KR101508747B1

KR101508747B1 - 벼 배반조직 특이 발현 프로모터 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101508747B1
Application number: KR20130070918A
Authority: KR
Inventors: 윤인선; 이정숙; 김둘이; 김범기; 허선미; 최기선
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-06-20
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2015-04-10
Also published as: KR20140147514A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터에 대한 것이다. 보다 상세하게는 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체에 대한 것이다. 본 발명의 프로모터는 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하기 때문에, 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 특이적으로 발현시킴으로써 작물의 형질을 개량시킬 수 있다.

Description

벼 배반조직 특이 발현 프로모터 및 이의 이용 {SCUTELLUM SPECIFIC EXPRESSION PROMOTER FROM RICE AND USE THEREOF}

본 발명은 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하는 벼 유래 프로모터에 대한 것이다. 보다 상세하게는 종자의 벼 배반조직 및 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체에 대한 것이다.

최근 들어 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터(promoter)가 요구된다.

일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절 영역의 일종이다. 그 동안 끊임없는 연구들을 통해 수많은 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분되어 질 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 첫째로 발현 양을 최대화할 수 있는 강한 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현량을 최대화하는데 이용되는 프로모터로써 초기에 많이 개발되었으며, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 유전자의 프로모터(P35S) 및 벼의 액틴(actin) 유전자 프로모터가 대표적이다. 이들은 식물의 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제 저항성 유전자, 식물의 병충해 억제 유전자 또는 식물을 이용한 물질 생산 등의 목적으로 주로 사용되고 있다.

둘째로, 발현 시기를 제한하는 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물 발달 단계 중 특별한 시기에만 국한시키는 프로모터로서 많은 예들이 보고되어 있다. 예를 들어, 개화에 관련된 유전자들의 프로모터는 개화기에만 유전자를 발현시키며, 각종 생물학적(biotic) 또는 비생물학적(abiotic) 자극에 의하여 발현되는 유전자들의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.

셋째로, 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 사용하고자 하는 다양한 목적에 따라서 식물체의 각 조직에 대하여 많은 예가 보고된 바 있다.

특히, 상기와 같이 기능 및 특징에 따라 구분되어진 프로모터들 중 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체 내에서 발현되는 조직에 따라 다시 다음과 같이 분류되고 있다.

첫째로, 전신 발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물체 전신에서 발현을 유도하는 프로모터로는 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터이기도 한 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍자엽 식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자의 프로모터들이 주로 이용되고 있고, 최근에는 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 개발된 바 있다(대한민국 등록특허 제0429335호). 이들도 상기 발현 양을 최대화하는 프로모터와 동일하게 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 사용되고 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.

둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherolmethyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 및 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터가 있다.

셋째로, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 이는 아직까지 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.

넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이와 관련된 프로모터로는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터 및 배추꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 있다.

이러한 종자, 뿌리 또는 잎 특이적 발현 프로모터들은 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용이 기대되고 있다.

그러나 상기 공지된 프로모터들, 특히 식물체에서 조직 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 알려진 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은, 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터에 대한 연구를 계속하여 벼에서 분리한 프로모터가 벼의 특정 조직에서 목적 유전자의 발현을 유도하는 활성이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제 0703569호

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물과 상기 형질전환된 미생물로 형질전환된 식물체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질이 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공한다.

또한 본 발명은 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 pBGWFS7-pOsPLAT1일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미생물이 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 식물체는 벼일 수 있다.

