KR101363412B1 - 고추로부터 분리된 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３９６ 분자의 새로운 표적 유전자인 ＤＲＭ 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도 - Google Patents

고추로부터 분리된 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３９６ 분자의 새로운 표적 유전자인 ＤＲＭ 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101363412B1
KR101363412B1 KR1020120111460A KR20120111460A KR101363412B1 KR 101363412 B1 KR101363412 B1 KR 101363412B1 KR 1020120111460 A KR1020120111460 A KR 1020120111460A KR 20120111460 A KR20120111460 A KR 20120111460A KR 101363412 B1 KR101363412 B1 KR 101363412B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
microrna
drm
methyltransferase
present
Prior art date
Application number
KR1020120111460A
Other languages
English (en)
Inventor
신찬석
박준현
황동규
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020120111460A priority Critical patent/KR101363412B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101363412B1 publication Critical patent/KR101363412B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01037—DNA (cytosine-5-)-methyltransferase (2.1.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열; 또는 상기 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진, 고추로부터 분리된 microRNA-396 분자, 상기 microRNA-396 분자를 포함하는 벡터, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 microRNA-396 분자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질의 활성을 조절하는 방법을 제공함으로써, 본 발명을 통해 식물의 후생유전에 크게 관여하는 유전자인 DRM 메틸전달효소가 고추 microRNA-396에 의해 조절되는 양상이 토마토를 비롯한 가지과 내에서 보존되어 있다는 사실을 토대로 식물의 개화, 종자발달 및 후성학적 현상과 관련된 모든 현상을 조절할 수 있는 방법에 기초하여 식량, 사료, 화훼, 원예, 에너지 작물 등의 형질개선을 위한 농생명공학에 적용될 수 있고 후성학적 정보의 기능이 주로 관여되어 있는 암세포 및 신경세포 분화 등 다양한 의학적 적용 가능성을 갖고 있어, 다방면에서 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

고추로부터 분리된 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３９６ 분자의 새로운 표적 유전자인 ＤＲＭ 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도{DRM　methyltransferase, a novel target gene of microRNA-396 molecules isolated from Capsicum annuum and uses thereof}
본 발명은 고추로부터 분리된 microRNA-396 분자의 새로운 표적 유전자인 DRM 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 또는 2의 염기서열; 또는 상기 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진, 고추로부터 분리된 microRNA-396 분자, 상기 microRNA-396 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 microRNA-396 분자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질의 활성을 조절하는 방법 및 식물체 내의 DRM 단백질의 활성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물체 내의 DRM 단백질의 활성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 DRM 단백질 활성 조절용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 microRNA는 전사 후 수준(post-transcriptional level)에서 유전자의 발현을 조절하는 단백질을 암호화하지 않는 작은 조각의 RNA이다. 성숙한 microRNA (mature microRNA)는 통상적으로 18~24개의 뉴클레오타이드의 길이로 구성되어 있으며 식물과 동물에 걸쳐 광범위하고 다양하게 분포한다. 식물에서 microRNA가 생성되는 과정은 RNA 중합효소 II에 의해 시작되는데 성숙 microRNA를 포함하는 primary microRNA가 중합효소에 의해 전사되고 나면 RNase III 타입의 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의해 microRNA 전구체를 거쳐 microRNA 듀플렉스가 생성된다. 핵 내에서 완성된 microRNA 듀플렉스는 세포질로 수송되어 이후 ARGONAUT 단백질을 포함하는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하고 한 가닥의 성숙 microRNA가 선택된다. 이들 복합체는 표적 유전자의 상보적인 부위에 결합하여 mRNA를 자르거나, 번역을 방해하는 두 가지 방식으로 표적 유전자의 발현을 억제한다.
