KR101437606B1 - 배추 유래 프로모터 및 상기 프로모터로 형질 전환된 식물 - Google Patents

배추 유래 프로모터 및 상기 프로모터로 형질 전환된 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터에 대한 것이다. 보다 상세하게는 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체에 대한 것이다. 본 발명의 프로모터는 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하기 때문에, 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 특이적으로 발현시킴으로써 작물의 형질을 개량시킬 수 있다.

Description

배추 유래 프로모터 및 상기 프로모터로 형질 전환된 식물{PROMOTER FROM BRASSICA AND PLANT TRANSFORMED WITH THE SAME}
본 발명은 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하는 배추 유래 프로모터에 대한 것이다. 보다 상세하게는 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체에 대한 것이다.
최근 들어 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두 되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터(promoter)가 요구된다.
일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종이다. 그 동안 끊임없는 연구들을 통해 수많은 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분되어 질 수 있다.
보다 구체적으로 살펴보면, 첫째로 발현 양을 최대화할 수 있는 강한 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현량을 최대화하는데 이용되는 프로모터로써 초기에 많이 개발되었으며, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 유전자의 프로모터(P35S) 및 벼의 액틴(actin) 유전자 프로모터가 대표적이다. 이들은 식물의 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제 저항성 유전자, 식물의 병충해 억제 유전자 또는 식물을 이용한 물질 생산 등의 목적으로 주로 사용되고 있다.
둘째로, 발현 시기를 제한하는 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물 발달 단계 중 특별한 시기에만 국한시키는 프로모터로서 많은 예들이 보고되어 있다. 예를 들어, 개화에 관련된 유전자들의 프로모터는 개화기에만 유전자를 발현시키며, 각종 생물학적(biotic) 또는 비생물학적(abiotic) 자극에 의하여 발현되는 유전자들의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.
셋째로, 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 사용하고자 하는 다양한 목적에 따라서 식물체의 각 조직에 대하여 많은 예가 보고된 바 있다.
특히, 상기와 같이 기능 및 특징에 따라 구분되어진 프로모터들 중 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체 내에서 발현되는 조직에 따라 다시 다음과 같이 분류되고 있다. 첫째로, 전신 발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물체 전신에서 발현을 유도하는 프로모터로는 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터이기도 한 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍자엽 식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자의 프로모터들이 주로 이용되고 있고, 최근에는 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 개발된 바 있다(대한민국 등록특허 제0429335호). 이들도 상기 발현 양을 최대화하는 프로모터와 동일하게 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 사용되고 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.
둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 및 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터가 있다.
셋째로, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 이는 아직까지 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.
넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이와 관련된 프로모터로는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터 및 배추 꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 있다.
이러한 종자, 뿌리 또는 잎 특이적 발현 프로모터들은 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용이 기대되고 있다.
그러나 상기 공지된 프로모터들, 특히 식물체에서 조직 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 알려진 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은, 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터에 대한 연구를 계속하여 배추에서 분리한 프로모터가 식물체의 생장 및 발달 시기에 특정 조직에서 목적 유전자의 발현을 유도하는 활성이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1054891호
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물과 상기 형질전환된 미생물로 형질전환된 식물체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질이 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공한다.
상기 잎은 잎의 배수조직(hydathode), 주맥(midrib) 및 모용(trichome)일 수 있다.
또한 본 발명은 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 pPBRU19445일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미생물이 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 식물체는 애기장대일 수 있다.
또한 본 발명은,
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고;
상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 제조하고; 그리고
상기 형질전환된 미생물을 식물체에 감염시키는;
단계를 포함하는, 목적 단백질이 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 특이적으로 발현하는 새로운 프로모터를 발굴하기 위하여, 배추에서만 특이적으로 발현하는 유전자들 중에서 기능이 확인되지 않은 기능 미확인 유전자의 프로모터 영역(- 2.03kb)을 분리하여 염기서열 확인하였다. 구체적으로, 배추 게놈 DB로부터 BRU19445의 유전자를 포함한 염기서열 정보를 확보하고 배추 게놈 유전정보를 이용 BRU19445 프로모터로 예상되는 영역(- 2.03 kb)을 분리하였다. 이렇게 획득한 DNA 염기서열을 서열번호 1로 기재하였으며, 이를 “BRU19445 프로모터”라고 명명하였다(실시예 1 참고).