또한 본 발명은,

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고;

상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 제조하고; 그리고

상기 형질전환된 미생물을 식물체에 감염시키는;

단계를 포함하는, 목적 단백질이 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 특이적으로 발현하는 새로운 프로모터를 발굴하기 위하여, 벼 종자발달과정을 4단계로 구분하고 각 단계별로 RNA를 추출하여 종자 발달 유전자 발현 프로파일링 데이터를 얻었다. 종자가 성숙되면서 발현이 증가하는 유전자군을 추출한 후 그 중 OsPLAT1 유전자(Os10g21670)를 선발하였다(실시예 1 참조). 이 유전자의 발현 정보를 좀 더 구체화하기 위하여 현재까지 공개된 3 종류의 벼 유전자 발현 DB를 탐색하여 OsPLAT1 유전자의 조직별 발현 양상 정보를 추출하였다. 탐색 DB에 따라 조직 발현 패턴이 상이하고, 종자, 자엽초, 유묘의 잎, 줄기, 화아 등 다양한 조직 발현 양상이 나타났으나, OsPLAT1이 발아초기 종자의 배반이나 자엽초에서 발현 가능성이 높다는 것을 알았다(실시예 1 참조).

본 발명자들은 본 발명의 OsPLAT1 프로모터가 식물체 내에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시키는지 확인하기 위하여 상기 본 발명의 OsPLAT1 프로모터에 GUS 유전자를 융합시켜 동진벼 캘러스에 감염하고 형질전환 캘러스를 선발해 줄기와 뿌리를 유도하여 얻어진 재분화 형질전환 벼를 온실에서 생육하였다. OsPLAT1 프로모터-GUS 벡터의 삽입을 확인한 형질전환 벼의 종자와 유묘를 GUS 염색하여 유전자발현 유도 특성을 분석하였다. 그 결과, OsPLAT1 프로모터는 성숙 종자의 배반에서 특이적으로 발현을 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 수술, 유묘의 잎과 뿌리, 미성숙 혹은 성숙 종자의 배유 등 다양한 조직에서 GUS 염색을 관찰하였으나, 배반 이외의 조직에서는 GUS 발현이 유도되지 않았다. 반면 성숙 종자를 2N6 배지에서 치상하면 배반에서 유래한 캘러스가 형성되는데, 캘러스에서 매우 강하게 GUS 발현이 유도된다는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

상기의 결과로부터 본 발명의 OsPLAT1 프로모터는 벼의 배반조직 및 배반유래 캘러스 조직에서 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터임을 알 수 있었다.

상기 "프로모터"는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 또한, 이러한 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 있으며, 특히, 본 발명에 따른 프로모터는 식물체의 특정 부위에서만 특이적으로 발현을 유도한다.

상기 "발현 벡터"는 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다.

본 발명에 따른 식물체의 조직 특이 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드가 있고, 식물 바이러스 벡터가 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용할 수 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 조직 특이적으로 발현되길 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.

그러므로 본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 특정 부위, 예를 들면 잎 또는 줄기 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 특정 조직에서 발현시킴으로써 잎 또는 줄기와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 Gus가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 OsPLAT1 프로모터를 GUS 유전자의 상류 부분에 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터인 pBGWFS7-pOsPLAT1를 제조하였다(실시예 참조).

본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 이 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포내로 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gunbombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포로는 미생물이 바람직하며, 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404을 사용하였다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 이 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법을 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환된 식물을 제공한다.

상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물은 이 기술분야의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 이 기술분야에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고; 상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 제조하고; 그리고 상기 형질전환된 미생물을 식물체에 감염시키는; 단계를 포함하는, 목적 단백질이 벼 배반조직 또는 배반유래 캘러스에 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 식물체는 벼일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 동진벼 캘러스일 수 있다.