지금까지 식물 microRNA가 식물의 성장과 발달에 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되어 왔고 다양한 생물학적 기능을 수행한다는 것이 실험적으로 증명되어 중요성이 대두되었다. 그에 따라 여러 모델 식물의 microRNA 발굴이 이루어지고 있는 반면, 고추의 microRNA에 대한 연구는 컴퓨터와 기존 데이터베이스를 활용한 간접적 발굴방식 (in silico approach)에 국한되어 있어 양적 질적으로 미흡한 편이다. 본 발명에서는 초고속 유전자 서열분석(high-throughput sequencing) 기술과 현재 진행 중인 고추 게놈 시퀀싱 프로젝트의 정보를 접목시켜 효율적으로 대량의 microRNA를 발굴하였다. 진행 중인 고추 유전체의 서열 정보를 활용하여 microRNA 표적 유전자를 예측하였고, 그 중에 기존에 없었던 새로운 표적 유전자인 DRM 메틸전달효소 (DRM methyltransferase)를 찾아내었다. MicroRNA가 표적 유전자를 조절하는 두 가지 방식 중 식물의 경우는 주로 mRNA 절단 메커니즘이 사용되는데 이러한 사실을 기반으로 컴퓨터를 이용하여 예측한 표적 유전자들이 실제로 절단되는지 실험적으로 확인하였다. 타겟 mRNA의 잘린 조각들 (cleavage fragments)을 증폭시켜 확인하는 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA ends) 실험을 통해 표적 유전자가 microRNA에 의해 실제로 조절되는지 확인했으며, 그 중에서 기존에 없었던 새로운 타겟인 DRM 메틸전달효소가 발견되었고 microRNA-396에 의해 조절된다는 것이 증명되었다.
DRM 메틸전달효소는 포유류에 존재하는 DNMT3라는 메틸전달효소의 오솔로그(ortholog)이며 이들은 DNA의 메틸화 초기 양상을 결정짓는 드 노보 메틸전달효소(de novo methyltransferae)이다. 이러한 DNA 메틸화는 고등 진핵생물에서 잘 보존되어 있는 후성학적 메커니즘 (epigenetic mechanism)으로서, 메틸화 양상과 정도에 따라 염색체의 응축과 풀림이 조절되며 전반적인 유전자 발현 수준을 조절하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. MicroRNA에 의한 DNA 메틸화 조절은 식물의 유전자 조절이 RNA 간섭 (RNAi)과 히스톤 메틸화 및 DNA 메틸화의 상호 교류작용을 통해 한층 더 복잡한 그림을 제공할 것이라는 것을 시사한다. 또한 식물에서는 heterochromatic siRNA (small interfering RNA)에 의한 RdDM(RNA-directed DNA methylation) 경로가 존재하여 유전자 발현을 전사 수준에서 조절한다. RdDM 또한 이질 염색체 (heterochromatin)와 진정 염색체 (euchromatin) 사이의 전환을 조절하여 염색체의 응축을 조절하는 경로인데 이 유전자 조절 경로에 반드시 필요한 효소 중 하나가 DRM 메틸전달효소이다. 아울러 RdDM은 전이인자 (transposon) 또는 작은 반복적인 DNA 조각 (repetitive DNA elements)의 활동을 억제하여 유전체의 안정성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 결국 MicroRNA에 의한 DRM 메틸전달효소의 조절은 RdDM 경로에도 관여하여 DNA 메틸화 양상뿐만 아니라 다양한 전이인자와 반복적인 DNA 조각들의 활동을 억제하여 유전체의 안정성에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다.
