CN114958842A - 一种miRNA-P81及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种miRNA‑P81及其应用。所述miRNA‑P81的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述miRNA‑P81的前体序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明经过研究得到了一种新的miRNA，将其应用于植物中可以有效提高靶向miRNA的表达水平，进而显著影响植物的多种性状，例如水稻株高、分蘖等重要性状。本发明提供的miRNA‑P81能够多物种表达并服务于特定育种需求，解决了应用非编码RNA进行分子设计育种的难题。

Description

一种miRNA-P81及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种miRNA-P81及其应用。
背景技术
miRNA是一类长度为20-24nt的非编码小分子RNA，由较长的初级转录物primiRNA自身折叠，形成具茎环结构的前体pre-miRNA，再经过剪切、甲基化、切割、解旋等过程形成。虽然不编码蛋白质，绝大多数的miRNA基因和蛋白编码基因一样拥有自己的转录结构单元，可通过剪切靶基因的转录产物或抑制蛋白质翻译发挥负调控基因表达的作用；同时，当活性增强子区域或5’UTR区域有miRNA的靶结合位点时，miRNA也能结合并激活靶标增强子或靶基因表达。在生物体内，miRNA通常以不完全匹配的方式与靶mRNA结合，其2-8bp的种子序列在识别中至关重要。靶mRNA上存在用于miRNA识别和结合的miRNA反应元件，主要位于mRNA的3′UTR，但在5′UTR甚至CDS区域也有存在。此外，miRNA在多种植物间具有很高的序列保守性和功能保守性。
分蘖、株高、抗病等作为作物育种目标的关键要素，对其转录后调控因子的发掘具有很大的应用价值。目前，在植物中功能miRNA研究相对较少，促进基因表达的miRNA应用更是鲜见报道，鉴于miRNA功能的高度保守性，迫切需要充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA，这对于多种作物的分子设计育种有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种一种miRNA-P81及其应用。
第一方面，本发明提供一种miRNA-P81，所述miRNA-P81的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明进一步提供一种miRNA-P81的前体，所述miRNA-P81的前体序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明进一步提供一种生物材料，所述生物材料包括所述的miRNA-P81；所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
本发明进一步提供所述的miRNA-P81或所述的miRNA-P81的前体或所述的生物材料在促进靶向mRNA表达中的应用。
进一步地，所述靶向mRNA包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，如SEQ IDNO.3所示的自5’末端起第14位至3’末端第33位的核苷酸序列。
本发明进一步提供所述的miRNA-P81或所述的miRNA-P81的前体或所述的生物材料在调控植物性状中的应用。
本发明进一步提供所述的miRNA-P81或所述的miRNA-P81的前体或所述的生物材料在提高植物节间长、株高、穗长或单穗粒重中的应用。
第二方面，本发明提供一种促进靶向mRNA表达的方法，包括：在包括所述靶向mRNA的植物中过表达miRNA-P81；所述miRNA-P81的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，通过将包括所述miRNA-P81的载体转导至所述植物中，以过表达所述miRNA-P81。
进一步地，所述mRNA包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，如SEQ ID NO.3所示的自5’末端起第14位至3’末端第33位的核苷酸序列。
进一步地，所述植物包括拟南芥、水稻、大麦或小麦中的一种或多种。
本发明具备如下有益效果：
本发明基于高通量测序结果，结合生物信息学分析、RT-qPCR、Dual-LuciferaseReporter Assay等多种生物学手段，从转录组水平鉴定到来自大麦的一个全新miRNA-P81，并对其靶mRNA进行验证。这为大麦、水稻等作物的育种(如提高抗性、调控株高)提供了宝贵的基因资源，带来一定的研究价值和社会效益，并可以最终用于实际生产中。本发明提供的miRNA-P81可能广泛参与大麦、水稻等多物种的多种生命活动调节过程，具有重要的生物学意义和潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的小RNA测序数据中分离和鉴定新miRNA的流程图。
