KR101820095B1 - 식물 종자의 호분층 또는 배 특이적 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 종자의 호분층 또는 배 특이적 OsDOG1L3(Oryza sativa Delay of Germination 1-Like 3) 프로모터, 및 이를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다. 상기 OsDOG1L3 프로모터를 이용하면 외래 유전자를 종자의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시킬 수 있다. 특히 호분층의 둥쪽에서 선택적으로 목적유전자를 발현시키는데 이용가능하다. 따라서, 성숙 종자 내에서의 목적 유전자 기능 분석에 유용하게 이용할 수 있고, 이를 통해 기능성 종자를 개발하는 데에 이용할 수 있다.

Description

식물 종자의 호분층 또는 배 특이적 프로모터 및 이의 용도 {Promoter specific for plant seed aleurone layer or embryo and uses thereof}

본 발명은 식물 종자의 호분층 또는 배 특이적 OsDOG1L3(Oryza sativa Delay of Germination 1-Like 3) 프로모터, 및 이를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.

육종(breeding)이란 생물이 가진 유전적 성질을 이용하여 새로운 품종을 만들어 내거나 기존 품종을 개량하는 일을 말한다. 새로운 품종은 그 형질(특성)이 조금이라도 기존의 것과는 다르고, 그것이 작물 또는 가축으로서 농업생산에 유익한 우수성, 균등성 및 영속성을 지녀야만 한다. 육종사업은 과학적 이론을 바탕으로 그 목적을 달성하기 위하여 여러 가지 수단을 쓰고 있는데, 그것을 육종기술이라고 한다.

육종의 방법으로는 선발법, 교잡법, 잡종 강세 육종법, 배수성 육종법, 돌연변이법, 유전공학을 이용하는 방법 등 여러 가지 방법이 있으며, 최근 분자생물학 기술의 발전에 따라 분자 육종법이 주목을 받고 있다.

분자 육종법은 생물학이 발전함에 따라 생긴 것으로 생물의 유전정보인 DNA를 직접 조작하여 유용생물을 만들어내는 기술이다. 이미 사람의 단백질을 생산하는 재조합미생물 등이 육종되고 있다. 분자육종에 의하여 종래 육종법의 한계였던 종의 벽을 건너뛰었으며, 이로써 교배되지 않던 사람과 미생물 등의 사이에도 유전정보를 교환할 수 있게 되었다. 분자 육종을 하기 위해서는 유용한 유전자를 발현시킬 수 있는 수단 및 다양한 동식물에 대한 형질전환기법 등이 필요하며, 특히 원하는 유전자를 원하는 부위에서 발현시키기 위한 다양한 프로모터 및 벡터 개발의 필요성이 지속적으로 요구되고 있다.

최근 들어 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두 되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터(promoter)가 요구된다.

일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종이다. 그동안 끊임없는 연구들을 통해 수많은 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분되어 질 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 첫째로 발현 양을 최대화할 수 있는 강한 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현량을 최대화하는데 이용되는 프로모터로써 초기에 많이 개발되었으며, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 유전자의 프로모터(P35S) 및 벼의 액틴(actin) 유전자 프로모터가 대표적이다. 이들은 식물의 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제 저항성 유전자, 식물의 병충해 억제 유전자 또는 식물을 이용한 물질 생산 등의 목적으로 주로 사용되고 있다.

둘째로, 발현 시기를 제한하는 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물 발달 단계 중 특별한 시기에만 국한시키는 프로모터로서 많은 예들이 보고되어 있다. 예를 들어, 개화에 관련된 유전자들의 프로모터는 개화기에만 유전자를 발현시키며, 각종 생물학적(biotic) 또는 비생물학적(abiotic) 자극에 의하여 발현되는 유전자들의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.

셋째로, 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 사용하고자 하는 다양한 목적에 따라서 식물체의 각 조직에 대하여 많은 예가 보고된 바 있다.

특히, 상기와 같이 기능 및 특징에 따라 구분되어진 프로모터들 중 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체 내에서 발현되는 조직에 따라 다시 다음과 같이 분류되고 있다.

첫째로, 전신 발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물체 전신에서 발현을 유도하는 프로모터로는 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터이기도 한 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍자엽 식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자의 프로모터들이 주로 이용되고 있고, 최근에는 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 개발된 바 있다(특허문헌 1). 이들도 상기 발현 양을 최대화하는 프로모터와 동일하게 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 사용되고 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 및 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터가 있다.

