的靶标基因Eui1的表达量相对于野生型的对照大幅的下降。 

图9：Target mimic基因在T₀代转MH63植株中的表达量检测。通过qRT的检测，有7个转MIMa MH63植株和3个转MIMb MH63植株外源基因表达量有大幅的提高。MIMa-16和MIMb-6是两个被选的家系，其相对表达量在图中用红色柱子表示。 

图10：转eui-amiRNA基因ZS97A的表型。A)转eui-amiRNA基因ZS97A的整株表型，左边的为野生型对照，转基因植株的株高明显增高；B)转eui-amiRNA基因ZS97A植株的最上部节间的表型。左边为野生型对照，转基因植株的最上部节间长度明显变长。 

图11：转基因杂交组合中株高与target mimic表达量以及穗颈长与target mimic表达量的散点图。A)转基因杂交组合eZS97B/MH63-MIMa中株高与target mimic表达量的散点图；B)转基因杂交组合eZS97B/MH63-MIMb中株高与target mimic表达量的散点图；C)转基因杂交组合eZS97B/MH63-MIMa中穗颈长与target mimic表达量的散点图；D)转基因杂交组合eZS97B/MH63-MIMb中穗颈长与target mimic表达量的散点图。整体上看，target mimic高效表达的杂交后代的株高和穗颈长均明显低于target mimic不存在或未有效表达的转基因杂交后代。 

图12：不同转基因杂交组合的表型及其Eui1基因的表达情况。A)只有eui-amiRNA的杂交组合的整株表型。如果杂种后代仅有eui-amiRNA存在，其株高和穗颈长均明显高于野生型对照(野生型对照在图片左侧)；B)eui-amiRNA和target mimic均存在的转基因杂交组合。如果杂种中同时存在eui-amiRNA和target mimic，则其株高和穗颈长可以恢复到与野生型对照相当的水平(野生型对照在图片左侧)。 

图13：本发明所涉及的表达载体pNW55示意图。 

具体实施方式：

实施例1构建amiRNA表达载体 

Warthmann等(2008)报道了利用玉米Ubiquitin启动子组成性表达特异性的amiRNA序列(TTGAGAACTATGCACGGGCGC)，可以特异性抑制水稻Eui1基因(Os05g40384)的表达，提高水稻的节间特别是最顶部一节的节间长度而显著增加水稻的株高和穗颈长。在本发明中，我们利用质粒pNW55(由德国马普生物发育研究所Detlef Weigel教授提供)作为模板，根据Warthmann等(2008)描述的重叠延伸PCR(overlap extension PCR)的方法获得针对水稻Eui1基因的amiRNA前体基因(命名为eui-amiRNA)，并克隆于T载体pGEM-T上(Promega，美国)，然后测序验证。用限制性内切酶BamH I和Kpn I从T载体上切下amiRNA前体基因，克隆于本实验室先前构建的表达载体pC1300-Ubi-nos(图2)上，获得植物表达载体pEUI-amiRNA(图3)。 

amiRNA构建的具体步骤： 

为了构建amiRNA，我们一共合成了6条PCR引物。其中，引物G-4368和G-4369为通用引物，引物amiI、amiII、amiIII和amiIV(引物的具体序列见表1)，第一步反应以pNW55为模板，使用引物组合G-4368+amiII、amiI+amiIV和amiIII+G-4369，反应体系为：10×pfu reaction Buffer 10μl，2μM dNTPs 5μl，50ng/μl pNW55质粒2μl，10μM左、右引物各2μl，pfu polymerase(New England Biolabs，美国)0.5μl，补灭菌超纯水至50μl。反应条件为：95℃ 2min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s重复循环30次；72℃ 7min。将PCR产物于0.8％琼脂糖胶电泳，挖胶后用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，德国)回收PCR产物，最后溶于30μl elution buffer。用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR。反应体系为：10x ExTaqE Buffer 5μl，2μM dNTPs 5μl，两种第一轮PCR产物各2μl，10μM的引物G-4368和G-4369各2μl，Ex TaqE(TaKaRa，中国大连)0.5μl，补灭菌超纯水至50μl。反应条件为：94℃ 2min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min重复循环35次；72℃ 7min。最终PCR产物克隆于T载体pGEM-T(Promega，美国)上，然后测序验证。利用BamH I和Kpn I酶切含有amiRNA的T载体释放出amiRNA基因，并将amiRNA基因克隆于中间载体pC1300-Ubi-Nos上获得最终表达载体pEUI-amiRNA(图3)。 