图2为本发明实施例1提供的miRNA-P81的前体二级结构图；茎环所在部分即成熟miRNA序列所在的位置。
图3为本发明实施例1提供的miRNA-P81在Bowman和GSHO1990各时期readscount值，值越高表明miRNA-P81表达水平可能更高。
图4为本发明实施例2提供的烟草双荧光素酶报告基因系统验证miRNA-P81促进靶mRNA表达的成像结果；其中T9是靶mRNA的简写。
图5为本发明实施例2提供的烟草双荧光素酶报告基因系统验证miRNA-P81促进靶mRNA表达的酶活测定结果；其中T9是靶mRNA的简写。
图6为本发明实施例3提供的miRNA-P81过表达纯合阳性株系表型统计结果，包含株高、穗长和单穗粒重；其中line1-4为4个过表达纯合阳性水稻株系，WT为TB309。
图7为本发明实施例3提供的miRNA-P81过表达纯合阳性株系与野生型TB309表型图；其中图左为miRNA-P81过表达纯合阳性株系的株高和节间长；图右为野生型TB309的株高和节间长。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所涉及的实验方法，若无特殊说明，均为本领域常规方法。
以下实施例中所涉及的试剂耗材和仪器等，若无特殊说明，均为可市售购得的产品。
以下实施例中的定量试验、酶活测定实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1miRNA-P81鉴定及定量分析
1、大麦样品采集
大麦于10月下旬种植于田间，各播种20行，于二叶期、二叶一心期、三叶一心期、四叶一心期和五叶一心期对分蘖节部位进行取样，迅速冻存于液氮，保存于-80℃备用。
2、大麦miRNA-P81的发现
2.1提取分蘖节总RNA
采用Trziol的方法提取大麦分蘖节部位总RNA；具体步骤如下：
(1)将-80℃冻存的大麦分蘖节直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，加少量液氮，再研磨，如此三次，将研磨粉末转入离心管中，加入1ml Trizol，剧烈震荡15s后室温静置5min；
(2)加入200μl氯仿，剧烈震荡15s后室温静置2-3min，4℃，12000r/min离心10min，收集上层水相，该步骤重复两次；
(3)加入500μl异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，4℃，12000r/min离心10min，弃上清；
(4)所得沉淀加入75％的无RNase乙醇温和震荡洗涤，4℃，7500r/min离心5min，室温晾干10min后加入RNase-Free水溶解；
(5)通过琼脂糖电泳并结合核酸蛋白仪检测RNA样品浓度和纯度。
2.2小RNA建库及测序
针对质检合格的分蘖节总RNA，进行小RNA建库和测序。采用5个不同时期的大麦野生型和突变体分蘖节样品所提取的RNA，分别投入1μg，构建多个小RNA文库。小RNA文库的构建按照Illumina Sample Preparation Protocol文库构建方法进行，构建好的文库采用Hiseq2500高通量测序(杭州联川生物)，获得高质量的18-30nt的小RNA序列。
2.3生物信息学分析获得miRNA-P81
采用公认的miRNA鉴定流程，结合杭州联川生物公司自主研发的软件ACGT101-miR进行miRNA的数据分析：①首先是将非纯序列清理过后，进行长度筛选(植物的保留长度为18-25nt)，再将所有的序列用以比对各种数据库将mRNA等筛除，②将留下的序列通过Bowtie比对到miRBase21.0中特定物种的前体上，鉴定该物种已知的miRNA，同时发现全新的5p-或者3p-miRNA序列。③利用合适的差异检验方法进行数据的差异表达分析，如利用Fisher精确检验、卡方(2*2)、卡方(N*N)、T检验以及ANOVA、EdgR等算法再筛选出表达差异显著的miRNA。具体鉴定和筛选流程如图1所示。
结果鉴定到1个新的miRNA，将其命名为miRNA-P81，miRNA-P81的序列如下(5’→3’)：
GCUUUUCUGAGCUGAGCUAAU(SEQ ID NO.1)
miRNA前体(pre-miRNA)序列的二级茎环结构是miRNA基因最显著的特点之一，也是所有miRNA鉴定方法都不可逾越的重要规则。miRNA-P81前体(pre-P81)序列如下(5’→3’)：
AGGAAAUAGUUUGCUAGCUUUUCUGAGCUGAGCUAAUAGCCGGCGAGUCACGGGCGAUCGGGCGGCUGUCGAUGUCGUUGAGGCGGUGACGGGCGUCGACGGCUGCCCGGAUGGCCAGAGCCUCGUCAGCUAGCAGCUCAGCUCGAAAAAGCUACCAAAUUAUUUUCU(SEQ ID NO.2)