셋째로, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 이는 아직까지 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이와 관련된 프로모터로는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터 및 배추 꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 있다.

이러한 종자, 뿌리 또는 잎 특이적 발현 프로모터들은 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용이 기대되고 있다.

그러나 상기 공지된 프로모터들, 특히 식물체에서 조직 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 알려진 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.

최근에는 식물의 특정 조직에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 프로모터들이 개발되고 있으며, 예를 들어 벼 Os05g0543000 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터 등이 공개되어 있다(특허문헌 2).

이에 본 발명자들은 형질전환 식물체 제조에 이용될 수 있는 새로운 프로모터를 개발하기 위한 연구를 하여, 식물 종자의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현되는 프로모터를 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허공보 제0429335호 대한민국 등록특허공보 제1554209호

본 발명의 목적은 식물 종자의 호분층(aleurone layer) 또는 배(embryo) 특이적 OsDOG1L3(Oryza sativa Delay of Germination 1-Like 3) 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 식물체로부터 수득한 형질전환된 종자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 식물 종자의 호분층(aleurone layer) 또는 배(embryo) 특이적 OsDOG1L3(Oryza sativa Delay of Germination 1-Like 3) 프로모터를 제공한다.

상기 프로모터는 벼(Oryza sativa L.)로부터 분리된 것일 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 벼 출수 후 25일째와 40일째 유전자 발현이 약 2배 이상 증가하는 유전자군에서 OsDOG1L3 유전자의 번역시작 상위염기서열을 분리하였다.

상기 프로모터는 종자 발아와 휴면 조절에 관여하는 다양한 조절인자를 포함할 수 있으며, 구체적으로 종자 또는 배 특이적인 발현을 지시하는 모티프(motif), cytokinin 호르몬에 의한 발현조절에 관여하는 모티프, GA(지베렐린) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프, ABA(앱시스산) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프 등이 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.

상기 서열번호 1의 염기서열은 2,000 bp 크기일 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열은 최근의 여러 가지 연구기법, 예를 들어 방향성 진화법(directed evolution) 또는 부위특이돌연변이기술(site-directed mutagenesis) 등의 방법을 통해 일정 정도 변형이 가능하다. 즉, 본 발명의 OsDOG1L2 프로모터 핵산 분자는 이와 기능적으로 동일한 작용을 수행하는 이의 작용성 등가물을 포함하는데, 상기 작용성 등가물은 인위적인 변형에 의해 뉴클레오타이드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합에 의해 변형된 변이체(varients) 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 폴리뉴클레오티드의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다.

본 기술분야의 통상의 기술자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명의 신규한 프로모터와 균등물로서 본 발명의 권리 범위에 속함을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 상기 프로모터는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상의 상동성(homology)을 나타내고, 프로모터 활성을 가지는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "상동성"은 핵산 서열 간의 유사도를 나타낵 위한 것으로서, 서열번호 1의 염기 서열과 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 염기서열을 포함한다.

상기 프로모터는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상의 상동성을 나타내고 프로모터 활성을 가지는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인(complementary) 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 바람직하게는, 이들은 상기 뉴클레오타이드와 동등한 프로모터 활성을 가지는 것이 좋다.

본 명세서에서 사용된 용어, "상보적인"은 뉴클레오타이드 또는 핵산, 예를 들어 이중가닥 DNA 분자의 2개의 가닥 간의 하이브리드화 또는 염기 짝지음을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "호분층(aleurone layer)"이란 볏과, 대나무과 종피의 안쪽에서 볼 수 있는 호분립을 다량으로 포함한 세포층을 의미하는 것으로, 배유(endosperm) 주변부의 세포에서 분화되며, 벼에서는 종자의 배쪽 (ventral side)에는 1개의 세포층, 등쪽 (dorsal side)에는 2~3개의 세포층으로 되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "배(embryo)"는 식물의 종자 속에 있는 발생초기의 어린 자엽, 배축, 유아, 유근을 의미하는 것으로, 종자가 발아하여 잎, 줄기, 뿌리의 어린 식물이 되는 부분이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "특이적"은 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물체 내의 적어도 하나 이상의 다른 조직보다 특정한 조직 내에서 더 높다는 것을 의미한다. 프로모터의 발현 활성의 수준은 본 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 미리 측정된 조직 내에서의 프로모터의 발현 수준을 다른 조직 내에서의 것과 비교함으로써 평가될 수 있다. 일반적으로 프로모터의 발현 수준은 프로모터의 조절 하에서 발현된 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 및 RNA 등의 생성량에 의해 측정된다.