본 발명의 프로모터는 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하기 때문에, 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 특이적으로 발현시킴으로써 작물의 형질을 개량시킬 수 있다. 구체적으로, 목적유전자를 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 주요하게 발현시킬 수 있도록 조절하여 발아 및 식물의 성장과 발달에 유익하거나 각종 환경 스트레스 저항성을 증진시키기 위하여 유전자의 발현을 조절하는 데 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 종자성숙단계에서 발현되는 OsPLAT1 유전자와 단백질을 나타낸 것이다: (A)는 종자 발달 단계에 따른 유전자 발현 양상 분석(마이크로어레이 분석) 결과이며, DAH는 출수 후 경과일수(day after heading)를 의미하고, (B)는 OsPLAT1 단백질의 특징 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, OsPLAT1 유전자의 조직별 발현양상 분석이며, 이를 인실리코(in silico) 데이터로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, OsPLAT1 유전자의 조직별 발현 분석(RT-PCR 분석) 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, OsPLAT1 프로모터가 포함하는 시스-액팅 엘리먼트(cis-acting element)의 종류 및 위치를 나타낸 것이다: (A)는 게노믹(Genomic) PCR 방법에 의한 OsPLAT1 프로모터 영역을 증폭 및 분리한 것이며, (B)는 시스-액팅 엘리먼트(Cis-acting element)의 종류 및 위치를 나타낸 것이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른, OsPLAT1 프로모터의 발현 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, OsPLAT1 프로모터-GUS(promoter-GUS) 형질전환 벼의 게노믹(Genomic) PCR 분석을 나타낸 것이다: WT는 대조구인 동진벼를 나타내며, 1-2, 4-3, 4-7, 5-5는 형질전환 벼를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, OsPLAT1-GUS 프로모터가 삽입된 형질전환 벼 종자의 GUS 염색 양상을 나타낸 것이다(sc는 배반(scutellum); em은 배(embryo); en은 배젖(endosperm)을 의미한다): (A)는 출수 후 경과 일수 0 DAH의 종자이며, (B)는 미성숙 종자이다. (C)는 성숙 건조 종자이며, (D)는 침지 후 12시간이 경과된 종자의 횡단면이다. (E)는 침지 후 24시간이 경과된 종자의 횡단면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, OsPLAT1-GUS 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 염색 양상을 나타낸 것이다(an은 꽃밥(anther); pal은 내화영(palea); lem은 외화영(lemma); ov는 씨방(ovary); cal은 캘러스(callus); co는 자엽초(coleoptile); L1은 제1엽(first leaf); L2는 제2엽(second leaf); r은 뿌리(root)를 나타낸다): (A)는 출수 후 경과 일수 0 DAH의 종자이며, (B)는 출수 후 경과 일수 2-3 DAH의 종자이다. (C)는 성숙종자에서 유래한 캘러스이며, (D)는 발아 후 3일이 지난 유묘이다. (E)는 발아 후 10일이 지난 유묘이며, (F)는 유묘의 뿌리이다.

본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: OsPLAT1 유전자 선발 및 유전자 발현조절 모티브 분석

1-1: OsPLAT1 유전자 선발 및 in silico 유전자 발현 분석

벼 종자 발달 과정을 4단계로 구분하고 각 단계별로 RNA를 추출하여 아질런트 44K 라이스 올리고뉴클레오티드 칩(Agillent 44K rice oligonucleotide chip)을 이용한 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행하여 종자 발달 유전자 발현 프로파일링 데이터를 얻었다. 먼저 종자가 성숙되면서 발현이 증가하는 유전자군을 추출한 후 그 중 OsPLAT1 유전자 (Os10g21670)를 선발하였다(도 1A). 이 유전자가 코드하는 단백질은 164 아미노산으로 구성되어 있으며, PLAT(폴리시스틴-1(polycystin-1), 리폭시지네이즈 및 α 톡신(lipoxygenase and α toxin)) 도메인을 포함하고 있으나 기능이 전혀 알려져 있지 않은 새로운 단백질이다(도 1B). 이를 "OsPALT1벼 폴리시스틴-1(Oryza sativa polycystin-1), 리폭시지네이즈 및 α 톡신(lipoxygenase and α toxin)) 유전자"라고 명명하였다.