pre-P81能形成良好的茎环结构，成熟的miRNA从miRNA前体的茎环部产生，完全符合miRNA前体的结构特征(见图2)。
miRNA-P81在Bowman和GSHO1990各时期测序readscount值如图3所示，表明miRNA-P81很可能参与影响大麦分蘖性状。
3、miRNA-P81定量分析
3.1miRNA-P81茎环法引物设计
miRNA定量RT-PCR引物参照Varkonyi-Gasic的描述设计：具有茎环结构的引物，产生空间位阻有效避免引物与miRNA前体结合，从而保证成熟miRNA的特异扩增。具体引物设计需遵循以下原则：
1)用于反转录步骤中特异的茎环结构RT引物，一般是在一段能形成茎环结构的序列后加上mi RNA 3′端6-8个碱基的反向互补序列，茎环序列多是固定的；
2)PCR反应时的正向引物设计，基本与miRNA序列相同，但要去掉3′端与RT引物反向互补的6个碱基，同时可在miRNA 3′端再减少1～2个碱基，维持miRNA的特异性扩增。在该序列5′端加几个碱基(G或C)，用来平衡引物中的GC含量，稳定Tm值。
3)反向引物一般是根据茎环序列设计的，可固定不变。茎环引物能结合到miRNA的3′端开始进行反转录，随后通过miRNA特异的正向引物和通用反向引物进行扩增。
该实施例中miRNA-P81的特异茎环反转录引物序列，如下所示(5’→3’)(SEQ IDNO.4):
P81-RT:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCATTAGCTC
3.2将总RNA逆转录成cDNA并特异反转录P81成熟序列
按照逆转录试剂盒(Takara公司)操作说明书在PCR管中加入模板RNA，随机逆转录引物和miRNA-P81特异茎环反转录引物等，总量20μL。
(1)总RNA去除DNA。
反应体系如下：
表1去除DNA反应体系
5xgDNA eraser Buffer 2μL
gDNA eraser 1μL
Total RNA 1μg
RNase free water Up to 10μL
反应条件：42℃2min，4℃forever。
(2)第二步是反转录反应，反应体系：
表2反转录反应体系
Figure BDA0003563904410000071
反应条件：37℃30min；85℃5s，4℃forever。
3.3荧光定量检测miRNA-P81表达量
按照荧光定量试剂盒(Takara公司)，具体反应体系如下：
表3荧光定量PCR反应体系
2×PCR MIX 5μL
F(10mM) 0.5μL
R(10mM) 0.5μL
cDNA 1μL
灭菌水 3μL
总体积 10μL
其中，荧光定量PCR反应条件为：95℃；3min；95℃2s，60℃2s，此步骤收集荧光信号，41个循环，然后进行溶解曲线分析，温度60-95℃，收集荧光信号。内参引物选用U6，引物序列如下(SEQ ID NO.5-6)：
U6-F:GTTCCTCTGGGGGCATCTGGTTA；
U6-R:ATTTATGCGTATCATCCCTGTGC。
荧光定量结果显示，miRNA-P81从二叶期到五叶一心期，在野生型大麦Bowman中的表达水平均显著高于寡分蘖突变体GSHO1990，与测序数据readscount基本一致。
3.4miRNA-P81靶基因预测
利用psRobot生物信息学软件在ensembl plants的大麦、水稻数据库中，寻找到能与miRNA序列近乎完全互补的cDNA或基因，即为miRNA的靶标。靶标的功能通过uniprot蛋白数据库(https://www.uniprot.org/uniprot/)直接检索或进行同源性检索，以同源性最高的已知功能基因进行注释。其中，miRNA-P81的水稻靶基因Os07g0569100(序列见SEQ IDNO.3)，位于BZIP23下游脱落酸(ABA)信号通路中，对油菜素内酯(BR)信号转导起拮抗和负调控作用，其过表达株系在株高、叶色、抗病性上均有显著变化，是重要的水稻性状调控基因，其大麦靶向基因暂无功能注释。
实施例2双荧光素酶报告系统验证miRNA-P81促进靶mRNA
1、miRNA-P81表达载体构建
本发明将包含miRNA-P81前体序列pre-P81在内的基因组上下游约300bp序列，构建在表达载体pCambia1301上，选择酶切位点NCOⅠ和BGIⅡ，采取同源重组法，扩增引物如下(5’→3’)(SEQ ID NO.7-8)：
P81-F:CGGGGGACTCTTGACCATGGCTTGTTAACCACACCACCTTCTCTT；
P81-R:TAGAAATTTACCCTCAGATCTCGGTTACCCAGGGGCCCT。
2、miRNA-P81靶mRNA表达载体构建
本发明首先用同源重组法对pGreenII 0800-LUC载体进行改造，在Luciferase基因前加入35S CaMV强启动子。将miRNA-P81与靶mRNA直接靶向的互作位点(即SEQ ID NO.3自5’末端第14位核苷酸至3’末端第33位核苷酸)序列构建在改造后质粒的Luciferase基因的5’UTR区域。选择酶切位点KpnⅠ切开，上下游引物直接变性复性合成带同源臂双链，采用同源重组法完成载体构建，引物如下(5’→3’)(SEQ ID NO.9-10)：