따라서, 용어 "식물 종자의 호분층(aleurone layer) 또는 배(embryo) 특이적"이란 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물 내 다른 조직 보다 식물 종자의 호분층 또는 배 조직 내에서 더 높다는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 OsDOG1L3 프로모터의 발현 활성은 식물 종자의 등쪽 호분층 또는 배에 특이적일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 OsDOG1L3 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 재조합 벡터는 상기 OsDOG1L3 프로모터에 작동가능하게 연결된 외래 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

상기 재조합 벡터는 상기 외래 유전자를 식물 종자의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "작동가능하게 연결된"이란 프로모터 서열이 상기 코딩 서열의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 코딩 서열과 프로모터가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서, 벡터의 제작은 Gateway 벡터 시스템을 이용하였다. 구체적으로, 발현하고자 하는 유전자 서열의 양쪽 서열을 프라이머(primer) 서열로 하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭하였다. attL1과 attL2 site를 가지고 있는 pENTR/Directional TOPO vector(Invitrogen)에 삽입하기 위하여 양 방향 프라이머 중 정 방향 프라이머 앞쪽에 CACC를 삽입하여 증폭된 유전자가 방향성을 가지고 pENTR™ Directional TOPO vector에 들어갈 수 있게 만들었다 (pENTR™ Directional TOPO Cloning Kits, Invitrogen). 그리고 이를 다시 attR1과 attR2를 가지고 있는 목적 Gateway 벡터 시스템에 LR Clonase II Enzyme Mix를 이용하여 목적 유전자를 목적 벡터(vector)에 삽입하였다. 이러한 방식으로 목적 유전자를 과발현하는 벡터를 제작하였다. att라 불리는 특이한 서열을 통한 위치 특이적 재조합(SSR, Site-specific recombination)을 이용한 것이다.

상기 재조합 벡터는 프로모터의 하위(downstream)에 리포터 유전자를 연결시켜 프로모터의 활성 정도를 측정할 수 있으며, 예를 들어 리포터 유전자로는 GUS를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 GUS 리포터 유전자를 포함하는 pBGWFS7 벡터에 OsDOG1L2 프로모터를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 OsDOG1L2 프로모터-GUS 발현 벡터를 예시하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다. 상기 GUS 리포터 유전자는 프로모터의 활성 정도를 측정하기 위한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터에서 GUS 리포터 유전자 대신 식물 종자의 호분층 또는 배에서 특이적 발현을 유도하기 위한 목적하는 외래 유전자를 도입할 수 있음은 자명한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 재조합 벡터의 식물체로의 도입은 당 기술분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 히트 쇼크법(heat shock), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움-매개에 의한 방법, 즉 본 발명에 따른 발현벡터가 도입된 아그로박테리움을 이용하여 식물 세포를 형질전환시키는 방법을 통해 본 발명의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 재조합 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다.

상기 형질전환 식물체는 벼, 보리, 밀, 수수 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로 벼일 수 있고, 예를 들어 동진벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 형질전환 식물체로부터 수득한 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, OsDOG1L3 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 종자를 발달단계에 따라 채취하여 GUS 염색법으로 분석한 결과, 종자의 호분층, 특히 등쪽 호분층 또는 배에서 GUS 발현을 유도하는 특성이 있는 것을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 OsDOG1L3 프로모터를 이용한 외래 유전자를 형질전환 식물체의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키는 방법을 제공하며, 보다 구체적으로

1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsDOG1L3(Oryza sativa Delay of Germination 1-Like 3) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계;를 포함하는, 외래 유전자를 형질전환 식물체의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.

상기 단계 2)의 식물체는 벼, 보리, 밀, 수수 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로 벼일 수 있고, 예를 들어 동진벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, OsDOG1L3 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 종자를 발달단계에 따라 채취하여 GUS 염색법으로 분석한 결과, 성숙 종자에서 배유(endosperm)에는 거의 염색되지 않고, 호분층, 특히 등쪽에 위치한 호분층 또는 배에서 특이적으로 강하게 염색되었으며, 유묘의 뿌리나 성숙한 벼의 잎에서는 GUS 염색이 관찰되지 않았으므로, OsDOG1L3 프로모터가 식물 종자의 호분층 또는 배에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 구체예에 따른 OsDOG1L3 프로모터를 이용하면 외래 유전자를 종자의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시킬 수 있다. 따라서, 성숙 종자 내에서의 목적 유전자 기능 분석에 유용하게 이용할 수 있고, 이를 통해 기능성 종자를 개발하는 데에 이용할 수 있다.