본 발명자들은 본 발명의 BRU19445 프로모터가 식물체 내에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시키는지 확인하기 위하여 상기 본 발명의 BRU19445 프로모터에 GUS 유전자를 융합시켜 애기장대 내에서 GUS 유전자의 발현 양상을 확인하였다(실시예 3-4 참조). 그 결과, 애기장대의 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 GUS 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 2-4 참조).
상기의 결과로부터 본 발명의 BRU19445 프로모터는 식물의 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터임을 알 수 있었다.
상기 “프로모터”는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 또한, 이러한 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 있으며, 특히, 본 발명에 따른 프로모터는 식물체의 특정 부위에서만 특이적으로 발현을 유도한다.
상기 "발현 벡터"는 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 이 기술분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 조직 특이 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드가 있고, 식물 바이러스 벡터가 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용할 수 있다. 그러나 이 기술분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 조직 특이적으로 발현되길 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.
그러므로 본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 특정 부위, 예를 들면 유묘 발달 후 잎 또는 줄기 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 특정 조직에서 발현시킴으로써 잎 또는 줄기와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 Gus가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 BRU19445 프로모터를 Gus 유전자의 상류 부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 pPBRU19445를 제조하였다(실시예 참조).
본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 이 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포내로 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포로는 미생물이 바람직하며, 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101을 사용하였다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 이 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법을 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환된 식물을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물은 이 기술분야의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 이 기술분야에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고; 상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 제조하고; 그리고 상기 형질전환된 미생물을 식물체에 감염시키는; 단계를 포함하는, 목적 단백질이 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 프로모터는 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하기 때문에, 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 특이적으로 발현시킴으로써 작물의 형질을 개량시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 식물 형질전환용 벡터 지도를 나타낸 것이다. BRU19445 프로모터에 의해 리포터 유전자 GUS가 조절 받고 항생제 선별유전자로 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하고 있다.
도 2는 생장 발달 단계별 BRU19445 프로모터 활성을 분석한 것이다. 0d부터 35d: 형질전환 애기장대의 종자 발아 전에서 발아 후 35일째 애기장대를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, BRU19445 유전자의 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대의 조직별 GUS 발현 분석 결과이다. 35d: 형질전환 애기장대의 종자 발아 후 35일째, Rl: 근생엽(rosette leaf), Ht: 배수조직(hydathode), Mr: 주맥(midrib), Cl: 경생옆 (cauline leaf), Tc: 모용 (trichome).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, BRU19445 유전자 프로모터가 도입된 형질전환 애기장대의 생식 생장기에서 GUS 발현 분석 결과를 나타낸 것이다. 35d: 발아 후 35일째 형질전환 애기장대 식물의 성숙체, F: 꽃(flower), Fb: 화아 (flower bud), Sty: 암술대(style), Pt : 꽃잎(petal), Sp: 꽃받침(sepal), Si: 꼬투리(silique), Rc: 화탁(receptacle), At: 화분(anther), YSi: 어린 꼬투리(young silique), OSi: 성숙한 꼬투리 (old silique).
본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 프로모터 영역 분리 및 염기서열 분석
배추(Brassica rapa)에서만 특이적으로 발현하는 유전자들 중에서 기능이 확인되지 않은 기능 미확인 유전자 BRU19445의 프로모터를 분리하기 위해 배추 게놈 DB로부터 BRU19445의 유전자를 포함한 염기서열 정보를 확보하고 배추 게놈 유전정보를 이용하여 BRU19445유전자 개시 코돈 상위에 TATA box 등을 포함하는 -2.03 kb의 프로모터 부분이라 예상되는 영역을 검색하였고 유전자 프로모터 분리를 위한 특이 프라이머를 다음과 같이 작성하였다.