T9-5UTR-F:GGACAGCCCAAGCTCACAGCTCAGCTCGGAGAAGCCCATGGAAGACGCCAAAAACA
T9-5UTR-R:TGTTTTTGGCGTCTTCCATGGGCTTCTCCGAGCTGAGCTGTGAGCTTGGGCTGTCC。
3、miRNA-P81和靶mRNA载体共注射烟草
本发明将构建成功的miRNA-P81和靶mRNA表达载体分别转入农杆菌感受态GV3101:pSoup中，利用K++Rif抗性的液体LB培养基进行农杆菌摇菌，至OD值约为1.0取出,；3900rpm/10min集菌。制备MMA注射液(常规配方；每10ml注射液含：500μL 0.2M MES,10μL100mM AS,33.3μL 1.5M MgCl2,ddH2O补足10μL)，对农杆菌进行重悬。将miRNA-P81、靶mRNA以及所有对照组的农杆菌菌液OD调整为0.8。按miRNA-P81+靶mRNA、P1301空载+靶mRNA、miRNA-P81+0800空载和P1301空载+0800空载的四个组合，共注射在一片烟草的下表皮，注射3-4片作为生物学重复。
4、成像分析和酶活测定验证miRNA-P81促进靶mRNA表达
注射36h后，对烟草叶片进行底物涂抹和成像观察，并用诺唯赞的DL101-01试剂盒进行样品制备和酶活测定。成像结果如图4所示，miRNA-P81+靶mRNA比P1301空载+靶mRNA累积了更多的荧光信号，表明miRNA-P81对靶mRNA存在促进作用。
本发明通过酶活测定进一步量化了促进水平。通过读值比Luciferase/Renilla,miRNA-P81+靶mRNA比P1301空载+靶mRNA高近三倍，说明miRNA-P81对靶mRNA存在较强促进作用。
当本发明将该20个核苷酸的靶位点序列中，从5’末端起第13位和第16位均由G突变成A后，阻碍了miRNA-P81与靶mRNA的结合。酶活测定发现，促进作用消失。该实例互补验证了，miRNA-P81通过与靶mRNA的5’UTR区域结合，促进了靶mRNA表达，从而进一步影响表型。上述酶活结果如图5所示。
实施例3过表达miRNA-P81提高水稻株高及抗性
1、miRNA-P81过表达载体构建
将含miRNA-P81成熟序列(SEQ ID NO.1)且包含其基因组上下游约300bp所组成的前体序列(SEQ ID NO.2)，构建到PCAMBIA1301表达载体上。
将上述过表达载体送往公司，进行水稻遗传转化，受体为TB309，公司返回T0代幼苗。
2、SDS法提取转基因植株DNA
用SDS法按株系编号提取转基因植株叶片的基因组DNA，提取野生型叶片为对照组。基因组DNA提取采用改良SDS法，具体如下：
①分别将样品装入2.0ml离心管中，立即用液氮冷冻后存放于-80℃超低温冰箱；65℃提前提前加热SDS提取液；
②在磨样仪上将材料磨成粉末，用移液枪吸700ul提前预热好的SDS提取液，剧烈摇晃，使提取液充分混合样品，在65℃水浴锅中反应30min，每隔5min翻动一下；
③将处理好的混合液置于冰上或者冰箱中10min使冷却；
④在冷却后的混合液中加入350μl冷冻的6M醋酸铵，-20℃放置20min；
⑤充分摇晃混匀，4℃，10000r/min离心15min；
⑥用移液枪吸500-600μl上清液到干净的离心管中，避免吸取到底部的沉淀造成杂质干扰；加入同体积的异丙醇轻轻摇晃混匀，-20℃冷冻30min以上；
⑦室温条件下，10000r/min离心10min，丢弃废液，小心不要倒出管底的DNA；
⑧加入100μl预冷的-70℃酒精，洗涤杂质，室温条件下10000r/min离心5min，丢弃废液，重复此操作2次；
⑨干燥DNA，使酒精完全挥发，加入100μl灭菌水充分溶解；
⑩用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带。
3、潮霉素和特异引物阳性检测
公司返回水稻T0代幼苗，经潮霉素引物和miRNA-P81特异引物检测，成功获得阳性转化事件。经温室加代和多代阳性鉴定，最终获得4个T3代稳定纯合阳性株系。
其中，潮霉素检测引物序列为(SEQ ID NO.11-12)：
Hyg-F：ATCCGGTCGGCATCTACTCT；
Hyg-R：TCTCGAGCTTTCGCAGATCC。
其中，miRNA-P81特异引物序列为(SEQ ID NO.13-14)：
P81-F：GATGTCGTTGAGGCGGTGAC；
P81-R：TAGCTGCATTTCCGGCTTTC。
对野生型TB309和miRNA-P81过表达纯合阳性株系进行表型观察、图片采集和性状统计(如图6和图7)。结果表明：过表达miRNA-P81，水稻各纯合阳性株系节间极显著伸长，株高极显著提高，部分株系穗长极显著增长，单穗粒重极显著提升。因此，miRNA-P81具有重要的生物学功能和育种价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种miRNA-P81及其应用