实施例2人工target mimic表达载体的构建 

质粒MT375(由德国马普生物发育研究所Detlef Weigel教授提供)携带有水稻天然target mimic基因OsIPS1(GenBank：AY568759.1)(图4)，OsIPS1转录的mRNA上带有24nt与水稻miRNA osa-MIR399互补的序列为模板。采用重叠延伸PCR的方法(Franco-Zorrilla，et al.2007)将天然OsIPS1上与osa-MIR399互补的序列替换为针对eui-amiRNA互补的序列，形成人工target mimic基因(见序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5)。Target mimic基因的设计参考了Franco-Zorrilla等(2007)在植物中发现的target mimicry的作用机理。我们设计了两条序列略有差异的target mimic基因(分别命名为MIMa(见序列表SEQ ID NO：3)和MIMb(见序列表SEQ ID NO：5))。MIMa是模拟eui-amiRNA在Eui1基因上的靶位点序列设计，即除了与amiRNA序列结合的第10和11个碱基之间有4个碱基的不匹配的小环突起且第10个碱基不能与amiRNA配对(该设计为了避免target mimic基因编码的mRNA序列被amiRNA切割)，其余的序列和eui-amiRNA的靶位点完全一致(见图5)。而MIMb则根据eui-amiRNA的序列设计，即除了与amiRNA结合的第10和11个碱基之间有4个碱基的不匹配的小环突起且第10个碱基不能与amiRNA配对外，其余序列与amiRNA完全互补(见图5)。因此，MIMa和MIMb的序列存在2个碱基的差别，且MIMb与eui-miRNA的互补性高于MIMa。设计MIMa和MIMb两种不同的target mimic基因，是为了考察提高target mimic与eui-amiRNA的配对能力是否能提高target mimic对amiRNA的抑制效果。 

MIMa和MIMb构建的具体步骤： 

为了构建MIMa和MIMb，我们一共合成了6条PCR引物。其中，引物MIMIII和MIMIV为通用引物，引物EuiMIMIa、EuiMIMIIa、EuiMIMIb和EuiMIMIIb(引物的具体序列见表1)是含有突变位点的特异引物。下面是MIMa的构建过程，除了使用不同的特异引物外，MIMb的构建过程与之完全一样。使用引物组合EuiMIMIa+MIMIII和EuiMIMIIa+MIMIV进行第一轮PCR反应，反应体系为：5×phusion HF reaction Buffer 10μl，2μM dNTPs 5μl，50ng/μl MT375质粒2μl，10μM左、右引物各2μl，phusion DNA polymerase(New England Biolabs，美国)0.5μl，补灭菌超纯水至50μl。反应条件为：98℃30s；98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 15s重复循环35次；72℃ 5min。将PCR产物于0.8％琼脂糖胶电泳，挖胶后用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，德国)回收PCR产物，最后溶于30μl elution buffer。用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR。反应体系为：10x ExTaqE Buffer 5μl，2μM dNTPs 5μl，两种第一轮PCR产物各2μl，10μM的引物MIMIII和MIMIV各2μl，Ex TaqE(TaKaRa， 中国大连)0.5μl，补灭菌超纯水至50μl。反应条件为：94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min重复循环35次；72℃ 5min。最终PCR产物克隆于T载体pGEM-T(Promega，美国)上，然后测序验证。利用BamH I和Kpn I酶切含有MIMa和MIMb的T体释放出MIMa和MIMb基因，并将MIMa和MIMb克隆于中间载体pC1300-Ubi-Nos上获得最终表达载体pC1300-MIMa和pC1300-MIMb(图6和7)。 