한편, 한국공개특허 제2012-0092542호에서는 배추에서 분리된 신규 miRNA가 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0860087호에는 인간 배아줄기세포에서 분리된 miRNA가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 고추로부터 분리된 microRNA-396 분자의 새로운 표적 유전자인 DRM 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 식물의 후생유전에 크게 관여하는 유전자인 DRM(domain rearranged methyltransferase) 메틸전달효소가 고추 microRNA-396에 의해 조절되며, 이러한 양상이 토마토를 비롯한 가지과 내에서 보존되어 있다는 사실을 밝혔다. 이러한 사실을 바탕으로 추후 microRNA-396 또는 DRM 메틸전달효소 유전자 형질전환체를 제작하여 고추 식물체의 후생 유전학적 기능을 규명할 수 있는 단서를 제시할 수 있을 것으로 예측되며, 고추 형질 개선에 응용될 가능성이 높을 것으로 예상됨으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열; 또는 상기 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진, 고추(Capsicum annuum)로부터 분리된 microRNA-396 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 microRNA-396 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 microRNA-396 분자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물체 내의 DRM 단백질의 활성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물체 내의 DRM 단백질의 활성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 DRM 단백질 활성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명은 기존에 보고되지 않은 고추 microRNA-396에 의한 새로운 표적 유전자를 밝혀냄으로써 현재 약 50여 종에 이르는 식물에서 진행되어온 microRNA와 그 표적 유전자에 대한 추가적인 데이터베이스를 제공한다. 또한 전이인자의 활동을 억제하여 유전체의 안정성을 확보하는 RdDM 경로에는 DRM 메틸전달효소가 필요한데, 이러한 경로에 관여한다는 것을 밝혀냄으로써 거대한 고추 유전체의 진화에 대한 실마리를 제공하고 복잡한 유전자 조절 경로에 대한 이해를 돕는다. 또한, 본 발명은 식물의 후생유전에 크게 관여하는 유전자인 DRM 메틸전달효소가 고추 microRNA-396에 의해 조절되는 양상이 토마토를 비롯한 가지과 내에서 보존되어 있다는 사실을 밝힌 것이다. 이를 통해, 본 발명은 식물의 개화, 종자발달 및 후성학적 현상과 관련된 모든 현상을 조절할 수 있는 방법에 기초하여 식량, 사료, 화훼, 원예, 에너지 작물 등의 형질개선을 위한 농생명공학에 적용될 수 있고 후성학적 정보의 기능이 주로 관여되어 있는 암세포 및 신경세포 분화 등 다양한 의학적 적용 가능성을 갖고 있어, 다방면에서 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 고추 DRM 메틸전달효소 유전자의 아미노산 서열 및 다른 식물체와의 보존 관계를 나타낸다 (Ca, 고추; AT, 애기장대; Solyc, 토마토; PGSC, 감자; Os, 벼).
도 2는 고추 DRM 메틸전달효소를 포함한 다양한 식물 DRM 메틸전달효소 간의 유연 관계를 나타낸다.
도 3은 MicroRNA-396에 의한 DRM 메틸전달효소의 발현 조절을 보여준다. 고추에 존재하는 서로 다른 3개의 DRM 메틸전달효소 표적 유전자에 대한 5'-RACE 실험을 진행하였고, 모두 똑같은 도메인에서 microRNA에 의한 조절을 받는 것으로 보인다. 화살표는 microRNA에 의해 잘린 위치를 나타낸다.
도 4는 고추를 포함한 다양한 식물체 내에서 microRNA-396의 보존 관계 및 발현량 분석을 나타낸다 (can-miR, Capsicum annuum 고추; ath-miR, Arabidopsis thaliana 애기장대; osa-miR, Oryza sativa 벼; gma-miR, Glycine max 콩; sly-miR, Solanum lycopersicum 토마토; stu-miR, Solanum tuberosum 감자). 노던 블럿 분석에서 U6 snRNA는 로딩 대조구로 사용되었다.
도 5는 가지과 식물에서의 microRNA-396의 표적 유전자 예측을 통해 토마토, 감자 및 담배에서 microRNA-396에 의한 DRM 메틸전달효소 조절 가능성을 보여준다.
도 6은 토마토 microRNA-396에 의한 DRM 메틸전달효소 발현 조절을 보여준다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열; 또는 상기 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진, 고추(Capsicum annuum)로부터 분리된 microRNA-396 분자를 제공한다.
본 발명에서는 고추(Capsicum annuum)로부터 microRNA-396 분자를 분리하였다. 본 발명에 따른 microRNA-396는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산 분자도 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. microRNA-396 분자는 주로 단일 가닥 분자인 반면, pre-miRNAs는 주로 이중 가닥 부분을 형성할 수 있는 적어도 부분적으로 자가-상보적인 분자(예: 스템- 및 루프- 구조)이다.