BRU19445-Pro-F: 5’-GGATCCAGAGGAGCTTGAAGATGCTCAG-3’(서열번호 2)
BRU19445-Pro-R: 5’-GAATTCCCAGCGAAGTCCTTGATCACAC-3’(서열번호 3)
배추 게놈 DNA로부터 유전자 증폭반응(PCR: polymerase chain reaction)을 수행하여 프로모터 영역을 분리하였다. 이때, 상기 PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후 95℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분간 반응을 1 사이클로 하여 35회 실시 한 다음, 72℃에서 10분간 반응하였다. 이후 상기 PCR 반응에서 획득한 DNA의 염기 서열을 확인 하였고 BRU19445 프로모터(-2.03 kb) 분리하여 서열번호 1로 기재하였다.
실시예 2: 형질전환 벡터 제작 및 식물체 형질전환
상기 실시예 1에서 분리한 BRU19445 프로모터는 pGEM-T-easy에 삽입시킨 후 BamH I과 EcoR I으로 절단한 후 BamH I과 EcoR I로 절단 된 pCAMBIA1391에 삽입시켰다. BRU19445 프로모터에 리포터 유전자 GUS가 융합된 식물 형질전환용 벡터 pPBRU19445를 제작하였고 이를 아그로박테리움 투메페시안스 GV3101에 도입하였다(도 1).
제작된 벡터인 pPBRU19445을 애기장대에 도입하기 위하여 Agrobacterium tumefaciens GV3101에 freeze와 thaw를 2번 반복 한 후 항생제 케나마이신 50 ㎎/ℓ, 리팜피신 10 ㎎/ℓ, 젠타마이신 40 ㎎/ℓ이 포함된 LB배지에서 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 GV3101 균주내 운반체 도입을 확인하였으며 유전자 도입이 확인된 콜로니를 애기장대 형질전환에 사용하였다. 야생형 애기장대 Col-0 (Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)를 형질전환하기 위해 먼저 애기장대를 파종 후 22℃ 생장상 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육시켰다. 4주된 애기장대 식물체의 일차 추대를 제거한 후 최소한 8-10 cm의 3-4개의 이차 추대를 유도하였다. 형질전환된 GV3101 균주를 이용하여 벡터 도입이 확인된 아그로박테리움을 kanamycin 50 ㎎/ℓ가 함유된 LB 배지에 접종하여 28℃에서 2일 정도 배양하였다. 완전히 자란 아그로박테리움을 원심분리하여 침전시킨 5% 수크로오스와 0.05% 실?(silwet) L-77이 함유된 용액에 O.D 0.6 정도로 희석하여 현탁액을 제조하였다. 상기 제조한 현탁액을 애기장대 꽃봉오리에 분사한 후 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 24시간 배양한 다음 22℃, 16 시간 낮 및 8 시간 밤 조건의 생장상에서 3-4일 더 배양시키고 상기와 동일한 방법으로 형질전환을 반복하였다. 이 후, 22℃, 16시간 낮 및 8시간 밤 조건의 생장상에서 꼬투리(silique)가 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 4-6주간 생육시킨 후 종자를 수확하였다. 수확된 종자를 30 μg/㎖ 하이그로마이신이 포함된 MS 배지에 파종하여 형질전환체 선발한 후 선발된 형질전환체로부터 GUS 염색을 통한 BRU19445 프로모터의 발현 양상을 분석 하였다.