이 유전자의 발현 정보를 좀 더 구체화하기 위하여 현재까지 공개된 3 종류의 벼 유전자 발현 DB(라이스 티슈 아틀라스(Rice Tissue Atlas), 벼 올리고뉴클레오티드 어레이(Rice Oligonucleotide Array), Rice XP개)를 탐색하여 OsPLAT1 유전자의 조직별 발현 양상 정보를 추출하였다(도 1A). 탐색 DB에 따라 조직 발현 패턴이 상이하고, 종자, 자엽초, 유묘의 잎, 줄기, 화아 등 다양한 조직 발현 양상이 나타났으나, OsPLAT1 발아 초기 종자의 배반이나 자엽초에서 발현 가능성이 높다는 것을 알았다(도 2).

1-2: RT - PCR 방법을 이용한 OsPLAT1 유전자 발현양상 확인

인실리코(In silico) 데이터를 이용하여 분석한 OsPLAT1 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여 동진벼의 성숙 종자, 발아 종자의 배, 유묘의 줄기와 뿌리, 캘러스로부터 각각 RNA를 분리하고 서열번호 2 및 서열번호 3의 특이 프라이머(OsPLAT1-F/R)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다(도 3). 추출한 RNA 5μg에서 Oligo(dT)12-18 상기 프라이머를 이용해 수퍼스크립트 Ⅲ 역전사 효소(SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase, Invitrogen)로 50℃에서 1시간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 희석하여 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 4분 변성 후, 변성(denaturation): 94℃, 40sec, 어닐링(annealing): 60℃, 40sec, 신장(extension): 72℃, 40sec 과정을 30회 반복 후 72℃ 10분 진행 후 반응을 마무리하였다.

OsPLAT1-F : 5'-ATGAAGCTTACCATGAAGC-3' (서열번호 2)

OsPLAT1-R : 5'-TCATGGCGCCGCTGCGCCAATG-3' (서열번호 3)

그 결과 OsPLAT1 유전자가 발아 종자의 배에서 우선적으로 발현하는 특징을 가진다는 것을 증명하였다(도 3).

1-3: OsPLAT1 프로모터 분리 및 프로모터 영역의 발현 조절 모티브 분석

OsPLAT1 유전자의 프로모터 영역을 분리하기 위하여 번역 시작 상위 염기서열 1,943 bp의 염기서열 정보를 벼 게놈 데이터베이스(genome database)에서 추출하고 서열번호 4 및 서열번호 5의 특이 프라이머 (OsPLAT1P-F/R)를 이용하여 동진 벼의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은(도 4A) 게이트웨이 도너 벡터(gateway donor vector, pDONOR)에 클로닝하고 전체 염기 서열을 결정하였다(서열번호 1).

OsPLAT1P-F: 5'-CACCTATAAAGCTAATCTCCATGAGGG-3' (서열번호 4)

OsPLAT1P-R: 5'-CTTTGTTGGGTGTGTGTGCAGTGTGGTGGTG-3' (서열번호 5)

OsPLAT1 프로모터가 어떤 종류의 발현 조절 모티브를 가지는지를 조사하기 위하여 공개 DB인 PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)와 PlantCARE(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)를 이용하여 시스-액팅 엘리먼트(cis-acting element)를 분석하였다(도 4B). OsPLAT1 프로모터는 종자 저장 단백질 유전자에서 발견되는 모티브이면서(RYEREPEAT), 종자 발달의 중심 조절자로 알려진 VP1 전사인자 결합 모티브(SPHCOREZMC1)를 -954 위치에 포함하고 있다. 또한 아밀라아제 Ramy1A 유전자에서 종자 호분층 발현을 유도하며 GA 반응 모티브로 알려진 피리미딘 박스(Pyrimidine box)를 2개 이상 포함하고 있다. 그 외에도 GA(GAREAT), 옥신(ARFAT, CATAGGMSAUR), ABA에 대한 반응모티브를 각각 가지고 있는 것을 확인하였다. OsPLAT1 프로모터에서 발견되는 주요 발현조절 모티브의 위치와 종류를 도 4에 표시하였다.