또한 본 발명의 핵산 분자는 RNA, DNA, 당- 또는 골격-변형 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드와 같은 핵산 유사체 분자(analog molecules)일 수 있다. 또한 PNA(peptide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acids)와 같은 다른 핵산 유사체 분자일 수도 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 핵산 분자는 적어도 하나의 변형된 핵산 유사체를 포함하는, 즉 자연적으로 생성되는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드가 비자연적으로 생성되는 뉴클레오티드로 변형된 RNA- 또는 DNA 분자일 수 있다. 상기 변형된 핵산 유사체는 예컨대 핵산 분자의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 위치할 수 있다.
바람직한 핵산 유사체는 당- 또는 골격-변형 리보뉴클레오티드이다. 또한 뉴클레오베이스(nucleobase)-변형 리보뉴클레오티드, 즉 다음과 같은 자연적으로 발생하는 뉴클레오베이스 대신 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오베이스를 포함하는 리보뉴클레오티드가 적합하다고 보고되었다: 예를 들면, 5' 위치에 변형된 우리딘 또는 시티딘(예: 5-(2-,아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘); 8-위치에 변형된 아데노신 및 구아노신(예:8-브로모 구아노신); 데아자(deaza) 뉴클레오티드(예: 7-데아자-아데노신); 및 O- and N-알킬화(O- and N-alkylated) 뉴클레오티드(예: N6-메틸 아데노신). 바람직한 당-변형 리보뉴클레오티드에서 2'-OH 그룹은 H, OR, R, 할로(halo), SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN(여기서, R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고 할로는 F, Cl, Br 또는 I임)으로 이루어진 군에서 선택되는 그룹에 의해 치환될 수 있다. 바람직한 골격-변형 리보뉴클레오티드에서 인접한 리보뉴클레오티드에 연결되어 있는 포스포에스터 그룹은 변형된 그룹, 예컨대, 포스포티오에이트 그룹으로 치환될 수 있다. 또한, 상기 기재된 변형이 조합될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 microRNA-396 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 microRNA-396 분자는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 벡터 내에 삽입될 수 있다. 상기에서 발현은 전사 또는 위에 기재한 바와 같은 microRNA-396 분자 또는 microRNA-396 전구체 분자를 야기하는 임의적인 부가 프로세싱을 말한다. 상기 벡터는 바람직하게는 DNA 벡터, 예컨대, 바이러스성 벡터 또는 플라스미드일 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 microRNA-396 분자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
microRNA-396 분자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 microRNA-396 분자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질의 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 상기 microRNA-396 분자를 식물체에서 과발현시킴으로써 microRNA-396 분자의 타겟인 DRM(domain rearranged methyltransferase) 유전자를 절단하여 DRM 단백질의 발현을 억제시켜 DRM 단백질의 활성을 억제할 수 있다. 또한, microRNA-396 분자가 표적하는 부분의 DRM 메틸전달효소의 염기서열이 변이된 유전자를 과발현시킴으로써 microRNA-396의 조절에 저항성을 나타내는 형질전환체를 제작할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질 활성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물체 내의 DRM 단백질의 활성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 바람직하게는 쌍자엽 또는 단자엽 식물일 수 있고, 쌍자엽 식물로는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 알팔파, 강낭콩 또는 완두일 수 있고, 단자엽 식물로는 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스 또는 오차드그래스 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 식물은 더욱 바람직하게는 토마토, 감자, 담배, 가지, 고추속(파프리카, 고추) 등과 같은 가지과 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열; 또는 상기 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진, 고추(Capsicum annuum)로부터 분리된 microRNA-396 분자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질 활성 조절용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1 또는 2의 염기서열; 또는 상기 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진, 고추로부터 분리된 microRNA-396 분자를 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 microRNA-396 분자를 포함하는 벡터로 식물체를 형질전환시켜 상기 microRNA-396 분자를 식물체에서 발현시킴으로써 식물체 내의 표적 단백질인 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질의 활성을 조절할 수 있는 것이다. 예를 들면, 상기 microRNA-396 분자를 식물체에서 과발현시킴으로써 microRNA-396 분자의 타겟인 DRM(domain rearranged methyltransferase) 유전자를 절단하여 DRM 단백질의 발현을 억제시켜 DRM 단백질의 활성을 억제할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 고추 small RNA 라이브러리 제작
본 발명에서 small RNA 시퀀싱 라이브러리는 Small RNA Sample Prep Kit (Illumina, CA, US)를 이용해 만들어졌으며, 고추의 뿌리와 꽃에서 총 RNA 5㎍이 추출되었다. 이 총 RNA에 3' 어댑터 및 5' 어댑터가 연결되고 뒤이어 RT-PCR에 의해 cDNA로 합성되었다. 다시 cDNA는 PCR을 통해 증폭되고 젤 정제 과정을 거친 후, Illumina/Solexa 시퀀싱이 이루어졌다.
