DE112010001703T5

DE112010001703T5 - RNA-vermittelte Induktion von Genexpression in Pflanzen

Info

Publication number: DE112010001703T5
Application number: DE112010001703T
Authority: DE
Inventors: Vinitha Joyce Cardoza; Peifeng REN; Lawrence Winfield Talton
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2009-04-21
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2012-09-20
Also published as: US20120036594A1; CN102459612A; AR076331A1; AU2010241034A1; CA2759100A1; EP2421978A1; WO2010121956A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung liegt in dem Gebiet der Pflanzengenetik und stellt ein Verfahren zum Erhöhen der Genexpression eines Zielgens in einer Pflanze oder einem Teil davon bereit. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zum Modifizieren der Spezifität von pflanzenspezifischen Promotern und zum Manipulieren von kleiner nichtcodierender aktivierender RNA (sncaRNA) zur Erhöhung der Expression eines Zielgens in einer Pflanze oder einem Teil davon. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Identifizieren von sncaRNA und ihren Primärtranskripten in einer Pflanze bereit, die fähig sind, die Genexpression in einer Pflanze oder einem Teil davon zu erhöhen.

Description

Die Genexpression in Pflanzen und anderen eukaryontischen Organismen wird von vielen Faktoren beeinflusst. In jüngster Zeit wurde gefunden, dass kleine RNAs mit 18 bis 26 Nukleotiden wichtige Repressoren der eukaryontischen Genexpression sind. Die bekannten kleinen regulatorischen RNAs werden in zwei Hauptklassen eingeteilt: kurze interferierende RNAs (siRNAs) und microRNAs.
Man weiß nun, dass microRNAs evolutionär konservierte Regulatoren der Genexpression in Tieren und Pflanzen auf RNA-Basis sind. microRNAs (ungefähr 18 bis 25 nt) stammen von längeren Vorstufen, pre-miRNAs, mit einer Stem-Loop-Struktur, die von nichtproteincodierenden Genen aus transkribiert werden. Die Prozessierung von pre-miRNAs in einer Pflanze oder einem Teil davon setzt diese 18 bis 25 Nukleotide großen microRNAs mit einer definierten und vorhersagbaren Sequenz frei. Der microRNA-Weg im Reich der Pflanzen unterscheidet sich von dem im Reich der Tiere. Wie von Kutter und Svoboda (2008) hervorgehoben, existieren Unterschiede bei der Prozessierung der microRNA-Vorstufe sowie der biologischen Aktivität. In Pflanzen entstehen microRNAs unter anderem durch DCL1, HYL1 und SE im Kern, wodurch ein methyliertes microRNA:microRNA-Duplexmolekül freigesetzt und in das Cytosol exportiert wird, wo bei Interaktion einer microRNA mit AGO und dem Zieltranskript ein sequenzspezifischer Abbau des Transkripts stattfindet. Bei Tieren ist ein unterschiedlicher Proteinsatz an der pre-miRNA-Prozessierung beteiligt, die im Zellkern und im Cytolsol stattfindet und wobei nichtmethylierte microRNA:microRNA-Duplexe freigesetzt werden. Im Cytosol von tierischen Zellen wird die Translation des Transkripts des Target-Gens bei Interaktion der microRNA mit AGO-Protein und dem Zieltranskript gehemmt.
Manche microRNAs sind an der Prozessierung von ta-siRNAs beteiligt, wobei die Letzteren Phasenregionen, umfassend kurze Fragmente von ungefähr 21 bp mit Homologie zu Target-Genen, umfassen. Diese ungefähr 21 bp großen RNA-Fragmente werden von der ta-siRNA bei Prozessierung in einer Pflanzenzelle als kleine doppelsträngige RNA-Fragmente mit einer vorhersagbaren Sequenz, die den sequenzspezifschen RNA-Abbau in Pflanzenzellen induziert, freigesetzt (Allen et al., 2005).
Die bis jetzt bekannten pflanzlichen microRNAs reprimieren die Expression von vielen Genen, die an Entwicklungsvorgängen beteiligt sind, woraus ersichtlich ist, dass die Regulation auf microRNA-Basis für die Stoffwechselwege, die Wachstum und Entwicklung beeinflussen, von essentieller Bedeutung ist. Pflanzliche microRNAs, die die Genexpression reprimieren, enthalten üblicherweise eine beinahe perfekte Komplementarität zu Zielstellen, die am häufigsten in proteincodierenden Regionen von mRNAs vorkommen (Llave C. et al. (2002) Science 297, 2053–2056; Rhoades M. W. et al. (2002) Cell 110, 513–520). Aufgrund dessen besteht die Funktion der meisten pflanzlichen microRNAs, die die Genexpression reprimieren, in Pflanzen darin, die Ziel-RNA-Spaltung zu kontrollieren (Janes-Rhoades M. W. und Bartel D. P. (2004) Mol. Cell 14, 787–799; Kasschau K. D. et al. (2003) Dev. Cell 4,. 205–217). Im Gegensatz dazu besteht die Funktion der meisten tierischen microRNAs darin, die Expression auf dem Translationsniveau bzw. dem Cotranslationsniveau zu reprimieren (Ambros V. (2003) Cell 113, 673–676; Aukerman M. J. und Sakai H. (2003) Plant Cell 15, 2730–2741; Olsen P. H. und Ambros V (1999) Dev. Biol. 216, 671–680; Seggerson K. et al. (2002) Dev. Biol. 243, 215–225). Obwohl viele tierische Ziel-mRNAs für Entwicklungskontrollfaktoren codieren, sind zwischen den Tieren und den Pflanzen keine microRNAs oder Ziele konserviert (Ambros V. (2003) Cell 113, 673–676).
Zusätzlich zu microRNAs, die die Genexpression reprimTeren, produzieren Pflanzen auch eine zweite Gruppe von expressionsregulierenden RNAs, bei denen es sich um unterschiedliche Sätze endogener siRNAs handelt. Diese unterscheiden sich von microRNAs insofern, als sie von doppelsträngiger RNA abstammen, was die Aktivität von RNA-abhängigen RNA-Polymerasen (RDRs) erfordert.
Bis in jüngster Zeit wurde angenommen, dass die microRNAs und siRNAs in Pflanzen und Tieren eine Funktion als posttranskriptionelle negative Regulatoren ausüben (Bartel D. (2004) Cell 116, 281–297; He L. und Hannon G. J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5, 522–531).
In jüngster Zeit wurde an menschlichen Zellen gezeigt, dass kleine siRNAs und microRNAs mit Targeting der Promoterregion eines Gens fähig sind, die Expression des jeweiligen Gens zu induzieren oder zu erhöhen (Li L.-C. et al. (2006) PNAS 103 (46), 17337–17342; Janowski B. A. et al. (2007) Nature Chemical Biology 3, 166–173; Place R. F. et al. (2008) PNAS 105 (5), 1608–1613).
Es sind nur wenige Patente veröffentlicht worden, in denen die Verwendung von kleinen RNAs für die Erhöhung der Genexpression beansprucht wird. US 2005/0226848 beschreibt die Verwendung von dsRNA-Molekülen für die Modulation der Expression von Genen in einem in-vitro-Säugetierzellsystem, wobei die Modulation die Erhöhung der Genexpression umfasst; WO 07/086990 beschreibt die Erhöhung der Target-Genexpression in Säugetierzellen dadurch, dass man die Zellen mit Oligomeren mit einer Länge von 12–28 bp, die zu einer Promoterregion des Target-Gens komplementär sind, in Kontakt bringt; WO 06/113246 beschreibt kleine aktivierende RNA-Moleküle und ihre Verwendung in Säugetierzellen. In allen erwähnten Anmeldungen wird die Verwendung von kleinen aktivierenden RNA-Molekülen in tierischen Zellen beansprucht. Keine solche Anwendung in Pflanzen wird nahegelegt.
Der Mechanismus einer durch kleine RNA vermittelten Aktivierung, Erhöhung und/oder Induktion der Genexpression (RNAa) ist bis jetzt ungeklärt. Place et al. (2008) zeigen an Säugetieren, dass für die Funktion zumindest eine partielle Komplementarität der kleinen RNA-Sequenz zu der als Target dienenden DNA-Sequenz erforderlich ist und dass die RNAa zu Chromatinveränderungen führt. Diese Autoren stellen die Vermutung an, dass die Bindung der kleinen RNAs an die entsprechende komplementäre DNA-Sequenz für die RNAa erforderlich ist und dass diesbezüglich die kleinen RNAs eine Funktion wie Transkriptionsfaktoren mit Targeting von komplementären Motiven in Genpromotern ausüben. Ein weiteres Modell, das von den Autoren diskutiert wird, ist, dass die Zellen eventuell RNA-Kopien der Zielpromoterregion induzieren, die die Genexpression reprimieren. Durch Interaktion der komplementären microRNAs mit den Promotertranskripten wird die Genexpression induziert oder verstärkt.
Shibuya et al. (2009) haben die Erhöhung der Expression eines pflanzlichen Gens, nämlich pMADS3, das 100 bis 1000 bp großen dsRNAi-Konstrukten, die gegen ein Intron des Gens gerichtet sind, als Target dient, nachgewiesen. DSRNAi-Moleküle induzieren einen Mechanismus, der zu der Produkion von 21- bis 24-Nukleotide großen siRNA-Molekülen aus der Vorstufe führt, und zwar unter Beteiligung eines Satzes von Proteinen, der sich von demjenigen, der an zum Beispiel der Prozessierung von microRNAs beteiligt ist, unterscheidet. Die siRNA-Moleküle, die von einem größeren dsRNA-Molekül abstammen, werden zufallsmäßig erzeugt, und daher wird aus einem dsRNA-Molekül ein Pool von siRNAs, die sich in Bezug auf ihre Nukleotidsequenz unterscheiden, erzeugt. Shibuya und Mitarbeiter haben gezeigt, dass eine Methylierung von pCG-Elementen im Intron, bei dem ein Targeting durch das dsRNA-Molekül erfolgt, stattfindet und stellen die Vermutung an, dass die siRNA-Moleküle, die von dem dsRNA-Molekül abstammen, Methylierung in der homologen DNA-Sequenz auslösen, was zur Induktion der Expression des pMADS3-Gens führt. Die Autoren stellen fest, dass sich der Mechanismus, der von ihnen beobachtet wurde, von dem in Humanzellen beobachteten RNAa-Mechanismus unterscheidet, da im letzteren Fall eine Histonmodifikation statt einer DNA-Methylierung beobachtet wurde. Sie ziehen daraus den Schluss, dass sich der Mechanismus der Regulation der Genexpression durch dsRNAi-Moleküle in Pflanzen von dem in Humanzellen beobachteten RNAa-Mechanismus unterscheidet.
Im Gegensatz zu der Beobachtung, dass die Genexpression in Pflanzen durch Targeting eines ein regulatorischen Introns mit dsRNA-Molekülen erhöht wird, zeigen Aufsatz et al. (2002), dass ein Gen-Silencing eintritt, wenn dsRNA-Molekülen in Pflanzen Promotersequenzen als Targete dienen. Sie zeigen, dass an diesem Mechanismus eine DNA-Methylierung beteiligt ist, und dass alle C-Reste in der Promoterregion, die eine Sequenzidentität zu der dsRNA aufweisen, methyliert werden.
Der Mechanismus der Regulation der Genexpression durch kleine RNAs unterscheidet sich zwischen microRNAs und siRNAs. Daran sind unterschiedliche Proteine beteiligt, die zu unterschiedlichen Auswirkungen auf DNA, Histone und Chromatin führen. Weiterhin macht es die Tatsache, dass bei Tieren und Pflanzen unterschiedliche Proteine beteiligt sind und unterschiedliche Mechanismen beobachtet wurden, unmöglich, aufgrund von Beobachtungen, die bei einer Spezies gemacht werden, auf andere Spezies zu schließen.
In der pflanzlichen Biotechnologie besteht ein ständiger Bedarf für die präzise Erhöhung, Induktion und/oder Aktivierung der Expression von Genen in Pflanzen. Bis jetzt verfügbaren Methoden der Verwendung von Promotern und Enhancern fehlt häufig Spezifität und/oder die Expression ist für gewisse Anwendungen nicht stark genug. Die vorliegende Anmeldung wird diesem Bedarf gerecht.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Einführung von pre-miRNAs, microRNAs, Vorstufen-ta-siRNAs, ta-siRNAs oder kurzen Hairpin-RNAs mit Homologie zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement in Pflanzenzellen zu der Erhöhung der Genexpression des entsprechenden Gens unter der Kontrolle des Regulationselements führen kann. Von Shibuya et al. (2009) wurde gezeigt, dass in Pflanzen das Targeting eines Introns durch 100 bis 1000 bp große dsRNA-Moleküle zu einer Erhöhung der Genexpression führen kann, und zwar über einen Mechanismus, der die Methylierung des Introns beinhaltet. Solche größeren dsRNA-Moleküle werden in einer Pflanzenzelle durch ein Verfahren prozessiert, das doppelsträngige RNA-Moleküle mit einer Größe von ungefähr 21 bp unvorhersagbarer Sequenz freisetzt. In der Zelle solch einer Pflanze wird daher ein Pool von randomisierten kurzen Molekülen mit einer Länge von ungefähr 21 bp erzeugt. Die Erhöhung der Genexpression von Pflanzengenen durch Einführung von pre-miRNA, microRNA, ta-siRNA oder kurzer Hairpin-RNA mit Adressierung an eine Regulationsregion in eine Pflanze oder einen Teil davon ist bis jetzt noch nicht gezeigt worden.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Verfahren zum Erhöhen der Expression eines Target-Gens in einer Pflanze oder einem Teil davon, das das Einführen eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das nicht in einer entsprechenden Wildtyppflanze oder einem Teil davon vorkommt, in die Pflanze oder den Teil davon umfasst, wobei mindestens ein Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls zu mindestens einem Teil eines pflanzenspezifischen Regulationselements, das die Expression eines Target-Gens in der Pflanze oder dem Teil davon reguliert, komplementär ist und wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül eine erhöhte Expression des Target-Gens im Vergleich zu einer entsprechenden Pflanze oder einem Teil davon, die/der das rekombinante Nukleinsäuremolekül nicht umfasst, vermittelt. Es ist klar, dass die rekombinanten Nukleinsäuremoleküle entweder zu dem sense- oder -antisense-Strang von mindestens einem Teil des pflanzenspezifischen Regulationselements komplementär sein können.
Der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremaleküls, der zu einem Teil eines pflanzenspezifischen Regulationselements komplementär ist, kann entweder völlig komplementär sein oder Fehlpaarungen umfassen. Vorzugsweise umfasst die komplementäre Region 5 oder weniger, 4 oder weniger, 3 oder weniger, 2 oder weniger oder eine Fehlpaarung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die komplementäre Region keine Fehlpaarungen und ist zu einem Teil des pflanzenspezifischen Regulationselements völlig komplementär. Die Fehlpaarungen befinden sich in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung nicht in einer der Positionen 4, 5, 6, 16, 17 und/oder 18 des Nukleinsäuremoleküls.
In einer bevorzugten Ausführungsform des obenbeschriebenen Verfahrens umfasst das rekombinante Nukleinsäuremolekül mit Homologie zu einer Regulationsregion einer Pflanze eine pre-miRNA, eine microRNA, einen Vorstufen-ta-siRNA, eine ta-siRNA oder eine kurze Hairpin-RNA. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das rekombinante Nukleinsäuremolekül eine pre-miRNA oder eine ta-siRNA. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfasst das rekombinante Nukleinsäuremolekül eine pre-miRNA.
Die Beobachtung, dass die Genexpression in Pflanzen bei Targeting des entsprechenden Regulationselements durch eine pre-miRNA, eine microRNA, eine Vorstufen-ta-siRNA, eine ta-siRNA oder eine kurzen Hairpin-RNA mit zumindest teilweiser Homologie zu dem Regulationselement erhöht wird, kontrastiert mit den Ergebnissen, die zuvor publiziert worden und die nur dann eine Repression der Genexpression in Pflanzen zeigen, wenn einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül der Promoter oder das Iranskript als Target dient (Aufsatz et al. (2002)). Es kontrastiert auch mit den Ergebnissen von Shibuya et al. (2009), die eine Erhöhung der Expression eines Pflanzengens, das 100 bis 1000 bp großen dsRNAi-Konstrukten mit Adressierung an ein Intron des Gens als Target dienten, nachgewiesen haben.
Obwohl über eine Erhöhung der Genexpression in menschlichen Zellen, wenn der Promoter des entsprechenden Target-Gens einer rekombinanten Nukleinsäure als Target dient, bereits berichtet wurde, war unser Ergebnis deshalb unerwartet, da sich die Mechanismen der Genregulation durch kleine RNAs zwischen tierischen und pflanzlichen Systemen unterscheiden (Vaucheret, 2006). Das einzige Ergebnis bis jetzt, dass eine erhöhte Genexpression in Pflanzen durch kleine RNAs vermittelt wird, war das Targeting eines regulatorischen Introns in der Petunie (Shibuya et al. (2009)). Wie oben erwähnt wurde, unterscheidet sich der Mechanismus, der an der Prozessierung von solchen dsRNAi-Molekülen beteiligt ist, von der Prozessierung der Moleküle der vorliegenden Erfindung. Weiterhin führt die Prozessierung von solchen 100 bis 1000 bp großen dsRNAi-Konstrukten zur Bildung eines Pools von kleinen dsRNAs mit unterschiedlichen und unvorhersagbaren Sequenzen, während die erfindungsgemäßen Moleküle zu der Bildung von kleinen RNA-Molekülen mit definierter Sequenz in der Pflanzenzelle führen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Erhöhen der Target-Genexpression in einer Pflanze oder einem Teil davon umfasst das Einführen von rekombinanten Nukteinsäuremoleküien, umfassend pre-miRNA, microRNA oder eine ta-siRNA, die zu dem Regulationselement des Target-Gens zumindest teilweise homolog sind, in die Pflanze oder den Teil davon. Die Einführung könnte zum Beispiel durch transiente Expression der RNA-Moleküle ausgehend von Vektoren, die in die Pflanze eingeführt worden sind, durch Einführen von künstlich hergestellten RNA- oder Nukleinsäuremolekülen in die Pflanzenzellen oder durch stabile Transformation von rekombinanten Konstrukten, die solche RNA-Moleküle oder deren Vorstufen exprimieren, in das Genom von Pflanzenzellen erzielt werden. Die erhöhte Expression eines Target-Gens, die durch Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erzielt werden kann, umfasst zum Beispiel eine Erhöhung der Expression des Target-Gene in demselben/denselben Gewebe(n), Entwicklungsstadium/-stadien und/oder unter derselben/denselben Bedingung(en) wie die Expression des entsprechenden Target-Gens unter der Regulation des entsprechenden Regulationselements in einer Pflanze oder einem Teil davon, die/der die erfindungsgemäße rekombinante Nukleinsäure nicht umfasst. Auf diese Weise kann die Erhöhung eines Gens, die zum Beispiel in einer Wildpflanze nur schwach exprimiert wird, erhöht werden. Diese erhöhte Expression kann eine wünschenswerte Auswirkung haben, zum Beispiel verbesserte Pflanzengesundheit, gesteigerter Ertrag, erhöhte Resistenz gegen biotischen oder abiotischen Stress oder verbesserte Qualität der geernteten Pflanze bzw. des geernteten Teils davon. Eine erhöhte Expression kann auch bedeuten, dass ein Target-Gen in Geweben, zu Entwicklungsstadien oder unter Bedingungen, in/unter denen es in einer Wildtyppflanze nicht exprimiert wird, exprimiert wird. So könnte zum Beispiel durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein endogenes Gen, das nur bei Infektion mit einem Pathogen exprimiert wird, konstitutiv exprimiert werden, wodurch die Pflanze resistent gegen das Pathogen gemacht wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu verwendet werden, die Expression eines endogenen Gens in einem Gewebe oder in einem Entwicklungsstadium, in dem es in einer Wildtyppflanze nicht exprimiert wird, zu induzieren.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch dazu verwendet werden, um ein transgenes Target-Gen in einer Pflanze auf präzisere Weise zu exprimieren. Die Anzahl und Spezifität der in der Fachwelt verfügbaren pflanzenspezifischen Regulationselemente ist beschränkt, und es könnte der Fall sein, dass ein Regulationselement mit einer gewissen Spezifität und Stärke nicht immer verfügbar ist. Die Identifikation von Regulationselementen mit solcher Spezifität, zum Beispiel Gewebespezifität, ist zeitaufwändig, und es ist dem Fachmann nicht immer möglich, solch ein Regulationselement überhaupt zu identifizieren. Eine Kombination von verschiedenen Regulationselementspezifitäten, die in der Fachwelt bekannt sind, könnte erforderlich sein. Mit der vorliegenden Erfindung kann man die Target-Genexpression in allen Geweben, allen Entwicklungsstadien und/oder unter allen Bedingungen in einer Pflanze erhöhen, in die das rekombinante Nukleinsäuremolekül eingeführt ist. In einer Ausführungsform kann solch ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül in einer Pflanze oder einem Teil davon bei transienter oder stabiler Transformation exprimiert werden. Je nach der Spezifität des Regulationselements, das die Expression des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls reguliert, ist die Target-Genexpression in diesen Geweben, Entwicklungsstadien oder den Bedingungen, in denen die rekombinante Nukleinsäure exprimiert wird, erhöht. Auf diese Weise können die Spezifitäten der zwei Regulationselemente, nämlich des einen, das die Expression des Target-Gens reguliert, und des anderen, das die Expression der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäure mit Targeting des Regulationselements des Target-Gens reguliert, kombiniert werden. Das Verfahren ist nicht auf die Kombination der Spezifität von zwei Regulationselementen beschränkt, da mehr als eine rekombinante Nukleinsäure mit Targeting desselben Regulationselements, das die Expression eines Target-Gens reguliert, oder mit Targeting von unterschiedlichen Regulationselementen desselben Target-Gens in eine Pflanze oder einen Teil davon eingeführt werden kann. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das rekombinante Nukleinsäuremolekül, mit vollständiger oder teilweiser Komplementarität zu mindestens einem Teil eines Regulationselements, das die Expression eines Target-Gens reguliert, zu einem Teil eines Promoters, der sich 100 bp oder weniger entfernt von der Transkriptionsinitiationsstelle befindet, komplementär sein. Die rekombinante Nukleinsäure kann zum Beispiel völlig oder teilweise komplementär zu einem Teil des Promoters sein, der nicht mehr als 100 bp stromaufwärts oder 100 bp stromabwärts der Transkriptionsinitiationsstelle des Promoters liegt. Vorzugsweise ist die rekombinante Nukleinsäure völlig oder teilweise komplementär zu einem Teil des Promoters, der nicht mehr als 50 bp stromaufwärts oder 50 bp stromabwärts von der Transkriptionsinitiationsstelle des Promoters liegt. Vorzugsweise ist die rekombinante Nukleinsäure völlig oder teilweise komplementär zu einem Teil des Promoters, der nicht mehr als 20 bp, stärker bevorzugt nicht mehr als 10 bp, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 5 bp von der Transkriptionsinitiationsstelle des Promoters entfernt liegt. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die rekombinante Nukleinsäure völlig oder teilweise komplementär zu der Transkriptionsinitiationsstelle des Promoters.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das rekombinante Nukleinsäuremolekül mit völliger oder teilweiser Komplementarität zu mindestens einem Teil eines Regulationselements, das die Expression eines Target-Gens reguliert, zu einem Teil des Regulationselements komplementär ist, der nicht mehr als 50 bp von einer Regulations-Box oder einem Regulations-Motiv des Regulationselements entfernt liegt. Vorzugsweise ist die rekombinante Nukleinsäure völlig oder teilweise komplementär zu einem Teil des Regulationselements, das nicht mehr als 20 bp, stärker bevorzugt nicht mehr als 10 bp, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 5 bp von einer Regulations-Box oder einem Regulations-Motiv des Regulationselements entfernt hegt. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante Nukleinsäure völlig oder teilweise komplementär zu einem Teil des Regulationselements, das mindestens einen Teil von solch einer Regulations-Box oder solch einem Regulations-Motiv umfasst.
Beispiele dafür, wie die vorliegende Erfindung durchgeführt werden kann, finden sich in den folgenden Beispielen. So können zum Beispiel kleine künstliche dsRNA-Moleküle mit einer Größe von 21 bp für das Screening von Sequenzen, die fähig sind, die Target-Genexpression zu erhöhen, verwendet werden. Mit diesen Sequenzen kann man dann rekombinante Nukleinsäuremoleküle erzeugen, zum Beispiel pre-miRNAs, microRNAs, Vorstufen-ta-siRNAs, ta-siRNAs oder kurze Hairpin-RNAs, die die Sequenzen umfassen und die bei Einführen in eine Pflanze oder einen Teil davon eine Erhöhung der Target-Genexpression vermitteln. Ein weiteres Beispiel dafür, wie das erfindungsgemäße Verfahren wie in den Beispielen gezeigt durchgeführt werden kann, besteht darin, dass rekombinante pre-miRNAs oder ta-siRNAs kloniert werden, in die microRNAs oder Phasenregionen, die jeweils zu dem Regulationselement eines Target-Gens homolog sind, wobei die microRNAs oder Phasenregionen, die die Target-Genexpression bei Prozessierung der Vorstufenmoleküle erhöhen, eingeführt werden. Diese rekombinanten Konstrukte können transient oder stabil in Pflanzen oder Teile davon transformiert werden, wodurch man bei Expression und Prozessierung RNA-Moleküle mit Homologie zu dem Regulationselement eines Target-Gens erzeugt, die die Target-Genexpression erhöhen. Der Fachmann ist mit weiteren Strategien zur Durchführung der vorliegenden Erfindung vertraut.
Das rekombinante Nukleinsäuremolekül könnte in die Pflanze oder den Teil davon mit Hilfe von verschiedenen Techniken, mit denen der Fachmann vertraut ist, eingeführt werden. So zum Beispiel kann das rekombinante Nukleinsäuremolekül stabil oder transient eingeführt werden. Eine stabile Einführung könnte zum Beispiel mittels Transformation unter Verwendung von zum Beispiel der Agrobacterium-vermittelten Transformation oder des Beschusses mit Genkanone erfolgen. Letzteres könnte auch für die transiente Einführung der rekombinanten Nukleinsäuremoleküle eingesetzt werden. Weitere Verfahren für die transiente Einführung des erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls sind zum Beispiel Vakuuminfiltration, Elektroporation, die chemikalieninduzierte Induktion, die Verwendung von Viren oder von von Viren abstammenden Vektoren. Der Fachmann kennt weitere Verfahren, die sich für die vorliegende Erfindung eignen.
Bevorzugte Verfahren für die Einführung von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen in Pflanzen oder Teile davon sind die Agrobacteriun-vermittelte Transformation, der Beschuss mit der Genkanone, die Elektroporation oder die chemikalieninduzierte Einführung unter Verwendung von zum Beispiel Polyethylenglykol. Besonders bevorzugt ist die Agrobacterium-vermittelte Transformation.
Eine weitere Ausführung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Expression eines Target-Gens in einer Pflanze oder einem Teil davon wie oben beschrieben, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen von einer oder mehreren pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die zu einem Regulahonselement eines Target-Gens mindestens teilweise komplementär ist,
b) Testen der einen oder mehreren pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA in vivo und/oder in vitro auf ihre Eigenschaft, die Expression des Target-Gens zu erhöhen,
c) Identifizieren, ob die pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA die Target-Genexpression erhöht und
d) Einführen der einen oder mehreren pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA in eine Pflanze.