도 1은 벼 출수 후 종자발달 단계에 따른 OsDOG1L3 유전자의 발현 수준을 나타낸 도이다;
(A) 벼 출수 후 종자발달 단계;
(B) RNA의 마이크로어레이(microarray) 분석 결과 종자발달 과정에서 발현이 증가되는 유전자군의 벼 출수 후 일수(0, 3-6, 25, 40일째)에 따른 발현 수준을 나타낸 그래프; 및
(C) OsDOG1L3 유전자의 벼 출수 후 일수(0, 3-6, 25 40일째)에 따른 발현 수준을 나타낸 그래프.
도 2는 공공데이터베이스를 이용하여 벼 발달 단계 및 조직에 따른 OsDOG1L3 유전자의 발현양상을 분석한 도이다 (RiceXPro, http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 OsDOG1L3 프로모터-GUS 발현 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 OsDOG1L2 프로모터-GUS 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 벼에서 벡터 도입 여부를 확인한 PCR 분석 결과이다:
DJ: 대조구인 동진벼(Dongjin); 및
T489-11, T489-12: OsDOG1L3 프로모터-GUS 발현 벡터로 형질전환된 벼.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 OsDOG1L3 프로모터-GUS 발현 벡터가 도입된 형질전환 벼의 GUS 염색 결과(AL, 호분층(Aleurone layer); EM, 배(Embryo); EN, 배유(Endosperm); ventral, 배쪽; dorsal, 등쪽)를 나타낸 도이다:
(A) 종측 절단 종자의 GUS 염색 결과;
(B) 횡측 절단 종자의 GUS 염색 결과;
(C) 캘루스의 GUS 염색 결과;
(D) 10일 간 키운 유묘의 뿌리의 GUS 염색결과; 및
(E) 10일 간 키운 유묘의 잎의 GUS 염색 결과.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 OsDOG1L3 프로모터-GUS 발현 벡터가 도입된 형질전환 벼의 파라핀 절편을 통한 발현 양상을 나타낸 도이다:
(A) 파라핀 섹션;
(B) 등쪽 세포층; 및
(C) 배쪽 세포층.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

<실시예 1> 벼 종자발달 전사체 분석 및 전사인자 OsDOG1L3 유전자 선발

고품벼에서 출수 후 종자발달 단계 (도 1A)에 따라 RNA를 분리하여 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행하고, 출수 후 25일째와 40일째 유전자 발현이 각각 2배 이상 증가하는 유전자군 선발하였다 (도 1B). 종자발달 과정에서 발현이 강화되는 유전자군 중에서 OsDOG1L3(Oryza sativa Delay of Germination 1-Like 3) 유전자(LOC_Os01g20030)를 선발하였다 (도 1C). 또한 선발한 LOC_Os01g20030 유전자의 조직별 발현양상을 공공데이터베이스 (RiceXPro, http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)를 이용하여 예측해보았을 때 종자의 배와 배유 등 종자에서 상대적으로 발현이 높다는 것을 알 수 있었다 (도 2).

<실시예 2> OsDOG1L3 프로모터 분리 및 재조합 벡터 제작

<2-1> OsDOG1L3 프로모터의 분리

상기 실시예 1에서 선발된 OsDOG1L3 유전자의 프로모터 영역을 분리하기 위하여, 번역시작 상위 염기서열 2,000 bp의 염기서열 정보를 벼 게놈 데이터베이스(genome database)에서 추출하였다. 그 다음, 상기 2,000 bp의 염기서열을 특이적으로 증폭하는 한 쌍의 특이 프라이머 (pOsDOG1L3P-F/R)를 제작하였다(표 1). 상기 프라이머 세트를 이용하여 동진 벼의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃ 5분, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 10초의 두 번째 단계에서 35회 반복 및 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen)에 클로닝하고 전체 염기서열을 결정하였으며, 상기 서열을 서열번호 1로 하였다.