2. 보존된 microRNA 의 동정과 그 표적 유전자의 예측
본 발명에서 small RNA 라이브러리의 시퀀싱을 통해 얻어진 small RNA reads 들은 가공과정을 거쳐 높은 질의 small RNA reads 들만을 뽑았다. Rfam database (http://www.sanger.ac.uk/ software/Rfam)와 토마토 유전체 데이터베이스, ITAG 2.3 Release (http://solgenomics.net/ organism /Solanum_lycopersicum/genome)를 활용하여 단백질을 암호화하지 않는 넌-코딩 RNAs(rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA)를 제거하였고, 남은 서열들은 miRNA 데이터베이스인 miRbase release 18.0 (http://www.mirbase.org)에 BLASTN 검색되었다. 이를 통해 최종적으로 보존된 microRNAs가 선별되었고(서열번호 1 및 2), 이들의 표적 유전자는 TargetFinder (http://carringtonlab.org/resources/targetfinder) 프로그램을 통해 microRNA 서열과 표적유전자 서열 사이의 상보성을 토대로 예측되었다.
3. MicroRNA 노던 블럿 분석
Ambion 사의 TriReagent 시약을 이용하여 총 RNA의 정제가 이루어졌다. 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매 및 묘목에서 추출된 20 ㎍의 총 RNA는 15% UREA-폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동하여 분리되었고, 이것을 Hybond-NX (GE healthcare) 막에 전이한 후 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)를 이용하여 크로스-링크(막에 더 강하게 결합) 시켰다. 5' 말단에 [γ-32P]ATP를 부착한 프로브를 사용하여 42℃에서 시그마사의 혼성화 버퍼를 이용하여 혼성화를 실시하였으며, 2X SSC, 0.1% SDS 조성의 버퍼를 이용하여 세척한 막을 이미지 필름에 노출시킨 뒤 BAS-2500 (Fuji) 기계로 시그널을 검출하였다.
4. MicroRNA 의 표적 유전자를 증명하는 실험
본 발명에서는 표적 유전자의 증명을 위해 유전자 특이적 5' RLM-RACE (5' RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends)가 실행되었다. 고추의 묘목, 뿌리, 그리고 꽃 조직을 혼합한 5 ㎍의 총 RNA가 0.25 mg의 GeneRacer RNA oligo adaptor (5'-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3' ; 서열번호 3)에 연결되었고, 올리고(dT)와 랜덤 헥사머에 의한 역전사 반응을 통해 첫번째 가닥 cDNA가 합성되었다. 이렇게 만들어진 cDNA는 GeneRacer 5' 프라이머와 각 유전자의 유전자 특이 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭되었고, 다시 한번 nested PCR을 통해 더욱 증폭되었다. 최종 PCR 산물은 젤-정제 및 클로닝 과정을 거쳐 염기서열을 확인하였다.