<130> KHP221111995.1
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcuuuucuga gcugagcuaa u 21
<210> 2
<211> 168
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aggaaauagu uugcuagcuu uucugagcug agcuaauagc cggcgaguca cgggcgaucg 60
ggcggcuguc gaugucguug aggcggugac gggcgucgac ggcugcccgg auggccagag 120
ccucgucagc uagcagcuca gcucgaaaaa gcuaccaaau uauuuucu 168
<210> 3
<211> 1622
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
accactcacc accacagctc agctcggaga agcgaagagg aggaagaaga gcaagacgcc 60
gatggttacg cgtgtgtgct agtggctgag cactagcggc ggcggcggcg gcgacggcga 120
cgacgacctc acccacggcg gcgacacatg ttgagtgaac aaacggcggc tagtggtagc 180
agcagcagca gccgcggcgc cgacgaccgg gagattgtca tcagcaccgg ccgggagatc 240
gtcgtcagaa gcagcggggg tgaggagagg gaggaggagg tggtggtgga ggaggagctc 300
gaggagccgg agttcaggga catccacgcg ctgagcccgc cgccgacgcc gacgccgagc 360
cagccgtcgt cgtcgtacca ccggcggagg agggagtcgt gggagtccgc ggcggggagc 420
aggcacacgt cgatccgctc cgtggggagc gacaccgccc caagtgagct cttccctact 480
atgagcaggg agttctcggc catggtcgcc gcagcagcca acgccaacgc cgccgccgcc 540
gcagccgcga acggcggcga ctccagccgc gccggggtgg acgacgcgct ggggaggatc 600
ggggaggatg agctcgagga gacgaacccg ctcgccatcg tcccggacag caaccccatc 660
ccgtcccctc gccgcgccca cctcgcgctc cccgcccccg gcgacgtgtc gtcggcgggc 720
ggcggccacg gcgacgaggt gtcggtgggg caggtgaaga aggaggaggt ggagtccaag 780
atcgccgcgt ggcagatcgc cgaggtcgcc aaggtcaaca accgcttcaa gcgcgaggag 840
gtcgtcatca atggctggga gggcgaccag gtcgagaagg ccaacgcctg gctcaagaag 900
tacgaggtaa aacaagaaac caaaacgaaa tccatcatct aatcgccatt gatttctacc 960
aatcgagctc tggattctga tggaattggg ggtgtgttgc agaggaagct ggaggagaag 1020
agggccaagg cgatggagaa ggcgcagaac gaggtggcga aggcgcggcg gaaggcggag 1080
gagaagcggg cgtcggcgga ggcgaagagg ggcaccaagg tggcgcgcgt gctggagctc 1140
gccaacttca tgagggccgt ggggagggcg ccatccaagc gctccttctt ctgagcgacc 1200
gcgccaccct cttcccctcc tcctcctcct ctctgctttg ctcgccgccg tcgccgtcgt 1260
cgtcgtcgcc ggcgccggcg gctgatcgtt caccgcttcg cttcacacgc agggatcagt 1320
gctgtgatgt ggttgctgtg tggaactctc gttttagtgt tgtatccaca tgtatgatgt 1380
actgtcatca tatcctctct tttttttctt tttttcttgt tctctttact ttcttgtgct 1440