Das Nukleinsäuremolekül mit Komplementarität zu einem Teil eines pflanzenspezifischen Regulationselements kann völlig komplementär sein oder Fehlpaarungen umfassen. Vorzugsweise umfasst die komplementäre Region 5 oder weniger, 4 oder weniger, 3 oder weniger, 2 oder weniger oder eine Fehlpaarung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die komplementäre Region keine Fehlpaarungen und ist völlig zu einem Teil des pflanzenspezifischen Regulationselements komplementär. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung befinden sich die Fehlpaarungen nicht an einer der Positionen 4, 5, 6, 16, 17 und/oder 18 des Nukleinsäuremoleküls.
Das wie oben definierte erfindungsgemäße Verfahren umfasst in einem ersten Schritt des Screening von pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA mit zumindest teilweiser Homologie zu dem Regulationselement eines Target-Gens auf ihre Fähigkeit, die Genexpression des Target-Gens zu erhöhen. Die pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA kann an die Pflanze oder den Teil davon als künstliche kleine RNA-Moleküle, zum Beispiel doppelsträngige RNA-Moleküle mit einer Größe von 21 bp, oder als weiteres Beispiel mittels rekombinanten pre-miRNAs, umfassend mindestens eine microRNA mit Homologie zu dem Regulationselement eines Target-Gens, abgegeben werden. Bei Einführung der kleinen Nukleinsäuremaleküle in die Pflanze oder den Teil davon kann die Expression des entsprechenden Target-Gens mit dem Fachmann bekannten Verfahren untersucht werden. Die Expression kann mit der Expression des Target-Gens vor der Abgabe der kleinen Nukleinsäuremoleküle in die Pflanze oder den Teil davon oder mit einer entsprechenden Wildtyppflanze oder einem Teil davon verglichen werden. Als Beispiel kann die Expression des interessierenden Gens untersucht werden. In einer weiteren Ausführungsform kann das Regulationselement des Target-Gens isoliert, mit einem Reportergen fusioniert und in die Pflanze oder den Teil davon eingeführt werden, bevor man auf kleine Nukleinsäuremoleküle, die fähig sind, die von dem Regulationselement dirigierte Expression zu erhöhen, screent.
Die eine oder mehreren pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die fähig ist/sind, die Target-Genexpression zu erhöhen, kann/können für die gezielte Erhöhung der Genexpression des entsprechenden Target-Gens in einem erfindungsgemäßen Verfahren wie oben beschrieben verwendet werden.
Die kleinen Nukleinsäuremoleküle können doppelsträngig oder einzelsträngig sein; sie können zum Beispiel aus DNA- und/oder RNA-Oligonukleotiden bestehen. Sie können weiterhin funktionelle Derivate davon wie zum Beispiel DNA umfassen oder daraus bestehen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den kleinen Nukleinsäuremolekülen um RNA-Oligonukleotide. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform sind die RNA-Oligonukleotide doppelsträngig. Die Länge von solchen Oligonukleotiden kann zum Beispiel zwischen ungefähr 15 und ungefähr 30 bp, zum Beispiel zwischen 15 und 30 bp, stärker bevorzugt zwischen ungefähr 19 und ungefähr 26 bp, zum Beispiel zwischen 19 und 26 bp, noch stärker bevorzugt zwischen ungefähr 20 und ungefähr 25 bp, zum Beispiel zwischen 20 und 25 bp, betragen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge der Oligonukleotide zwischen ungefähr 21 und ungefähr 24 bp, zum Beispiel zwischen 21 und 24 bp. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge der Oligonukleotide ungefähr 21 bp und ungefähr 24 bp, zum Beispiel 21 bp und 24 bp.
Die Sequenzen der pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA können völlig oder teilweise komplementär zu einem oder beiden Strängen der Regulationselementsequenz sein. Vorzugsweise sind sie völlig oder teilweise komplementär zu dem sense-Strang der Regulationselementsequenz eines Target-Gens. Die Sequenzen der pre-miRNA, micro-RNA oder ta-siRNA können die ganze Regulationselementsequenz oder Teile davon abdecken. Die Sequenz der pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA kann überlappend sein, wodurch die Sequenz um mindestens ein bp verschoben werden kann, oder kann einer anderen benachbart sein, ohne dass die Sequenz überlappt. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die kleinen Nukleinsäuremoleküle überlappende Sequenzen auf, die um 5 oder mehr, stärker bevorzugt um 3 oder mehr und noch stärker bevorzugt um 1 bp oder mehr verschoben sind.
Die pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA kann einzeln oder in Pools in eine Pflanze oder einen Teil davon eingeführt werden. Sie können zum Beispiel mittels Elektroporation oder chemisch vermittelter Transformation in Protoplasten eingeführt werden. Die kleinen Nukleinsäuremoleküle können jedoch auch in vitro in zellfreien Systemen getestet werden. Kleine Nukleinsäuremoleküle, die die Expression des entsprechenden Target-Gens erhöhen, können zum Beispiel durch Analysieren der Expression des Target-Gens vor und nach Einführung der kleinen Nukleinsäuremoleküle in die Zelle oder in das zellfreie System identifiziert werden, und zwar unter Verwendung von Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist. Sobald eine pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die das entsprechende Target-Gen erhöht, identifiziert ist, kann dieses kleine Nukleinsäuremolekül für die gerichtete Erhöhung der Expression des entsprechenden Target-Gens verwendet werden, und zwar dadurch, dass man das kleine Nukleinsäuremolekül in eine Pflanze oder einen Teil davon einführt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Erhöhen der Expression eines Target-Gens in einer Pflanze oder einem Teil davon wie oben beschrieben, wobei die pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die das Target-Gen erhöht, in die Pflanze dadurch eingeführt wird, dass man die pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die das Target-Gen erhöht, in einen Pflanzentransformationsvektor, umfassend ein pflanzenspezifisches Regulationselement, kloniert, eine Pflanze oder Teile davon mit dem Vektor transformiert und eine transgene Pflanze, umfassend den Vektor oder einen Teil des Vektors wie die T-DNA-Region, gewinnt.
Wie oben beschrieben, kann pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA transient in eine Pflanze oder einen Teil davon eingeführt werden, oder sie können ausgehend von Nukleinsaurenkonstrukten, die stabil in das Genom einer Pflanze oder eines Teils davon integriert sind, exprimiert werden. Im letzteren Fall kennt der Fachmann Verfahren zur Herstellung von chimären rekombinanten Konstrukten, die die Expression in Pflanzen oder Teilen davon steuern. So zum Beispiel können pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA durch DNA-Rekombinationstechniken in Pflanzentransformationsvektoren kloniert werden. So kann zum Beispiel ein Wildtyp-pre-miRNA-Gen oder Wildtyp-ta-siRNA-Gen dadurch modifiziert werden, dass man mindestens eine Phasenregion in dem ta-siRNA-Gen oder die Region mit Homologie zu dem Target-Gen in der pre-miRNA ersetzt. Ersetzen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang des Hinzufügen einer Phasenregion oder microRNA in dem entsprechenden Gen, die Substitution der endogenen microRNA oder Phasenregion durch eine andere microRNA oder Phasenregion. Es kann auch die Mutation der Sequenz einer microRNA oder Phasenregion durch zum Beispiel das Austauschen, Deletieren oder Insertieren eines Basenpaars bedeuten. Solche Gene bilden, wenn sie in einer Pflanzenzelle oder einem Teil davon exprimiert werden, RNA-Vorstufenmoleküle, umfassend die rekombinante Region mit Homologie zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement. Das Vorstufenmolekül kann eventuell anschließend prozessiert werden und so das rekombinante kleine RNA-Molekül mit Homologie zu einem Target-Genregulationselement freisetzen. Zusätzliche genetische Elemente können auf dem Vektor vorhanden sein, wie ein Promoter, der die Expression des kleinen Nukleinsäuremoleküls oder der entsprechenden Vorstufenmoleküle kontrolliert. Andere genetische Elemente, die auf dem Vektor vorhanden sein könnten, könnten ein Terminator sein. Verfahren zum Einführen von solch einem Vektor, umfassend solch ein Expressionskonstrukt, umfassend zum Beispiel einen Promoter, das kleine Nukleinsäuremolekül und einen Terminator, in das Genom einer Pflanze und zum Gewinnen von transgenen Pflanzen und einer transformierten Zelle sind ebenfalls gut in der Fachwelt bekannt. Je nach dem Verfahren, das für die Transformation einer Pflanze oder eines Teils davon verwendet wird, könnte der gesamte Vektor in das Genom der Pflanze oder des Teils davon integriert werden, oder es könnten gewisse Komponenten des Vektors in das Genom integriert werden, wie zum Beispiel eine T-DNA.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zum Erhöhen der Expression eines Target-Gens in einer Pflanze oder einem Teil davon, umfassend das Einführen eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine modifizierte pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, in die Pflanze oder den Teil davon, wobei die Sequenz der pre-miRNA, micro RNA oder ta-siRNA in Bezug auf eine natürliche pre-miRNA-, microRNA- oder ta-siRNA-Sequenz dadurch modifiziert ist, dass mindestens eine Region der natürlichen pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die zu ihrer entsprechenden natürlichen Zielsequenz komplementär ist, durch eine Sequenz ersetzt wird, die zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens reguliert und das in Bezug auf die natürliche pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA heterolog ist, komplementär ist.
Die Region der natürlichen pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement komplementär ist, kann völlig komplementär sein oder Fehlpaarungen umfassen. Vorzugsweise umfasst die komplementäre Region 5 oder weniger, 4 oder weniger, 3 oder weniger, 2 oder weniger oder eine Fehlpaarung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die komplementäre Region keine Fehlpaarungen und ist völlig zu einem Teil des Target-Gen-Promoters komplementär. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung befinden sich die Fehlpaarungen nicht an einer der Positionen 4, 5, 6, 16, 17 und/oder 18 des Nukleinsuremoleküls.
Die Erfindung könnte zum Beispiel dadurch durchgeführt werden, dass man ein pre-miRNA-, microRNA- oder ta-siRNA-Gen isoliert. Pre-miRNA-, microRNA- oder ta-siRNA-Gene, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Ein pre-miRNA-, microRNA- oder ta-siRNA-Gen kann Regionen mit Homologie zu dem natürlichen Target-Gen des pre-miRNA-, microRNA- oder ta-siRNA-Gens umfassen. Solch eine Region kann durch eine Sequenz mit Homologie zu dem Regulationselement eines Target-Gens ersetzt werden, wobei bekannt ist, dass die Ersatzsequenz die Genexpression des Target-Gens erhöht, wenn ein Nukleinsäuremolekül der entsprechenden Sequenz in eine Pflanzenzelle eingeführt wird. Verfahren zum Ersetzen einer Region in einem isolierten Nulkleinsäuremolekül sind dem Fachmann bekannt. Bei Einführen solch eines modifizierten pre-miRNA-, microRNA- oder ta-siRNA-Gens in eine Pflanze oder einem Teil davon wird dieses in ein Vorstufen-RNA-Molekül, umfassend eine Region mit Homologie zu einem Target-Genregulationselement, exprimiert. Das Vorstufenmolekül wird anschließend prozessiert, wodurch ein oder mehrere kleines doppelsträngiges regulierendes RNA-Molekül mit einer Länge von zum Beispiel 21 oder 24 bp einer definierten Sequenz sowie mit Homologie zu dem Regulationselement eines Target-Gens freigesetzt wird. Diese kleinen doppelsträngigen regulierenden RNA-Moleküle lösen die Erhöhung der Expression des Target-Gens aus.
Natürliche kleine nichtcodierende regulierende RNAs sind zum Beispiel auf Vorstufenmoleküle, die in dem Genom codiert werden, umfasst. Solche kleinen nichtcodierenden regulierenden RNAs sind zum Beispiel microRNAs oder ta-siRNAs. Weitere sncRNAs können zum Beispiel shRNAs, snRNAs, nat-siRNA und/oder snoRNAs sein. Bevorzugte sncRNAs sind ta-siRNAs, nat-siRNAs und microRNAs. Besonders bevorzugt sind microRNAs.
Diese Vorstufenmoleküle werden in der Pflanzenzelle von einem spezifischen Satz von Proteinen erkannt, die diese Vorstufenmoleküle prozessieren und so die kleinen regulierenden RNAs, wie microRNAs oder siRNAs, freisetzen. Die Prozessierung von solchen Vorstufenmolekülen setzt einzelsträngige oder doppelsträngige RNA-Moleküle mit einer Länge von zum Beispiel 21 oder 24 bp einer definierten Sequenz frei. Die Prozessierungswege in Pflanzen für Vorstufen-pre-miRNAs oder Vorstufen-ta-siRNAs sind zum Beispiel bei Vaucheret (2006) beschrieben.
Der Fachmann ist mit Methoden zur Modifikation oder Synthese von solchen Genen von Vorstufenmolekülen, die kleine nichtcodierende aktivierende RNA-Moleküle mit Homologie zu dem Regulationselement eines Target-Gens freisetzen, vertraut.
Eine Phasenregelung bedeutet im vorliegenden Text eine Region, die auf einem ta-siRNA-Molekül umfasst ist und eine Homologie zu einem Target-Gen aufweist und bei Prozessierung des ta-siRNA-Moleküls als kleines dsRNA-Molekül mit einer Größe von 21 bis 24 bp freigesetzt wird. Solch eine Phasenregion kann nach fachbekannten Verfahren wie Klonierungstechniken oder Rekombination ersetzt werden, oder es kann die gesamte ta-siRNA, umfassend eine Phasenregion, die gegen eine Regulationselementeregion gerichtet ist, in vitro synthetisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind alle Phasenregionen einer natürlichen ta-siRNA durch Sequenzen ersetzt, die völlig oder teilweise zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens reguliert, komplementär sind. So zum Beispiel könnten alle Sequenzen, die die Phasenregionen in einer natürlichen pre-miRNA oder ta-siRNA ersetzen, völlig oder teilweise zu demselben pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens reguliert, komplementär sein. Alternativ dazu könnten die Sequenzen, die die Phasenregionen in einer natürlichen ta-siRNA ersetzen, völlig oder teilweise zu unterschiedlichen pflanzenspezifischen Regulationselementen, die die Expression von einem Target-Gen regulieren, oder zu unterschiedlichen pflanzenspezifischen Regulationselementen, die die Expression von unterschiedlichen Target-Genen regulieren, komplementär sein.
In einer weiteren Ausführungsform könnte eine pre-miRNA dazu verwendet werden, um die Expression eines Target-Gens in einer Pflanze oder einem Teil davon zu aktivieren. Verfahren zum Ersetzen einer microRNA, die auf einem pre-miRNA-Molekül umfasst ist, sind in der Fachwelt bekannt und zum Beispiel beschrieben bei Schwab R. et al. (2006) Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis Plant Cell 18: 1121–1133.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Identifizieren von aktivierenden microRNAs in einer Pflanze oder einem Teil davon, umfassend die folgenden Schritte:

– Identifizieren von microRNAs in der Pflanze oder dem Teil davon mit Homologie zu einer Regulationssequenz in der entsprechenden Pflanze, Klonieren der microRNAs aus der Pflanze oder dem Teil davon, Einführen der microRNAs in eine Pflanze und Vergleichen der Genexpression von möglichen Target-Genen in den Pflanzen, umfassend die microRNA mit entsprechenden Wildtyppflanzen.

Unter microRNAs versteht man im vorliegenden Zusammenhang RNA-Moleküle mit einer Länge von 18 bis 24 Nukleotiden, die die Genexpression regulieren. Die microRNAs werden von Nichtproteincodiergenen codiert, die in ein Primärtranskript transkribiert werden, welches eine Stem-Loop-Struktur mit der Bezeichnung pre-miRNA bildet. Die microRNA wird ausgehend von der pre-miRNA prozessiert und als doppelsträngiges RNA-Molekül freigesetzt.
Verfahren zum Identifizieren von microRNAs aus biologischem Material, wie einer Pflanze, sind in der Fachwelt beschrieben (Sunkar R. und Zhu J. (2004) Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis. The Plant Cell 16: 2001–2019 und Lu C. et al. (2005) Elucidation of the small RNA components of the transcriptome. Science 309: 1567–1569). Diese Verfahren können zum Beispiel in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Die microRNA-Region dieser pre-miRNAs können wie in der Fachwelt beschrieben bestimmt werden und mit Werkzeugen der Bioinformatik auf Homologie mit pflanzenspezifischen Regulationselementen in der Pflanze, von der die microRNAs abstammen, getestet werden. Bioinformatik-Werkzeuge, die für die Analyse verwendet werden können, sind in der Fachwelt bekannt, und Beispiele sind oben angeführt. Um auf eine genexpressionssteigernde Wirkung der identifizierten microRNAs zu prüfen, könnten diese microRNAs synthetisiert werden und zum Beispiel in eine Pflanzenzelle, einen Protoplasten oder ein zellfreies System eingeführt werden. Die genexpressionserhöhende Wirkung dieser microRNAs könnte auch durch Klonieren und Überexprimieren des jeweiligen microRNA-Codiergens getestet werden. Verfahren zum Klonieren und Überexprimieren von microRNAs sind zum Beispiel beschrieben bei Schwab R. et al. (2006) Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis Plant Cell 18: 1121–1133 oder Warthmann N. et al. (2008) Highly Specific Gene Silencing by Artificial miRNAs in Rice PLoS ONE 3(3): e1829.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, solche aktivierenden microRNA-Codiergene zu isolieren und sie in Pflanzen oder Teile davon einzuführen, um die Expression der entsprechenden Target-Gene zu erhöhen. Das microRNA-Codiergen kann zum Beispiel operativ mit einem heterologen Promoter verknüpft sein. Solch ein rekombinantes Konstrukt kann auf einem Vektor vorliegen und in eine Pflanze oder einen Teil davon transformiert werden. Der heterologe Promoter, der die Expression des microRNA-Codiergens reguliert, kann die Expression der microRNA in Geweben, Entwicklungsstadien und/oder unter Bedingungen wie zum Beispiel Stressbedingungen wie Trockenheit oder Kälte vermitteln; die microRNA wird in einer Bezugspflanze, zum Beispiel einer Wildtyppflanze, die das jeweilige Konstrukt nicht umfasst, nicht exprimiert. Auf diese Weise wird die Expression des entsprechenden Target-Gens in der Pflanze in dem Gewebe, dem Entwicklungsstadium und/oder unter der Bedingung erhöht oder induziert.
Ein Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements durch Modifizieren eines Abschnitts in dem pflanzenspezifischen Regulationselement, der einer kleinen nichtcodierenden RNA (sncRNA), die eine Erhöhung der Expression von Genen, die von dem Regulationselement kontrolliert werden, vermittelt, als Target dient, stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
„Ersetzen der Regulationsspezifität” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang, dass sich die Regulationsspezifität eines Regulationselements, das erfindungsgemäß adaptiert wurde, von der Regulationsspezifität des Regulationselements vor dem Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens unterscheidet. Die Regulationsspezifität kann sich bezüglich der Expressionsstärke unterscheiden, was bedeutet, dass das adaptierte Regulationselement eine Expression zum Beispiel in denselben Geweben, demselben Entwicklungsstadium und/oder denselben Bedingungen vermittelt, dass die Expression jedoch im Vergleich zu dem Regulationselement, bevor das erfindungsgemäße Verfahren auf das Regulationselement angewandt wurde, höher Liegt. Es kann auch bedeuten, dass das Regulationselement eine Expression in zusätzlichen oder in anderen Geweben, Zellen, Kompartimenten der Pflanze, in zusätzlichen oder in anderen Entwicklungsstadien der Pflanze oder unter zusätzlichen oder unterschiedlichen Bedingungen, wie Umweltbedingungen, im Vergleich zu dem Regulationselement, bevor das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wurde, vermittelt.
Die Spezifität eines Regulationselements hängt unter anderem ab von seiner DNA-Sequenz und der Interaktion mit verschiedenen Proteinen und RNA-Molekülen. Die Interaktion mit den RNA-Molekülen hängt auch von der Sequenz des Regulationselements ab. Es ist daher möglich, die Spezifität eines Regulationselements dadurch zu verändern, dass man die Sequenz von mindestens einem dieser Abschnitte auf dem Regulationselement, die für die Interaktion mit regulierenden RNAs erforderlich sind, verändert. Diese Abschnitte könnten zum Beispiel durch Umwandeln der Sequenz, Deletion oder Insertion modifiziert werden, so dass die endogene sncRNA, die mit diesem Abschnitt interagiert, nicht mehr zu einer Interaktion befähigt ist. Dies könnte zum Beispiel zu einem Hinunterregulieren des Regulationselements in gewissen Geweben oder Entwicklungsstadien führen, wenn die interagierende RNA eine kleine nichtcodierende aktivierende RNA (sncaRNA) gewesen ist. Die Sequenz des Abschnitts kann auch so adaptiert werden, dass eine andere sncRNA, zum Beispiel eine pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, mit diesem Abschnitt interagiert, was zu einer Änderung der Spezifität des Regulationselements führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen durch Einführen eines Abschnitts in das pflanzenspezifische Regulationselement, der einer rekombinanten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die eine Erhöhung der Expression von Genen, die von dem Regulationselement kontrolliert werden, vermittelt, als Target dient, und wobei die rekombinante pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA unter der Kontrolle eines pflanzenspezifischen Regulationselements, das eine Erhöhung der Expression des Target-Gens gemäß der Spezifität des pflanzenspezifischen Regulationselements, das die rekombinante pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA kontrolliert, vermittelt, steht. Die Spezifität eines Regulationselements kann erfindungsgemäß dadurch verändert werden, dass man in die Regulationselementsequenz einen neuen Abschnitt einführt, der mit einer rekombinanten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die in die Pflanze oder den Teil davon eingeführt werden wird und die das Regulationselement umfasst, interagiert. Bei der Einführung kann es sich um eine Insertion, die zu einer erhöhten Länge des Regulationselements führt, oder um einen Ersatz für eine Sequenz mit einer ähnlichen oder derselben Große wie der eingeführte Abschnitt, wodurch die Sequenzlänge des Regulationselements im Wesentlichen unverändert bleibt, handeln. Modifizieren eines Abschnitts bedeutet im vorliegenden Zusammenhang zum Beispiel das Ersetzen eines Abschnitts, der einer sncRNA als Target dient, durch einen anderen, der einer pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA als Target dient, unter Mutieren der Sequenz eines Abschnitts derart, dass er einer pre-miRNA, microRNA als Target dient, oder derart, dass der Abschnitt nicht mehr der endogenen oder regulatorischen kleinen RNA, der der Abschnitt zuvor als Target gedient hat, als Target dient. Es kann auch bedeuten, dass ein Abschnitt von dem pflanzenspezifischen Regulationselement deletiert wird. Das Deletieren eines Abschnitts könnte bedeuten, dass der Abschnitt deletiert wird und die DNA-Stränge, die diesem Abschnitt benachbart waren, fusioniert werden, oder durch Ersetzen des Abschnitts durch ein zufallsmäßiges DNA-Molekül von ungefähr derselben Größe wie der Abschnitt, wobei das DNA-Molekül nicht einer sncRNA als Target dient. Im ersten Fall ist die Regulationselementsequenz nach dem Deletieren des Abschnitts kürzer, während im letztgenannten Fall die Regulationselementsequenz ungefähr dieselbe Größe aufweist wie bevor der Abschnitt deletiert worden ist. Unabhängig davon, wie die Deletion des Abschnitts erfolgt, ist die sncRNA nicht mehr fähig, mit dem so modifizierten pflanzenspezifischen Regulationselement zu interagieren.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht auch darin, Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements dadurch zu ersetzen, dass man in das pflanzenspezifische Regulationselement einen Abschnitt, der einer endogenen pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die eine Erhöhung der Expression von Genen, die von dem Regulationselement kontrolliert werden, vermittelt, als Tagert dient, einführt. So zum Beispiel könnte das Verfahren zum Modifizieren der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements so verwendet werden, dass der mindestens eine Abschnitt, der in das pflanzenspezifische Regulationselement eingeführt wird, einen Abschnitt ersetzt, der einer endogenen sncRNA als Target dient. Der mindestens eine Abschnitt, der den endogenen Abschnitt, der einer endogenen sncaRNA als Target dient, ersetzt, könnte selbst wiederum einer anderen endogenen pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA mit unterschiedlicher Spezifität als die sncRNA, der der endogene Abschnitt als Target gedient hat, oder einer rekombinanten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die in die entsprechende Pflanze oder einen Teil davon eingeführt ist, als Target dienen.
Die Modifikation des pflanzenspezifischen Regulationselements könnte in einer Ausführungsform der Erfindung in vivo erfolgen, zum Beispiel unter Einsatz von Rekombinationstechniken. Die pflanzenspezifische Regulationselementsequenz in dieser Ausführungsform kann modifiziert werden, während sie sich in dem Genom einer lebensfähigen Zelle oder in einem intakten Zellkompartiment befindet. Während und nach Anwendung dieser Techniken bleibt das zu modifizierende pflanzenspezifische Regulationselement mit seinem ursprünglichen genomischen Kontext bestehen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das pflanzenspezifische Regulationselement aus seinem natürlichen Kontext isoliert werden und die Regulationsregion kann in vitro durch fachbekannte Techniken, wie zum Beispiel DNA-Rekombinationstechniken wie Klonierungstechniken, Rekombination oder Synthese modifiziert werden. Der mindestens eine Abschnitt, der in einem pflanzenspezifischen Regulationselement modifiziert werden soll, könnte ebenso durch Mutieren seiner ursprünglichen Sequenz modifiziert werden. So könnte zum Beispiel mindestens ein Basenpaar in der Sequenz des Abschnitts ausgetauscht werden, oder es könnte mindestens ein Basenpaar deletiert oder eingeführt werden. Als Ergebnis von solch einer Mutation könnte der mindestens eine Abschnitt nicht mehr einer sncRNA als Target dienen, der dieser Abschnitt zuvor als Target gedient hat, er könnte daher überhaupt keiner sncRNA mehr als Target dienen oder er könnte einer anderen pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die endogen oder rekombinant sein könnte, als Target dienen. Die Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements könnte auch dadurch modifiziert werden, dass man mindestens einen Abschnitt, der einer endogenen sncRNA dieser Regulationssequenz als Target dient, deletiert. Der Abschnitt kann vollständig oder teilweise deletiert werden und zwar in vitro oder in vivo, wie es oben beschrieben wurde.
Die Einführung eines Abschnitts, der einer rekombinanten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA als Target dient, in ein pflanzenspezifisches Regulationselement kann dadurch erzielt werden, dass man einen Abschnitt in das Regulationselement insertiert, wodurch die Länge der Regulationsregion vergrößert wird, dadurch, dass man einen Teil der Regulationsregion ersetzt, zum Beispiel dass man einen endogenen Abschnitt, der einer endogenen sncRNA als Target dient, ersetzt, oder dadurch, dass man die Sequenz der Regulationsregion mutiert. Wie oben hervorgehoben, können die entsprechenden Verfahren in vivo oder in vitro erfolgen. Alternativ dazu könnte das gesamte pflanzenspezifische Regulationselementmolekül nach fachbekannten Verfahren synthetisch hergestellt werden.
Bei der rekombinanten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die in die Pflanze eingeführt wird, könnte spezifisch ein Targeting an ein Target-Gen oder an mehrere Target-Gene, die gemeinsam in einer Pflanze oder einem Teil davon aktiviert werden sollen, erfolgen.
Das Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements umfasst zum Beispiel die Aktivierung eines pflanzenspezifischen, zum Beispiel pflanzengewebespezifischen, Regulationselements mit einer wünschenswerten Spezifität, das jedoch nicht eine erforderliche Expressionsrate erzeugt. Solch ein Regulationselement könnte spezifisch aktiviert werden, und zwar durch Einführen eines Abschnitts, der einer rekombinanten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA als Target dient, in das Regulationselement, wobei die rekombinante pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA unter der Kontrolle eines Regulationselements steht, das zur Expression der rekombinanten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA in dem Gewebe, wo eine erhöhte Aktivität des Target-Gens wünschenswert ist, führt. Das Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements könnte auch eine Aktivierung eines Regulationselements wie zum Beispiel in einem Gewebe oder einem Entwicklungsstadium, in dem es normalerweise nicht aktiv ist, bedeuten. Weiterhin könnte sich das Verfahren dazu eignen, um die Aktivität eines Regulationselements zum Beispiel in einem Gewebe oder einem Entwicklungsstadium dadurch zu reprimieren, dass man ein Repressorgen, dem das interessierende Gen als Target dient, erhöht, wodurch man die Spezifität einer bestimmten Regulationssequenz verbessert.
Ein Nukleinsäurekonstrukt für die Expression in Pflanzen, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die für eine modifizierte pre-miRNA-, microRNA- oder ta-siRNA-Sequenz codiert, wobei die Sequenz in Bezug auf eine Wildtyp-pre-miRNA-, -microRNA- oder -ta-siRNA-Sequenz dadurch modifiziert ist, dass mindestens eine Region der Wildtyp-pre-miRNA, -microRNA oder -ta-siRNA mit Komplementarität zu ihrer entsprechenden Wildtyp-Zielsequenz durch eine Sequenz ersetzt wird, die zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens reguliert und in Bezug auf die Wildtyp-pre-miRNA, -microRNA oder -ta-siRNA heterolog ist komplementär ist, und die eine Erhöhung der Expression des Target-Gens bei Einführung in die Pflanze oder einen Teil davon vermittelt, ist ebenfalls eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die Sequenz mit Komplementarität zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement kann völlig komplementär sein oder kann Fehlpaarungen umfassen. Vorzugsweise umfasst die komplementäre Sequenz 5 oder weniger, 4 oder weniger, 3 oder weniger, 2 oder weniger oder eine Fehlpaarung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die komplementäre Sequenz keine Fehlpaarungen und ist zu einem Teil des Target-Genregulationselements vollständig komplementär. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung befinden sich die Fehlpaarungen nicht an einer der Positionen 4, 5, 6, 16, 17 und/oder 18 der komplementären Sequenz.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls mit Komplementarität zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens wie oben beschrieben exprimiert, eine Länge von zum Beispiel ungefähr 15 bis ungefähr 30 bp aufweist, zum Beispiel 15 bis 30 bp, vorzugsweise ungefähr 19 bis ungefähr 26 bp, zum Beispiel 19 bis 26 bp, stärker bevorzugt ungefähr 21 bis ungefähr 25 bp, zum Beispiel 21 bis 25 bp, noch stärker bevorzugt 21 oder 24 bp.
Der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls mit Komplementarität zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens, welches auf dem obenbeschriebenen Nukleinsäurekonstrukt vorliegt, reguliert, könnte eine Identität von 60% oder mehr, vorzugsweise 70% oder mehr, stärker bevorzugt 75% oder mehr, noch stärker bevorzugt 80% oder mehr, am stärksten bevorzugt 90% oder mehr, aufweisen.
Das rekombinante Nukleinsäuremolekül mit Komplementarität zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens reguliert, könnte weiterhin mindestens ungefähr 7 bis ungefähr 11, zum Beispiel 7 bis 11, vorzugsweise ungefähr 8 bis ungefähr 10, zum Beispiel 8 bis 10, stärker bevorzugt ungefähr 9, zum Beispiel 9, aufeinanderfolgende Basenpaare mit Homologie zu dem Zielregulationselement aufweisen.
Die aufeinanderfolgenden Basenpaare weisen eine Identität zu dem Target-Genregulationselement von mindestens 80%, vorzugsweise 90%, stärker bevorzugt 95%, am stärksten bevorzugt 100% auf.
Der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls mit Komplementarität zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens reguliert, kann vollständig komplementär sein oder kann Fehlpaarungen umfassen. Vorzugsweise umfasst die komplementäre Region 5 oder weniger, 4 oder weniger, 3 oder weniger, 2 oder weniger oder eine Fehlpaarung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die komplementäre Region keine Fehlpaarungen und ist zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement, das die Expression eines Target-Gens reguliert, vollständig komplementär. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung befinden sich Fehlpaarungen nicht an einer der Positionen 4, 5, 6, 16, 17 und/oder 18 des Nukleinsäuremoleküls.
Das rekombinante Nukleinsäuremolekül mit Komplementarität zu einem pflanzenspezifischen Regulationselement könnte zum Bespiel in einem pre-miRNA-Gen oder einem Gen, das für eine ta-siRNA codiert, umfasst sein.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, umfassend ein wie oben definiertes Nukleinsäurekonstrukt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein System zum Erhöhen der Genexpression in einer Pflanze oder einem Teil davon bereit, das Folgendes umfasst:

