JP2021501602A - 植物における耐倒伏性 - Google Patents

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Abstract

トウモロコシの耐倒伏性を改変する方法が提供され、その方法は、少なくとも1つのラッカーゼの発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiRNA528の発現もしくは活性を改変することを含む。耐倒伏性が改変されたトランスジェニック植物、およびそのような植物を作製する方法も提供される。

Description

本発明は、トウモロコシの耐倒伏性を改変する方法、改変された耐倒伏性を有するトランスジェニック植物、およびそのような植物を作製する方法に関する。
トウモロコシ（corn、あるいはmaize）は世界で最も重要な食用作物の一つであり、現在では世界人口の約1/3が主食として消費している。トウモロコシは、米より蛋白質含量が高く、小麦粉、米、キビより脂肪含量が高く、小麦粉、米、ソルガムよりカロリー含量が高い。従って、多くの先進地域においてトウモロコシは不可欠な食品である。とうもろこし加工産業の発展に伴い、消費用とうもろこしの品質は向上を続けており、コーンフレーク、コーンミール、コーングリット、特殊とうもろこし粉、インスタントとうもろこし等の新しいとうもろこし食品が製造され、それらはさらに麺類、パン、ビスケット等に加工することができる。トウモロコシはまた、トウモロコシタンパク質、トウモロコシ油、グルタミン酸ナトリウム、醤油、白ワインなどに加工することもできる。トウモロコシは飼料の王様でもある。トウモロコシ100 kgの飼料価値は、オート麦135 kg、ソルガム120 kg、インディカ米150 kgに相当すると報告されている。副産物であるトウモロコシ茎葉、あるいはそれどころか植物全体（穂／穂軸プラス茎葉）もサイレージにすることができる。世界のトウモロコシの約65〜70%、先進国では最大80%が飼料として利用されており、トウモロコシは畜産業の発展の重要な基盤となっている。
高収量を得るために、農家はしばしば過剰量の窒素（N）化学肥料を施用する。例えば、中国では合成N肥料の施用量が1977年の707万トンから2005年には2621万トンに増加した (Ju et al., 2009) 。これらの外的Nの大きなインプットは、N使用効率の低下と組み合わさって、環境問題を生じ（Ju et al., 2009；Guo et al., 2010；Liu et al., 2013）、また、「N贅沢」条件下での倒伏による収量損失を生じる（Zhang et al., 2016；Shahら、2017；Khanら、2018）。N肥料の過剰施用は、作物の重心を高めること、ならびに茎の直径および基底節間の細胞壁の厚さを減少させることにより、耐倒伏性の乏しさを悪化させる（Wang et al., 2012；Zhang et al., 2014）。しかし、倒伏を調節する分子機構はまだ探求されていない。
穀類植物の倒伏には、根倒伏と茎倒伏が含まれる（Zhang et al., 2016）。茎の強さは、茎の耐倒伏性において重要な役割を果たす（Zuber et al., 1999）。セルロースに次いで二番目に豊富な生物性ポリマーとして、リグニンは、茎の剛性と強度、および害虫と病原体に対する抵抗性のために重要である（Boerjan et al., 2003；Bhuiyan et al., 2009；Zhang et al., 2014；Barros et al., 2015）。リグニンは、植物細胞壁におけるp‐クマリルアルコール (H単位) 、コニフェリルアルコール (G単位) 、およびシナピルアルコール (S単位)という3種のモノリグノール前駆体の酸化重合によって生成される、フェニルプロパノイド由来重合体である（Vanholme et al., 2008）。ペルオキシダーゼに加えて、ラッカーゼが、モノリグノールの酸化重合を介したリグニン重合のために必要である（Berthetら、2011；Zhao et al., 2013；Bryan et al., 2016）。
下流の標的遺伝子を活性化する転写因子の発現を改変することにより、リグニン生合成を変化させ得ることを、多くの研究が報告している。これらの転写因子にはNAC、WRKY、およびMYBが含まれる（Mitsuda et al., 2007；Zhou et al., 2009；Wang et al., 2010）。マイクロRNA（miRNA）および他の低分子RNAは、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはヘテロクロマチン修飾を介した遺伝子調節のために重要であることが知られている（Vaucheret et al., 2006）。最近の研究は、 miR397とmiR857がそれぞれポプラとシロイヌナズナにおけるリグニン生合成と維管束組織の二次成長において重要な役割を果たすことを見出した（Lu et al., 2013；Wang et al., 2014；Zhao et al., 2015）。
miR528は単子葉植物特異的miRNAである。イネにおいてmiR528は、L-アスコルビン酸オキシダーゼ (AO) 、プラストシアニン様タンパク質、RING-H2フィンガーE3ユビキチンリガーゼVirE 2相互作用タンパク質2、およびFボックスドメインとロイシンリッチリピート含有タンパク質DWARF3を標的とする（Wu et al., 2017）。イネがウイルスに感染すると、 miR528はAGO18と優先的に結合し、AO活性の増強、基礎的な活性酸素種蓄積の増加、および抗ウイルス防御の増強をもたらす（Wu et al., 2017）。イネmiR528の構成的な（constitutive）発現は、AAO（アスコルビン酸オキシダーゼ）およびCBP1（銅イオン結合タンパク質1）転写物を抑制することによって、ハイコヌカグサ（creeping bentgrass）における塩分ストレスおよびN欠乏に対する耐性を増強させる（Yuan et al., 2015）。しかし、ZmmiR528の予測される潜在的標的はイネのものとは異なるため、トウモロコシにおけるmiR528の機能的意義は不明のままである。