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 방향	염기서열(5'→3')
2	pOsDOG1L3P-F	정방향	gccgcccccttcacc GCTAGTGAGCTGCAGGTT
3	pOsDOG1L3P-R	역방향	tcggcgcgcccaccc tt TCTTTGCCCCTCCCACCCT

<2-2> OsDOG1L3 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터의 제작

게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용하여 OsDOG1L3 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제조하였다.

구체적으로, 분리한 프로모터는 GUS 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 pBGWFS7.0 벡터(PSB사, Plans System Biology)에 클로닝하여 도 3과 같은 OsDOG1L3 프로모터-GUS 발현 벡터를 제작하였다. 즉, 진입클론으로서 pENTR/D-TOPO 벡터에 클로닝 되어있는 OsDOG1L3 프로모터를 LR clonase(Invitrogen)를 이용한 치환 방법을 통해서 목표 벡터인 GUS 리포터 유전자를 포함하는 pBGWFS7.0으로 클로닝하였다.

<2-3> OsDOG1L3 프로모터에 존재하는 조절인자의 확인

OsDOG1L3 프로모터에 존재하는 조절인자를 확인하기 위해 PLACE (plant cis-acting element database: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, OsDOG1L3 프로모터에는 종자 또는 배 특이적인 발현을 지시하는 모티프(RYREPEATLEGUMINBOX, DPBFCOREDCDC3, CANBNNAPA), cytokinin 호르몬에 의한 발현조절에 관여하는 모티프(ARR1AT), GA 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프(GAREAT) 및 ABA 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프(ABRELATERD1, ABRERATCAL)등이 포함되어 있음을 확인하였다. 이로부터 OsDOG1L3 프로모터에 종자 발아와 휴면 조절에 관여하는 다양한 조절인자가 포함되어 있음을 알 수 있었다.(표 2).

Element name	Motif sequence	Numbers	Positions
MYBGAHV	TAACAAA	1	-1184
ABRELATERD1	ACGTG	4	-350, -504, -505, -1435
ABRERATCAL	MACGYGB	6	-87, -310, -354, -505, -702, -703
WRKY71OS	TGAC	14	-498, -507, -524, -610, -724, -871, -1085, -1428, -1437, -1461, -1491, -1499, -1573, -1603
CGACGOSAMY3	CGACG	5	-333, -338, -587, -858, -1950
DPBFCOREDCDC3	ACACNNG	8	-353, -481, -713, -784, -786, -818, -1434, -1621
GAREAT	TAACAAR	1	-1184
RYREPEATBNNAPA	CATGCA	4	-1136, -1328, -1623, -1876
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A	CCTTTT	4	-2001, -2001, -405, -1095
AMYBOX1	TAACARA	1	-1184
RYREPEATLEGUMINBOX	CATGCAY	3	-1328, -1624, -1877
LTRECOREATCOR15	CCGAC	2	-1751, -234
RYREPEATGMGY2	CATGCAT	1	-1877
CANBNNAPA	CNAACAC	1	-768
MYCATRD22	CACATG	2	-1283, -1621
ARR1AT	NGATT	23	-35, -62, -549, -740, -918, -948, -952, -1070, -1147, -1154, -1286, -1375, -1385, -1548, -1635, -1711, -1739, -1765, -1771, -1794, -1803, -1882, -1939
RAV1BAT	CACCTG	2	-244, -722

<실시예 3> OsDOG1L3 프로모터-GUS 발현 벡터가 도입된 형질전환 벼의 제작

OsDOG1L3 프로모터의 기능을 연구하기 위하여 상기 실시예 2-2에서 제작한 OsDOG1L3 프로모터-GUS 발현 벡터를 이용하여 형질전환 벼를 제작하였다.

구체적으로, OsDOG1L3 프로모터-GUS 발현 벡터를 아그로박테리움 LBA4404에 도입한 후, 동진벼 캘루스에 감염시켰다. 그 다음, 6 ㎍/L PPT(phosphinothricin) 조건에서 형질전환체를 선발하여 온실에서 생육하였다. 얻어진 형질전환 벼의 잎에서 genomic DNA를 분리하여 도입 벡터에 존재하는 GUS (GUSA-anti) 혹은 GFP (EGFP-Anti) 유전자와 프로모터 염기서열 (OsDOG1L3P-1785F)에 특이적인 프라이머를 각각 이용하여 genomic PCR을 수행하여 도입한 벡터가 삽입되었는지 확인하였다(표 3 및 도 4).