a) ein pflanzenspezifisches Regulationselement, umfassend einen Abschnitt, der einer pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA mit Heterologie zu dem pflanzenspezifischen Regulationselement als Target dient, und
b) ein Konstrukt, umfassend eine aktivierende pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, der der unter a) definierte Abschnitt als Target dient, unter der Kontrolle eines pflanzenspezifischen Promoters.

Ein wie oben beschriebenes System gestattet eine präzise Expression eines Target-Gens in einer Pflanze oder einem Teil davon. Die Spezifität der Expression des Target-Gens hängt von dem mit der entsprechenden Anwendung zu erreichenden Ziel ab. So könnte es zum Beispiel vorteilhaft sein, ein Target-Gen in zwei unterschiedlichen Geweben oder in demselben Gewebe zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien einer Pflanze zu exprimieren. Endogene Regulationselemente mit solchen Spezifitäten sind häufig nicht verfügbar und könnten sogar nicht einmal existieren. Ein wie oben beschriebenes System kann dazu verwendet werden, um die Spezifitäten von unterschiedlichen Regulationselementen dadurch zu kombinieren, dass man einen spezifischen Abschnitt in ein gegebenes Regulationselement, das einer rekombinanten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA als Target dient, einführt. Auf diese Weise können die Expressionsmuster von zwei unterschiedlichen Regulationselementen kombiniert werden, da die Expression des rekombinanten Regulationselements bei Interaktion mit der aktivierenden pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die von einem unterschiedlichen Regulationselement mit unterschiedlicher Spezifität exprimiert wird, erhöht wird. Ebenso könnte die pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA unter der Kontrolle desselben Regulationselements wie das Target-Gen exprimiert werden, was zu einer erhöhten Expression des Target-Gens in den Zielgeweben führt, ohne dass das Expressionsmuster des Regulationselements verändert wird.
Daher kann die Spezifität der Expression eines Target-Gens an den Bedarf des Anwenders angepasst werden.
Das wie oben definierte System kann zum Beispiel dazu angewandt werden, um die Genexpression eines endogenen Gens zu erhöhen. Zu diesem Zweck könnte eine pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, der das endogene Regulationselement des Target-Gens als Target dient und die die Expression des endogenen Regulationselements des Target-Gens erhöht, in die Pflanze eingeführt werden. Es könnte auch möglich sein, in das Regulationselement des endogenen Gens einen Abschnitt, der einer pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, von der bekannt ist, dass sie bei Interaktion mit einem gegebenen Regulationselement die Expression erhöht, als Target dient, einzuführen. Der Abschnitt kann in das endogene Regulationselement entweder in vitro oder in vivo eingeführt werden, und zwar durch DNA-Rekombinationstechniken, mit denen der Fachmann vertraut ist. Das System könnte ebenso dazu verwendet werden, um die Genexpression eines Transgens zu erhöhen. Zu diesem Zweck kann ein Abschnitt, der einer pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA als Target dient, in die Sequenz eines Regulationselements, das die Expression eines transgenen Target-Gens kontrolliert, eingeführt werden. Das Konstrukt, umfassend das rekombinante Regulationselement und das Target-Gen, kann in eine Pflanze oder einen Teil davon auf demselben Konstrukt wie das Gen, das für die entsprechende pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA codiert, eingeführt werden; die beiden Komponenten könnten auf separaten Konstrukten vorliegen und in eine Pflanze oder einen Teil davon gleichzeitig oder in aufeinanderfolgenden Transformations- und/oder Kreuzungsschritten eingeführt werden.
Eine Pflanze oder ein Teil davon, umfassend ein wie oben definiertes rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül zu einer Erhöhung der Expression eines Target-Gens in der Pflanze oder dem Teil davon im Vergleich zu einer entsprechenden Pflanze oder Teil davon, die/der das rekombinante Nukleinsäuremolekül nicht umfasst, führt, ist ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
in einer Ausführungsform ist das rekombinante Nukleinsäuremolekül in das Genom der Pflanze oder des Teils davon integriert. Unter Genom versteht man im vorliegenden Zusammenhang das Kerngenom, das in den Plastiden der Pflanzen umfasste Genom, das auch unter der Bezeichnung Plastom bekannt ist, sowie das in den Mitochondrien der Pflanzen umfasste Genom.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein wie oben definiertes Verfahren, umfassend ein wie oben definiertes Nukleinsäurekonstrukt, eine wie oben definierte Pflanze und/oder eine wie oben definierte Pflanzenzelle.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Mikroorganismus, der fähig ist, Nukleinsäuren in eine Pflanze oder einen Teil einer Pflanze zu transferieren, wobei der Mikroorganismus ein wie oben definiertes rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt umfasst, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül beim Transfer des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts in eine Pflanze oder einen Teil einer Pflanze eine Erhöhung der Expression eines Target-Gens in der Pflanze oder dem Teil einer Pflanze im Vergleich zu einer entsprechenden Pflanze oder einem entsprechenden Teil einer Pflanze, die/der das rekombinante Nukleinsäuremolekül nicht umfasst, vermittelt. Solch ein Mikroorganismus gehört bevorzugt zu der Gattung Agrobacterium, vorzugsweise Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus Agrobacterium tumefaciens.
Ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten Nukleinsäurekonstrukts, eines wie oben definierten Vektors, einer wie oben definierten Pflanze und/oder eines wie oben definierten Teils einer Pflanze oder einer wie oben definierten Pflanzenzelle sind weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, die eine Erhöhung der Genexpression in einer Pflanze oder einem Teil davon, umfassend die Sequenz von einer der SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 und/oder 39, vermitteln.
Die Verwendung einer wie oben definierten pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA für die Erhöhung der Expression eines Target-Gens in einer Pflanze ist ebenfalls eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die pre-miRNA-, microRNA- oder ta-siRNA-Moleküle könnten in dieser Ausführungsform zum Beispiel zum Erhöhen der Expression eines endogenen Target-Gens oder zum Erhöhen der Expression eines transgenen Target-Gens verwendet werden.
DEFINITIONEN

Abkürzungen: BAP – 6-Benzylaminopurin; 2,4-D – 2,4-Dichlarphenaxyessigsäure; MS – Murashige-Skoog-Medium; NAA – 1-Naphthalinessigsäure; MES, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, IAA – Indolessigsäure; Kan – Kanamycinsulfat; GA3 – Gibberellinsäure; Timentin^TM – Ticarcillin-Dinatrium/Kaliumclavulanat.

Es ist klar, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die als solche beschriebenen jeweiligen Methodiken, Protokolle, Zelllinien, Pflanzenarten oder -gattungen, Konstrukte und Reagentien beschränkt ist. Es ist ebenfalls klar, dass die im vorliegenden Text verwendete Terminologie lediglich der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen dient und den Umfang der vorliegenden Erfindung, der nur durch die beigelegten Ansprüche eingeschränkt wird, nicht einschränken soll. Es ist anzumerken, dass im vorliegenden Text und in den beigefügten Ansprüchen die Singularformen (ein/e/s) und „der/die/das” auch den Plural beinhalten, außer wenn dies aus dem Zusammenhang anders hervorgeht. So bedeutet zum Beispiel die Erwähnung von „einem Vektor” die Erwähnung von einem oder mehreren Vektoren und beinhaltet Äquivalente davon, mit denen der Fachmann vertraut ist, usw. Der Begriff „ungefähr” soll im vorliegenden Zusammenhang „circa”, „grob gesagt”, „ungefähr” oder „im Bereich von” bedeuten. Wird der Begriff „ungefähr” im Zusammenhang mit einem Zahlenbereich verwendet, so modifiziert er diesen Bereich dadurch, dass er die oberen und unteren Grenzen der angeführten Zahlenwerte erweitert. Im Allgemeinen wird der Begriff „ungefähr” im vorliegenden Zusammenhang dazu verwendet, um einen Zahlenwert über und unter dem angegebenen Wert zu modifizieren, und zwar um eine Varianz von 20%, vorzugsweise 10%, hinauf oder hinunter (höher oder niedriger). Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet das Wort „oder” ein beliebiges Mitglied einer bestimmten Aufzählung und beinhaltet auch beliebige Kombinationen von Mitgliedern dieser Aufzählung. Die Wörter „umfassen”, „umfassend”, „beinhalten”, „beinhaltend” und „beinhaltet” sollen in dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen das Vorhandensein von einer/einem oder mehreren angegebenen Merkmalen, ganzen Zahlen, Komponenten oder Schritten angegeben, schließen jedoch das Vorhandensein oder die Hinzufügung von einer/einem anderen Merkmalen, ganzen Zahlen, Komponenten, Schritten oder Gruppen davon nicht aus. Aus Klarheitsgründen werden gewisse Ausdrücke, die in der Beschreibung verwendet werden, folgendermaßen definiert und verwendet:
Aktivieren: „Aktivieren”, „Induzieren” oder „Erhöhen” der Expression einer Nukleotidsequenz in einer Pflanzenzelle bedeutet, dass das Expressionsniveau der Nukleotidsequenz in einer Pflanzenzelle nach dem Anwenden eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung höher ist als ihre Expression in der Pflanze, dem dem Teil der Pflanze oder der Pflanzenzelle vor dem Anwenden des Verfahrens oder im Vergleich zu einer Referenzpflanze, die das erfindungsgemäße chimäre RNA-Molekül nicht aufweist. Die Begriffe „aktiviert”, „induziert” oder „erhöht” sind im vorliegenden Zusammenhang synonym und bedeuten eine höhere, vorzugsweise signifikant höhere, Expression der Nukleotidsequenz. Eine „höhere Expression” könnte auch bedeuten, dass die Expression der Nukleotidsequenz nicht nachweisbar war, bevor ein Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wurde. im vorliegenden Zusammenhang bedeutet eine „Aktivierung”, „Induktion” oder „Erhöhung” der Menge solch eines Agens wie eines Proteins oder einer mRNA, dass die Menge im Vergleich zu einer im Wesentlichen identischen Pflanze, einem im Wesentlichen identischen Teil einer Pflanze oder einer im Wesentlichen identischen Pflanzenzelle, die/der unter im Wesentlichen identischen Bedingungen herangezogen wurde, und die/der ein erfindungsgemäßes chimäres RNA-Malekül, das fähig ist, das Agens zu aktivieren, nicht aufweist, erhöht ist. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet „Aktivierung”, „Induktion” oder „Erhöhung” der Menge eines Agens (wie zum Beispiel einer preRNA, mRNA, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA, die von dem Target-Gen exprimiert wird, und/oder des Proteinprodukts, das davon codiert wird), dass die Menge um 10% oder mehr, zum Beispiel 50% oder mehr, vorzugsweise 100% oder mehr, stärker bevorzugt um das Fünffache oder mehr, am stärksten bevorzugt um das Zehnfache oder mehr, zum Beispiel um das Zwanzigfache in Bezug auf eine Zelle oder einen Organismus, die/der ein erfindungsgemäßes chimäres RNA-Molekül, das fähig ist, dieses Agens zu induzieren, nicht aufweist, erhöht ist. Es könnte auch bedeuten, dass die Expression eines Gens nach der Anwendung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung nachweisbar ist, während sie nicht nachweisbar war, bevor das Verfahren angewandt worden ist. Die Aktivierung, Erhöhung oder Induktion kann nach Verfahren bestimmt werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. So kann die Aktivierung, Erhöhung oder Induktion der Proteinmenge zum Beispiel durch einen immunologischen Nachweis des Proteins bestimmt werden. Weiterhin können biochemische Techniken, wie Northern-Hybridisierung, Nuklease-Schutz-Assay, reverse Transkription (quantitative RT-PCR), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Western-Blotting, Radioimmun-Assay (RIA) oder andere Immun-Assays und fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS) verwendet werden, um ein bestimmtes Protein oder eine bestimmte RNA einer Pflanze oder Pflanzenzelle zu messen. Je nach der Art des induzierten Proteinprodukts können auch seine Aktivität oder die Auswirkung auf den Phänotyp des Organismus oder der Zelle bestimmt werden. Der Fachmann ist mit Verfahren zur Bestimmung der Proteinmenge vertraut. Beispiel, die zu erwähnen sind, sind: micro-Biuret-Methode (Goa J. (1953) Scand. J. Clan. Lab. Invest. 5: 218–222), die Folin-Ciocalteau-Methode (Lowry O. H. et al. (1951) J. Biol. Chem. 193: 265–275) oder die Messung der Absorption von CBB G-250 (Bradford M. M. (1976) Analyt. Biochem. 72: 248–254).
Agronomisch wertvolles Merkmal: der Begriff „agronomisch wertvolles Merkmal” bezieht sich auf jeden Phänotyp in einem Pflanzenorganismus, der für die Nahrungsmittelproduktion oder für Nahrungsmittelprodukte, einschlielllich Pflanzenteile und Pflanzenprodukte, nützlich oder vorteilhaft ist. Nichtnahrungsmittel-Agrarprodukte, wie Papier usw. sind ebenfalls mit umfasst. Eine Teilliste von agronomisch wertvollen Merkmalen beinhaltet Schädlingsresistenz, Wüchsigkeit (Entwicklungszeit bis zur Ernte), erhöhten Nährstoffgehalt, neue Wachstumsmuster, Aromen oder Farben, Salz-, Hitze-, Dürre- und Kältetoleranz, und dergleichen. Vorzugsweise beinhalten die agronomisch wertvollen Merkmale nicht Selektionsmarkergene (z. B. Gene, die für Herbizid- oder Antibiotikaresistenz codieren und die nur dazu dienen, um den Nachweis oder die Selektion von transformierten Zellen zu erleichtern), Hormonbiosynthesegene, die zu der Produktion eines Pflanzenhormons (z. B. von Auxinen, Gibberellinen, Cytokininen, Abscisinsäure und Ethylen, die nur für Selektionszwecke verwendet werden) führen, oder Reportergene (z. B. Luciferase, Glucuronidase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT, usw.). Solche agronomisch wertvollen wichtigen Merkmale können die Verbesserung der Schädlingsresistenz (z. B. Melchers et al. (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 3(2): 147–52), der Wüchsigkeit, der Entwicklungszeit (Zeit bis zur Ernte), des erhöhten Nährstoffgehalts, der neuen Wachstumsmuster, Aromen oder Farben, der Salz-, Hitze-, Dürre- und Kältetoleranz (z. B., Sakamoto et al. (2000) J Exp. Bot. 51(342): 81–8; Saijo et al. (2000) Plant J. 23(3): 319–327; Yeo et al. (2000) Mol. Cells 10(3): 263–8; Cushman et al. (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 3(2): 117–24), und dergleichen beinhalten. Dem Fachmann ist klar, dass zahlreiche Polynukleotide existieren, aus denen ausgewählt werden kann, um diese und andere agronomisch wertvollen Merkmale zu vermitteln.
Aminosäuresequenz: Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Aminosäuresequenz” auf eine Aufzählung von Abkürzungen, Buchstaben, Symbolen oder Wörtern, die Aminosäurereste bedeuten. Die Aminosäuren können im vorliegenden Zusammenhang entweder mit ihren allgemein bekannten Drei-Buchstaben-Symbolen oder durch die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlenen Ein-Buchstaben-Symbole bezeichnet werden. Ebenso können die Nukleotide mit ihren allgemein anerkannten Ein-Buchstaben-Codes bezeichnet werden.
Antiparallel: „Antiparallel” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf zwei Nukleotidsequenzen, die über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basenresten gebunden sind, wobei die Phosphodiesterbindungen in eine Nukleotidsequenz in 5'-3'-Richtung laufen und in der anderen Nukleotidsequenz in 3'-5'-Richtung.
Antisense: Der Begriff „antisense” bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die in Bezug auf ihre normale Orientierung für die Transkription oder Funktion invertiert ist und so ein RNA-Transkript exprimiert, das zu einem innerhalb der Wirtszelle exprimierten Target-Gen-mRNA-Molekül komplementär ist (z. B. die mit dem Target-Gen-mRNA-Molekül oder der einzelsträngigen genomischen DNA über Watson-Crick-Basenpaarung hybridisieren kann) oder die zu einem Ziel-DNA-Molekül, wie zum Beispiel genomischer DNA, die in der Wirtszelle vorliegt, komplementär ist.
Codierregion: Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Codierregion”, wenn er in Bezug auf ein Strukturgen verwendet wird, auf die Nukleotidsequenzen, die für die in dem naszierenden Polypeptid als Ergebnis der Translation eines mRNA-Moleküls auftretenden Aminosäuren codieren. Die Codierregion wird in Eukaryonten an der 5'-Seite von dem Nukleotid-Triplett „ATG”, das für das Initiator-Methionin codiert, und an der 3'-Seite von einem der drei Tripletts, die Stopp-Codons spezifizieren (d. h. TAA, TAG, TGA), begrenzt. Zusätzlich dazu, dass die genomischen Formen eines Gens Introns enthalten, können sie auch Sequenzen beinhalten, die am 5' und am 3'-Ende der Sequenzen, die am RNA-Transkript vorhanden sind, liegen. Diese Sequenzen werden als „flankierende” Sequenzen oder Regionen bezeichnet (diese flankierenden Sequenzen befinden sich in 5'- oder 3'-Richtung von den nichttranslatierten Sequenzen, die auf dem mRNA-Transkript vorliegen). Die 5'-flankierende Region kann Regulationssequenzen wie Promoter und Enhancer enthalten, welche die Transkription des Gens kontrollieren oder beeinflussen. Die 3'-flankierende Region kann Sequenzen enthalten, die Transkriptionstermination, posttranskriptionelle Spaltung und Polyadenylierung dirigieren.
Komplementär: „komplementär” oder „ Komplementarität” bezieht sich auf zwei Nukleotidsequenzen, die antiparallele Nukleotidsequenzen umfassen, welche fähig sind, sich bei Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenresten in den antiparallelen Nukleotidsequenzen miteinander zu paaren (gemäß den Basenpaarungsregeln). Zum Beispiel ist die Sequenz 5'-AGT-3' zu der Sequenz 5'-ACT-3' komplementär. Die Komplementarität kann „teilweise” oder „vollständig” sein. Eine „teilweise” Komplementarität besteht dann, wenn eine oder mehrere Nukleinsäurebasen nicht gemäß den Basenpaarungsregeln gepaart sind. Eine „vollständige” oder „komplette” Komplementarität zwischen den Nukleinsäuremolekülen besteht dann, wenn jede einzelne Nukleinsäurebase mit einer anderen Base gemäß den Basenpaarungsregeln gepaart ist. Das Ausmaß der Komplementarität zwischen den Nukleinsäuremolekülsträngen hat signifikante Auswirkungen auf die Wirksamkeit und Stärke der Hybridisierung zwischen den Nukleinsäuremolekülsträngen. Ein „Komplement” einer Nukleinsäuresequenz bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine Nukleotidsequenz, deren Nukleinsäuremoleküle eine vollständige Komplementarität zu den Nukleinsäuremolekülen der Nukleinsäuresequenz aufweisen.
Das Vermitteln einer aktivierenden Expression bedeutet im vorliegenden Zusammenhang, dass bei Interaktion eines Peptids, Proteins und/oder Nukleinsäuremoleküls zum Beispiel einer pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, mit der Regulationsregion eines Gens die Expression dieses Gens im Vergleich zu der Expression des Gens vor Interaktion der Regulationsregion dieses Gens mit dem Peptid, Protein und/oder Nukleinsäuremolekül erhöht, induziert oder aktiviert wird. Die Interaktion der Regulationsregion mit dem Peptid, Protein und/oder Nukleinsäuremalekül, zum Beispiel einer pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, kann eine direkte Interaktion zum Beispiel eine Bindung, oder eine indirekte Interaktion, wobei das Peptid, Protein und/oder Nukleinsäuremolekül mit weiteren Elementen involviert ist, um eine Expressionsaktivierung zu vermitteln, sein.
Doppelstrang-RNA: ein „doppelstrang-RNA”-Molekül oder „dsRNA”-Molekül umfasst ein sense-RNA-Fragment einer Nukleotidsequenz und ein antisense-RNA-Fragment der Nukleotidsequenz, die beide Nukieotidsequenzen, die zueinander komplementär sind, umfassen und es so dem sense- und dem antisense-RNA-Fragment gestatten, sich miteinander zu paaren und ein Doppelstrang-RNA-Molekül zu bilden.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich „RNA-Aktivierung”, „RNAa” und „dsRNAa” auf die genspezifische Erhöhung der Expression, die von einer pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA induziert wird. Diese pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA könnte ein endogenes RNA-Molekül oder ein RNA-Molekül, das in eine Pflanze oder einen Teil davon eingeführt worden ist, sein und zum Beispiel auf einem Konstrukt umfasst sein, das bei Expression diese pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA produziert. Bei den Doppelstrang-RNA-Malekülen handelt es sich vorzugsweise um pre-miRNA oder ta-siRNAs.
Endogen: Eine „endogene” Nukleotidsequenz bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die in dem Genom der untransformierten Pflanzenzelle vorhanden ist.
Essential: Ein „essentielles” Gen ist ein Gen, das für ein Protein wie zum Beispiel ein Biosynthese-Enzym, einen Rezeptor, ein Signaltransduktionsprotein, ein Strukturgenprodukt oder ein Transportprotein, das/der für das Wachstum oder das Überleben der Pflanze oder Pflanzenzelle essentiell ist, codiert.
Expression: „Expression” bezieht sich auf die Biosynthese eines Genprodukts, vorzugsweise die Transkription und/oder Translation einer Nukleotidsequenz, zum Beispiel eines endogenen Gens oder eines heterologen Gens in einer Zelle. Bei einem Strukturgen zum Beispiel involviert Expression die Transkription des Strukturgens in mRNA und – gegebenenfalls – die anschließende Translation der mRNA in ein oder mehrere Polypeptide. In anderen Fällen kann sich Expression nur auf die Transkription der DNA, die ein RNA-Malekül birgt, beziehen.
Expressionskonstrukt: „Expressionskonstrukt” im vorliegenden Zusammenhang bedeutet ein DNA-Sequenz, die fähig ist, die Expression einer bestimmten Nukleotidsequenz mit einem entsprechenden Teil der Pflanze oder einer entsprechenden Pflanzenzelle zu dirigieren, der einen Promoter, der im Teil der Pflanze oder der Pflanzenzelle, in dem/die es eingeführt werden wird, funktionell ist, umfasst, und der operativ mit der Nukleotidsequenz von Interesse verbunden ist, die – gegebenenfalls – operativ mit Terminationssignalen verbunden ist. Ist eine Translation erforderlich, so umfasst es typischerweise auch Sequenzen, die für die korrekte Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. Die Codierregion kann für ein interessierendes Protein codieren, kann jedoch auch für eine interessierende funktionelle RNA, zum Beispiel RNAa, oder für eine beliebige sonstige nichtcodierende regulierende RNA codieren, und zwar in sense- oder antisense-Richtung. Das Expressionskonstrukt, das die interessierende Nukleotidsequenz umfasst, kann eine Chimäre sein, das bedeutet, dass mindestens eine seiner Komponenten in Bezug auf mindestens eine seiner sonstigen Komponenten heterolog ist. Das Expressionskonstrukt kann auch ein natürlich vorkommendes Expressionskonstrukt sein, das jedoch in rekombinanter Form erhalten wurde, so dass es sich für die heterologe Expression eignet. Typischerweise jedoch ist das Expressionskonstrukt in Bezug auf den Wirt heterolog, d. h. die bestimmte DNA-Sequenz des Expressionskonstrukts kommt nicht auf natürliche Weise in der Wirtszelle vor und muss in die Wirtszelle oder einen Vorläufer der Wirtszelle durch ein Transformations-Event eingeführt worden sein. Die Expression der Nukleotidsequenz in dem Expressionskonstrukt kann unter Kontrolle eines konstitutiven Promoters oder eines induzierbaren Promoters, der die Transkription nur dann initiiert, wenn die Wirtszelle einem bestimmten äußeren Reiz ausgesetzt wird, stehen. Bei einer Pflanze kann der Promoter auch für ein bestimmtes Gewebe oder Organ oder Entwicklungsstadium spezifisch sein.
Fremd: Der Begriff „fremd” bezieht sich auf jedes Nukleinsäuremolekül (z. B. eine Gensequenz), das in das Genom einer Zelle durch versuchsmäßge Manipulationen eingeführt wird und kann Sequenzen beinhalten, die in dieser Zelle auftreten, solange die eingeführte Sequenz irgendeine Modifikation enthält (z. B. eine Punktmutation, das Vorhandensein eines Selektionsmarkergens usw.) und sich daher von der natürlich vorkommenden Sequenz unterscheidet.
Gen: Der Begriff „Gen” bezieht sich auf eine Region, die mit entsprechenden Regulationssequenzen, die fähig sind, die Expression des Genprodukts (z. B. ein Polypeptid oder eine funktionelle RNA) auf irgendeine Art und Weise zu regulieren, operativ verknüpft ist. Ein Gen beinhaltet untranslatierte Regulationsregionen der DNA (z. B. Promoter, Enhancer, Repressoren usw.), die vor (stromaufwärts) und nach (stromabwärts) der Codierregion (offenes Leseraster, ORF) stehen, sowie, wo zutreffend, dazwischenliegende Sequenzen (z. B. Introns) zwischen einzelnen Codierregionen (d. h. Exons). Der Begriff „Strukturgen” soll im vorliegenden Zusammenhang eine DNA-Sequenz bedeuten, die in mRNA transkribiert wird, welche dann in eine Aminosäuresequenz, die für ein bestimmtes Polypeptid spezifisch ist, translatiert wird.
Genom und genomische DNA: Die Begriffe „Genom” oder „genomische DNA” beziehen sich auf die vererbbaren genetischen Informationen eines Wirtsorganismus. Diese genomische DNA umfasst die DNA des Zellkerns (auch als chromosomale DNA bezeichnet), jedoch auch die DNA der Plastiden (z. B. Chloroplasten) und von anderen Zellorganellen (z. B. der Mitochondrien). Vorzugsweise beziehen sich die Ausdrücke Genom oder genomische DNA auf die chromosomale DNA des Zellkerns.
Hairpin: im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich „Hairpin-RNA” oder „Hairpin-Struktur” auf jedes Doppelstrang-RNA- oder -DNA-Molekül, das mit sich selbst reassoziieren kann. In ihrer einfachsten Form besteht eine Hairpin-Struktur aus einem Doppelstrang-„Stem”, der aus den reassoziierenden Nukleotidsäuresträngen, die über einen Einzelstrang-Nukleinsäure-„Loop” verbunden sind, besteht, und wird auch als „Panhandle”-Nukleinsäure bezeichnet. Der Begriff „Hairpin-RNA” oder „Hairpin-Struktur” soll auch kompliziertere Sekundärnukleinsäurestrukturen, umfassend mit sich selbst reassoziierende Doppelstrangsequenzen, jedoch auch interne Ausbuchtungen und „Loops” beinhalten. Die spezifische Sekundärstruktur, die eingenommen wird, wird von der freien Energie des Nukleinsäuremoleküls bestimmt und kann für verschiedene Situationen mit einer entsprechenden Software wie FOLDRNA (Zuker und Stiegler (1981) Nucleic Acids Res. 9(1): 133–48; Zuker, M. (1989) Methods Enzymol. 180: 262–288) vorhergesagt werden.
Heterolog: Die Begriffe „heterolog” bedeuten in Bezug auf ein Nukleinsäuremolekül oder eine DNA eine Nukleotidsequenz, die mit einer Nukleinsäuremolekülsequenz, mit der sie in der Natur nicht operativ verknüpft war, operativ verknüpft ist bzw. dahingehend manipuliert wird, dass sie damit operativ verknüpft wird, oder an die sie in der Natur in einer unterschiedlichen Lage operativ verknüpft ist. Ein heterologes Expressionskonstrukt, umfassend eine Nukleinsäuresequenz und mindestens eine Regulationssequenz (wie einen Promoter oder ein Transkriptionsterminationssignal), die damit verknüpft ist, ist zum Beispiel ein Konstrukt, das durch versuchsmäßige Manipulationen entsteht, wobei entweder a) die Nukleinsäuresequenz oder b) die Regulationssequenz oder c) beide (d. h. a) und b)) nicht in ihrer natürlichen (nativen) genetischen Umwelt vorliegt/vorliegen oder durch versuchsmäßige Manipulationen modifiziert wurde/wurden, wobei ein Beispiel für eine Modifikation eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehr Nukleotidresten ist. Die natürliche genetische Umwelt bezieht sich auf den natürlichen chromosomalen Locus in dem Ausgangsorganismus oder auf das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek. Bei einer genomischen Bibliothek bleibt die natürliche genetische Umwelt der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise erhalten, zumindest teilweise. Die Umwelt flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest einseitig und weist eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindesten 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1,000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5,000 bp, auf. Ein natürlich vorkommendes Expressionskonstrukt – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination eines Promoters mit dem entsprechenden Gen – wird zu einem transgenen Expressionskonstrukt, wenn es durch nichtnatürliche, synthetische, „künstliche” Verfahren wie zu Beispiel Mutagenisierung modifiziert wird. Solche Verfahren sind beschrieben worden ( US 5,565,350 ; WO 00/15815 ). So zum Beispiel wird eine Proteincodiernukleinsäuresequenz in operativer Verknüpfung mit einem Promoter, bei dem es sich nicht um den nativen Promoter dieser Sequenz handelt, als heterolog in Bezug auf den Promoter betrachtet. Vorzugsweise ist die heterologe DNA nicht endogen mit bzw. nicht natürlich assoziiert mit der Zelle, in die sie eingeführt wird, sondern wurde aus einer anderen Zelle gewonnen oder wurde synthetisch hergestellt. Heterologe DNA beinhaltet auch eine endogene DNA-Sequenz, die eine gewisse Modifikation, nichtnatürlich vorkommende, multiple Kopien einer endogenen DNA-Sequenz, oder eine DNA-Sequenz, die mit einer anderen DNA-Sequenz, mit der sie physikalisch verbunden ist, nicht natürlich assoziiert ist, enthält. Im Allgemeinen, jedoch nicht unbedingt, codiert heterologe DNA für RNA und Proteine, die von der Zelle, in die sie exprimiert wurde, normalerweise nicht produziert werden.
Homologe DNA-Sequenz: „Homolog” bedeutet in Bezug auf den Vergleich von zwei oder mehr Nukleinsäure- oder Aminosäuremoleküle, dass den Sequenzen dieser Moleküle ein gewisses Ausmaß von Sequenzähnlichkeit gemein ist, wobei die Sequenzen teilweise identisch sind.
Hybridisierung: Der Begriff „Hybridisierung” beinhaltet im vorliegenden Zusammenhang „jeglichen Vorgang, durch den sich ein Strang von Nukleinsäuremolekülen durch Basenpaarung mit einem Komplementärstrang verbindet” (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). Die Hybridisierung und Stärke der Hybridisierung, (d. h. die Stärke der Assoziation zwischen den Nukleinsäuremolekülen) wird von Faktoren wie dem Ausmaß der Komplementarität zwischen den Nukleinsäuremolekülen, der Stringenz der vorherrschenden Bedingungen, der Tm des gebildeten Hybrids und dem G:C-Verhältnis innerhalb der Nukleinsäuremoleküle beeinflusst. im vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff „Tm” in Bezug auf die „Schmelztemperatur” verwendet. Die Schmelztemperatur ist diejenige Temperatur, bei der eine Population von Doppelstrangnukleinsäuremolekülen halb in Einzelstränge dissoziiert. Die Gleichung für die Berechnung der Tm von Nukleinsäuremolekülen ist in der Fachwelt bekannt. Aus Standardreferenzen ergibt sich, dass ein einfacher Schätzwert des Tm-Werts mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet werden kann: Tm = 81,5 + 0,41(% G + C), wenn ein Nukleinsäuremolekül in einer wässrigen Lösung mit 1 M NaCl vorliegt [siehe z. B. Anderson und Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]. In anderen Referenzen finden sich kompliziertere Berechnungen, die Strukturcharakteristika wie auch Sequenzcharakteristika für die Berechnung der Tm mit einbeziehen. Stringente Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und finden sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6.
In Bezug auf die Nukleinsäurehybridisierung umfassen Niederstringenzbedingungen Bedingungen, die der Bindung oder Hybridisierung bei 68°C in einer Läsung bestehend aus 5× SSPE (43,8 g/L NaCl, 6,9 g/L NaF₂PO₄·H₂O und 1,85 g/L EDTA, pH-Einstellung auf 7,4 mit NaOH), 1% SDS, 5× Denhardt-Reagens [50× Denhardt enthält pro 500 ml Folgendes: 5 g Ficoll (Typ 400, Pharmacia), 5 g BSA (Fraktion V; Sigma)] und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und anschließendem Waschen (vorzugsweise einmal 15 Minuten, stärker bevorzugt zweimal 15 Minuten, stärker bevorzugt dreimal 15 Minuten) mit einer Lösung, umfassend 1 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl plus 0,015 M Natriumcitrat) und 0,1% SDS, bei Raumtemperatur oder – vorzugsweise 37°C – entsprechen, wenn man eine DNA-Sonde mit einer Länge von vorzugsweise ungefähr 100 bis ungefähr 1000 Nukleotiden verwendet.
In Bezug auf die Nukleinsäurehybridisierung umfassen Mittelstringenzbedingungen Bedingungen, die der Bindung oder Hybridisierung bei 68°C in einer Lösung bestehend aus 5× SSPE (43,8 g/L NaCl, 6,9 g/L NaH₂PO₄·H₂O und 1,85 g/L EDTA, pH-Einstellung auf 7,4 mit NaOH), 1% SDS, 5× Denhardt-Reagens [50× Denhardt enthält pro 500 ml Folgendes: 5 g Ficoll (Typ 400, Pharmacia), 5 g BSA (Fraktion V; Sigma)] und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und anschließendem Waschen (vorzugsweise einmal 15 Minuten, stärker bevorzugt zweimal 15 Minuten, stärker bevorzugt dreimal 15 Minuten) mit einer Lösung, umfassend 0,1 × SSC (0,1 × SSC ist 0,15 M NaCl plus 0,015 M Natriumcitrat) und 1% SDS, bei Raumtemperatur oder – vorzugsweise 37°C – entsprechen, wenn man eine DNA-Sonde mit einer Länge von vorzugsweise ungefähr 100 bis ungefähr 1000 Nukleotiden verwendet.
In Bezug auf die Nukleinsäurehybridisierung umfassen Hochstringenzbedingungen Bedingungen, die der Bindung oder Hybridsierung bei 68°C in einer Lösung bestehend aus 5 × SSPE, 1% SDS, 5× Denhardt-Reagens und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und anschließendem Waschen (vorzugsweise einmal 15 Minuten, stärker bevorzugt zweimal 15 Minuten, stärker bevorzugt dreimal 15 Minuten) mit einer Lösung, umfassend 0,1 × SSC und 1% SDS bei 68°C, entsprechen, wenn man eine Sonde mit einer Länge von vorzugsweise ungefähr 100 bis ungefähr 1000 Nukleotiden verwendet.
Der Begriff „äquwalent” bedeutet in Bezug auf eine Hybridisierungsbedingung in Bezug auf eine interessierende Hybridisierungsbedingung, dass die Hybridisierungsbedingung und die interessierende Hybridisierungsbedingung zu der Hybridisierung von Nukleinsäuresequenzen mit demselben Prozentbereich (%) Homologie führen. Wenn zum Beispiel eine interessierende Hybridisierungsbedingung zu der Hybridisierung einer ersten Nukleinsäuresequenz mit anderen Nukleinsäuresequenzen, die 80% bis 90% Homologie zu der ersten Nukleinsäuresequenz aufweisen, führt, dann wird die andere Hybridisierungsbedingung als Äquivalent zu der interessierenden Hybridisierungsbedingung betrachtet, wenn diese andere Hybridisierungsbedingung ebenfalls zu der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresequenz mit den anderen Nukleinsäuresequenzen, die 80 bis 90% Homologie zu der ersten Nukleinsäuresequenz aufweisen, führt. In Bezug auf Nukleinsäurehybridisierung ist in der Fachwelt bekannt, dass zahlreiche äquivalente Bedingungen eingesetzt werden können, um entweder Nieder- oder Hochstringenzbedingungen zu umfassen; Faktoren wie die Länge und Art (DNA, RNA, Basenzusammensetzung) der Sonde sowie Art des Angriffspunkts (DNA, RNA, Basenzusammensetzung, in Lösung vorlegend oder immobilisiert, usw.) und Konzentration der Salze und anderen Komponenten, (z. B. Vorliegen oder Abwesenheit von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglykol) werden in Betracht gezogen, und die Hybridisierungslösung kann variiert werden, um entweder Nieder- oder Hochstringenzhybridisierungsbedingungen zu schaffen, die sich von den oben aufgeführten Bedingungen unterscheiden, ihnen jedoch äquivalent sind. Dem Fachmann ist bekannt, dass, während höhere Stringenzen für die Reduktion oder Elimination von unspezifischen Bindungen bevorzugt werden können, niedrigere Stringenzen für das Nachweisen einer größeren Anzahl von Nukleinsäuresequenzen mit unterschiedlichen Homologien bevorzugt sein können.
„Identität”: Der Begriff „Identität” ist ein Verhältnis zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Nukleinsäuremolekülsequenzen, wie durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt wird. In dem Fachgebiet bedeutet „Identität” auch das Ausmaß der Sequenzverwandschaft zwischen Polypeptid- oder Nukleinsäuremolekülsequenzen, wie durch das Übereinstimmen zwischen Abfolgen von solchen Sequenzen bestimmt wird. „Identität” wie im vorliegenden Text verwendet kann zwischen Nukleinsäuresequenzen desselben Ribonuklein-Typs (wie zwischen DNA- und DNA-Sequenzen) oder zwischen unterschiedlichen Typen (wie zwischen RNA- und DNA-Sequenzen) gemessen werden. Es ist klar, dass beim Vergleich einer RNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz eine „identische” RNA-Sequenz Ribonukleotide enthält, wo die DNA-Sequenz Desoxyribonukleotide enthält, und weiterhin, dass die RNA-Sequenz ein Uracil an Positionen enthält, wo die DNA-Sequenz Thymidin enthält.
Wird eine Identität zwischen RNA- und DNA-Sequenzen gemessen, so gelten Uracilbasen der RNA-Sequenzen als identisch zu den Thymidinbasen der DNA-Sequenzen. „Identität” kann leicht nach bekannten Verfahren berechnet werden, darunter, jedoch ohne Einschränkung, diejenigen, die beschrieben sind in Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Hrsg., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Hrsg., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., Stockton Press, New York (1991) und Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J. Applied Math, 48: 1073 (1988). Verfahren zur Bestimmung der Identität werden dahingehend entwickelt, dass man die größte Übereinstimmung zwischen den geprüften Sequenzen erhält. Weiterhin sind Verfahren zur Bestimmung der Identität in öffentlich zugänglichen Programmen niedergeschrieben. Zu den Computerprogrammen, die für die Bestimmung der Identität zwischen zwei Sequenzen verwendet werden können, zählen, jedoch ohne Einschränkung, GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984); die Folge von fünf BLAST-Programmen, drei, die für Nukleotidsequenzabfragen entwickelt wurden (BLASTN, BLASTX und TBLASTX) sowie zwei, die für Proteinsequenzabfragen entwickelt wurden (BLASTP und TBLASTN); (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76–80 (1994); Birren et al., Genome Analysis, 1: 543–559 (1997)). Das BLASTX-Programm ist beim NCBI und von anderen Quellen öffentlich verfügbar (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mal. Biol., 215: 403–410 (1990)). Der gut bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls für die Bestimmung der Identität verwendet werden. Zu den Parametern für den Polypeptidsequenzvergleich zählen typischerweise die Folgenden:

– Algorithm: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443–453 (1970)
– Comparison matrix: BLOSUM62 von Hentikoff und Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915–10919 (1992)
– Gap Penalty: 12
– Gap Length Penalty: 4

Ein Programm, das mit diesen Parametern verwendet werden kann, ist als „Gap”-Programm von Genetics Computer Group, Madison, Wis., öffentlich verfügbar. Die obengenannten Parameter sowie keine „Penalty” für „End Gap” sind die Default-Parameter für Peptidvergleiche.
Zu den Parametern für den Nukleinsäuremolekülsequenzvergleich zählen die Folgenden:

– Algorithm: Needleman und Wunsch, J. Mol. Blo. 48: 443–453 (1970)
– Comparison matrix: matches- +10; mismatches = 0
– Gap Penalty: 50
– Gap Length Penalty: 3

Im vorliegenden Zusammenhang wird die „Identität in %” mit den obengenannten Parametern als Default-Parameter für Nukleinsäuremolekülsequenzvergleiche und dem „Gap”-Programm von GCG, Version 10.2, bestimmt.
Intron: Der Begriff „Intron” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf den normalen Sinn des Begriffs und zwar mit der Bedeutung Abschnitt von Nukleinsäuremolekülen, üblicherweise DNA, der nicht einen Teil eines exprimierten Proteins oder das gesamte exprimierte Protein codiert und der unter endogenen Bedingungen in RNA-Moleküle transkribiert wird, jedoch aus der endogenen RNA herausgespleißt wird, bevor die RNA in ein Protein translatiert wird. Das Spleißen, d. h. die Entfernung von Introns, findet an einer definierten Spleißstelle, z. B. typischerweise mindestens ungefähr 4 Nukleotide, zwischen cDNA und Intronsequenz, statt. So zum Beispiel, und ohne Einschränkung, enthielten die im vorliegenden Test erläuterten sense- und antisense-Intron-Abschnitte, die eine Doppelstrang-RNA bilden, keine Spleißstellen. Den Introns kann eine Regulationsfunktion innewohnen, die die Genexpression reguliert, so können Introns zum Beispiel die Expressionsspezifität oder – stärke regulieren, oder sie können die Effizienz der RNA-Spleißung oder die RNA-Stabilität beeinflussen.
„Erhöhen”: Die Begriffe „Aktivieren”, „Erhöhen” und „Induzieren” werden im vorliegenden Zusammenhang in Bezug auf die Expression eines Gens als Synonyme verwendet. Siehe Definition oben für „Aktivieren”.
Isogen: Organismen (z. B. Pflanzen), die genetisch identisch sind, mit der Ausnahme, dass sie sich durch das Vorliegen oder Fehlen einer heterologen DNA-Sequenz unterscheiden können.
Isoliert: Der Begriff „isoliert” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang, dass ein Material durch den Menschen entfernt worden ist und außerhalb seiner ursprünglichen, nativen Umwelt vorliegt und daher nicht ein Naturprodukt ist. Ein isoliertes Material oder Molekül (wie ein DNA-Molekül oder ein Enzym) kann in aufgereinigter Form vorliegen oder kann in einer nichtnativen Umwelt vorliegen, wie zum Beispiel in einer transgenen Wirtszelle. So zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid, das in einer lebenden Pflanze vorhanden ist, nicht isoliert, jedoch dasselbe Polynukleotid bzw. Polypeptid, das von einem Teil oder allen koexisitierenden Materialien in dem natürlichen System getrennt ist, ist isoliert. Solche Polynukleotide können Teil eines Vektors sein, und/oder solche Polynukleotide oder Polypeptide könnten Teil einer Zusammensetzung sein, und wären insofern isoliert, als solch ein Vektor oder eine Zusammensetzung nicht Teil der ursprünglichen Umwelt ist. Vorzugsweise bezieht sich der Begrifft „isoliert”, wenn er in Bezug auf ein Nukleinsäuremolekül verwendet wird, wie zum Beispiel in „eine isolierte Nukleinsäuresequenz”, auf eine Nukleinsäuresequenz, die identifiziert und von mindestens einem kontaminierenden Nukleinsäuremolekül, mit dem es üblicherweise in seiner natürlichen Quelle assoziiert ist, getrennt ist. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist ein Nukleinsäuremolekül, das in einer Form oder einem Milieu vorliegt, die/das sich von der/dem in der Natur auftretenden Form bzw. Milieu unterscheidet. Im Gegensatz dazu sind nichtisolierte Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäuremoleküle wie DNA und RNA, die in dem Zustand auftreten, in dem sie in der Natur vorliegen. So zum Beispiel tritt eine gegebene DNA-Sequenz (z. B. ein Gen) auf dem Wirtszellenchromosom neben benachbarten Genen auf; RNA-Sequenzen, wie eine spezifische mRNA-Sequenz, die für ein spezifisches Protein codiert, tretten in der Zelle als Mischung mit zahlreichen anderen mRNAs, die für eine Vielzahl von Proteinen codieren, auf. Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die zum Beispiel SEQ ID NO: 1 umfasst, beinhaltet jedoch zum Beispiel solche Nukleinsäuresequenzen in Zellen, die üblicherweise SEQ ID NO: 1 enthalten, wobei die Nukleinsäuresequenz in einer chromosomalen oder extrachromosomalen Lage vorkommt, die sich von derjenigen der natürlichen Zellen unterscheidet, oder auf andere Weise von einer unterschiedlichen Nukleinsäuresequenz wie derjenigen, die in der Natur auftritt, flankiert wird. Die isolierte Nukleinsäuresequenz kann in Einzelstrangform oder Doppelstrangform vorliegen. Soll eine isolierte Nukleinsäuresequenz zum Exprimieren eines Proteins verwendet werden, so enthält die Nukleinsäuresequenz als Minimum zumindest einen Abschnitt des sense-Strangs bzw. Codierstrangs (d. h. die Nukleinsäuresequenz kann einzelsträngig sein). Alternativ dazu kann sie sowohl den sense- als auch den antisense-Strang enthalten (d. h. die Nukleinsäuresequenz kann doppelsträngig sein).
Minimalpromoter: Promoterelemente, insbesondere ein TATA-Element, die inaktiv sind oder die bei Fehlen einer Aktivierung stromaufwärts eine stark reduzierte Promoteraktivität aufweisen. In Gegenwart eines geeigneten Transkriptionsfaktors ermöglicht das Funktionieren des Minimalpromoters eine Transkription.
Nichtcodieren: Der Begriff „Nichtcodieren” bezieht sich auf Sequenzen von Nukleinsäuremolekülen, die nicht für einen Teil eines exprimierten Proteins oder das gesamte exprimierte Protein codieren. Zu nichtcodierenden Sequenzen zählen, jedoch ohne Einschränkung, Introns, Enhancer, Promoterregionen, 3'-untranslatierte Regionen sowie 5'-untranslatierte Regionen.
Nukleinsäuren und Nukleotide: Die Begriffe „Nukleinsäuren” und „Nukleotide” beziehen sich auf natürlich vorkommende oder synthetische oder künstliche Nukleinsäuren oder Nukleotide. Die Begriffe „Nukleinsäuren” und „Nukleotide” umfassen Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide oder beliebige Nukleotidanaloga und Polymere oder Hybride davon, und zwar entweder in Einzelstrang- oder Doppelstrangform, sense-Form oder antisense-Form. Falls nicht anders erwähnt umfasst eine bestimmte Nukleinsäuresequenz nicht nur die explizit angegebene Sequenz, sondern implizit auch konservativ modifizierte Varianten davon (z. B. degenerierte Codonsubstitutionen) sowie komplementäre Sequenzen. Der Begriff „Nukleinsäure” wird im vorliegenden Text austauschbar mit „Gen”, „cDNA”, „mRNA”, „Oligonukleotid” und „Polynukleotid” verwendet. Zu den Nukleotidanaloga zählen Nukleotide mit Modifikationen in der chemischen Struktur der Base, des Zuckers und/oder des Phosphate, darunter, jedoch nicht ausschließlich, Modifikationen der Pyrimidine in 5-Position, Modifikationen der Purine in 8-Position, Modifikationen von exocyclischen Cytosinaminen, Substitution von 5-Bromuracil und dergleichen; und Modifikationen von Zuckern in 2'-Position, darunter, jedoch nicht ausschließlich, zuckermodifizierte Ribonukleotide, in denen das 2'-OH durch eine Gruppe aus der Reihe H, OR, R, Halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 oder CN ersetzt ist. Kurze Hairpin-RNAs (shRNAs) können auch nichtnatürliche Elemente umfassen, wie nichtnatürliche Basen, z. B. Ionosin und Xanthin, nichtnatürliche Zucker, z. B. 2'-Methoxyribose oder nichtnatürliche Phosphodiesterbindungen, z. B. Methylphosphonate, Phosphorothioate und Peptide.
Nukleinsäuresequenz: Der Begriff „Nukleinsäuresequenz” bezieht sich auf ein einzelsträngiges oder doppelsträngiges Polymer von Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen, das vom 5'- zum 3'-Ende gelesen wird. Er beinhaltet chromosomale DNA, selbstreplizierende Plasmide, infektiöse Polymere von DNA oder RNA und DNA oder RNA mit primär strukturellem Zweck. „Nukleinsäuresequenz” bezieht sich auch auf eine aufeinanderfolgende Aufzählung von Abkürzungen, Buchstaben, Symbolen oder Wörtern, die Nukleotide darstellen. In einer Ausführungsform kann eine Nukleinsäure eine „Sonde” sein, wobei es sich um eine relativ kurze Nukleinsäure mit einer Länge von üblicherweise weniger als 100 Nukleotiden handelt. Häufig weist eine Nukleinsäuresonde eine Länge von ungefähr 50 Nukleotiden bis ungefähr 10 Nukleotiden auf. Eine „Zielregion” einer Nukleinsäure ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, der als interessant identifiziert wird. Eine „Codierregion” einer Nukleinsäure ist derjenige Abschnitt der Nukleinsäure, der, wenn er unter die Kontrolle von entsprechenden Regulationssequenzen gestellt wird, auf sequenzspezifische Art und Weise transkribiert und translatiert wird, wodurch man zu einem bestimmten Polypeptid oder Protein gelangt. Man sagt, dass die Codierregion für solch ein Polypeptid oder Protein codiert.
Oligonukleotid: Der Begriff „Oligonukleotid bezieht sich auf ein Oligomer oder Polymer von Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder ihren Mimetika, sowie auf Oligonukleotide mit nichtnatürlich vorkommenden Abschnitten mit einer ähnlichen Funktion. Solche modifizierten oder substituierten Oligonukleotide werden häufig gegenüber nativen Formen bevorzugt, da sie wünschenswerte Eigenschaften aufweisen, wie zum Beispiel eine gesteigerte Aufnahme durch die Zelle, eine gesteigerte Affinität als Target für Nukleinsäuren sowie eine erhöhte Stabilität in Gegenwart von Nukleasen. Ein Oligonukleotid beinhaltet vorzugsweise zwei oder mehr Nukleomonomere, die miteinander kovalent durch Bindungen (z. B. Phosphodiester) oder Ersatzbindungen gekoppelt sind.
Operative Verknüpfung: Der Begriff „operative Verknüpfung” oder „operativ verknüpft” soll zum Beispiel als die aufeinanderfolgende Anordnung eines Regulationselements (z. B. eines Promoters) mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz sowie gegebenenfalls weiteren Regulationselementen (wie z. B. einem Terminator) verstanden werden, so dass jedes der Regulationselemente seine gewünschte Funktion beim Ermöglichen, Modifrzieren, Erleichtern oder anderweitigem Beeinflussen der Expression dieser Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Je nach der Anordnung der Nukleinsäuresequenzen in Bezug auf sense- oder antisense-RNA kann Expression erfolgen. Zu diesem Zweck ist eine direkte Bindung im chemischen Sinn nicht unbedingt erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch auf die Zielsequenz von Positionen ausüben, die weiter entfernt sind, ja sogar von anderen DNA-Molekülen aus. Bevorzugte Anordnungen sind solche, in denen die rekombinant zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter die als Promoter agierende Sequenz gestellt wird, so dass die zwei Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Die Distanz zwischen der Promotersequenz und der rekombinant zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz beträgt vorzugsweise weniger als 200 Basenpaare, insbesondere vorzugsweise weniger als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt weniger als 50 Basenpaare. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter dem Promoter, so dass der Transkriptionsstart mit dem gewünschten Anfang der chimären RNA der Erfindung identisch ist. Eine operative Verknüpfung und ein Expressionskonstrukt können wie beschrieben mit Hilfe von üblichen Rekombinations- und Klonierungstechniken erzeugt werden (z. B. in in Maniatis T., Fritsch E. F. und Sambrook J. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. und Wiley Interscience; Gelvin et al. (Hrsg.) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Niederlande). Weitere Sequenzen, die beispielsweise als Linker mit spezifischen Restriktionsenzymspaltstellen oder als Signalpeptid agieren, können jedoch ebenfalls zwischen die zwei Sequenzen gestellt werden. Die Insertion von Sequenzen kann auch zur Expression von Fusionsproteinen führen. Vorzugsweise kann das Expressionskonstrukt, das aus einer Verknüpfung einer Regulationsregion, zum Beispiel einem Promoter und der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz besteht, in vektorintegrierter Form vorliegen und in ein Pflanzengenom zum Beispiel mittels Transformation insertiert werden.
Organ: Der Begriff „Organ” bedeutet in Bezug auf eine Pflanze (oder ein „Pflanzenorgan”) Teile einer Pflanze und kann Folgendes beinhalten (jedoch ohne Einschränkung): zum Beispiel Wurzeln, Früchte, Sprosse, Stängel, Blätter, Antheren, Kelchblätter, Blütenkronblätter, Pollen, Samen usw.
Überhang: Überhang ist eine relativ kurze einzelsträngige Nukleotidsequenz am 5'- oder 3'-Hydroxylende eines doppelsträngigen Oligonukleotidmoleküls (auch als „Extension”, „hervorstehendes Ende” oder „kohäsives Ende” bezeichnet).
Teil einer Pflanze: Der Begriff „Teil einer Pflanze” umfasst jeglichen Teil einer Pflanze, wie Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe oder eine oder mehrere Pflanzenzelle(n), wobei diese differenziert oder undifferenziert sein können.
Phasenregion: Unter Phasenregion versteht man im vorliegenden Zusammenhang eine Region auf einem ta-siRNA-Molekül mit Homologie zu einer Zielregion, das bei Prozessierung des ta-siRNA-Maleküls in einer Pflanzenzelle als 21 bis 24 bp kleines dsRNA-Molekül freigesetzt wird. Zielregionen von solchen kleinen dsRNA-Molekülen, die sich von ta-siRNA-Molekülen ableiten, sind zum Beispiel die Codierregion eines Target-Gens, die transkribierte Region eines Nichtcodiergens oder der Promoter eines Target-Gens. Die Prozessierung von ta-siRNAs und die Vorhersage von Phasenregionen sind zum Beispiel beschrieben bei Allen et al. (2005).
Pflanze: Die Begriffe „Pflanze” oder „pflanzlicher Organismus” beziehen sich auf jeden eukaryontischen Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, und auf die Zellen, Gewebe, Teile des Vermehrungsmaterials (wie Samen oder Früchte), die davon stammen. Im Umfang der Erfindung sind alle Gattungen und Arten der höheren und niederen Pflanzen des Königreichs der Pflanzen, jedoch auch Algen, eingeschlossen. Bevorzugt sind einjährige, mehrjährige, monokotyle und dikotyle Pflanzen und Gymnospermen. Eine „Pflanze” bezieht sich auf eine beliebige Pflanze oder einen beliebigen Pflanzenteil zu einem beliebigen Entwicklungsstadium. „Reife Pflanzen” bezieht sich auf Pflanzen in einem beliebigen Entwicklungsstadium nach dem Keimpflanzenstadium. Umfasst sind reife Pflanze, Samen, Sprosse und Keimpflanzen, sowie Teile, Vermehrungsmaterialien (z. B. Knollen, Samen oder Früchte) und Kulturen (z. B. Zellkulturen oder Kalluskulturen), die davon abstammen. Keimpflanze bedeutet eine junge, unreife Pflanze zu einem frühen Entwicklungsstadium. Ebenfalls umfasst darunter sind Ableger, Zell- oder Gewebekulturen und Semen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Begriff „Pflanzengewebe” – jedoch ohne Einschränkung – ganze Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzenorgane, Pflanzensamen, Protoplasten, Kallus, Zellkulturen sowie beliebige Gruppen von Pflanzenzellen, die strukturelle und/oder funktionelle Einheiten ergeben. Vorzugsweise bedeutet der Begriff „Pflanze” im vorliegenden Zusammenhang eine Mehrzahl von Pflanzenzellen, die größtenteils zu einer Struktur differenziert sind, die in einem beliebigen Stadium der Entwicklung einer Pflanze vorhanden ist. Zu solchen Strukturen zählen ein oder mehrere Pflanzenorgane, darunter jedoch ohne Einschränkung, Frucht, Spross, Stängel, Blatt, Blütenblatt usw. Stärker bevorzugt beinhaltet der Begriff „Pflanze” ganze Pflanzen, vegetative Organe/Strukturen des Sprosses (zum Beispiel Blätter, Stängel und Knollen), Wurzeln, Blüten und Blütenorgane/-strukturen (zum Beispiel Hochblätter, Kelchblätter, Blütenkronblätter, Staubblätter, Fruchtblätter, Antheren und Ovula), Samen (einschließlich Embryo, Endosperm und Samenhülle) und Früchte (reifes Ovarium), Pflanzengewebe (zum Beispiel Leitbündelgewebe, Grundgewebe und dergleichen) und Zellen (zum Beispiel Schließzellen, Eizellen, Trichome und dergleichen), sowie deren Nachkommen. Die Klasse der Pflanzen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, ist im Allgemeinen die gesamte Breite der Klasse der höheren und niederen Pflanzen, die Transformationstechniken zugänglich sind, einschließlich Angiospermen (monokotyle und dikotyle Pflanzen), Gymnospermen, Farne und mehrzellige Algen. Umfasst vom Umfang der Erfindung sind alle Gattungen und Arten der höheren und niederen Pflanzen des Königreichs Pflanzen. Umfasst sind weiterhin die reifen Pflanzen, Samen, Sprosse und Keimpflanzen, sowie Teile, Vermehrungsmaterial (zum Beispiel Samen und Früchte) und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, die davon abstammen. Bevorzugt sind Pflanzen und Pftanzenmaterial der folgenden Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tetragoniaceae. Bevorzugte Organismen für die Erzeugung von transgenen Pflanzen sind einjährige, mehrjährige, monokotyle und dikotyle Pflanzen. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist weiterhin vorteilhaft bei allen Zierpflanzen, Forstwirtschaft, Früchten oder Tierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern oder Rasen. Zu diesen Pflanzen können folgende zählen – jedoch ohne Einschränkung: Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Lebermoose) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Bärlapp, Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo sowie Gnetatae; Algen wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae. Pflanzen für die Zwecke der Erfindung können die folgenden Familien umfassen: Rosaceae, wie Rose, Ericaceae wie Rhododendron-Arten und Azaleen, Euphorbiaceae, wie Weinachtsstern und Croton, Caryophyllaceae, wie Nelken, Solanaceae, wie Petunien, Gesneriaceae, wie Usambaraveilchen, Balsaminaceae, wie Springkraut, Orchidaceae, wie Orchideen, Iridaceae, wie Gladiolen, Iris, Freesien und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae, wie Geranien, Lifiaceae, wie Dracaena, Moraceae, wie Ficus, Araceae, wie Philodendron und viele andere. Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen stammen weiterhin insbesondere aus der Reihe der dikotylen Kulturpflanzen wie zum Beispiel den Familien Leguminosae, wie Erbse, Luzerne und Sojabohne; der Familie Umbelliferae, insbesondere der Gattung Daucus (ganz besonders der Art carota (Karotte)) und Apium (ganz besonders der Art graveolens var. dulce (Sellerie)) und vielen anderen; der Familie Solanaceae, insbesondere der Gattung Lycopersicon, ganz besonders der Art esculentum (Tomate) und der Gattung Solanum, ganz besonders der Art tuberosum (Kartoffel) und Melongena (Aubergine), Tabak und vielen anderen; und der Gattung Capsicum, ganz besonders der Art annuum (Paprika) und vielen anderen; der Familie Leguminose, insbesondere der Gattung Glycine, ganz besonders der Art max (Sojabohne) und vielen anderen; der Familie Cruciferae, insbesondere der Gattung Brassica, ganz besonders der Art napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv. Tastie (Kraut), oleracea cv. Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv. Emperor (Brokkoli); sowie der Gattung Arabidopsis, ganz besonders der Art thaliana und vielen anderen; der Familie Compositae, insbesondere der Gattung Lactuca, ganz besonders der Art sativa (Salat) und vielen anderen. Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen stammen insbesondere aus der Reihe der monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreide wie Weizen, Gerste, Hirse, einschließlich Sorghumhirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer, und Zuckerrohr. Weiterhin bevorzugt sind Bäume wie Apfel, Birne, Quitte, Pflaume, Kirsche, Pfirsich, Nektarine, Aprikose, Papaya, Mango, sowie andere Gehölze, darunter Koniferen und laubabwerfende Bäume wie Pappel, Kiefer, Sequoia, Zeder, Eiche usw. Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Raps, Sojabohne, Mais (Kukuruz), Weizen, Baumwolle, Kartoffel und Tagetes.
Polypeptid: Die Begriffe „Polypeptid”, „Peptid”, „Oligopeptid”, „Palypeptid”, „Genprodukt”, „Expressionsprodukt” und „Protein” werden im vorliegenden Zusammenhang als gleichwertig verwendet, um ein Polymer oder Oligomer von aufeinanderfolgenden Aminosäureresten zu bezeichnen.
Präprotein: Protein, bei dem normalerweise ein Targeting an ein Zellorganell, wie einen Chloroplasten, erfolgt und das noch sein Transitpeptid umfasst.