表1.本发明所涉及的引物序列 

实施例3水稻的遗传转化 

由于水稻不育系不能够收到转基因种子，因此表达载体pEUI-amiRNA首先通过农杆菌介导的遗传转化方法转化到水稻保持系ZS97B中，获得转基因水稻家系eZS97B。然后，再通过杂交转育将eZS97B中的eui-amiRNA导入到相应的不育系ZS97A中获得转基因不育系eZS97A(中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO P201111)。通过农杆菌介导的方法将pC1300-MIMa和pC1300-MIMb导入水稻恢复系明恢63(MH63)中，获得转基因材料命名为MH63-MIMb(中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO P201113)。转基因的方法参考Lin和Zhang(2005)。 

农杆菌介导的遗传转化的步骤如下： 

3.1愈伤诱导 

将成熟的明恢63水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞种子表面消毒15分钟； 

1)用灭菌水洗种子4-5次； 

2)将种子放在诱导培养基上； 

3)将接种后的培养基置于黑暗处培养4-6周，温度28±1℃。 

3.2愈伤继代 

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养3周，温度28±1℃。 

3.3预培养 

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度28±1℃。 

3.4农杆菌培养 

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)预培养农杆菌2天，温度为28±1℃； 

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，在摇床上以28℃，200rpm的条件培养2-3小时。 

3.5农杆菌侵染 

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内； 

2)调节农杆菌的悬浮液至OD600值为0.3左右； 

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟； 

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。 

3.6愈伤洗涤和选择培养 

1)灭菌水洗涤愈伤7-8次； 

2)浸泡在含400mg/L的羧苄青霉素的灭菌水中30分钟； 

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干； 

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养3次，每次2周。 

3.7分化 

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养7天，温度26±1℃； 

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26±1℃。 

3.8生根 

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26±1℃。 

3.9移栽 

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。 

待移栽的转基因植株生长3周后，利用潮霉素抗性基因的PCR引物Hpt-1F和Hpt-1R(表1)进行转基因植株的PCR阳性筛选，3个表达载体pEUI-amiRNA、pC1300-MIMa和pC1300-MIMb最终分别获得21、24和39个T₀代独立阳性转化植株。 

实施例四转基因保持系eZS97B的表型鉴定 

所有21株T₀代植株转pEUI-amiRNA的阳性植株都种植于盆子中，在自然条件下生长至收种。在转基因水稻的成熟期，我们测量了每株T₀代植株的株高和任意5个穗子的穗颈长并计算平均穗颈长(我们将穗颈长定义为水稻稻穗的基部到叶鞘部位的距离)。野生型ZS97B的平均株高为61.4±3.3cm，平均穗颈长为-3.07±1.3cm(n＝17)，也有一定的包穗现象(表2)。在转基因家系中，不同的T₀代转化植株表现出强弱不同的表型，这可能外源基因插入位置不同而导致的amiRNA的表达强弱不同有关(图8A和8B)。有8个T₀代单株(38％)的平均穗颈长＞＝0cm，意味着这些单株已经解除了包穗症状(表2)。其中，eZS97B-11和eZS97B-20两个转化单株的表型最为明显，其株高分别为86.0cm和91.5cm，平均穗颈长分别为10.0±2.8cm和11.5±2.0cm(表2)。茎环反转录PCR(stem loop reverse transcription PCR，stem-loop RT-PCR)检测表明，eZS97B-11和eZS97B-20两个株系中eui-amiRNA均能有效表达(图8C)。由于eui-amiRNA主要的针对水稻Eui1基因。我们通过定量PCR的技术(quantitative PCR，qRT)检测了eZS97B-11和eZS97B-20两个株系的穗子中的Eui1基因的表达量，结果表明eZS97B-11和eZS97B-20两个株系穗子中Eui1基因的表达量相对于野生型对照分别下降了90％和86％。在T₀代，eZS97B-11的育性好于eZS97B-20，因此eZS97B-11被选择进行进一步的试验。 

表2 T₀代转eui-amiRNA基因保持系ZS97B的表型 

a：n＝17，数据为平均值±标准差。 

b：数据为平均值±标准差。 

实施例五筛选target mimic高表达的转基因MH63家系 

通过农杆菌介导的方法分别获得了24个MH63-MIMa和39个MH63-MIMb T₀代阳性独立转基因单株。由于target mimic为非蛋白编码的(non-protein coding)基因，没有蛋白产物，理论上不影响转基因株性的农艺性状。通过对T₀转基因植株的表型观察，我们未发现导入人工target mimic的转基因明恢63与野生型MH63在外观上有明显的差异。由于转基因过程导致的“体细胞突变”或外源基因插入的“位置效应”，常常会导致转基因植株发生一些表型的改变，但是这些改变在不同的转基因家系中是不一致的。 