서열번호	프라이머 명칭	프라이머 방향	염기서열(5'→3')
4	GUSA-Anti	역방향	CGC GAT CCA GAC TGA ATG CCC
5	EGFP-Anti	역방향	GGT CTT GTA GTT GCC GTC GTC C
6	OsDOG1L3P-1785F	정방향	GCAGATGCATATGCAGCCTGCAGC

<실시예 4> OsDOG1L3 프로모터의 조직 발현 검정을 위한 형질전환 벼의 GUS 염색 분석

상기 실시예 3에 따라 OsDOG1L3 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 종자를 발달단계에 따라 채취하여 GUS 염색법으로 분석하였다. GUS 염색은 GUS 염색액(X-gluc 20mM, NaH2PO4H2O 100mM, NaEDTA 10mM, 0.1% Triton-X / pH7.5)에 시료를 넣고 37℃ 암조건에서 14시간 동안 반응한 후 90% 에탄올을 이용해서 염색액을 제거해주었다.

그 결과, 성숙종자에서 배유(endopserm)에는 거의 염색되지 않고 배(embryo)와 호분층 (aleurone layer)에서 특이적으로 염색되었다 (도 5A, 5B). 또한 종자의 배쪽 보다는 등쪽 부위에서 강한 GUS 염색이 관찰되었다 (도 5A, 5B). 반면 종자에서 유도한 캘루스에서는 GUS 염색이 관찰되지 않았다 (도 5C). 또한 10일간 키운 유묘의 뿌리와 잎에서도 GUS 염색이 전혀 관찰되지 않았다 (도 5D, 5E). 따라서 OsDOG1L3 프로모터가 벼 종자의 배 또는 호분층, 특히 등쪽 호분층에서 목적유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 증명하였다.

<실시예 5> 종자에서 OsDOG1L3 프로모터 발현 세포 분석

종자 내에서 GUS 발현이 유도되는 세포와 조직을 확인하기 위하여 염색 종자를 파라핀에 embedding 한 후 횡단 절편을 제작하였다. GUS 염색한 OsDOG1L3 프로모터-GUS 형질전환 벼의 성숙 종자를 10 % NBF (Neutral Buffered Formalin) 용액에 고정한 후 순차적으로 (90%, 95%, 99%, 100%) 에탄올 용액에 넣어 탈수하였다. 이 후 Xylene 용액으로 clearing한 후 60도 파라핀으로 조직을 굳힌 후 mounting하여 4 μm 파라핀 절편을 제작하여 현미경으로 절편 조직을 관찰하였다.

현미경 관찰 결과 GUS 염색 위치가 호분층 세포라는 것을 규명하였으며, 특히 종자의 등 쪽에 위치한 호분층 세포에서만 특이적으로 발현되는 것과 달리 (도6B) 배 쪽의 호분층 세포에서는 전혀 발현되지 않는다는 (도 6C) 것을 확인하였다. 따라서 OsDOG1L3 프로모터가 벼 종자의 등쪽 호분층 세포에서 목적유전자를 선택적으로 발현시킬 수 있음을 증명하였다.