실시예 3: 유형질전환 애기장대 생장발달 단계별 BRU19445 프로모터 활성 분석
배추 BRU19445 유전자의 프로모터가 식물체 내에서 유전자 발현을 특이적으로 유도하는지 확인하기 위하여 배추 BRU19445 유전자의 프로모터가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 애기장대의 생장 발달 단계와 각 조직에서 GUS 유전자 발현 양상을 분석하였다. 즉, 상기 실시예 2에서 형질전환된 애기장대로부터 독립된 4개 라인을 선발하여 수확한 종자를 일부는 MS배지에서 발아시켜 유묘의 발달단계에서 GUS (청색 발색 유전자) 발현 양상을 관찰하였고, 일부는 상토에 파종하여 생육 15 일과 35일째 식물체에서 잎, 줄기, 뿌리들의 여러 조직에서 생육 단계별로 GUS 유전자 발현 양상을 관찰하였다. 상기 발아시킨 유묘를 GUS-어세이 버퍼 (X-gluc (cyslohexyl ammonium salt) 20 mM, NaH2PO4H2O 100 mM, NaEDTA 10 mM, Triton-X-1000.1%, pH7.5)에 침지하고 37℃에서 24시간 처리 후, 70% 에탄올로 클로로필(chlorophyll)을 완전히 제거하여 GUS 유전자 발현 양상을 비교분석 하였다.
도 2에 나타난 것과 같이, 종자 발아 후 7일부터 GUS의 발현이 줄기 정단 분열조직(apical meristem)에서 강하게 나타나기 시작하여 35일 때까지 강하게 나타났다.
또한 도 2 및 3에 나타난 것과 같이, 35일 때 BRU19445 프로모터에 의한 GUS 발현은 줄기 정단 분열조직(shoot apical region)과 잎의 주맥(midrib)에서 강하게 발현되었고 또한 잎의 배수조직(hydathode)에서 발현을 나타내었다. 또한 도 3에 나타난 것과 같이, 잎의 모용(trichome)에서 GUS 발현을 확인하였다. 뿌리 조직에서는 35일째의 주근(Primary root)에서 GUS 발현을 나타내고 있고 그 외의 생장 단계에서는 발현되지 않았다.
실시예 4: 형질전환 애기장대 개화 및 종자 성숙 등의 발달 단계에서 BRU19445 프로모터 활성 분석
배추 BRU19445 유전자의 프로모터가 식물체의 개화 및 종자 성숙 등의 발달 단계에서 유전자의 발현을 특이적으로 유도하는지를 확인하기 위하여 상토에서 35일째 배양된 형질전환 애기장대에서 화아(flower bud), 꽃, 꼬투리 조직 (silique) 을 포함한 각 조직에서의 GUS 발현 양상을 분석하였다. 도 4에 나타난 것과 같이, 성숙된 꽃에서는 암술머리(stigma)를 제외한 화서(inflorescence stem)를 포함한 꽃받침(sepal), 암술대(style), 화탁(rReceptacle)에서 GUS 발현을 확인하였다. 어린 꼬투리에서는 암술대(style)와 화탁(receptacle)에서 GUS의 발현을 확인 할 수 있으며 성숙한 꼬투리에서는 화탁에서만 GUS 발현이 나타났다. 따라서 BRU19445 프로모터는 생식기관인 꽃과 꼬투리 부위에서 발현을 유도하는 조직 특이적 프로모터임을 알 수 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA <120> PROMOTER FROM BRASSICA AND PLANT TRANSFORMED WITH THE SAME <130> P120913 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2030 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 agaggagctt gaagatgctc agaaagatta tatccaggcg tcagtgggag tgagccccag 60 ggggaagttg attgtatcca agatgcttca ctgttttgct aagaactttg tcgatgactc 120 caaggttgct ctgtggatct cacggcactt gcctcctcgc cacgctgcgt tcgttgagca 180 gtgtattcac cggagacaac ggtgggggtt tctggattca tctagtagca aatgcggagt 240 tattcctttt gattcacggt ttcggtattt gttccttccg taatgatgga agcacacaat 300 tgttactgtt gttagggttt agggtctatg gctatttagg tgattctaat aaacaaatta 360 atggattcag aactgctaaa cgaaataaga aagatgaaac acaaattttc aatattgcag 420 aagtttaata gtaatcatgc atacacatga atttgattca gacaaataac tgaatggtat 480 tgtgttctgt ttgaaagagt gttaacaata agggagagat agaaactaac ttgatcctaa 540 ctaggcattg atagaagaaa cgtctacttt ccgaggggct tggaccacgt tcttgtttcc 600 agggaatgag ttgcgggaga cgtccacgag tgctttgaag ctgtaaggct catgcataga 660 cagctcagag aggactttac gattcagctg gatgttctcc ttcatcagtc cgtggataaa 720 gttaccgtag ttcacctgtt ttcaaccttt aaatgttaag attccaacca