Primärtranskript: Der Begriff „Primärtranskript” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf ein unreifes RNA-Transkript eines Gens. Ein „Primärtranskript” umfasst zum Beispiel noch Introns und/oder umfasst noch nicht einen polyA-Schwanz oder eine Cap-Struktur und/oder es fehlen ihm andere Modifikationen, die für sein korrektes Funktionieren als Transkript erforderlich sind, wie zum Beispiel Trimming oder Editieren.
Promoter: Die Begriffe „Promoter” oder „ Promotersequenz” sind Äquivalente; im vorliegenden Zusammenhang bedeuten sie eine DNA-Sequenz, die, wenn sie mit einer interessierenden Nukleotidsequenz ligiert wird, fähig ist, die Transkription der interessierenden Nukleotidsequenz im mRNA zu kontrollieren. Solche Promoter finden sich zum Beispiel in den folgenden öffentlichen Datenbanken: http://www.grassius.org/grasspromdb.html, http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=plantprom, http://ppdb.gene.nagoyau.ac.jp/cgi-bin/index.cgi. Die darin angeführten Promoter können mit dem Verfahren der Erfindung zielgesteuert werden und werden in dem vorliegenden Text durch Bezugnahme aufgenommen. Ein Promoter befindet sich in 5'-Richtung (d. h. stromaufwärts) in der Nähe des Transkriptionsstartpunkts einer interessierenden Nukleotidsequenz, deren Transkription in mRNA er kontrolliert, und stellt eine Stelle für die spezifische Bindung durch die RNA-Polymerase und andere Transkriptionsfaktoren zwecks Initiation der Transkription bereit. Der Promoter umfasst zum Beispiel die mindestens 10 kb, zum Beispiel 5 KB oder 2 kb, die der Transkriptionsstartstelle benachbart sind. Er kann auch die mindestens 1500 bp, vorzugsweise die mindestens 1000 bp, stärker bevorzugt die mindestens 500 bp, noch stärker bevorzugt die mindestens 400 bp, die mindestens 300 bp, die mindestens 200 bp oder die mindestens 100 bp, die der Transkriptionsstartstelle benachbart sind, umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Promoter die mindestens 50 bp, zum Beispiel mindestens 25 bp, die der Transkriptionsstartstelle benachbart sind. Der Promoter umfasst nicht Exon- und/oder Intronregionen oder 5'-untranslatierte Regionen. Der Promoter kann zum Beispiel heterolog oder homolog in Bezug auf die entsprechende Pflanze sein. Eine Polynukleotidsequenz ist „heterolog” in Bezug auf einen Organismus oder eine zweite Potynukleotidsequenz, wenn sie von einer fremden Art stammt oder, wenn sie von derselben Art ist, in Bezug auf ihre ursprüngliche Form modifiziert ist. So zum Beispiel bedeutet Promoter in operativer Verknüpfung zu einer heterologen Kodiersequenz eine Codiersequenz von einer Art, die sich von derjenigen, von der der Promoter erhalten wurde, unterscheidet, oder, wenn er von derselben Art ist, eine Codiersequenz, die mit dem Promoter nicht natürlich assoziiert ist (z. B. eine gentechnisch veränderte Codiersequenz oder ein Allel von einem unterschiedlichen Ökotyp oder einer unterschiedlichen Varietät). Geeignete Promoter können von Genen von Wirtszellen stammen, wo die Expression stattfinden soll, oder von Pathogenen von diesen Wirtszellen (zum Beispiel Pflanzen oder Pflanzenpathogenen wie Pflanzenviren). Ein pflanzenspezifischer Promoter ist ein Promoter, der sich für die Regulation der Expression in einer Pflanze eignet. Er kann von einer Pflanze stammen, jedoch auch von Pflanzenpathogenen, oder es kann sich um einen vom Menschen entwickelten synthetischen Promoter handeln. Handelt es sich bei einem Promoter um einen induzierbaren Promoter, dann erhöht sich die Transkriptionsrate als Reaktion auf ein Induktionsmittel. Der Promoter kann auch auf gewebespezifische oder gewebebevorzugte Weise reguliert werden, so dass er beim Transkribieren der assoziierten Codierregion nur, oder in erster Linie, in einem spezifischen Gewebetyp(en) wie Blättern, Wurzeln oder im Meristem aktiv ist. Der Begriff „gewebespezifisch” bezieht sich in Bezug auf amen Promoter auf einen Promoter, der fähig ist, eine selektive Expression einer interessierenden Nukleotidsequenz in einem bestimmten Gewebetyp (zum Beispiel Blütenkronenblättern) bei relativem Fehlen der Expression derselben interessierenden Nukleotidsequenz in einem unterschiedlichen Gewebetyp (zum Beispiel den Wurzeln) zu dirigieren. Die Gewebespezifität eines Promoters kann zum Beispiel dadurch ausgewertet werden, dass man ein Reportergen operativ mit der Promotersequenz verknüpft, um ein Reporterkonstrukt zu erzeugen, dann das Reporterkonstrukt in das Genom einer Pflanze einführt, so dass das Reporterkonstrukt in jedes Gewebe der erhaltenen transgenen Pflanze integriert ist, und die Expression des Reportergens (zum Beispiel Nachweisen von mRNA, Protein, oder der von dem Reportergen codierten Aktivität eines Proteins) in unterschiedlichen Geweben der transgenen Pflanze nachweist. Der Nachweis eines höheren Expressionsniveaus des Reportergens in einem oder mehreren Geweben in Bezug auf das Expressionsniveau des Reportergens in anderen Geweben zeigt, dass der Promoter für die Gewebe spezifisch ist, in denen höhere Expressionsniveaus nachgewiesen werden. Der Begriff „zelltypspezifisch” bezieht sich im Zusammenhang mit einem Promoter auf amen Promoter, der fähig ist, die selektive Expression einer interessierenden Nukleotidsequenz in einem spezifischen Zelltyp bei relativem Fehlen von Expression derselben interessierenden Nukleotidsequenz in einem unterschiedlichen Zelltyp innerhalb desselben Gewebes zu dirigieren. Der Begriff „zelltypspezifisch” bedeutet in Bezug auf einen Promoter auch einen Promoter, der fähig ist, die selektive Expression einer interessierenden Nukleotidsequenz in einer Region innerhalb eines einzelnen Gewebes voranzutreiben. Die Zelltypspezifität eines Promoters kann mit gut fachbekannten Verfahren beurteilt werden, zum Bespiel GUS-Aktivitätsfärbung, GFE-Protein-Färbung oder immunhistochemische Färbung. Der Begriff „konstitutiv” bedeutet im Zusammenhang mit einem Promoter, dass der Promoter fähig ist, die Transkription einer operativ verknüpften Nukleinsäuresequenz bei Fehlen eines Reizes (zum Beispiel Hitzeschock, Chemikalien, Licht usw.) in einem Großteil der Pflanzengewebe und -zellen zu dirigieren. Typischerweise sind konstitutive Promoter fähig, die Expression eines Transgens in im Wesentlichen jeglicher Zelle und jeglichem Gewebe zu dirigieren.
Aufgereinigt: Im vorliegenden Zusammenhang betrifft der Begriff „aufgereinigt” Moleküle, entweder Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die aus ihrer natürlichen Umwelt entfernt, isoliert oder getrennt sind. „Weitgehend aufgereinigte” Moleküle sind zumindest 60% frei, vorzugsweise mindestens 75% frei und stärker bevorzugt mindestens 90% frei von anderen Bestandteilen, mit denen sie auf natürliche Weise assoziiert sind. Eine gereinigte Nukleinsäuresequenz kann eine isolierte Nukleinsäuresequenz sein.
Rekombinant: Der Begriff „rekombinant” bedeutet in Bezug auf Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäuremoleküle, die mittels DNA-Rekombinationstechniken erzeugt worden sind. Rekombinante Nukleinsäuremoleküle können auch Moleküle umfassen, die als solche in der Natur nicht vorkommen, sondern die von Menschen modifiziert, verändert, mutiert oder sonstwie manipuliert sind. Vorzugsweise ist ein „rekombinantes Nukleinsäuremolekül” ein nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül, das sich in Bezug auf die Sequenz um mindestens eine Nukleinsäure von einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül unterscheidet. Ein „rekombinantes Nukleinsäuremolekül” kann auch ein „rekombinantes Konstrukt” umfassen, das, vorzugsweise in operativer Verknüpfung, eine Sequenz von Nukleinsäuremolekülen, die in der Natur in dieser Reihenfolge nicht vorkommen, umfasst. Bevorzugte Verfahren zur Herstellung dieses rekombinanten Nukleinsäuremoleküls können Klonierungstechniken, gerichtete oder ungerichtete Mutagenese-, Synthese- oder Rekombinationstechniken umfassen.
Referenzpflanze: Eine „Referenzpflanze” ist jede Pflanze, die als Referenz für eine genetisch modifizierte Pflanze, zum Beispiel eine transgene oder eine mutagenisierte Pflanze, verwendet wird. Eine Referenzpflanze ist vorzugsweise weitgehend identisch mit, stärker bevorzugt ein Klon der in dem jeweiligen Verfahren zur Transformierung oder Mutagenisierung wie oben definiert verwendeten Ausgangspflanze.
Regulations-Box einer Regulationsregion: Eine „Regulations-Box einer Regulationsregion” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang ein Sequenzelement oder ein Motiv, das in der Sequenz eine Regulationsregion, mit der Regulationsproteine und/oder Nukleinsäuren interagieren, umfasst ist, wodurch die Spezifität einer Regulationsregion beeinflusst wird. Eine Regulations-Box einer Regulationsregion kann zum Beispiel 22 bp oder weniger, vorzugsweise 16 bp oder weniger, stärker bevorzugt 12 bp oder weniger, noch stärker bevorzugt 8 bp oder weniger, lang sein. Die Regulations-Box einer Regulationsregion besteht aus mindestens 4 bp. Solche Regulations-Boxen sind zum Beispiel in der Transfac-Datenbank http://www.biobaseinternational.com/pages/index.php?id=transfac angeführt.
Regulatiorisregion: Eine „Regulationsregion” oder ein „Regulationselement” könnte jede auf dem Genom und/oder auf dem Transkript, das die Expression eines Gens beeinflusst, codierte Region sein. So zum Beispiel könnte „Einfluss” das Dirigieren oder das Verhindern der Expression, das Regulieren der Menge oder der Spezifität der Expression bedeuten. Vorgänge, die von einer Regulationsregion beeinflusst werden können, sind zum Beispiel die Transkription, die Translation oder die Stabilität des Transkripts. So sind zum Beispiel „Regulationsregionen” Promoter, Enhancer, Repressoren, Introns, 5'- und 3'-UTRs. Diese Aufzählung ist nicht erschöpfend. Eine pflanzenspezifische Regulationsregion ist eine Regulationsregion, die in einer Pflanze funktionell ist. Sie kann von einer Pflanze abstammen, jedoch auch von Pflanzenpathogenen, oder es könnte sich um eine vom Menschen entwickelte synthetische Regulationsregion handeln.
Ein „Abschnitt, der einer sncRNA als Target dient”, einschließlich einer sncaRNA, zum Beispiel pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, oder eine „Abschnitt” bedeutet einen Sektor oder Teil einer Regulationsregion, der mit einer sncRNA interagiert und so die Expression, die von der Regulationsregion vermittelt wird, reguliert, wie eine Erhöhung oder Verringerung der Expression. Bei der Interaktion kann es sich um eine direkte Interaktion der sncRNA und der Regulationsregion handeln, zum Beispiel eine Basenpaarung zwischen homologen Regionen der sncRNA und der Regulationsregion. Bei der Interaktion kann es sich auch um die Adsorption oder Anlagerung der sncRNA an die Regulationsregion ohne Basenpaarung zwischen den beiden Molekülen handeln. Zusätzlich kann sie eine indirekte Interaktion bedeuten, zum Beispiel insofern als die sncRNA mit einem oder mehreren Proteinen interagiert, die dann mit der Regulationsregion interagieren.
Ein „Abschnitt, der einer sncaRNA als Target dient” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine Nukleinsäuresequenz, die Teil einer Regulationsregion ist, mit der die sncaRNA, zum Beispiel aktivierende pre-miRNA, microRNA oder ta-siRNA, interagiert. Bei solch einem Abschnitt kann es sich um jede Region innerhalb einer pflanzenspezifischen Regulationsregion handeln, er kann eine Regulations-Box der Regulationsregion oder die Transkriptionsstartstelle der Regulationsregion ganz oder teilweise umfassen. Der Abschnitt ist zu einer scnaRNA, die bei Interaktion mit, zum Beispiel Bindung, einer sncaRNA, eine Erhöhung des von der Regulationsregion regulierten Gens vermittelt, homolog, zum Beispiel zu 70% oder mehr homolog, vorzugsweise zu 80% oder mehr homolog, stärker bevorzugt zu 90% oder mehr homolog, am stärksten bevorzugt zu 100% homolog.
Sense: Der Begriff „sense” soll ein Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die zu einer Zielsequenz komplementär ist oder damit identisch ist, bedeuten, zum Beispiel einer Sequenz, die an einen Proteintranskriptionsfaktor bindet und die an der Expression eines bestimmten Gens beteiligt ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül ein interessierendes Gen sowie Elemente, die die Expression des interessierenden Gens gestatten.
Kurze Hairpin-RNA: eine „kurze Hairpin-RNA” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang ein teilweise doppelsträngiges RNA-Molekül mit einer Länge von ungefähr 16 bis ungefähr 26 bp, zum Beispiel 16 bis 26 bp, das eine Hairpin-Struktur umfasst. Diese kurzen Hairpin-RNAs stammen von der Expression von Rekombinationskonstrukten ab, die in 5'- bis 3'-Richtung 16 bis 26 bp umfassen und anschließend einen kurzen Linker mit ungefähr 5–50 bp und anschließend 16 bis 26 bp, die zu den ersten 16 bis 26 bp zumindest teilweise komplementär sind, und anschließend eine 3'-untranskribierte Region. Dieses Konstrukt ist mit dem Promoter eines Pol-III-RNA-Gen-Promoters, zum Beispiel eines pflanzenspezifischen Pol-III-RNA-Gen-Promoters, operativ verknüpft. Bei Expression dieses Konstrukts bilden die jeweilig komplementären 16 bis 26 bp eine doppelsträngige Struktur, wobei der Linker eine Haarnadel (Hairpin) bildet. Solche Konstrukte sind zum Beispiel bei Lu et al. (2004) beschrieben. Der Fachmann weiß, dass bei der Entwicklung von solchen Konstrukten Variationen möglich sind.
Nennenswerte Erhöhung oder Erniedrigung: eine Erhöhung oder Erniedrigung, zum Beispiel bei der Enzymaktivität oder der Genexpression, die größer ist als die messtechnisch bedingte Fehlermarge, vorzugsweise eine Erhöhung oder Erniedrigung um das ungefähr Zweifache oder mehr als die Aktivität des Kontrollenzyms oder der Expression in der Kontrollzelle, stärker bevorzugt eine Erhöhung oder Erniedrigung um ungefähr das Fünffache oder mehr, und am stärksten bevorzugt eine Erhöhung oder Erniedrigung um ungefähr das Zehnfache oder mehr.
Kleine Nukleinsäuremoleküle: „Kleine Nukleinsäuremoleküle” bedeuten Moleküle, die aus Nukleinsäuren oder Derivaten davon bestehen, wie RNA oder DNA. Sie können doppelsträngig oder einzelsträngig sein und weisen eine Größe zwischen ungefähr 15 und ungefähr 30 bp, zum Beispiel zwischen 15 und 30 bp, stärker bevorzugt zwischen ungefähr 19 und ungefähr 26 bp, zum Beispiel zwischen 19 und 26 bp, noch stärker bevorzugt zwischen ungefähr 20 und ungefähr 25 bp, zum Beispiel zwischen 20 und 25 bp, auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Oligonukleotide eine Größe zwischen ungefähr 21 und ungefähr 24 bp, zum Beispiel zwischen 21 und 24 bp, auf. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform weisen die kleinen Nukleinsäuremoleküle eine Größe von ungefähr 21 bp und ungefähr 24 bp, zum Beispiel 21 bp und 24 bp auf.
Kleine nichtcodierende RNA: Eine „kleine nichtcodierende RNA” oder „sncRNA” bedeutet im vorliegenden Dokument RNAs, die von einer Pflanze oder einem Teil davon abstammen und die nicht für ein Protein oder Peptid codieren und eine biologische Funktion als RNA-Molekül als solches aufweisen. Sie sind zum Beispiel an der Regulation der Genexpression, wie Transkription, Translation, Prozessierung der pre-mRNA und mRNA und/oder am RNA-Abbau, beteiligt. Es wurden sehr viele unterschiedliche „sncRNAs” identifiziert, die sich bezüglich Ursprung und Funktion unterscheiden. „SncRNAs” sind zum Beispiel ta-siRNAs, shRNAs, siRNAs, microRNAs, snRNAs, nat-siRNA und/oder snoRNAs. Sie können doppelsträngig oder einzelsträngig sein und weisen eine Größe zwischen ungefähr 10 und ungefähr 80 bp, zum Beispiel zwischen 10 und 80 bp, zwischen ungefähr 10 und ungefähr 50 bp, zum Beispiel zwischen 10 und 50 bp, zwischen 15 und ungefähr 30 bp, zum Beispiel zwischen 15 und 30 bp, stärker bevorzugt zwischen ungefähr 19 und ungefähr 26 bp, zum Beispiel zwischen 19 und 26 bp, noch stärker bevorzugt zwischen ungefähr 20 und ungefähr 25 bp zum Beispiel zwischen 20 und 25 bp, auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Oligonukleotide eine Größe zwischen ungefähr 21 und ungefähr 24 bp, zum Beispiel zwischen 21 und 24 bp, auf. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform weisen die sncRNAs eine Größe von ungefähr 21 bp und ungefähr 24 bp, zum Beispiel 21 bp und 24 bp, auf.
Kleine nichtcodierende aktivierende RNA: „Kleine nichtcodierende aktivierende RNA” oder „sncaRNA” bedeuten im vorliegenden Dokument eine Untergruppe der sncRNAs. Sie sind an der Regulation der Genexpression beteiligt. Bei Interaktion mit Regulationsregionen führen sie zu einer erhöhten Expression, die von diesen Regulationsregionen stammt.
Stabilisieren: Die Expression einer Nukleotidsequenz in einer Pflanzenzelle zu „stabilisieren” bedeutet, dass das Expressionsniveau der Nukleotidsequenz nach der Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens in Zellen aus demselben Gewebe in unterschiedlichen Pflanzen derselben Generation oder über mehrere Generationen hinweg, ungefähr dasselbe ist, wenn die Pflanzen unter denselben oder vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden.
Weitgehend komplementär: im weitesten Sinn bedeutet der Begriff „weitgehend komplementär”, wenn er für eine Nukleotidsequenz in Bezug auf eine Referenz- oder Zielnukleotidsequenz verwendet wird, eine Nukleotidsequenz mit einem Identitätsprozentsatz zwischen der weitgehend komplementären Nukleotidsequenz und der exakt komplementären Sequenz dieser Referenz- oder Zielnukleotidsequenz von mindestens 60%, stärker erwünscht mindestens 70%, stärker erwünscht mindestens 80% oder 85%, vorzugsweise mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 95% oder 96%, noch stärker bevorzugt vorzugsweise mindestens 97% oder 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99% oder am stärksten bevorzugt 100% (wobei Letzteres in diesem Zusammenhang dem Begriff „identisch” äquivalent ist). Vorzugsweise wird die Identität über eine Länge von mindestens 19 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 50 Nukleotiden, stärker bevorzugt über die gesamte Länge der Nukleinsäuresequenz gegenüber der Referenzsequenz beurteilt (falls unten nicht anders angegeben). Sequenzvergleiche werden unter Verwendung der Default-GAP-Analyse mit der University of Wisconsin GCG, SEQWEB-Applikation von GAP, durchgeführt, die auf dem Algorithmus von Needleman und Wunsch (Needleman und Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443–453; wie oben definiert) beruht. Eine Nukleotidsequenz, die gegenüber einer Referenznukleotidsequenz „weitgehend komplementär” ist, hybridisiert mit der Referenznukleotidsequenz unter Niederstringenzbedingungen, vorzugsweise Mittelstringenzbedingungen, am stärksten bevorzugt Hochstringenzbedingungen (wie oben definiert).
Weitgehend identisch: In weitesten Sinn bedeutet der Begriff „weitgehend identisch”, wenn er im vorliegenden Zusammenhang in Bezug auf eine Nukleotidsequenz verwendet wird, eine Nukleotidsequenz in Bezug auf eine Referenz- oder Zielnukleotidsequenz, wobei der Identitätsprozentsatz zwischen der weitgehend identischen Nukleotidsequenz und der Referenz- oder Zielnukleotidsequenz erwünschterweise mindestens 60%, stärker erwünscht mindestens 70%, stärker erwünscht mindesteris 80% oder 85%, vorzugsweise mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 93%, noch stärker bevorzugt mindestens 95% oder 96%, noch stärker bevorzugt mindestens 97% oder 98%, noch stärker bevorzugt mindestens 99% oder am stärksten bevorzugt 100% (wobei Letzteres in diesem Zusammenhang dem Begriff „identisch” äquivalent ist), beträgt. Vorzugsweise wird die Identität über eine Länge von mindestens 19 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 50 Nukleotiden, stärker bevorzugt über die gesamte Länge der Nukleinsäuresequenz gegenüber der Referenzsequenz beurteilt (falls unten nicht anders angegeben). Sequenzvergleiche werden unter Verwendung der Default-GAP-Analyse mit der University of Wisconsin GCG, SEQWEB-Applikation von GAP, durchgeführt, die auf dem Algorithmus von Needleman und Wunsch (Needleman und Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443–453; wie oben definiert) beruht. Eine mit einer Referenznukleotidsequenz „weitgehend identische” Nukleotidsequenz hybridisiert mit der exakt komplementären Sequenz der Referenznukleotidsequenz (d. h. ihrem entsprechenden Strang in einem doppelsträngigen Molekül) unter Niederstringenzbedingungen, vorzugsweise Mittelstringenzbedingungen, am stärksten bevorzugt Hochstringenzbedingungen (wie oben definiert). Homologe einer spezifischen Nukleotidsequenz beinhalten Nukleotidsequenzen, die für eine Aminosäuresequenz codieren, die zu der Referenzaminosäuresequenz gemäß Messung unter Verwendung der der oben beschriebenen Parameter zu mindestens 24% identisch, stärker bevorzugt zu mindestens 35% identisch, noch stärker bevorzugt zu mindestens 50% identtsch, noch stärker bevorzugt zu mindestens 65% identisch ist, wobei die von dem Homolog codierte Aminosäuresequenz dieselbe biologische Aktivität wie das von dem spezifischen Nukleotid codierte Protein aufweist. Der Begriff „weitgehend identisch” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang in Bezug auf ein Polypeptid ein Protein, das einem Referenzpolypeptid entspricht, wobei das Polypeptid weitgehend dieselbe Struktur und Funktion wie das Referenzprotein aufweist, zum Beispiel wo nur Aminasäuresequenzänderungen auftreten, die die Polypeptidfunktion nicht beeinflussen. Wird er für ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz verwendet, so beträgt der ldentitätsprazentsatz zwischen dem weitgehend ähnlichen Polypeptid und dem Referenzpolypeptid bzw. zwischen der weitgehend ähnlichen Aminosäuresequenz und der Referenzaminosäuresequenz mindestens 24%, stärker erwünscht mindestens 30%, stärker erwünscht mindestens 45%, vorzugsweise mindestens 60%, stärker bevorzugt mindestens 75%, noch stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 95%, noch stärker bevorzugt mindestens 99%, und zwar unter Verwendung der Default-GAP-Analyseparameter wie oben beschrieben. Homologe sind Aminosäuresequenzen, die zu dem Referenzpolypeptid bzw. der Referenzaminosäure gemäß Messung mit den oben beschriebenen Parametern zu mindestens 24% identisch, stärker bevorzugt zu mindestens 35% identisch, noch stärker bevorzugt zu mindestens 50% identisch, noch stärker bevorzugt zu mindestens 65% identisch sind, wobei die von dem Homolog codierte Aminosäuresequenz dieselbe biologische Wirksamkeit wie das Referenzpolypeptid aufweist. Der Begriff „weitgehend identisch” bedeutet im vorliegenden Zusammen in Bezug auf eine Pflanze im breitesten Sinn zwei Pflanzen derselben Gattung. Wird er für eine transgene Pflanze und eine Referenzpflanze verwendet, so bedeutet „weitgehend identisch”, dass die genomische Sequenz der Referenzpflanze zu der transgenen Pflanze weitgehend identisch ist, mit Ausnahme des rekombinanten Konstrukts, das die transgene Pflanze trägt.