<110> Republic of Korea <120> Promoter specific for plant seed aleurone layer or embryo and uses thereof <130> P17R12C0507 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2000 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gctagtgagc tgcaggtttt gtcctagagc aatttgatgc caagcccatc cgtcgtctca 60 ttgatttctc ttggaggttc ttctcctagc aacctaggca tcagctgcga gcatttgtcg 120 attatgcatg gagtgcccaa gaagtttgtg aagaatatat accttacctc agtaaggaaa 180 agtggtaaat tgggacaaat caagcttgat tttggtggtc gcttggtgag gattatgatt 240 gaaggagacc cgactcttcg gaatccttca atagagatgt aagatatatg gattcaaact 300 ttgatgatcg gttgtctcca tcctctcatt gcctttgtat ttactaatat gtgctaaaat 360 tgctcaatct actcttgtgc atgtgtaaac ttggtggtga ccctatattc tgatcactga 420 tatggaagtc atcaatgtaa tggttgaggg ttcgatttca tctctaatag cttgagaaag 480 gcagccgtta gatacgaggg agtcacctat gacaactgat cagctggtgg tgtcgagctg 540 tcatagatga tccttcaacc caatgacgtg tgtgaccctt atctgtaatg gttgtttcga 600 accattacag atgaatgatt accaaaatct atatattttt ttggtttgta gctagcctta 660 aaattttcta gccatgcacc tcgacaaaaa atacacatat atacccacaa atttaatcac 720 atgagcgatg ttccggtgct ctctactaat attattatat tactagtatt attagggata 780 aattagtaat ttactaatac aataattaag agttattttg ttatttatgt tttttcctag 840 ctaagtcgat ttatgattat ccattgcatg ctcatatttt accgaaaacc caaaaaaaaa 900 tttaaaaaag gtttagtcac tgctaaatga tgattatatc ttgtacctat tttttttaca 960 ataataccct tatacgtttc tactactaac tgggtggtag ctagtataaa tagatctaaa 1020 cccttcgatg aaatgatatc agcggttcag attgatttct actaccagta aggtgaggct 1080 ctaatcgcat atatctccca gttatcccac tgtttagttc gtttagtctg tcacatatga 1140 tccgtcgtag atacgagaat ttatgagaat ttatcattta tgctcgtgta aaaagaggag 1200 tatgagaatt tatgctcgtg tgtcgtattt gagtgtttga aattttttta ctcagtctta 1260 ggattcctgt ctcggtgtca cctgtaccga gtgttccaac gcgtgcttac gaatgcaaag 1320 aaaaaatatc tcacacgaag aagaagccaa atttgctgca cgcaagtatc acatacgaga 1380 agaagaagaa gtcaaatttg ctgctaagac ctacgacgcg cggggaacga agataccggg 1440 accagaaaac gaatcagaaa taccacccag gttccgtgac ttggtggact cttgtcacgt 1500 gctgaccatg ggacagagca caccaggcag gctagctacg agtagctaac ttgccgcgac 1560 ttgggaagcc aactcccgcc tcgccaccac ctcctccttt tgtctccgtg ccacgggcat 1620 gcgaaccccc gcggcgccgt gcgcgcgcgc gtgtccgccg cacgtcgcga cgcaacagca 1680 agcggcagcc cacgcggaga gccgcccaga acgccctgtg ctgccgtgcc gccgctcaac 1740 tcttcctcct ccactccacc tgcgcgccga ccaaccaacc aactgcagat gcatatgcag 1800 cctgcagcta gctgttggtt ttgctcctat ttcccctcgt ggtctcgcct cgtctcttcc 1860 ttcgccggct gcgggctcgc cgcgaggttg cctccgcgcc taagcaaaag cagccgcgtg 1920 cgcgcgcgcg cgcgcgccaa tccttctagg ccaagaaacc gcgcccgatt tatgccggcc 1980 cagggtggga ggggcaaaga 2000 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pOsDOG1L3P-F <400> 2 gccgccccct tcaccgctag tgagctgcag gtt 33 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pOsDOG1L3P-R <400> 3 tcggcgcgcc caccctttct ttgcccctcc caccct 36 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSA-Anti <400> 4 cgcgatccag actgaatgcc c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP-Anti <400> 5 ggtcttgtag ttgccgtcgt cc 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsDOG1L3P-1785F <400> 6 gcagatgcat atgcagcctg cagc 24

Claims (10)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 식물 종자의 호분층(aleurone layer) 또는 배(embryo) 특이적 OsDOG1L3(Oryza sativa Delay of Germination 1-Like 3) 프로모터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 호분층은 식물 종자의 등쪽에 위치하는 호분층인 것인, OsDOG1L3 프로모터.
3. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 벼(Oryza sativa L.)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 OsDOG1L3 프로모터.
4. 제 1항의 OsDOG1L3 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제 4항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
6. 제 5항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 벼, 보리, 밀, 수수 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
7. 제 5항에 따른 형질전환 식물체로부터 수득한 형질전환된 종자.
8. 1) 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 OsDOG1L3(Oryza sativa Delay of Germination 1-Like 3) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
   2) 상기 단계 1)에서 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계;를 포함하는, 외래 유전자를 형질전환 식물체의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 호분층은 식물 종자의 등쪽에 위치하는 호분층인 것인, 외래 유전자를 형질전환 식물체의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키는 방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 식물체는 벼, 보리, 밀, 수수 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외래 유전자를 형질전환 식물체의 호분층 또는 배에서 특이적으로 발현시키는 방법.

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