aacatctaag 780 ttaaatgtta agtacaaacc attaaacaat caatggaacc aagactagaa acagaagtca 840 taaaaaagag aaatttaaga gcactctaaa ccacaaaaca ctatacccta aatcaagcat 900 tcaaatttac ataacagaac actaaaaaaa gaaaaattta agagcatcat aaaccctaaa 960 tcactaaacc ctatctcaaa aatttcattt ctacactaat cgaatttgga ggatgcaaag 1020 agagaacgta caccgtgctg acgagagccg gcgttgatac gctcgatcca gagacctctc 1080 atctcacgct tcttgttgcg cctgtctctg taagagtact gaagagcttt ctccactctc 1140 tccctcgcga ttcttatgca gttcttcgct cttcccctga aaccctttgc tagcttgaag 1200 atctccttct tgttcatctt tctcctttac tttctgaact gttcttcctt tccttgctcc 1260 tctctcagtg agagtctctc actgttcacg ccgcctctgt tgttgtttcc cttctgtttc 1320 aattccgggt cgatcgggtc ggatcagatc caagacaaat ccgatcacaa ttaaataaag 1380 cccattactt gtttaatggg cctcgctcca ttgtcagtgt caccaaacaa aagacacgtg 1440 ttgccacgtc atgaagagac agtaacacgt gttacaagtt agtttcacat ccgtttaatt 1500 ttccgcggga aacagacaaa acagaaacaa aaaaaaacag aattattatg ttcccggaag 1560 aacattttcc acagatttta agtgggtttg ctctgtttcg tgtagtcccg tcaatcatca 1620 tcacacagaa aagcttcaaa aagaaagact tttaagtgtc gtcaagtaca aatgggagga 1680 ggagaaccga tggatcatca tcaacaacga atctccgcca cgaaatccga cggtgtggga 1740 caggggaacc tctactctcc tgaccacgcg atcaaagtcg ctacgaaact cgacgaaaac 1800 gtgggacagg gggatctgta ttctcctgac cacgcgatca aaatcgctac gagccctgag 1860 cataagctta actctgagtg tgaggaggag aagcagagga tgttggggct gaagagtctc 1920 gcgacggtta aggactaagt actagagaag ctagcggcgg ctgcggttcc gtcggagtcg 1980 ctggagaacg ctaaacagtt tttggaaggt gtgatcaagg acttcgctgg 2030 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRU19445-Pro-F Primer <400> 2 ggatccagag gagcttgaag atgctcag 28 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRU19445-Pro-R Primer <400> 3 gaattcccag cgaagtcctt gatcacac 28

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 잎은 잎의 배수조직(hydathode), 주맥(midrib) 및 모용(trichome)인 프로모터.
  3. 제1항 또는 제2항의 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 pPBRU19445로 제1도에 기재된 개열지도를 갖는 재조합 발현 벡터.
  5. 제3항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 미생물이 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)인, 형질전환 미생물.
  7. 제5항의 형질전환 미생물로 형질전환된 형질전환 식물체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 식물체는 애기장대인 형질전환 식물체.
  9. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고;
    상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 제조하고; 그리고
    상기 형질전환된 미생물을 식물체에 감염시키는;
    단계를 포함하는, 목적 단백질이 줄기 정단분열조직, 잎, 꽃 및 꼬투리에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 미생물은 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)인 형질전환 식물체의 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 식물체는 애기장대인 형질전환 식물체의 제조 방법.
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