실시예 1. microRNA -396 (또는 miR396 ) 표적 유전자의 증명과 그 도메인( domain ) 분석
본 발명에서 TargetFinder 프로그램을 통해 microRNA-396의 표적 유전자로 DNA 메틸전달효소가 예측되었다. 이 표적 유전자가 microRNA-396에 의해 절단되는 것을 보임으로서 표적 유전자임을 증명하였고(도 3), 단백질의 구체적인 정보를 위해 아미노산 서열을 HHpred server (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)를 통해 분석하였다. 도메인을 분석한 결과, 포유류 DNA 메틸전달효소 3A (DNMT3)와 유사한 C-말단 촉매 도메인(C-terminal catalytic domain)과 식물의 DRM 메틸전달효소에 존재하는 N-말단 유비퀴틴 관련 도메인(N-terminal ubiquitin associated domain)이 존재하였다(도 3). DRM 메틸전달효소는 DNMT3의 오솔로그이기 때문에 Targetfinder가 예측한 microRNA-396의 표적 유전자는 식물의 드 노보 메틸전달효소 (de novo methyltransferase)인 DRM 메틸전달효소라는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 고추와 다른 식물체 간의 DRM 메틸전달효소 관계 분석
고추에서 발견된 새로운 표적 유전자인 DRM 메틸전달효소의 아미노산 서열이 다른 식물 유전체에서 잘 보존되어 있는지 알아보기 위해서 식물 게놈 데이터베이스에 BLAST 검사를 실행하였다. 많은 식물 종에서 DRM 메틸전달효소는 아미노산 서열 수준에서 다른 식물체와 매우 잘 보존되어 있으며 유연적으로도 연관되어 있음을 확인하였다 (도 1 및 도 2).
실시예 3. 가지과 내의 다른 식물에서 microRNA -396의 발현양 분석
본 발명에서는 이 유전자의 발현을 조절하는 microRNA-396 패밀리가 여러 식물 종에서 잘 보존되어 있다는 것을 확인한 후(도 4), 가지과 식물 내에서 노던 블럿 분석을 통해 microRNA의 발현이 유의미함을 확인하였다(도 4). 발현양은 고추 (Capsicum annuum)와 토마토(Solanum lycopersicum)에서 상대적으로 더 높고, 담배(Nicotiana benthamiana)와 감자(Solanum tuberosum)에서 더 낮은 편이다(도 4).
실시예 4. 가지과 식물에서 microRNA -396에 의한 DRM 메틸전달효소 조절 경로의 보존 증명
고추를 비롯한 가지과 식물에서 microRNA-396의 서열이 잘 보존되어 있고 유의미하게 발현됨을 확인한 후, 토마토, 감자 및 담배에서 각각 microRNA-396과 DRM 메틸전달효소 서열의 상보성이 얼마나 높은지 알아보았다. 그 결과, microRNA와 표적유전자 서열 간의 상보성이 토마토에서 조금 더 높았고, 감자와 담배에서는 상대적으로 낮았으며(도 5), 전체적으로 microRNA-396에 의한 조절 경로가 존재할 가능성을 확인할 수 있었다. 이를 토대로 토마토, 감자 및 담배에서 5'-RACE를 시행한 결과, 비슷한 miR396-DRM 메틸전달효소 경로가 토마토에서는 존재함을 증명하였다(도 6). 결론적으로 토마토 microRNA-396은 상보성을 가지는 표적 유전자인 DRM 메틸전달효소에 결합하고, 그 유전자를 절단하는 경로가 고추와 마찬가지로 존재함을 알 수 있었다(도 6).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호 1 또는 2의 염기서열; 또는 상기 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진, 고추(Capsicum annuum)로부터 분리된 microRNA-396 분자.
  2. 제1항의 microRNA-396 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 숙주세포는 식물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
  5. 제2항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 microRNA-396 분자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질의 활성을 조절하는 방법.
  6. 제2항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질 활성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  7. 제6항의 방법에 의해 제조된 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질 활성이 조절된 형질전환 식물체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물체는 가지과 식물인 것을 특징으로 하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질 활성이 조절된 형질전환 식물체.
  9. 제7항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
  10. 제2항의 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 DRM(domain rearranged methyltransferase) 단백질 활성 조절용 조성물.