我们通过qRT来鉴定target mimic高效表达的转基因家系。我们根据OsIPS1的序列设计了qRT的引物IPS1-F和IPS1-R(表1)。利用qRT，我们检测了所有T₀代MH63-MIMa和MH63-MIMb家系的表达量。由于人工设计的target mimic基因与天然的水稻OsIPS1基因仅替换了24bp的序列，qRT不能区分OsIPS1和target mimic的表达产物，因此检测的表达量是内源OsIPS1基因和人工target mimic基因表达量之和。OsIPS1是一个磷饥饿诱导表达的基因，且其表达主要集中在水稻的根部(Hou et al.2005)。理论上，水稻叶片中内源OsIPS1的表达量要远远低于组成性强启动子玉米Ubiquitin启动子驱动的target mimic的表达量。初步的qRT检测表明，在T₀代转基因植株中有7个MIMa和3个MIMb T₀代转基因植株检测到的mRNA的表达活性有大幅提高，其相对表达量比非转基因对照高出至少3个数量级(图9)。这可能是外源基因插入位点的“位置效应”而导致的外源基因没有有效表达。这个结果表明，如果target mimic基因在转基因植株中高效表达，其内源OsIPS的表达对检测结果的影响可以忽略不计。有4个MIMa和17个MIMb转基因植株中检测出OsIPS1的表达量低于野生型对照的表达量(数据未显示)，这可能是人工target mimic基因与同源性的内源OsIPS1基因产生了“共抑制”而导致的(Napoli 1990)；还有部分家系与对照相比较，表达量的变化不大，或提高幅度较小。根据qRT表达的检测结果和田间农艺性状表现，我们在T₀代MH63-MIMa和MH63-MIMb转基因植株中各挑选出了1个target mimic表达量高且田间农艺性状较好的植株MH63-MIMa-16和MH63-MIMb-6进行下一步的试验。 

实施例六转基因不育系eZS97A抽穗特性的考察 

虽然eui-amiRNA的表达在转基因保持系eZS97B中显著提高了其穗颈长，但是作为不育系的ZS97A包穗症状比保持系ZS97B更为严重，因此eui-miRNA能否彻底解除不育系ZS97A的包穗症状还需要进一步的 试验。我们将T₁代的eZS97B-11植株与野生型ZS97A进行杂交，将eui-amiRNA基因导入到ZS97A中，考察eui-amiRNA能否解除ZS97A的包穗现象。我们将eZS97B-11的T₁代植株的混合花粉与ZS97A进行杂交。由于eZS97B-11 T₁代植株还未纯合，我们通过stem-loop RT-PCR的方法检测其杂交后代中是否有eui-amiRNA的表达，剔除没有eui-amiRNA的阴性杂种。田间考察发现，对照野生型ZS97A的株高是72.9±6.3cm，平均穗颈长为-5.3±2.1cm(n＝49)；而带有eui-amiRNA的eZS97A的平均株高是92.1±11.9cm，平均穗长是6.5±3.4cm(n＝75)。无论是株高还是穗长，相对于野生型ZS97A，转基因的eZS97A均有极显著的增加(图10)。由于平均穗颈长由野生型的-5.3±2.1cm增加到6.5±3.4cm，这表明在不施外源920的条件下，eZS97A可以完全解除包穗症状。一般条件下，水稻恢复系明恢63的株高为95-100cm左右。eZS97A的株高虽然有较大的提高，但仍低于MH63的高度。因此，eZS97A的株高在杂交稻生产中不太会影响杂交种的授粉。 

实施例七转基因杂交组合的农艺性状的考察 

虽然ZS97A有明显的包穗症状，但其与MH63的杂交种汕优63却无包穗现象。利用amiRNA改良不育系的包穗特性，由于amiRNA导致的性状是显性的，理论上eZS97A与普通MH63的杂种也会出现穗颈长变长，株高变高的特性，而这会导致杂交种抗倒伏性能力和其他农艺性状的改变，从而影响其产量。因此，我们在作为父本的MH63中引入target mimic基因，希望在其杂种中通过target mimic来抑制eui-amiRNA的作用，使转基因杂种的株高和穗颈长恢复到与非转基因杂种一致的水平。 