tgataagggt attgcaaagt tgggagggac agacagaaca agtaaatagc ataagttgga 1500
tggtgctctg ccccttatag cttatggtga gggggacaag agctgcctgt aatttgtttt 1560
ttgtcatcat caaggattgt gtatgtcaat atgaacaaga tatggagcta cctgttttgt 1620
gt 1622
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcatt agctc 45
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gttcctctgg gggcatctgg tta 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atttatgcgt atcatccctg tgc 23
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cgggggactc ttgaccatgg cttgttaacc acaccacctt ctctt 45
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tagaaattta ccctcagatc tcggttaccc aggggccct 39
<210> 9
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggacagccca agctcacagc tcagctcgga gaagcccatg gaagacgcca aaaaca 56
<210> 10
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tgtttttggc gtcttccatg ggcttctccg agctgagctg tgagcttggg ctgtcc 56
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atccggtcgg catctactct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tctcgagctt tcgcagatcc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gatgtcgttg aggcggtgac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tagctgcatt tccggctttc 20

Claims (10)

1.一种miRNA-P81，其特征在于，所述miRNA-P81的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种miRNA-P81的前体，其特征在于，所述miRNA-P81的前体序列的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求1所述的miRNA-P81；所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
4.权利要求1所述的miRNA-P81或权利要求2所述的miRNA-P81的前体或权利要求3所述的生物材料在促进靶向mRNA表达中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶向mRNA包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，如SEQ ID NO.3所示的自5’末端起第14位至3’末端第33位的核苷酸序列。
6.权利要求1所述的miRNA-P81或权利要求2所述的miRNA-P81的前体或权利要求3所述的生物材料在调控植物性状中的应用。
7.权利要求1所述的miRNA-P81或权利要求2所述的miRNA-P81的前体或权利要求3所述的生物材料在提高植物节间长、株高、穗长或单穗粒重中的应用。
8.一种促进靶向mRNA表达的方法，其特征在于，包括：在包括所述靶向mRNA的植物中过表达miRNA-P81；所述miRNA-P81的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.根据权利要求8所述方法，通过将包括所述miRNA-P81的载体转导至所述植物中，以过表达所述miRNA-P81。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述mRNA包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，如SEQ ID NO.3所示的自5’末端起第14位至3’末端第33位的核苷酸序列。
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