KR1020120111460A 2012-10-08 2012-10-08 고추로부터 분리된 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３９６ 분자의 새로운 표적 유전자인 ＤＲＭ 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도 KR101363412B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120111460A KR101363412B1 (ko) 2012-10-08 2012-10-08 고추로부터 분리된 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３９６ 분자의 새로운 표적 유전자인 ＤＲＭ 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120111460A KR101363412B1 (ko) 2012-10-08 2012-10-08 고추로부터 분리된 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３９６ 분자의 새로운 표적 유전자인 ＤＲＭ 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101363412B1 true KR101363412B1 (ko) 2014-03-19

Family

ID=50647043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120111460A KR101363412B1 (ko) 2012-10-08 2012-10-08 고추로부터 분리된 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３９６ 분자의 새로운 표적 유전자인 ＤＲＭ 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101363412B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101669246B1 (ko) 2016-10-04 2016-10-25 서울대학교산학협력단 무궁화로부터 분리된 신규 hsy-miR-n002 microRNA 분자 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130034258A (ko) * 2011-09-28 2013-04-05 서울대학교산학협력단 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 ｍｉＲ399 유전자 및 이의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130034258A (ko) * 2011-09-28 2013-04-05 서울대학교산학협력단 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 ｍｉＲ399 유전자 및 이의 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Current Biology, Volume 13, Issue 24, 16 December 2003, Pages 2212-2217 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101669246B1 (ko) 2016-10-04 2016-10-25 서울대학교산학협력단 무궁화로부터 분리된 신규 hsy-miR-n002 microRNA 분자 및 이의 용도

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Morea et al. Functional and evolutionary analyses of the miR156 and miR529 families in land plants
Wan et al. Identification and characterization of small non-coding RNAs from Chinese fir by high throughput sequencing
Jia et al. Small tandem target mimic-mediated blockage of microRNA858 induces anthocyanin accumulation in tomato
Shi et al. Over-expression of rice OsAGO7 gene induces upward curling of the leaf blade that enhanced erect-leaf habit
Guleria et al. Plant small RNAs: biogenesis, mode of action and their roles in abiotic stresses
Zhang et al. Identification and temporal expression analysis of conserved and novel microRNAs in Sorghum
Groszmann et al. Epigenetics in plants—vernalisation and hybrid vigour
Szyrajew et al. MicroRNAs are intensively regulated during induction of somatic embryogenesis in Arabidopsis
DE112010001703T5 (de) RNA-vermittelte Induktion von Genexpression in Pflanzen
Rosati et al. Characterisation of 3′ transgene insertion site and derived mRNAs in MON810 YieldGard® maize
Sakaguchi et al. miR165/166 and the development of land plants
Zhao et al. Comprehensive analysis of Dicer-like, Argonaute, and RNA-dependent RNA polymerase gene families in grapevine (Vitis vinifera)
Dhandapani et al. Identification of potential microRNAs and their targets in Brassica rapa L.
Li et al. Characterization and expression analysis of the Arabidopsis mir169 family
Zhang et al. Cloning and characterization of miRNAs from maize seedling roots under low phosphorus stress
Shin et al. Intronic long noncoding RNA, RICE FLOWERING ASSOCIATED (RIFLA), regulates OsMADS56-mediated flowering in rice
KR101363412B1 (ko) 고추로부터 분리된 ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３９６ 분자의 새로운 표적 유전자인 ＤＲＭ 메틸전달효소의 발굴 및 이의 용도
Ding et al. Identification and expression analysis of miR396 and its target genes in Jerusalem artichoke under temperature stress
JP2021501602A (ja) 植物における耐倒伏性
Diler et al. Differential expression of hyperhydricity responsive peach microRNAs
Yao et al. Downregulation of OsAGO17 by artificial microRNA causes pollen abortion resulting in the reduction of grain yield in rice
Vashisth et al. Genome-wide study of the ABI3 gene family and identification of putative miRNA targeting ABI3 gene in Oryza sativa ssp. indica
Li et al. An effective artificial microRNA vector based on Fv-miR166 precursor from strawberry
Pehlivan Stochasticity in transcriptional expression of a negative regulator of Arabidopsis ABA network
Ma et al. PeGRF6-PeGIF1 complex regulates cell proliferation in the leaf of Phalaenopsis equestris

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160224

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200203

Year of fee payment: 7