为了验证我们的设计是否成功，我们使用了转基因T₁代的eZS97B-11植株作为母本，与转基因T₁代的MH63-MIMa-16和MH63-MIMb-6进行杂交获得了杂交组合eZS97B/MH63-MIMa和eZS97B/MH63-MIMb。同时我们使用野生型ZS97B和MH63配组杂交组合ZS97B/MH63以及eZS97B-11和野生型MH63配组杂交组合eZS97B/MH63分别作为阴性和阳性对照。 

由于T₁代的转基因亲本其外源基因没有纯合，我们对转基因杂交后代的每一个单株都用stem-loop RT-PCR的方法检测eui-amiRNA是否存在，用qRT的方法检测target mimic是否高效表达。因为我们试验的目的是考察杂交组合中，target mimic是否可以有效抑制eui-amiRNA的效应。因此，我们考察了在eui-amiRNA存在的前提下，有target mimic表达和无target mimic表达两种情况下杂交后代的株高及穗颈长两个表型性状，考察的结果见图11。从图11中可以观察到，target mimic基因高效表达的转基因杂交后代的株高和穗颈长明显低于target mimic基因不表达的转基因杂交后的的株高和穗颈长，即target mimic可以有效抑制amiRNA的作用。 

我们考察了野生型杂交组合ZS97B/MH63，仅有eui-amiRNA基因存在的杂交组合eZS97B/MH63，以及eui-amiRNA和target mimic同时存在的杂交组合eZS97B/MH63-MIMa和eZS97B/MH63-MIMb这四种基因型的杂交组合的平均株高和平均穗颈长。作为阴性对照的野生型杂交组合的株高为125.8±3.7cm，平均穗颈长为2.7±0.8cm(n＝11)；作为阳性对照的杂交组合eZS97B-11/MH63的平均株高为144.5±6.5cm，平均穗颈长为11.3±2.6cm(n＝21)(表3)，显著高于野生型杂种对照。这个结果证实了只有eui-amiRNA存在的情况下，杂交组合的株高和穗颈长均会显著增加，从而降低了杂交组合抗倒伏的能力而影响产量。如果有MIMa存在，转基因杂交组合的平均株高和平均穗颈长分别为129.2±5.6cm和1.8±1.6cm(n＝64)；如果有MIMb存在，转基因杂交组合平均株高和平均穗颈长分别为131.1±6.0cm和2.6±2.1cm(n＝52，表3)，均显著低于仅有eui-amiRNA基因存在的阳性对照。这个结果说明无论是MIMa还是MIMb均可以有 效抑制eui-amiRNA的作用。有eui-amiRNA和target mimic同时存在的转基因杂交组合的平均穗颈长与野生型杂交组合无显著差异；但是，平均株高有增加趋势，其中MIMb的转基因杂交组合显著高于野生型对照(表3)，说明target mimic不能100％有效抑制eui-amiRNA的作用。 

表3转基因不育系和转基因杂交组合的株高及穗颈长 

**表示显著水平小于0.05； 

不同的小写字母代表不同平均值之间存在显著差异(P＜0.05) 

先前的试验表明，amiRNA可以大幅减少Eui1基因的表达水平，为了证实target mimic是否可以抑制amiRNA的作用。我们随机检测了2个eZS97B/MH63-MIMa杂交组合单株和2个eZS97B/MH63-MIMb杂交组合单株穗部的Eui1基因的表达水平。野生型杂交组合ZS97B/MH63和仅含有eui-amiRNA的杂交组合eZS97B/MH63分别作为检测的阴性和阳性对照。结果表明，仅含有eui-amiRNA的eZS97B/MH63单株其Eui1基因的相对表达水平仅为野生型对照的1/10左右；而2个eZS97B/MH63-MIMa单株中的Eui1表达量与野生型对照基本接近，而2个eZS97B/MH63-MIMb单株中的Eui1表达量略有下降，但是远高于阳性对照(图12)。该分子检测结果也证实了target mimic的表达可以抑制amiRNA的作用，从而提高amiRNA目标基因Eui1的表达水平。 