Die Begriffe „Ziel/Target”, „Ziel/Target-Gen” und „Ziel/Target-Nukleotidsequenz” werden als äquivalent eingesetzt. Im vorliegenden Zusammenhang kann es sich bei einem Target-Gen um ein beliebiges interessierendes Gen, das in einer Pflanze vorliegt, handeln. Ein Target-Gen kann endogen sein oder eingeführt sein. So zum Beispiel ist ein Target-Gen ein Gen mit einer bekannten Funktion, oder ein Gen, dessen Funktion unbekannt ist, dessen Gesamt- oder Partialnukleotidsequenz jedoch bekannt ist. Ein Target-Gen ist ein natives Gen der Pflanzenzelle oder ein heterologes Gen, das zuvor in die Pflanzenzelle oder eine Elternzelle dieser Pflanzenzelle eingeführt worden ist, zum Beispiel durch genetische Transformation. Ein heterologes Target-Gen ist in das Genom der Pflanzenzelle stabil integriert oder liegt in der Pflanzenzelle als extrachromosomales Molekül vor, zum Beispiel als autonom replizierendes extrachromosomales Molekül. Ein Target-Gen kann Polynukleotide beinhalten, die eine Region umfassen, die für eine Polypeptid- oder Polynukleotidregion codiert, die die Replikation, Transkription, Translation oder einen anderen Vorgang, der bei der Expression eines Zielproteins wichtig ist, reguliert; oder ein Polynukleotid, das eine Region umfasst, die für das Zielpolypeptid codiert, und eine Region, die die Expression des Zielpolypeptids reguliert; oder nichtcodierende Regionen, wie die 5'- oder 3'-UTR, oder Introns. Ein Target-Gen kann sich zum Beispiel auf ein RNA-Molekül, das durch Transkription eines interessierenden Gens erzeugt worden ist, beziehen. Bei dem Target-Gen kann es sich auch um ein heterologes Gen handeln, das in einer rekombinanten Zelle oder einer genetisch veränderten Pflanze exprimiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei Target-Genen um Gene, die agronomisch wichtige Merkmale verbessern, wie zum Beispiel Ertrag und Ertragsstabilität, Stressresistenz, was sowohl biotische als auch abiotische Stressfaktoren wie Pilzresistenz oder Dürreresistenz umfasst. Weitere agronomisch wichtige Merkmale sind zum Beispiel der Gehalt an Vitaminen, Aminosäuren, PUFAs oder anderen interessierenden Metaboliten.
Gewebe: Der Begriff „Gewebe” bedeutet in Bezug auf eine Pflanze die Anordnung von mehreren Zellen, einschließlich differenzierten und undifferenzierten Geweben des Organismus. Gewebe können einen Teil eines Organs darstellen (zum Bespiel die Epidermis eines Pflanzenblatts), können jedoch auch Tumorgewebe (zum Beispiel Kallusgewebe) und verschiedene Arten von Zellen in Kultur (zum Beispiel Einzelzellen, Protoplasten, Embryos, Kalli usw.) darstellen. Das Gewebe kann in vivo (zum Beispiel in planta), in Organkultur, Gewebekultur oder Zellkultur vorliegen.
Transformation: Der Begriff „Transformation” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf die Einführung von genetischem Material (z. B. eines Transgens oder von heterologen Nukleinsäuremolekülen) in eine Pflanzenzelle, in Pflanzengewebe oder eine Pflanze. Die Transformation einer Zelle kann stabil oder transient sein. Der Begriff „transiente Transformation” oder „transient transformiert” bezieht sich auf die Einführung von einem oder mehreren Transgenen in eine Zelle, ohne dass das Transgen in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Eine transiente Transformation kann zum Beispiel durch den enzymgebundenen Immunsorptions-Assay (ELISA) nachgewiesen werden, mit dem das Vorliegen eines Polypeptids, das von einem oder mehreren der Transgene codiert wird, nachgewiesen wird. Eine transiente Transformation kann jedoch auch durch Nachweisen der Aktivität des Proteins (z. B. β-Glucuronidase), das von dem Transgen codiert wird (z. B. dem uid-A-Gen), nachgewiesen werden. Der Begriff „transiente Transformante” bezieht sich auf eine Zelle, die ein oder mehrere Transgene transient eingebaut enthält. Im Gegensatz dazu bezieht sich der Begriff „stabile Transformation” oder „stabil transformiert” auf die Einführung und Integration von einem oder mehreren Transgenen in das/dem Genom einer Zelle, was vorzugsweise zu chromosomaler Integration und stabiler Vererbbarkeit durch Meiose führt. Die stabile Transformation einer Zelle kann durch Southern-Blot-Hybridisierung von genomischer DNA der Zelle mit Nukleinsäuresequenzen, die an eines oder mehrere der Transgene zu binden vermögen, nachgewiesen werden. Alternativ dazu kann die stabile Transformation einer Zelle auch mittels Polymerase-Kettenreaktion von genomischer DNA der Zelle zwecks Amplifikation von Transgensequenzen nachgewiesen werden. Der Begriff „stabile Transformante” bezieht sich auf eine Zelle, die ein oder mehrere Transgene stabil in die genomische DNA integriert enthält. Eine stabile Transformante unterscheidet sich also von einer transienten Transformante dadurch, dass, während genomische DNA von der stabilen Transformante ein oder mehrere Transgene enthält, genomische DNA von der transienten Transformante kein Transgen enthält. Transformation beinhaltet auch die Einführung von genetischem Material in Pflanzenzellen in Form von Pflanzenvirusvektoren unter Einbeziehung von epichromosomaler Replikation und Genexpression, was variable Eigenschaften in Bezug auf Meiosestabilität aufzeigen kann. Transformierte Zellen, Gewebe oder Pflanzen sollen nicht nur das Endprodukt eines Trarisformationsvorgangs, sondern auch die transgene Nachkommenschaft davon, umfassen.
Transgen: Der Begriff „Transgen” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die in das Genom einer Zelle durch experimentelle Manipulationen eingeführt wird. Bei einem Transgen kann es sich um eine „endogene DNA-Sequenz” oder eine „heterologe DNA-Sequenz” (d. h. „Fremd-DNA”) handeln. Der Begriff „endogene DNA-Sequenz” bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die in der Zelle, in die sie eingeführt wird, auf natürliche Weise auftritt, solange sie nicht irgendeine Modifikation (z. B. eine Punktmutation, das Vorliegen eines Selektionsmarkergens usw.) in Bezug auf die natürlich vorkommende Sequenz enthält.
Transgen: Der Begriff „transgen” bedeutet in Bezug auf eine Pflanzenzelle, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanze, dass diese(s) mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das vorzugsweise einen geeigneten Promoter in operativer Verknüpfung mit einer interessierenden DNA-Sequenz umfasst, transformiert, vorzugsweise stabil transformiert, ist.
Vektor: Im vorliegeriden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das fähig ist, ein anderes Nukleinsäuremolekül, mit dem es verbunden worden ist, zu transportieren. Eine Art von Vektor ist ein genomisch integrierter Vektor, oder „integrierter Vektor”, der in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert werden kann. Ein weiterer Typ eines Vektors ist ein episomaler Vektor, d. h. ein Nukleinsäuremolekül, das zur extrachromosomalen Replikation befähigt ist. Vektoren, die fähig sind, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verknüpft sind, zu dirigieren, werden im vorliegenden Text als „Expressionsvektoren” bezeichnet. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid” und „Vektor” austauschbar verwendet, falls dies nicht aus dem Zusammenhang anders hervorgeht. Expressionsvektoren, die dahingehend entwickelt wurden, dass sie in vitro oder in vivo wie hierin beschriebene RNAs produzieren, können Sequenzen enthalten, die von irgendeiner RNA-Polymerase erkannt werden, darunter mitrochondrieller RNA-Polymerase, RNA pol I, RNA pol II und RNA pol III. Mit diesen Vektoren kann das gewünschte RNA-Molekül in der erfindungsgemäßen Zelle transkribiert werden. Unter einem Pfianzentransformationsvektor versteht man einen Vektor, der sich für das Verfahren der Pflanzentransformation eignet.
Wildtyp: Der Begriff „Wildtyp”, „natürlich” oder „natürlicher Ursprung” bedeutet in Bezug auf einen Organismus, ein Polypeptid oder eine Nukleinsäuresequenz, dass dieser Organismus natürlich vorkommt oder zumindest in einem natürlich vorkommenden Organismus, der vom Menschen nicht verändert, mutiert oder anderweitig manipuliert ist, auftritt.
Beispiele
Beispiel 1 Arabidopsis-Protoplastentransformation und hormoninduzierbarer Promoter-Reporter-Assay
Material und Methoden
Pflanzenmaterial: Für die Versuche wurden vier Wochen alte Arabidopsis Pflanzen des Ökotyps col-0 eingesetzt.
Plasmidkonstrukte:
Die Versuche wurden unter Verwendung von 2 unterschiedlichen Promoter::Reporter-Konstrukten durchgeführt. GH3-LUC, das von IAA induziert wird, und RD29A-LUC (Kovtun et al., 2000,. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 97: 2940–2945), das von ABA induziert wird, wurden vom Arabidopsis Biological Resource Center (www.biosci.ohiostate.edu/-plantbio/Facilities/abrclabrccontactus.htm) bezogen.
Protoplastenisolation:
Für die Protoplastenisolation wurden gut entfaltete gesunde Blätter verwendet. Die Protoplasten wurden gemäß Yoo et al., (2007, Nature protocols 2(7): 1565–1572) mit einigen Modifikationen isoliert. Ungefähr 10–20 Blätter wurden in 10 ml Enzymlösung, die 1,5% Cellulose und 0,3% Macerozym enthielt, verdaut. Die Blätter wurden in 0,5–1 mm breite Blattstreifen geschnitten und in die Enzymlösung eingetaucht und 3 Minuten lang im Vakuum infiltriert. Nach dem Ende der 3 Minuten wurde das Vakuum rasch abgeschaltet, um die Enzymlbsung in die Blattabschnitte zu drücken. Der Vorgang wurde dreimal wiederholt. Die Blätter wurden über Nacht in der Enzymlösung belassen.
Protopfastentransformation:
1 × 104 Protoplasten wurden mit 10 μg Plasmid-DNA unter Verwendung von PEG (Polyethylenglykol) transformiert. Die transformierten Protoplasten wurden 16 h lang im Dunkeln mit 1 μM IAA im Fall der mit GH3-LUC transformierten Protoplasten bzw. 100 μM ABA im Fall der mit RD29A-LUC transformierten Protoplasten induziert. Die Kontrollen waren scheintransformierte Protoplasten und Protoplasten, die mit ihren entsprechenden Plasmiden transformiert worden waren, jedoch nicht mit IAA oder ABA behandelt worden waren.
Bei Versuchen mit siRNA wurden 1 × 104 Protoplasten mit 10 μg Reporterplasmid und 5 μg siRNA cotransformiert.
Luciferase-Assay
Der Luciferase-Assay erfolgte mit dem Luciferase-Assay-System (Promega) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Protoplasten wurden pelletiert, das Pellet wurde mit 100 μl Zell-Lysepuffer versetzt, im Vortex-Mischer gemischt und zentrifugiert. 20 μl Überstand wurden mit 100 μl Assay-Puffer versetzt, und die Lumineszenz wurde mit einem Luminometer abgelesen (Lmax). Die gezeigten Ergebnisse werden als Mittel der relativen LUC-Aktivitäten aus dreifach wiederholten Proben zusammen mit dem Fehlerbalken gezeigt. Alle Versuche wurden dreimal wiederholt, wobei man zu ähnlichen Ergebnissen gelangte. In Gegenwart von IAA und ABA konnte eine Luciferaseexpression durch Versetzen mit 1 μM IAA bzw. 100 μM ABA induziert werden, wie dies bereits von Hwang & Sheen (2001) berichtet wurde.
Beispiel 2 Entwicklung von siRNAs, denen hormoninduzierbare Promoter als Target dienen
Um die Aktivierung der Genexpression durch kleine RNAs zu testen, wurden mehrere siRNAs entwickelt, deren Sequenz Abschnitten der ABA- und IAA-Promotersequenzen entsprechen. Es wurden 21 Nukleotid große synthetische Duplex-RNAs entwickelt, bei denen 19 Nukleotide mit zwei Nukleotid langen 3'-Überständen sowohl am sense- als auch am antisense-Strang überlappten. Es wurden siRNAs entwickelt, die Promotersequenzen von 100 Nukleotiden stromaufwärts der TATA-Box vom 3'-Ende des Promoters entsprachen.
ABA-induzierbarer Promoter
Es wurden ABA-Promoter(SEQ ID NO: 1)-siRNAs entwickelt, die eine 216 Basenpaare lange Region, die sich von 100 Nukleotiden stromaufwärts der TATA-Box zum Ende des Promoters (Positionen 141 bis 356 von SEQ ID NO: 1) erstreckt, abdecken. Es wurden 21 Nukleotide lange siRNAs entwickelt, die in Position 141 von SEQ ID NO: 1 beginnen und bei denen ein „walking” entlang der restlichen Länge des Promoters in 5'- bis 3'-Richtung erfolgt, wobei jeweils um fünf Nukleotide vorgerückt wird. Insgesamt wurden 40 siRNAs entwickelt, die die Region von Position 141 bis 356 von SEQ ID NO: 1 abdecken.
So zum Beispiel enthält die erste siRNA, die für den ABA-Promoter entwickelt wurde und die als A-1 bezeichnet wurde, einen sense-Strang, der den Positionen 141 bis 161 von SEQ ID NO: 1 entspricht. Der antisense-Strang der A-1-siRNA ist das reverse Komplement zu den Positionen 139 bis 159 von SEQ ID NO: 1. Die sense- und die antisense-siRNAs werden aneinander anlagern gelassen, um zu einem siRNA-Duplex mit 2 nt langen Überhängen am 3'-Ende zu gelangen. So enthält zum Beispiel der A-1-siRNA-Duplex sense (SEQ ID NO: 22) und anti-sense (SEQ ID NO: 23) von kleinen aktivierenden A-1-RNAs. Die zweite siRNA, die als A-2 bezeichnet wird und die für den ABA-Promoter entwickelt wird, enthält einen sense-Strang, der Position 146 bis 166 von SEQ ID NO: 1 entspricht. Der antisense-Strang der A-2-siRNA ist das reverse Komplement zu den Positionen 144 bis 164 von SEQ ID NO: 1. Es wurden siRNAs entwickelt, die die verbleibende ABA-Promotersequenz abdecken, und zwar wie bei der Entwicklung von A-1-siRNA und A-2-siRNA.
IAA-induzierbarer Promoter
Der IAA-Promoter (SEQ ID NO: 2) enthält zwei mutmaßliche TATA-Boxen. Es wurden IAA-Promoter(SEQ ID NO: 2)-siRNAs entwickelt, die eine 761 Basenpaare lange Region, die sich von 100 Nukleotide stromaufwärts der ersten TATA-Box zum Ende des Promoters (Positionen 2753 bis 3513 von SEQ ID NO: 2) erstreckt, entwickelt. Es wurden 21 Nukleotide lange siRNAs entwickelt, die in Position 2753 von SEQ ID NO: 2 beginnen und bei denen ein „walking” entlang der restlichen Länge des Promoters in 5'- bis 3'-Richtung erfolgt, wobei jeweils um fünf Nukleotide vorgerückt wird. Insgesamt wurden 149 siRNAs entwickelt, die die Region von Position 2753 bis 3513 von SEQ ID NO: 2 abdecken.
So zum Beispiel enthält die erste siRNA, die für den IAA-Promoter entwickelt wurde und die als I-1 bezeichnet wurde, einen sense-Strang, der den Positionen 2753 bis 2773 von SEQ ID NO: 2 entspricht. Der antisense-Strang der I-1-siRNA ist das reverse Komplement zu den Positionen 2751 bis 2771 von SEQ ID NO: 2. Die sense- und die antisense-siRNAs werden aneinander anlagern gelassen, um zu einem siRNA-Duplex mit 2 nt langen Überhängen am 3'-Ende zu gelangen. So enthält zum Beispiel der I-24-siRNA-Duplex sense (SEQ ID NO: 6) und anti-sense (SEQ ID NO: 7) von kleinen aktivierenden I-24-RNAs. Die zweite siRNA, die als I-2 bezeichnet wurde und die für den IAA-Promoter entwickelt wurde, enthält einen sense-Strang, der Position 2758 bis 2778 von SEQ ID NO: 2 entspricht. Der antisense-Strang der I-2-siRNA ist das reverse Komplement zu den Positionen 2756 bis 2776 von SEQ ID NO: 2. Es wurden siRNAs entwickelt, die die verbleibende IAA-Promotersequenz abdecken, und zwar wie bei der Entwicklung von I-1-siRNA und I-2-siRNA.
ACC-induzierbarer Promoter
Es wurden siRNAs des ACC-induzierbaren Promoters (SEQ ID NO: 3) entwickelt, die die vollständige Promoterregion abdecken (Positionen 1 bis 146 von SEQ ID NO: 3). Es wurden 21 Nukleotide lange siRNAs entwickelt, die in Position 1 von SEQ ID NO: 3 beginnen und bei denen ein „walking” entlang der restlichen Länge des Promoters in 5'- bis 3'-Richtung erfolgt, wobei jeweils um fünf Nukleotide vorgerückt wird. Es wurden insgesamt 26 siRNAs entwickelt, um diese Region abzudecken.
Zeatin-induzierbarer Promoter
Es wurden siRNAs des ABA-induzierbaren Promoters (SEQ ID NO: 4) entwickelt, die eine 411 Basenpaare lange Region, die sich von 200 Nukleotide stromaufwärts der TATA-Box zum Ende des Promoters (Positionen 1987 bis 2397 von SEQ ID NO: 4) erstreckt, abdeckt. Es wurden 21 Nukleotide lange siRNAs entwickelt, die in Position 1987 von SEQ ID NO: 4 beginnen und bei denen ein „walking” entlang der restlichen Länge des Promoters in 5'- bis 3'-Richtung erfolgt, wobei jeweils um fünf Nukleotide vorgerückt wird. Es wurden insgesamt 79 siRNAs entwickelt, die die Region von Position 1987 bis 2397 von SEQ ID NO: 4 abdecken.
Beispiel 3: Test der Aktivierung von hormoninduzierbaren Promotern durch siRNAs im Arabidopsi s-Protoplastensystem
Von den 149 siRNAs mit Targeting für den GH3-LUC-Promoter aktivierten 8 die Luciferase-Genexpression in Abwesenheit von IAA (1A). Beim RD29A-LUC-Promoter zeigten 9 der getesteten 40 siRNAs eine erhöhte Luciferaseexpression in Abwesenheit von ABA (1B).
Unter Verwendung von Genomatix wurde der GH3-LUC- und der RD29A-LUC-Promoter für Transkriptionsfaktorbindungssteilen charakterisiert. Interessanterweise wurde gefunden, dass die Hits um die TATA-Box-Region oder Regulationselemente, darunter der Transkriptionsrepressor BELLRINGER, Promoter von unterschiedlichen auf Zucker reagierenden Genen, Elicitor response element, ABA-induzierbarer Transkriptionsaktivator, Reis-Transkriptionsaktivator-1, TCP-Kasse-II Transkriptionsfaktor, Auxin response element und CA-rich element, lagen.
Tabelle 1: siRNAs zum GH3-LUC-Promoter, die die Luciferaseexpression aktiviert haben (mit SEQ ID NO), und sie umgebende siRNAs
Tabelle 2: siRNAs zu dem RD29A-Promoter, die die Luciferaseexpression aktiviert haben (mit SEQ ID NO), und sie umgebende siRNAs
Beispiel 4 In-silico-Identifikation von mutmaßichen Genen, die endogenen miRNAs als Target dienen, in den Regulationsregionen
Es wurden über 100 bekannte Arabidopsis-microRNAs aus Mirbase (http://microrna.sanger.ac.uk) entnommen und es wurde damit eine Suche gegen eine TAIR-Datenbank (www.arabidopsis.org/) bestehend aus bis zu 3 Kilobasen großen Regionen stromabwärts jedes Gens in Arabidopsis durchgeführt. Wir suchten die diese mutmaßlichen Promoterregionen können die entsprechende 5'-untranslatierte Regulationregion in beiden Leserastern umfassen mit den bekannten Arabidopsis-microRNAs als Abfrage unter Verwendung von „ungapped” BLAST mit einer reduzierten Wortgröße von 7 als Vorfilter und führten dann ein Realignment mit den Regionen unter Verwendung des Smith-Waterman-Algorithmus durch. Dann wurde bestimmt, dass die folgenden Bedingungen für ein Alignment als mutmaßlicher Angriffspunkt bezeichnet wurden. Alle diese Bestimmungen werden an der 5'-sten Base der bekannten microRNA indexiert.
Erstens: Maximal 4 Mismatches Insgesamt.
Zweitens: Keine Mismatches an Base 10 oder 11.
Drittens: Zwischen Base 2 und Base 9 ist maximal ein Mismatch gestattet.
Viertens: Existiert ein Mismatch zwischen bp 2 und 9, maximal 2 weitere Mismatches im Alignment.
Fünftes: Maximal 2 aufeinander folgende Mismatches von Base 12 bis Base 21.
Alle Alignments, die die oben genannten Bedingungen erfüllten, galten als Promotorangriffspunkt für die microRNA.
Weiterhin wurden miRNA-Hits innerhalb der 2 kB stromaufwärts der mutmaßlichen Promotorregionen, umfassend die entsprechenden 5'-untranslatierten Regulationsregionen, eingeschränkt und es wurde gefunden, dass der sense-Strang des Promoters von 853 Genen und der antisense-Strang des Promoters von 651 Genen bekannten miRNAs als Target dienen. Dann wurde eine miRNA-Familie genommen, und so wurden 214 miRNAs identifiziert, denen der sense-Strang als Target dient, und 171 miRNAs, denen der antisense-Strang als Target dient.