실시예 2: 형질전환 벡터 제작 및 식물체 형질전환

2-1: OsPLAT1 프로모터- GUS 발현 벡터 제작

상기 실시예 1에서 분리한 OsPLAT1 유전자의 프로모터를 이용하여 리포터 유전자 GUS를 발현시키기 위하여 재조합 발현 벡터를 구축하였다. 이를 위해 먼저, pDONOR 벡터에 클로닝한 OsPLAT1 프로모터를 리포터 유전자(β-glucuronidase)를 포함하는 게이트웨이(gateway) 벡터(pBGWFS7)에 클로닝하여 프로모터 발현 분석 벡터를 제작하였다(도 5).

2-2: 형질전환 벼 생산

제작한 발현벡터를 아그로박테리아 LBA4404에 도입후 동진벼 캘러스에 감염하고 PPT(포스피노트리신(phosphinothricin), 6 μg/l) 조건에서 형질전환 캘러스를 선발 후 줄기와 뿌리를 유도하여 얻어진 재분화 형질전환 벼를 온실에서 생육하였다. 형질전환 벼의 종자를 PPT(6 μg/l) 조건에서 발아시켜 도입한 제초제저항성 유전자가 발현되었는지 확인하였으며, 잎에서 게노믹(genomic) DNA를 분리한 후 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 도입한 벡터가 삽입되었는지 확인하였다(도 6).

OsPLAT1P-7: 5'-CCAGCCAACCTAGTGTGTGGAATGC-3' (서열번호 6)

GUSA-R: 5'-CGCGATCCAGACTGAATGCCC-3' (서열번호 7)

실시예 3: OsPLAT1 프로모터의 조직 특이 발현 분석

OsPLAT1 프로모터-GUS 벡터의 삽입을 확인한 형질전환 벼의 종자와 유묘를 GUS 염색하여 유전자 발현 유도 특성을 분석하였다. 종자 발달 단계별로 GUS 염색 패턴을 조사한 결과 OsPLAT1 프로모터는 성숙 종자의 배반에서 특이적으로 발현을 유도하였으며, 종자를 침지하여 발아를 유도한지 24 시간 후에도 배반 특이적 발현이 유지된다는 것을 증명하였다(도 7). 또한 수술, 유묘의 잎과 뿌리, 미성숙 혹은 성숙 종자의 배유 등 다양한 조직에서 GUS 염색을 관찰하였으나, 배반 이외의 조직에서는 GUS 발현이 유도되지 않았다(도 8). 반면 성숙 종자를 2N6 배지에서 치상하면 배반에서 유래한 캘러스가 형성되는데, 캘러스에서 매우 강하게 GUS 발현이 유도된다는 것을 확인하였다(도 8E).