目前生产上已经少量实际应用的采用人工诱变而培育的e-杂交水稻，相对其对应的野生型杂交水稻，株高也有轻微的增加(张红林等，2009)。实际的生产情况表明，轻微增加的株高对e-杂交水稻的产量似乎略有正面效应(张红林等，2009)。通过amiRNA和target mimic构成的双因子系统，我们可以提高水稻不育系的株高和穗颈长，同时基本不影响杂交水稻的株高。虽然与野生型杂交组合相比，株高有轻微增加，但增加程度与人工诱变而培育的e-杂交水稻基本一致。本发明可以使杂交水稻制种过程不再需要使用920，从而也避免了使用920而带来的一系列的弊端。 

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Claims (2)

1.一种减弱人工microRNA干涉eui-1基因功能的target mimic基因MIMb在调控水稻株高和穗颈长性状中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO：5所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征包括如下步骤：

(1)将干涉水稻eui-1基因的microRNA基因构建到pC1300-Ubi-nos载体上，得到重组质粒pEUI-amiRNA，用该重组质粒转化水稻ZS97B，得到转基因材料eZS97B；

(2)将转基因材料eZS97B与水稻材料ZS97A杂交得到长穗颈的水稻材料eZS97A，其保藏号为CCTCCNO P201111；

(3)设计扩增MIMb基因的引物MIMIII、MIMIV、EuiMIMIb和EuiMIMIIb，然后用两轮PCR合成MIMb基因，并将MIMb基因构建到pC1300-Ubi-nos载体上，得到重组质粒pC1300-MIMb，用该重组质粒转化水稻材料MH63，得到转基因水稻材料MH63-MIMb，其保藏号为CCTCC NO P201113；

(4)用长穗颈的水稻材料eZS97A与MH63-MIMb进行杂交，得到株高和穗颈长恢复到野生水平的水稻材料；

其中：步骤(1)所述的microRNA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

步骤(1)所述的重组质粒pC1300-Ubi-nos含有序列表SEQ ID NO：1所示的microRNA基因；

步骤(3)所述的MIMIII、MIMIV、EuiMIMIb和EuiMIMIIb引物序列的核苷酸序列如下所示：

MIM-III CCCTGCCTTCATACGCTATT(5′-3′)；

MIM-IV ATTGCCAAATGTTTGAACGA(5′-3′)；

EuiMIM-Ib atTTGAGAACTAAACCGCACGGGCGCccttagtagaggtaaaagtc(5′-3′)；

EuiMIM-IIb ggGCGCCCGTGCGGTTTAGTTCTCAAattattcggtggatgtctgt(5′-3′)；

其中步骤(3)所述的重组质粒pC1300-Ubi-nos含有序列表SEQ ID NO：5所示的MIMb基因；

其中步骤(3)所述的PCR方法如下所述：

使用引物组合EuiMIMIb+MIMIII和EuiMIMIIb+MIMIV进行第一轮PCR反应，反应体系为：5×phusion HF reaction Buffer 10μl，2μM dNTPs 5μl，50ng/μl MT375质粒2μl，10μM左、右引物各2μl，phusion DNA polymerase 0.5μl，补灭菌超双蒸水至50μl；

反应条件为：98℃ 30s；98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 15s重复循环35次；72℃ 5min。将PCR产物于0.8％琼脂糖胶电泳，挖胶后回收PCR产物，最后溶于30μl elution buffer；用回收的第一轮PCR的两种PCR产物进行第二轮PCR；反应体系为：10x ExTaqE Buffer 5μl，2μM dNTPs 5μl，两种第一轮PCR产物各2μl，10μM的引物MIMIII和MIMIV各2μl，Ex Taq 0.5μl，补灭菌双蒸水至50μl；

反应条件为：94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min重复循环35次；72℃ 5min；最终PCR产物克隆于T载体pGEM-T上，然后测序验证；利用BamH I和Kpn I酶切含有MIMb的T体释放出MIMb基因，并将MIMb克隆于中间载体pC1300-Ubi-Nos上获得最终表达载体pC1300-MIMb。

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