Eine ähnliche Suche wurde an Arabidopsis-Introns, die von der TAIR-Datenbank (www.arabidopsis.org/) heruntergeladen wurden, durchgeführt, und es wurde gefunden, dass 471 Introns (sense-Strang) in Arabidopsis 107 bekannten Arabidopsis-miRNAs als Target dienen (siehe Tabelle unten).

miRNA	Angriffspunkt	Beschreibung des Angriffspunkts
ath-miR782	AT5G14090.1-2	\|174-661\| chr5:4547377-4547864 FORWARD
ath-miR782	AT3G30200.1-1	\|175-2202\| chr3:11834540-11836667 REVERSE
ath-miR833-5p	AT4G31430.3-1	\|326-659\| chr4:15248787-15249120 FORWARD
ath-miR407	AT2G33340.3-11	\|3102-3195\| chr2:14135025-14135118 REVERSE
ath-miR418	AT4G32440.2-2	\|1010-1273\| chr415657700-15657963 FORWARD
ath-miR863-3p	AT5G37850.2-2	\|318-1080\| chr5:15082932-15083694 FORWARD
ath-miR1888	AT5G21100.1-1	\|387-909\| chr5:7168572-7169094 FORWARD
ath-miR869.1	AT5G43930.2-14	\|3953-4033\| chr5:17698002-17698082 FORWARD
ath-miR838	AT1G01040.1-14	\|5287-5562\| chr128432-28707 FORWARD
ath-miR779.2	AT5G67630.1-1	\|1838-1199\| chr5:26985422-26985783 REVERSE
ath-miR854b	AT2G15620.1-1	\|453-648\| chr2:6818010-6818205 FORWARD
ath-miR835-3p	AT5G57720.1-1	\|173-715\| chr523408132-23408674 REVERSE
ath-miR403	AT4G03640.1-1	\|121-1237\| chr4:1614932-1616048 FORWARD
ath-miR156g	AT2G19420.1-2	\|633-1878\| chr2:8419415-8420660 FORWARD
ath-miR414	AT5G15725.1-1	\|161-427\| chr5:5127567-5127833 FORWARD
ath-miR397b	AT4G23540.1-1	\|40-366\| chr4:12284328-12284654 REVERSE
ath-miR776	AT3G26950.1-4	\|1302-1382\| chr3:9943336-9943416 REVERSE
ath-miR868	AT4G34120.1-4	\|974-1236\| chr4:16341986-16342248 FORWARD
ath-miR405b	AT1G16680.1-3	\|439-592\| chr1:5703244-5703397 FORWARD
ath-miR865-5p	AT2G35610.1-1	\|317-833\| chr2:14957494-14958010 REVERSE
ath-miR396b	AT5G04240.1-3	\|1653-1958\| chr5:1171197-1171502 FORWARD
ath-miR778	AT2G41620.1-15	\|5124-7052\| chr2:17355111-17357039 REVERSE
ath-miR156d	AT5G26146.1-1	\|91-1632\| chr5:9136006-9137547 FORWARD
ath-miR158b	AT3G55920.1-2	\|273-346\| chr3:20755717-20755790 REVERSE
ath-miR866-5p	AT4G18580.2-3	\|784-900\| chr4:10235138-10235254 REVERSE
ath-miR853	AT3G23325.1-3	\|522-1038\| chr3:8346299-8346815 FORWARD
ath-miR862-3p	AT2G25170.1-15	\|4037-4793\| chr2:10724922-10725678 FORWARD
ath-miR866-3p	AT1G10910.1-1	\|303-669\| chr1:3640180-3640546 FORWARD
ath-miR847	AT1G05385.1-1	\|150-371\| chr1:1583347-1583568 REVERSE
ath-miR858	AT5G58510.1-3	\|454-683\| chr5:23671096-23671325 REVERSE
ath-miR172c	AT5G22510.1-5	\|2293-2397\| chr5:7475548-7475652 REVERSE
ath-miR397a	AT5G60022.1-2	\|488-2135\| chr5:24185353-24187000 REVERSE
ath-miR159a	AT5G26320.1-1	\|88-1456\| chr5:9238400-9239768 FORWARD
ath-miR416	T1G20860.1-1	\|687-3752\| chr1:7254915-7257980 REVERSE
ath-miR862-5p	AT2G25170.1-15	\|4037-4793\| chr2:10724922-10725678 FORWARD
ath-miR1886	AT2G37160.2-10	\|2894-3327\| chr2:15618800-15619233 FORWARD
ath-miR860	AT5G26030.2-8	\|2340-2412\| chr5:9098802-9098874 FORWARD
ath-miR834	AT1G08540.1-2	\|927-1159\| chr1:2704265-2704497 FORWARD
ath-miR854a	AT2G15620.1-1	\|453-648\| chr2:6818010-6818205 FORWARD
ath-miR863-5p	AT4G30210.2-16	\|3646-3734\| chr4:14800415-14800503 FORWARD
ath-miR855	AT3G19050.1-16	\|3911-3999\| chr3:6581963-6582051 FORWARD
ath-miR777	AT5G51200.1-11	\|4236-4327\| chr5:20826387-20826478 FORWARD
ath-miR172b	AT5G18100.2-2	\|326-684\| chr5:5987514-5987872 FORWARD
ath-miR157b	AF5G10946.1-1	\|184-1050\| chr5:3456258-3457124 REVERSE
ath-miR870	AT3G47500.1-1	\|236-577\| chr3:17516467-17516808 REVERSE
ath-miR827	AT1G65900.1-8	\|1755-1842\| chr1:24520309-24520396 REVERSE
ath-miR405d	AT1G16680.1-3	\|439-592\| chr1:5703244-5703397 FORWARD
ath-miR781	AT5G45190.1-1	\|159-1110\| chr5:18297993-18298944 REVERSE
ath-miR157d	AT3G13490.1-4	\|1045-1141\| chr3:4398192-4398288 REVERSE
ath-miR157a	AT5G10946.1-1	\|184-1050\| chr5:3456258-3457124 REVERSE
ath-miR854d	AT2G15620.1-1	\|453-648\| chr2:6818010-6818205 FORWARD
ath-miR413	AT5G57110.2-12	\|2715-2820\| chr5:23131970-23132075 REVERSE
ath-miR402	AT1G77230.1-1	\|262-1016\| chr1:29021284-29022038 FORWARD
ath-miR832-3p	AT5G05690.3-4	\|1276-3011\| chr5:1703778-1705513 REVERSE
ath-miR156e	AT5G26146.1-1	\|91-1632\| chr5:9136006-9137547 FORWARD
ath-miR156a	AT5G26146.1-1	\|91-1632\| chr5:9136006-9137547 FORWARD
ath-miR869.2	AT3G05270.1-1	\|73-360\| chr3:1502967-1503254 REVERSE
ath-miR829.2	AT2G04700.1-5	\|1347-1494\| chr2:1648150-1648297 FORWARD
ath-miR156h	AT3G02530.1-9	\|2337-2609\| chr3:529981-530253 REVERSE
ath-miR846	AT1G33790.1-2	\|540-2405\| chr1:12257183-12259048 FORWARD
ath-miR850	AT4G13495.2-3	\|653-3273\| chr4:7843615-7846235 FORWARD
ath-miR783	AT2G35340.1-17	\|3922-4263\| chr2:14883320-14883661 FORWARD
ath-miR162a	AT5G08185.2-3	\|466-566\| chr5:2634874-2634974 REVERSE
ath-miR861-5p	AT2G31170.2-1	\|395-491\| chr2:13292253-13292349 REVERSE
ath-miR859	AT1G59890.1-2	\|571-1146\| chr1:22048065-22048640 FORWARD
ath-miR830	AT2G38950.1-2	\|1017-1565\| chr2:16268947-16269495 FORWARD
ath-miR405a	AT1G16680.1-3	\|439-592\| chr1:5703244-5703397 FORWARD
ath-miR829.1	AT1G43665.1-1	\|288-739\| chr1:16455506-16455957 REVERSE
ath-miR773	AT1G64650.2-2	\|844-937\| chr1:24028919-24029012 REVERSE
ath-miR779.1	AT3G51620.2-1	\|436-788\| chr3:19155066-19155418 FORWARD
ath-miR857	AT5G65500.1-3	\|1084-1164\| chr5:26200060-26200140 REVERSE
ath-miR844	AT2G23348.1-1	\|49-1201\| chr2:9948694-9949846 REVERSE
ath-miR420	AT5G62850.1-4	\|845-974\| chr5:25247780-25247909 REVERSE
ath-miR156c	AT5G26146.1-1	\|91-1632\| chr5:9136006-9137547 FORWARD
ath-miR865-3p	AT1G68080.3-1	\|107-173\| chr1:25521256-25521322 FORWARD
ath-miR854c	AT2G15620.1-1	\|453-648\| chr2:6818010-6818205 FORWARD
ath-miR852	AT4G14500.1-4	\|1739-2261\| chr4:8335910-8336432 FORWARD
ath-miR837-3p	AT1G18880.1-1	\|144-647\| chr1:6520882-6521385 FORWARD
ath-miR856	AT5G16740.1-1	\|143-511\| chr5:5502349-5502717 REVERSE
ath-miR419	AT1G28815.1-1	\|118-202\| chr1:10095900-10095984 FORWARD
ath-miR848	AT5G13890.3-1	\|1016-1768\| chr5:4479156-4479908 REVERSE
ath-miR172e	AT5G18100.2-2	\|326-684\| chr5:5987514-5987872 FORWARD
ath-miR828	AT2G16660.1-2	\|1322-2224\| chr2:7226484-7227386 REVERSE
ath-miR825	AT5G45390.1-2	\|1308-1497\| chr5:18414836-18415025 FORWARD
ath-miR159b	AT5G16810.1-9	\|2352-2452\| chr5:5527482-5527582 REVERSE
ath-miR840	AT1G73960.2-24	\|7925-8073\| chr1:27810035-27810183 REVERSE
ath-miR844*	AT2G23348.1-1	\|49-1201\| chr2:9948694-9949846 REVERSE
ath-miR762b	AT5G08185.2-3	\|466-566\| chr5:2634874-2634974 REVERSE
ath-miR837-5p	AT1G18880.1-1	\|144-647\| chr1:6520882-6521385 FORWARD
ath-miR836	AT1G54260.1-4	\|1139-1329\| chr1:20262145-20262335 FORWARD
ath-miR157c	AT5G10946.1-1	\|184-1050\| chr5:3456258-3457124 REVERSE
ath-miR172b*	AT4G33870.1-2	\|956-1049\| chr4:16235449-16235542 REVERSE
ath-miR426	AT5G42320.1-1	\|41-390\| chr5:16938084-16938433 REVERSE
ath-miR824	AT3G52535.1-1	\|134-7082\| chr3:19498240-19499188 FORWARD
ath-miR835-5p	AT3G46340.1-1	\|92-1282\| chr3:17037734-17038924 FORWARD
ath-miR156b	AT5G26146.1-1	\|91-1632\| chr5:9136006-9137547 FORWARD
ath-miR173	AT3G45090.1-2	\|464-951\| chr3:16504797-16505284 REVERSE
ath-miR172a	AT5G18100.2-2	\|326-684\| chr5:5987514-5987872 FORWARD
ath-miR172d	AT5G22510.1-5	\|2293-2397\| chr5:7475548-7475652 REVERSE
ath-miR845b	AT2G26590.3-10	\|3264-3556\| chr2:11318618-11318910 REVERSE
ath-miR415	AT4G02800.1-4	\|1093-1176\| chr4:1251107-1251190 FORWARD
ath-miR867	AT4G36970.1-1	\|849-1031\| chr4:17430650-17430832 REVERSE
ath-miR849	AT2G13680.1-15	\|3818-4117\| chr2:5706023-5706322 FORWARD
ath-miR1887	AT4G03580.1-1	\|52-412\| chr4:1597034-1597394 FORWARD
ath-miR472	AT3G20350.1-2	\|1121-1504\| chr3:7097474-7097857 FORWARD
ath-miR864-3p	AT1G13830.1-2	\|579-663\| chr1:4740373-4740457 REVERSE
ath-miR156f	AT5G26146.1-1	\|91-1632\| chr5:9136006-9137547 FORWARD
ath-miR159c	AT1G27760.1-2	\|683-770\| chr1:9669253-9669340 FORWARD

Tabelle 3: Introns, die microRNAs als Target dienen

Beispiel 5 Test der Aktivierung und Hinaufregulation von Genen, deren Promoter Targets für endogene miRNAs darstellten
Mittels PCR wurden Vorläufer der in Tabelle 1 angeführten miRNAs aus Arabidopsis isoliert. Die Vorläufer wiesen eine Länge von 800–1000 bp auf. Das PCR-Produkt wurde zuerst mittels TA in den Gateway-5'-Entry-Vektor ENTR 5'-TOPO (Invitrogen Nr. K591-20) kloniert. Binäre pflanzliche Expressionsvektoren wurden mittels Multi-site-Gateway-Cloning dadurch konstruiert, dass man drei Entry-Vektoren, die Promoter, interessierendes Gen und Terminator enthielten, und einen Destinationsvektor in einer LR-Reaktion (Invitrogen Nr. K591-10) kombinierte. Die Expression von jedem miRNA-Vorläufer steht also unter der Kontrolle des Petersilie-Ubiquitin-Promoters und des Terminators aus der Nopalinsynthase. Die schlusseridlichen binären Vektoren wurden mittels Sequenzieren verifiziert, col-0-Arabidopsispflanzen wurden mit den Konstrukten mit der Floral-Dip-Methode transformiert (Clough und Bent, 1998, Plant J. 16: 735–43), wodurch man transgene Linien erhielt.
Mittels qRT-PCR wurde die Aktivierung und Hinaufregulation von Genen, deren Promoter als Target für eine miRNA diente, in transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die die miRNA überexprimieren, bestimmt. Es wurden Samen auf MS-Medium mit einem Zusatz von 10 mg/l Phosphinothricin (PPT) keimen gelassen. Aus 3 Wochen alten Pflanzen wurde die RNA aus drei unabhängigen Events mit dem RNeasy-Pflanzen-Minikit (Qiagen) extrahiert. Pro Event wurden fünf Pflanzen gepoolt. Die qRT-PCR erfolgte mittels sybr Green. Insgesamt wurden 43 Gene geprüft. Das Gen bzw. die Gene, von dem/denen vorhergesagt wurde, dass es/sie in der Codierregion derselben miRNA als Target dient(dienen), wurde(n) in der qRT-PCR mitgeprüft. Als endogene Kontrolle zum Normalisieren der relativen Expression wurde das Tubulin- oder Actingen aus Arabidopsis verwendet. Die Gene, die hinaufreguliert wurden, wurden weiterhin mittels TaqMan verifiziert.
Von den 214 bzw. 172 miRNAs mit Targeting des sense- bzw. antisense-Strangs von mutmaßlichen Promotern wurden 12 miRNAs getestet, um herauszufinden, ob bei den Genen von diesen Promoter irgendeine Hinaufregulation beobachtet werden konnte. Mit der qRT-PCR-Methode wurde miR159b, die das Gen (AT3G50830) durch Targeting seiner Promoter hinaufregulierte, bzw. miR398a, die das Gen (AT3G15500) durch Targeting seiner Promoter hinaufregulierte, identifiziert.
Beispiel 6 Weitere Analyse von siRNAs mit Targeting von hormoninduzierbaren Promotern
Mutierte siRNAs
In den ersten Versuchen wurde gefunden, dass neun siRNAs, die Regionen des ABA-induzierbaren Promoters entsprachen, die Genexpression aktivieren. Es wurde gefunden, dass acht siRNAs, die Regionen des IAA-induzierbaren Promoters entsprachen, die Genexpression aktivieren. Machen Mutationen in den siRNAs entdeckte in den ursprünglichen ABA- und IAA-induzierbaren Promoterversuchen die Fähigkeit, die Genexpression zu aktivieren, aufweisen. Spezifische(s) Nukleotid(e) werden in den siRNA-Duplices verändert werden, um zu untersuchen, welchen Effekt spezifische Positionen auf die Genaktivierung ausüben.
Positionen 9, 10 und 11
SiRNAs entwickeln, um zu prüfen, ob es notwendig ist, dass die Positionen neun, zehn und elf mit perfektem Match zu ihren Promoter-Zielregionen für die RNA-induzierte Genaktivierung sind. Positionen neun, zehn und elf des sense-Strangs der funktionellen siRNAs A-23, A-25, A-27, A-28, A-29, A-33 bzw. I-24, I-25, I-113, I-114, I-115 mutieren. Die entsprechenden Mutationen im antisense-Strang der Duplex-siRNAs erzeugen. Beim Erzeugen der Mutationen denselben G/C-Gehalt wie bei den funktionellen siRNAs aufrechterhalten. Die mutierten Nukleotide sind in der Tabelle unten in Großbuchstaben dargestellt. siRNAs mit Mutationen in den Positionen neun, zehn und elf führten zu vergleichbaren Resultaten wie die ursprünglichen siRNAs mit perfekter Homologie zu den Promoter-Zielregionen. Mismatches in den Positionen neun, zehn und elf zwischen der siRNA und der als Target dienenden Promoterregion haben keine signifikante Auswirkung auf die RNAa-Aktivität.
Tabelle 4: siRNAs mit Mutationen in den Positionen 9,10 und 11
Positionen 4, 5 und 6
siRNAs entwickeln, um zu prüfen, ob Mismatches am 5'-Ende der siRNAs und der Promoter-Zielregionen eine Auswirkung auf die Genaktivierung zeigen. Positionen vier, fünf und sechs des sense- und des antisense-Strangs einzeln von funktionellen siRNAs-Duplices mutieren. Entsprechende Mutationen im antisense-Strang der Duplex-siRNAs vornehmen. Die zuvor identifizierten funktionellen siRNAs A-27, A-28, I-113 und I-114 mutieren. Beim Erzeugen der Mutationen denselben G/C-Gehalt wie in den funktionellen siRNAs beibehalten. Die mutierten Nukleotide sind in der Tabelle unten als Großbuchstaben dargestellt. Die siRNAs mit Mutationen an den Positionen vier, fünf und sechs haben die RNAa-Aktivität verloren. Mismatches an den Positionen vier, fünf und sechs zwischen der siRNA und der als Targget dienenden Promoterregion reduzierten die RNAa-Aktivität im Vergleich zu den ursprünglichen, zuvor identifizierten funktionellen siRNAs signifikant.
Tabelle 5: siRNAs mit Mutationen an den Positionen 4, 5 und 6
Positionen 16, 17 und 18
SiRNAs entwickeln, um zu prüfen, ob Mismatches am 3'-Ende der siRNAs und der Promoter-Zielregionen eine Auswirkung auf die Genaktivierung zeigen. Positionen 16, 17 und 18 des sense- und des antisense-Strangs einzeln von funktionellen siRNAs-Duplices mutieren. Entsprechende Mutationen im antisense-Strang der Duplex-siRNAs vornehmen. Die zuvor identifizierten funktionellen siRNAs A-27, A-28, I-113 und I-114 mutieren. Beim Erzeugen der Mutationen denselben G/G-Gehalt wie in den funktionellen siRNAs beibehalten. Die mutierten Nukleotide sind in der Tabelle unten als Großbuchstaben dargestellt. Die siRNAs mit Mutationen an den Positionen sechzehn, siebzehn und achtzehn haben die RNAa-Aktivität verloren. Mismatches an den Positionen sechzehn, siebzehn und achtzehn zwischen der siRNA und der als Target dienenden Promoterregion reduzierten die RNAa-Aktivität im Vergleich zu den ursprünglichen, zuvor identifizierten funktionellen siRNAs signifikant.
Tabelle 6: siRNAs mit Mutationen an den Positionen 16,17 und 18
Position 1
siRNAs, um den Effekt des ersten Nukleotids einer siRNA auf die RNA-Aktivierung entwickeln zu testen. Das erste Nukleotid von siRNAs, von denen zuvor in den ursprünglichen Versuchen mit ABA- und IAA-induzierbaren Promotern gezeigt wurde, dass sie die Genexpression hinaufregulieren, verändern. Zwei GenaktivierungssiRNAs für jeden der ABA- und IAA-induzierbaren Promoter auswählen. Alle möglichen Nukleotide an der ersten Position von jedem Strang der siRNA-Duplices testen. Das erste Nukleotid des sense- und des antisense-Strangs einzeln mutieren und den Effekt auf die RNA-Aktivierung testen. Die erste Position der funktionellen siRNAs A-27, A-28, I-113 und I-114 mutieren. Die entsprechenden Mutationen im antisense-Strang der Duplex-siRNAs durchführen. Die mutierten Nukleotide sind in der Tabelle unten als Großbuchstaben dargestellt. Die siRNAs mit Mutationen am ersten Nukleotid führten zu vergleichbaren Ergebnissen wie bei den ursprünglichen siRNAs, die perfekte Homologie zu den Promoter-Zielregionen aufweisen.
Tabelle 7: siRNAs, bei denen die Nukleotide in der ersten Position verändert wurden
Position 20 und 21 zu TT
siRNAs entwickeln, um den Effekt der gleichzeitigen Veränderung der Positionen 20 und 21 am sense- und antisense-Strang des siRNA-Duplex auf die Genaktivierung. Die Positionen 20 und 21 an beiden Strängen der funktionellen siRNAs A-27, A-28, I-113 und I-114 mutieren. Die mutierten Nukleotide sind in der Tabelle unten als Großbuchstaben dargestellt. siRNAs mit den Desaxyribonukleatiden TT an den Positionen 20 und 21 ergaben vergleichbare Ergebnisse wie bei den ursprünglichen siRNAs, die eine perfekte Homologie zu den Promoter-Zielregionen aufweisen.
Tabelle 8: siRNAs, deren Positionen 20 und 21 zu TT verändert wurden
Auf Motiven basierende siRNAs
siRNAs entwickeln, die spezifischen Promotermotiven in den ABA- und IAA-induzierbaren Promotern entsprechen, um ihre Effekte auf die Genaktivierung zu bestimmen. Für jedes Promotermotiv, das als Target dienen soll, zwei siRNAs entwickeln. Die erste siRNA, der ein bestimmtes Motiv als Target dient, wird die Motivsequenz am 5'-Ende des entsprechenden sense- oder antisense-Strangs der Duplex-siRNA enthalten. Die zweite siRNA, der ein bestimmtes Motiv als Target dient, wird die Motivsequenz in der Mitte des entsprechenden sense- oder antisense-Strangs der Duplex-siRNA enthalten. In der Tabelle unten sind die Motive unterstrichen. Die auf Motiven basierenden siRNAs zeigten keine nennenswerte Fähigkeit, die Genexpression zu aktivieren.
Table 9: siRNAs mit Motiven des ABA-induzierbaren Promoters

Tabelle 10: siRNAs mit Motiven des IAA-induzierbaren Promoters
Auf Hotspots basierende siRNAs
Aus den ursprünglichen Versuchen mit ABA- und IAA-induzierbaren Promotern können spezifische Regionen eines Promoters eine verstärkte Fähigkeit, die Genexpression zu aktivieren, zeigen, wenn sie siRNAs als Targete dienen. siRNAs entwickeln, bei denen ein „Walking” entlang der interessierenden Promoterregionen stattfindet, wobei in 5'-3'-Richtung jeweils zwei Nukleotide vorgerückt wird.
Eine Region im ABA-induzierbaren Promoter könnte eine größere Aktivität aufweisen, wenn sie siRNAs als Target dient. Es wurden siRNAs des ABA-induzierbaren Promoters (SEQ ID NO: 1) die eine 71 Basenpaare große Region, die sich von den Positionen 251 bis 321 von SEQ ID NO: 1 erstreckt, abdecken, entwickelt. Insgesamt wurden 26 siRNAs entwickelt, die diese Region abdeckten.
Zwei Regionen in dem IAA-induzierbaren Promoter könnten eine größere Aktivität aufweisen, wenn sie siRNAs als Target dienen. Beim Botspot Nr. 1 des IAA-induzierbaren Promoters (SEQ ID NO: 2) handelt es sich um eine 49 Basenpaare große Region, die sich von den Positionen 2868 bis 2916 von SEQ ID NO: 2 erstreckt. Es wurden fünfzehn siRNAs entwickelt, die die Hotspot-Region Nr. 1 des IAA-induzierbaren Promoters abdeckten. Der Hotspot Nr. 2 des IAA-induzierbaren Promoters (SEQ ID NO: 2) ist eine 31 Basenpaare große Region, die sich von den Positionen 3313 bis 3343 von SEQ ID NO: 2 erstreckt. Es wurden sechs siRNAs entwickelt, die die Hotspot-Region Nr. 2 des IAA-induzierbaren Promoters abdeckten.
Beispiel 7 Abgeben von kleinen aktivierenden RNAs in die Pflanze unter Verwendung eines microRNA-Vorläufers
Aus den ursprünglichen Versuchen ging hervor, dass neun siRNAs, die Regionen des ABA-induzierbaren Promoters entsprachen, die Genexpression aktivieren. Es wurde gefunden, dass acht siRNAs, die Regionen des IAA-induzierbaren Promoters entsprachen, die Genexpression aktivieren. Diese 17 siRNAs wurden in das 272 Basenpaar große Fragment der Arabidopsis-thaliana-microRNA-Vorstufe für ath-miR164b (SEQ ID NO: 5) hinein manipuliert. Die Wildtyp-microRNA-Sequenz (Positionen 33–53 von SEQ ID NO: 5) wurde mit der sense-Strangsequenz der siRNAs, bei denen im ursprünglichen Versuch entdeckt wurde, dass sie die Genexpression aktivieren, ersetzt. Die Wildtyp-microRNA-star-Sequenz (Positionen 163–183 von SEQ ID NO: 5) wurde durch die antisense-Strangsequenz der siRNAs, bei denen im ursprünglichen Versuch entdeckt wurde, dass sie die Genexpression aktivieren, ersetzt. Die manipulierte ath-pri-miR164b, die die ersetzten sense- und antisense-siRNA-Sequenzen enthielt, wurde synthetisiert und stromabwärts eines Petersilie-Ubiquitin-Promoters kloniert. Bei dem verwendeten Terminator handelt es sich um die 3' UTR der Nopalinsynthase aus Agrobacterium-tumefaciens-T-DNA.
Bei den manipulierten siRNA-Konstrukten wurde in mindestens 4 Konstrukten der Regionen des ABA-induzierbaren Promoters (SEQ ID NO: 1), entsprechend siRNAs A-16 (RTP3362-1 SEQ ID NO: 40), A-23 (RTP3363-1 SEQ ID NO: 41), A-25 (RTP3364-1, SEQ ID NO: 42) und A-27 (RTP3365-1, SEQ ID NO: 43) eine Aktivierung des Luciferasegens beobachtet. Bei den Konstrukten der Regionen des IAA-induzierbaren Promoters (SEQ ID NO: 2), zeigten drei davon, die den siRNAs I-114 (RTP3374-1, SEQ ID NO: 45), I-115 (RTP3375-1, SEQ ID NO: 46) und I-146 (RTP3376, SEQ ID NO: 47) entsprachen, eine Aktivierung. Das Aktivierungsniveau war ähnlich demjenigen, das bei Verwendung der entsprechenden synthetischen siRNAs beobachtet wird. Keine signifikante Aktivierung wurde von RTP3377-1 (SEQ ID NO: 44) beobachtet, die zufallsmäßige siRNA als Negativkontrolle produziert.
RTP3362-1 produziert kleine aktivierende RNA, der der ABA-induzierbare Promoter RD29A als Target dient, und die seine Genexpression aktiviert.
RTP3363-1, RTP3364-1 und RTP3365-1 produzieren kleine aktivierende RNAs, denen die 5' UTR der RD29A-Gene als Target dient, und die seine Expression aktivieren.
Die Konstrukte RTP3374-1, RTP3375-1 und RTP3376-1 produzieren kleine aktivierende RNAs, denen die 5' UTR des GH3-Gens als Target dient, und die seine Expression aktivieren.
Beispiel 8 Einführen von kleinen aktivierenden RNAs in die Pflanze unter Verwendung eines ta-siRNA-Vorläufers
Das Arabidopsis-ta-siRNA-Gen At3g17185 wurde aus genomischer Arabidopsis-DNA mittels PCR unter Verwendung der Primer MW-P11F
(5' CCATATCGCAACGATGACGT 3') und MW-P12R
(5' GCCAGTCCCCTTGATAGCGA 3') amplifiziert und anschließend mittels TA in den
Vektor PCR8/GW/TOPO (Invitrogen Nr. K2500-20) kloniert. Die 1200 bp des At3g17185-Gens enthält eine 178 bp große ta-siRNA-Region, eine 865 bp große Region stromaufwärts der ta-siRNA (eine potentielle Promoterregion) sowie eine 156 bp große Region stromabwärts der ta-siRNA (eine potentielle Terminatorregion). Unter den acht 21 nt langen ta-siRNA-Phasen beginnend mit Position 11 von miR390 werden zwei sehr ähnliche Phasen, nämlich 5'D7(+) und 5'D8(+), durch dieselben zwei 21 nt großen Fragmente von A-16 (SEQ ID NO: 16) ersetzt. Solche manipulierten ta-siRNA-Vorläufer werden als Entry-Vektoren verwendet, um binäre Expressionsvektoren zu erzeugen, in denen die Expression des ta-siRNA-Vorläufers unter der Kontrolle des Petersilie-Ubiquitin-Promoters und der 3' UTR der Nopalinsynthase aus der Agrobacteriumtumefaciens-T-DNA (RWT384, SEQ ID NO: 48) steht. RWT384 produziert kleine aktivierende RNAs mit Targeting des RD29A-Promoters, eines ABA-induzierbaren Promoters, und aktiviert so die RD29A-Genexpression. RWT385 (SEQ ID NO: 49) wird auf ähnliche Weise erzeugt und produziert kleine aktivierende RNA mit Targeting der 5' UTR des GH3-Gens, und aktiviert so dessen Expression. Weitere kleine aktivierende RNAs können auf ähnliche Weise in ta-siRNA-Vorläufer (miR390 oder miR173 abgeleitet) hinein manipuliert werden.
Beispiel 9 Abgeben von kleinen aktivierenden RNAs mit Targeting für Introns in die Pflanze unter Verwendung eines miRNA-Vorläufers oder eines ta-siRNA Vorläufers
Auf Basis der im Beispiel 7 umrissenen Klonierungsstrategie kann man mittels miRNA-Vorläufer ein künstliches miRNA-Konstrukt entwickeln, um kleine aktivierende RNAs mit Targeting für (ein) Intron(s) eines Pflanzengens zu produzieren.
Auf Basis der im Beispiel 8 umrissenen Klonierungsstrategie kann man mittels ta-siRNA-Vorläufer ein manipuliertes ta-siRNA-Konstrukt entwickeln, um kleine aktivierende RNAs mit Targeting für (ein) Intron(s) eines Pflanzengens zu produzieren.
Beispiel 10: Transformation von ganzen Pflanzen
Um RNAa in ganzen Pflanzen zu testen, wurden Konstrukte mit siRNA-Hits der durch die Hormone IAA und ABA induzierbaren Promoter in Arabidopsis-Keimpflanzen hinein transformiert.
Die Transformation erfolgte in Arabidopsis col-0 und ABA2-1-Mutanten. Die ABA2-1-Mutanten wurden vom Arabidopsis Strock Center bezogen.
Die Konstrukte wurden mit Hilfe von siRNAs wie in Beispiel 7 beschrieben entwickelt. Sechs Wochen alte Arabidopsis-Keimpflanzen von col-0 und ABA2-1 wurden mit dem Floral-Dip-Verfahren (Clough und Bent, 1998, Plant J. 16: 735–43) mit diesen Konstrukten transformiert, wodurch man zu transgenen Linien gelangte.