이상의 실험결과를 통해서 OsPLAT1 프로모터가 대표적인 단자엽 식물인 벼에서 목적유전자를 주요하게 배반조직 및 배반유래 캘러스 조직에서 발현시킬 수 있음을 증명하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> SCUTELLUM SPECIFIC EXPRESSION PROMOTER FROM RICE AND USE THEREOF <130> P130332 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1943 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 tataaagcta atctccatga gggtttttta ctagtggtaa aaaaatagcg aaaaagccgg 60 atggaaaaaa aaccggaaaa aaggcaaggg aataaaaaag aaagtaaaag aaacaacgga 120 tggaaaaaac tgaaaaaaac taagaaaaaa ggcgcgcggg aaaaagacaa aacgaaaaaa 180 aggtctaact atatttatac cgtcatattt tttatcaaaa aaatagtcag cgtgtattta 240 tattgtaagt ctcaaaatta catatgtaag tcccaaaatt acatgtgtaa ttttagtgta 300 tttataatgt gagttctaaa gttacgtatg tatttacaag gaacaatata gcgtctcctt 360 ttctatgatt accttatttt gatgtaataa tttggtgtta atcatattct tatgaactag 420 cgtgtgaaca cacattatgg tagagacacg gaagtactcc ggcatgaatc taataggaga 480 tcccagggat acaaatctga ctgtaatcta acaagattta tggcgatata attatagcaa 540 aaccgaaaaa aaaacggaga ggaaaaaagg aaaaaagggc aaaaaaaaaa gaagaagaaa 600 aaagcaaagc aaaagaacat gggtcgataa ctagtggcca actagatcag cgcgtgggca 660 tgatcaaaat tcaaaagcaa tgtgtacatg taaataaact aggaaatttt gaataagatt 720 tccagccaac ctagtgtgtg gaatgcatat ggtcatattt tccgtatggg ccgggggagt 780 cttctatttt ggatcaatgc gtgcagaatt gcgaacgaat atattccgga tgaaactatg 840 catgttgcgc cgatgaaatg ccaaaaacca gggcagctac atctgcatcc atgcagcagc 900 agccaaaaac caaatttagt gaacaattca acaagacaat accactgcct ctgcatgcat 960 ggaggatgga tcagcacctc tatccttcta tctcttcccc aaacaaattt agcaaaactt 1020 tgaacaagac aataccactg cctctgcatg aatggaggat ggagcagcac ctctctcctc 1080 tcctaaatta cttatctgat ttacgatccg acttaaccac tgtattcatt gaaattgaat 1140 ctttaaatta aaatattaca tgattatatt tatcacaaaa atataaatga ttatatccaa 1200 aattgaaata tttatgatac ataaaatatc tagttataat tgttgaaaca tcataaatat 1260 atgttaaaat ataaaagata gcctgtgcaa catttaacaa taaactaagt aacgaaacgt 1320 cggaaaaata tccaaataat actgtgcatg ggcacattat aagaaaaact tcatttgcaa 1380 aaacaaaaaa aaagaatatg caatatagtc gaatttcagt tagaatcacg agagatcttt 1440 cgaaaaagct taattaccat gaatacaatg atacagccgg cttaattata tatcagctac 1500 atcatttaga ctaaaaaagt catttgaagt gtgttaagtg gagcttctct tagctagcta 1560 cttgcactcc tatactacca tgaagacaga agagagggaa atctcgatgg gagagagagg 1620 agatgggtag aaattagtgg gtggtgtgtt agttagctga gagcgggggt atgtctgatt 1680 ttttttttct tgacgagatt gggcgcatga cagtgagcat tttccatcat atattcctca 1740 cagaatagac acccagtcac agctcatagt atttgcatcc ccacaggtca cggcattatc 1800 atttaagaaa atggcaagtg ccattggcct tcctagctct ctgccggcta taaaacggtg 1860 ccttggggga gcatgcaata ccacagcaaa tcactccact cctccactca tacaccacca 1920 cactgcacac acacccaaca aag 1943 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPLAT1-F primer <400> 2 atgaagctta ccatgaagc 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPLAT1-R primer <400> 3 tcatggcgcc gctgcgccaa tg 22 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPLAT1P-F primer <400> 4 cacctataaa gctaatctcc atgaggg 27 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPLAT1P-R primer <400> 5 ctttgttggg tgtgtgtgca gtgtggtggt g 31 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPLAT1P-7 primer <400> 6 ccagccaacc tagtgtgtgg aatgc 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUSA-R primer <400> 7 cgcgatccag actgaatgcc c 21

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터.
제1항에 따른 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제1항의 프로모터와 작동가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제3항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터가 pBGWFS7-OsPLAT1인 재조합 발현 벡터.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물.
제5항에 있어서,
상기 미생물이 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)인 형질전환 미생물.
제5항의 형질전환 미생물로 형질전환된 형질전환 식물체.
제7항에 있어서,
상기 식물체는 벼인 형질전환 식물체.
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터와 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고;
상기 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 형질전환된 미생물을 제조하고; 그리고
상기 형질전환된 미생물을 식물체에 감염시키는;
단계를 포함하는, 목적 단백질이 벼의 배반조직 또는 배반유래 캘러스에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법.