Die transgenen Linien wurden im Gewächshaus herangezogen, und es wurden Samen von diesen transgenen Linien geerntet. Blätter von diesen T1-Linien wurden gesammelt, die RNA wurde extrahiert und es wurde mittels TaqMan eine qRT-PCR durchgeführt. Für die qRT-PCR wurden zehn Pflanzen von jedem Konstrukt verwendet. Der Effekt von RNAa in ganzen Pflanzen wurden in den Pflanzen, die mit den IAA-siRNA-Konstrukten transformiert worden waren, durch Hinaufregulieren von GH3 (AT2G23170) und in den Pflanzen, die mit den ABA-siRNA-Konstrukten transformiert worden waren, durch Hinaufregulieren von RD29A (AT5G52310) bestätigt. Als interne Kontrolle für die Normalisierung wurde Actin verwendet. Die Ergebnisse wurden statistisch mit dem SAS-Mixed-Model-Test auf dem 0,05-Konfidenzniueau auf Signifikanz geprüft, wonach RTP3361, 62, 63, 65 und 68 ein signifikantes Hinaufregulieren von RD29A zeigten. Bei den ABA-Konstrukten wurde ein drei- bis 11-faches Hinaufregulieren von AT5G52310 beobachtet (Tabelle 11). Bei den IAA-siRNA-Konstrukten zeigten RTP3369, 75 und 76 ein im Vergleich zu dem zufallsmäßigen siRNA-Kontrollkonstrukt (RTP3377) signifikantes Hinaufregulieren (Tabelle 12).

Konstrukt	siRNA	Konstrukt (Kontrolle)	Schtzwert	Standardfehler	FG	t-Wert	Pr > \|t\|	Expressionsverhaltnis
RTP3360	ABA-1	RTP3377	–1,43	0,742	66	–1,94	0,0556	2,71
RTP3361	ABA-4	RTP3377	–3,57	0,79	66	–4,5	2,69E-05	11,86*
RTP3362	ABA-16	RTP3377	–2,23	0,72	66	–3,11	0,0027	4,69*
RTP3363	ABA-23	RTP3377	–1,74	0,74	66	–2,36	0,0212	3,34*
RTP3365	ABA-27	RTP3377	–1,92	0,74	66	–2,61	0,0113	3,79*
RTP3366	ABA-28	RTP3377	–0,99	0,72	66	–1,38	0,1736	1,98
RTP3368	ABA-33	RTP3377	–2,47	0,72	66	–3,45	0,0009	5,56*

Tabelle 11: Relative Expression von RD29A (AT5G52310) in Pflanzen, die mit den ABA-siRNA-Konstrukten transformiert wurden * Signifikant bei p < 0,05

Konstrukt	siRNA	Konstrukt (Kontrolle)	Schätzwert	Standardfehler	FG	t-Wert	Pr > \|t\|	Expressionsverhältnis
RTP3369	IAA-24	3377	–5,26	0,61	137	–8,58	1,84E-14	38,21*
RTP3370	IAA-25	3377	–1,52	0,6	137	-2,54	0,01	2,87
RTP3371	IAA-59	3377	–0,79	0,6	137	–1,31	0,19	1,72
RTP3372	IAA-75	3377	1,19	0,61	137	1,94	0,05	0,44
RTP3373	IAA-113	3377	–0,56	0,6	137	–0,93	0,35	1,47
RTP3374	IAA-114	3377	0,14	1,26	137	0,11	0,91	0,91
RTP3375	IAA-115	3377	–2,61	0,61	137	–4,26	3,84E-05	6,09*
RTP3376	IAA-146	3377	–2,23	0,61	137	–3,64	0,00038	4,69*

Tabelle 12: Relative Expression von GH3 (AT2G23170) in Pflanzen, die mit den IAAsiRNA-Konstrukten transformiert worden waren * Signifikant bei p < 0,05

Beispiel 11: RNAa in Nichthormonpromotem

Das Profiling der Arabidopsis-Expression erfolgte mit Affymetric-Chips unter Verwendung von Protoplasten-RNA, um potentielle Gene für RNAa-Versuche mit einem Nichthormonpromoter zu selektieren. Aufgrund niedriger bis mittelstarker Expression in den Microarray-Versuchen wurden die potentiellen Gene auf zehn eingeschränkt. Zwei kB stromaufwärts liegende mutmaßliche Promoterregionen von diesen Genen wurden mittels PCR isoliert und mit dem Luciferase-Reporter und dem nos-Terminator kloniert. Die Konstrukte wurden in Arabidopsis-Protoplasten hinein transformiert, und die Luciferase-Assays wurden wie in Beispiel 1 erklärt durchgeführt. Auf Basis einer niedrigen bis mittelstarken Luciferase-Expression wurden 2 Promoter (AT4G36930 und AT2G37590) entsprechend den RTP-Nummern 4044 und 4050 ausgewählt (Tabelle 13). Anschließend wurden siRNAs für diese 2 Promoter entwickelt, und zwar beginnend bei 50 bp stromaufwärts der vorhergesagten Transkriptionsstartstelle von diesen Promotern bis zum Start-Codon des Gens. Insgesamt wurden für AT4G36930 und AT2G37590 14 bzw. 41 siRNAs entwickelt. Die Arabidopsis-Protoplasten wurden mit den Promoter::Reporter-Konstrukten transformiert, und die jeweiligen siRNAs und Luciferase-Assays wurden wie in Beispiel 1 erklärt durchgeführt. Auf Basis der Luciferase-Expression kannte bei beiden getesteten Promotern eine RNA-Aktivierung gezeigt werden. Sechs von den 14 siRNAs, die beim Promoter von AT4G36930 (Konstrukt RTP4044) getestet wurden, zeigten einen RNAa-Effekt (Tabelle 14), und 6 der 41 siRNAs für den Promoter AT2G37590 (Konstrukt RTP 4050) zeigten einen RNAa-Effekt (Tabelle 15).

Konstrukt	Gen-ID des Promoters	RLU	Standardabweichung
Keine DNA	Keine	0,23	0,18
DNA, keine ABA	AT5G52310	11,3	2,67
DNA + ABA	AT5G52310	36,09	5,11
RTP4042	AT5G15710	304,697	142,86
RTP4043	AT4G37480	0,97	0,078
RTP4044	AT4G36930	58,05	12,79
RTP4045	AT4G26150	264,14	114,9
RTP4046	AT3G55170	0,79	0,72
RTP4047	AT3G53090	2,62	1,73
RTP4049	AT2G47260	298,19	44,11
RTP4050	AT2G37590	144,19	42,96
RTP4051	AT2G18350	691,45	22,67
RTP4052	AT1G68590	7,9	1,12

Tabelle 13: Relative Luciferase-Expression von möglichen Arabidopsis-RNAa

siRNA-Hits	RLU	Standardabweichung
RTP4044 (Kontrolle)	3,62	0,61
NPAT4-1	7,21	0,09
NPAT4-5	8,31	2,06
NPAT4-6	9,73	2,27
NPAT4-10	8,49	2,4
NPAT4-11	13,59	2,94
NPAT4-13	11,08	3,31

Tabelle 14: Relative Luciferase-Expression von Nichthormonpromoter von AT4G36930, die durch siRNAs aktiviert wurde

siRNA-Hits	RLU	Standardabweichung
RTP4050 (Kontrolle)	63,58	6,28
NPAT2-5	104,03	28,56
NPAT2-6	128,25	25,63
NPAT2-8	90,71	8,09
NPAT2-10	133,62	10,43
NPAT2-11	144,74	10,18
NPAT2-18	150,4	29,16

Tabelle 15: Relative Luciferase-Expression von Nichthormonpromoter von AT2G37590, die durch siRNAs aktiviert wurde

Beispiel 12 Weitere Analyse von siRNAs mit Targeting eines hormoninduzierbaren Promoters
Mutierte siRNAs
In den ersten Versuchen wurde gefunden, dass neun siRNAs, die Regionen des ABA-induzierbaren Promoters entsprachen, die Genexpression aktivieren. Es wurde gefunden, dass acht siRNAs, die Regionen des IAA-induzierbaren Promoters entsprachen, die Genexpression aktivieren. Machen Mutationen in den siRNAs entdeckte in den ursprünglichen ABA- und IAA-induzierbaren Promoterversuchen die Fähigkeit, die Genexpression zu aktivieren, aufweisen. (Ein) spezifische(s) Nukleotid(e) wird/werden in den siRNA-Duplices verändert werden, um zu untersuchen, welchen Effekt spezifische Positionen auf die Genaktivierung ausüben.
Positionen 2 und 3
SiRNAs entwickeln, um zu prüfen, ob es notwendig ist, dass die Positionen zwei und drei 5 mit perfektem Match zu ihren Promoter-Zielregionen für die RNA-induzierte Genaktivierung sind. Positionen zwei und drei des sense-Strangs und des antisense-Strangs der funktionellen siRNAs A-29 und A-33 individuell mutieren. Die entsprechenden Mutationen im Gegenstrang der Duplex-siRNAs erzeugen. Beim Erzeugen der Mutationen denselben G/C-Gehalt wie bei den funktionellen siRNAs aufrechterhalten. Die mutierten Nukleotide sind in der Tabelle unten in Großbuchstaben dargestellt.
Tabelle 16: siRNAs, bei denen die Positionen 2 und 3 des sense- und des antisense-Strangs separat mutiert wurden
Positionen 19 und 20
siRNAs entwickeln, um zu prüfen, ob es notwendig ist, dass die Positionen 19 und 20 mit perfektem Match zu ihren Promoter-Zielregionen für die RNA-induzierte Genaktivierung sind. Positionen 19 und 20 des sense-Strangs und des antisense-Strangs der funktionellen siRNAs A-29 und A-33 individuell mutieren. Die entsprechenden Mutationen im Gegenstrang der Duplex-siRNAs erzeugen. Beim Erzeugen der Mutationen denselben G/C-Gehalt wie bei den funktionellen siRNAs aufrechterhalten. Die mutierten Nukleotide sind in der Tabelle unten in Großbuchstaben dargestellt.
Tabelle 17: siRNAs, bei denen die Positionen 19 und 20 des sense- und des antisense-Strangs separat mutiert wurden
Mutationen in nur einem Strang von siRNAs
Mutationen in den siRNAs erzeugen, bei denen in den ursprünglichen Experimenten mit den ABA- und IAA-induzierbaren Promotern entdeckt wurde, dass sie die Fähigkeit aufweisen, die Genexpression zu aktivieren. Spezifische(s) Nukleotid(e) wird/werden in den siRNA-Duplices verändert werden, um den Effekt zu untersuchen, den spezifische Positionen auf die Genaktivierung ausüben. In früheren Versuchen (siehe Beispiel 6) wurde nachgewiesen, dass die siRNAs die Fähigkeit, die Transkription zu aktivieren, verlieren, wenn die Positionen 4, 5 und 6 oder 16, 17 und 18 zusammen mit ihren komplementären Basen mutiert werden. siRNAs entwickeln, die Mutationen in nur einem Strang der Duplex-siRNAs enthalten. Die mutierten Nukleotide sind in der Tabelle unten als Großbuchstaben dargestellt.
Positionen 4, 5 und 6. Mutationen in nur einem Strang von siRNAs
Tabelle 18: Mutationen in nur einem Strang von siRNAs an den Positionen 4, 5 und 6.
Tabelle 19: Mutationen in nur einem Strang von siRNAs an den Positionen 16, 17 und 18
siRNAs mit unterschiedlicher Länge
Kleine RNAs, darunter siRNAs und miRNAs, können einen Längenbereich von 18 bis 24 Nukleotide aufweisen. In den ursprünglichen Versuchen wurde gefunden, dass neun siRNAs, die Regionen des ABA-induzierbaren Promoters entsprechen, die Genexpression aktivieren. siRNAs mit 18 und 24 Nukleotiden auf Basis von ABA-29 und ABA-33 entwickeln.
siRNAs mit 18 Nukleotiden
Tabelle 20: siRNAs mit 18 Nukleotiden
siRNAs mit 24 Nukleotiden
Tabelle 21: siRNAs mit 24 Nukleotiden
Beispiel 13: RNAa in monokotylen Pflanzen:
Es wurde ein Maisgen ausgewählt, um RNAa in monokotylen Pflanzen zu testen. Die 2 KB stromaufwärts von mutmaßlichen Promoterregionen von Gen GRMZM2G140653 wurde mittels PCR amplifiziert und mit dem Luciferase-Reporter und dem NOS-Terminator kloniert. Das Konstrukt erhielt die Bezeichnung RTP 4962.
Dieses Konstrukt wurde anschließend wie zuvor von Hwang und Sheen (2001) beschrieben in Maisprotoplasten hinein transformiert. RTP4962 zeigte in Protoplasten-Assays eine Luciferase-Expression. Insgesamt wurden 63 siRNAs zu diesem Promoter (GRMZM2G140653) entwickelt, von denen 34 in Maisprotoplasten getestet wurden. Von den 34 getesteten siRNAs zeigten 4 eine 1,5- bis 2-fache Aktivierung (Tabelle 22)

siRNA RLU Standardabweichung

RTP4962 9,59 1,52

NF-3 18,09 2,46

NF-5 16,01 2,2

NF-6 15,54 5,21

NF-34 16,38 3,44

Tabelle 22: Relative Luciferase-Expression des von siRNAs aktivierten Mais-Promoters GRMZM2G140653
Tabelle 23: siRNAs zu dem GRMZM2G140663-LUC-Promoter, der die Luciferase-Expression aktvierte (mit SEQ ID NO)
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zum Erhöhen der Expression eines Zielgens in einer Pflanze oder einem Teil davon im Vergleich zu einem entsprechenden Wildtyp oder Teil davon, das das Einführen eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das nicht in einer entsprechenden Wildtyppflanze oder einem Teil davon vorkommt, in die Pflanze oder den Teil davon umfasst, wobei mindestens ein Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls zu mindestens einem Teil eines Regulationselements, das die Expression eines Zielgens in der Pflanze oder dem Teil davon reguliert, komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem rekombinanten Nukleinsäuremolekül um eine pre-miRNA, eine microRNA, einen Vorstufen-ta-siRNA, eine ta-siRNA oder eine kurze Hairpin-RNA handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Prozessierung der rekombinanten Nukleinsäure in einer Pflanzenzelle zu einem methylierten RNA-Molekül führt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül, das zu mindestens einem Teil einer Region, die die Expression eines Zielgens reguliert, komplementär ist, zu einem Teil eines Promoters komplementär ist, der 100 Bp oder weniger von der Transkriptionsinitiationsstelle entfernt ist, und vorzugsweise zu der Transkriptionsinitiationsstelle des Promoters komplementär ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül, das zu mindestens einem Teil eines Regulationselements, das die Expression eines Zielgens reguliert, komplementär ist, zu einem Teil des Regulationselements komplementär ist, das mindestens einen Teil einer Regulations-Box des Regulationselements umfasst oder nicht mehr als 100 Bp von solch einem Regulationselement entfernt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen von einer oder mehreren pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurzen Hairpin-RNA, die zu einem Regulationselement eines Zielgens komplementär ist, b) Testen der einen oder mehreren pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurzen Hairpin-RNA in vivo oder in vitro auf ihre Eigenschaft, die Expression des Zielgens zu erhöhen, c) Identifizieren, ob die pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurze Hairpin-RNA die Zielgenexpression erhöht und d) Einführen der einen oder mehreren pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurzen Hairpin-RNA in eine Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die pre-miRNA, micro-RNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurze Hairpin-RNA, die die Zielgenexpression erhöhen, in die Pflanze dadurch eingeführt werden, dass man die pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurze Hairpin-RNA, die die Zielgenexpression erhöht, in Pflanzentransformationsvektoren, die pflanzenspezifische Regulationselemente umfassen, cloniert, Pflanzen oder Teile davon mit dem Vektor transformiert und transgene Pflanzen, die den Vektor oder einen Teil des Vektors umfassen, gewinnt.
Verfahren zum Erhöhen der Expression eines Zielgens in einer Pflanze oder einem Teil davon, umfassend das Einführen eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine modifizierte pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA oder ta-siRNA, in die Pflanze oder den Teil davon, wobei die Sequenz in Bezug auf eine Wildtyp-pre-miRNA-, -microRNA-, -Vorstufen-ta-siRNA- oder -ta-siRNA-Sequenz dadurch modifiziert ist, dass mindestens eine Region der natürlichen pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA oder ta-siRNA, die zu ihrer entsprechenden homologen Zielsequenz komplementär ist, durch eine Sequenz ersetzt wird, die zu einem Regulationselement, das die Expression eines Zielgens reguliert und das in Bezug auf die natürliche pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA oder ta-siRNA heterolog ist, komplementär ist.
Verfahren zum Identifizieren von aktivierenden microRNAs oder ta-siRNAs in einer Pflanze oder einem Teil davon, umfassend die folgenden Schritte: a) Identifizieren von microRNAs oder ta-siRNAs in der Pflanze oder dem Teil davon, wobei die microRNA homolog ist oder die ta-siRNA eine Phasenregion, die zu einem Regulationselement in der jeweiligen Pflanze homolog ist, umfasst, b) Clonieren der microRNAs oder ta-siRNAs von der Pflanze oder dem Teil davon, c) Überexprimieren der microRNAs und/oder ta-siRNAs in einer Pflanze und d) Vergleichen der Genexpression in den transgenen Pflanzen mit entsprechenden Wildtyppflanzen.
Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements durch Modifizieren eines Abschnitts, der einer pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA oder ta-siRNA, die Aktivierung der Expression von Genen unter der Kontrolle des Regulationselements vermittelt, als Ziel dient, in dem pflanzenspezifischen Regulationselement.
Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements durch Einführen eines Abschnitts mit Homologie zu einer pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA oder ta-siRNA, die eine erhöhte Expression von Genen unter der Kontrolle des Regulationselements vermittelt, in das pflanzenspezifische Regulationselement.
Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements nach Anspruch 11, wobei der Abschnitt einen Abschnitt mit Homologie zu einer endogenen pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA oder ta-siRNA ersetzt.
Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements nach Anspruch 12, wobei der Abschnitt zu einer endogenen pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA oder ta-siRNA homolog ist.
Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements nach Anspruch 12, wobei der Abschnitt zu einer rekombinanten pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurzen Hairpin-RNA homolog ist.
Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei das pflanzenspezifische Regulationselement in vivo modifiziert wird.
Verfahren zum Ersetzen der Regulationsspezifität eines pflanzenspezifischen Regulationselements nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei das pflanzenspezifische Regulationselement in vitro modifiziert wird.
Nukleinsäurekonstrukt für die Expression in Pflanzen, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die für eine modifizierte pre-miRNA-, microRNA-, Vorstufen-ta-siRNA- oder ta-siRNA-Sequenz codiert, wobei die Sequenz in Bezug auf eine Wildtyp-pre-miRNA-, -microRNA-, -Vorstufen-ta-siRNA- oder -ta-siRNA-Sequenz dadurch modfiziert ist, dass mindestens eine Region der Wildtyp-pre-miRNA, -microRNA, -Vorstufen-ta-siRNA oder -ta-siRNA, die zu ihrer entsprechenden Wildtypzielsequenz komplementär ist, durch eine Sequenz ersetzt wird, die zu einem Regulationselement, das die Expression eines Zielgens reguliert und das in Bezug auf die natürliche pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA oder ta-siRNA heterolog ist, komplementär ist und die bei Einführen in die Pflanze oder den Teil davon eine erhöhte Expression vermittelt.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 17, wobei der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, der zu einem Regulationselement, das die Expression eines Zielgens reguliert, komplementär ist, eine Länge von 15 bis 30 Bp aufweist.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 18, wobei der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, der zu einem Regulationselement, das die Expression eines Zielgens reguliert, komplementär ist, eine Länge von 19 bis 26, vorzugsweise 20 bis 25, stärker bevorzugt 21 bis 24 bp, noch stärker bevorzugt 21 Bp aufweist.
Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, der zu einem Regulationselement, das die Expression eines Zielgens reguliert, komplementär ist, eine Identität von 60% oder mehr, vorzugsweise 70% oder mehr, stärker bevorzugt 75% oder mehr, noch stärker bevorzugt 80% oder mehr, ganz besonders bevorzugt 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr, zum Beispiel 100%, beträgt.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 19 oder 20, wobei der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, der zu einem Regulationselement, das die Expression eines Zielgens reguliert, komplementär ist, 7 bis 11, vorzugsweise 8 bis 10, stärker bevorzugt 9, aufeinanderfolgende Basenpaare mit Homologie zu dem Zielgenregulationselement umfasst.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 21, wobei der Teil des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, der zu einem Regulationselement, das die Expression eines Zielgens reguliert, komplementär ist, wobei die aufeinanderfolgenden Basenpaare mindestens 80% Identität, vorzugsweise 90% Identität, stärker bevorzugt 95% Identität, am stärksten bevorzugt 100% Identität zu dem Zielgenregulationselement aufweisen.
Vektor, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 17 bis 22.
System zum Aktivieren der Genexpression in einer Pflanze oder einem Teil davon, umfassend a) ein pflanzenspezifisches Regulationselement, umfassend einen Abschnitt mit Homologie zu einer pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurzen Hairpin-RNA mit Heterologie zu dem Regulationselement sowie b) ein Konstrukt, umfassend eine aktivierende pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurze Hairpin-RNA mit Homologie zu dem Abschnitt gemäß a) unter der Kontrolle eines pflanzenspezifischen Promoters.
System nach Anspruch 24 zum Aktivieren der Genexpression eines endogenen Gens.
System nach Anspruch 24 zum Erhöhen der Genexpression eines Transgens.
Pflanze oder Teil davon, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül eine Erhöhung der Expression eines Zielgens in einer Pflanze oder einem Teil davon im Vergleich zu einer entsprechenden Pflanze oder einem Teil davon, die/der das rekombinante Nukleinsäuremolekül nicht umfasst, vermittelt.
Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 27, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül in das Genom der Pflanze oder des Teils davon integriert ist.
Pflanzenzelle, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül eine Erhöhung der Expression eines Zielgens in der Pflanzenzelle im Vergleich zu einer entsprechenden Pflanzenzelle, die das rekombinante Nukleinsäuremolekül nicht umfasst, vermittelt.
Pflanzenzelle nach Anspruch 29, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül in das Genom der Pflanze oder des Teils davon integriert ist.
Mikroorganismus, der fähig ist, Nukleinsäuren in eine Pflanze oder einen Teil einer Pflanze zu transferieren, wobei der Mikroorganismus ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 17 bis 22 umfasst, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül bei Transfer des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts eine Erhöhung der Expression eines Zielgens in der Pflanze oder dem Teil einer Pflanze im Vergleich zu einer entsprechenden Pflanze oder einem entsprechenden Teil einer Pflanze, die/der das rekombinante Nukleinsäuremolekül nicht umfasst, vermittelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 16, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 17 bis 22, eine Pflanze nach einem der Ansprüche 27 bis 28 und/oder eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 29 bis 30.
Verfahren zur Herstellung eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 17 bis 22, eines Vektors nach Anspruch 23, einer Pflanze nach einem der Ansprüche 27 bis 28 und/oder eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 29 bis 30.
pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurze Hairpin-RNA, die eine Erhöhung der Genexpression in einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, umfassend die Sequenz nach einer von SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 und/oder 39.
Verwendung einer pre-miRNA, microRNA, Vorstufen-ta-siRNA, ta-siRNA oder kurzen Hairpin-RNA nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Erhöhung der Expression eines Zielgens in einer Pflanze.
Verwendung nach Anspruch 35 zum Erhöhen der Expression eines endogenen Zielgens.
Verwendung nach Anspruch 35 zum Erhöhen der Expression eines transgenen Zielgens.