したがって、トウモロコシのような価値のある作物において倒伏を制御する必要性が存在する。本発明はこの必要性に対処する。
本出願では、植物の耐倒伏性を改善させる方法を記述する。通常、倒伏は、植物が吹き倒されるほど大きくなった（そして作物の栽培に多大な資源が既に費やされた）栽培シーズンのかなり遅い時期に発生し、機械的手段によって作物を収穫することを完全に不可能にし得る。従って、倒伏を防ぐことは経済的に非常に重要である。また、栽培シーズン中に倒伏条件が発生しない限り、ある品種が倒伏に耐性であるか否かを育種家、農家、作物試験者等が判断することは困難である。従って、個々の植物や品種が、仮に倒伏の条件が生じたとしたら倒伏に抵抗性を示すかどうかを決定できることも非常に価値がある。
トウモロコシにおけるリグニンの組成と含量はN供給によって著しく影響されること、およびZmLACCASE3（ZmLAC3）とZmLACCASE5（ZmLAC5）がZmmiR528の真正な標的であることを我々は見出した。ラッカーゼ、特にLAC3（ZmMZS）とLAC5がリグニン重合の調節に関与し、リグニン含量の変化をもたらし、植物の機械的強度を変化させることを我々は示す。これらのラッカーゼの過剰発現が、植物中のリグニン含量の増加を促進させ、耐倒伏性を改善させることを示す。逆に、ラッカーゼの発現を阻害すると、植物中のリグニン含量を低下させることができ、これは、バイオエネルギーを生産するための原料として、また家畜の飼料としての植物の有用性を高める。我々はまた、ZmmiR528が、ZmLAC3およびZmLAC5のmRNA量を負に調節することにより、トウモロコシのリグニン生合成および耐倒伏性に影響を及ぼすことを実証する。
本発明の1つの態様において、植物の耐倒伏性を改変する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む方法が提供される。
好ましい一態様において、本方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることによって、植物における耐倒伏性を増加させる。より好ましくは、ラッカーゼ遺伝子は、ラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択される。
1つの実施形態において、本方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物（コンストラクト）を導入し発現させることを含み、ここで、該核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードし、調節配列に動作可能に連結される。
好ましい一実施形態では、ラッカーゼ3をコードする核酸は、配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸は、配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含む。
別の実施形態では、この方法は、配列番号7もしくは16で定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を導入し発現させることを含む。
好ましい一態様において、調節配列は、構成的なまたは強力なプロモーターである。
1つの実施形態において、miR528の活性が、少なくとも1つのmiR528阻害因子を用いて低下される。好ましくは、miR528阻害因子は、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである。
別の実施形態では、本方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子に少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、そのラッカーゼポリペプチドは、miR528結合部位に少なくとも1つの突然変異を含む。好ましくは、ラッカーゼ遺伝子は、ラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択される。より好ましくは、ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4で定義されるポリペプチドをコードする。さらに好ましくは、ラッカーゼ3をコードする核酸は、配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸は、配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含む。
一実施形態では、配列番号3の位置1〜12から選択された少なくとも1つの位置、または配列番号2の位置191〜211から選択された少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択された少なくとも1つの位置に、少なくとも1つの突然変異が導入される。より好ましくは、突然変異は、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入される。あるいは、突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて突然変異が導入される。
別の実施形態では、本方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を減少させること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を増加させることによって、植物における耐倒伏性を低減させる。
1つの実施形態において、ラッカーゼ遺伝子は、ラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択される。より好ましくは、ラッカーゼ3遺伝子は、配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、ラッカーゼ5遺伝子は、配列番号4で定義されるポリペプチドをコードする。さらに好ましくは、ラッカーゼ3をコードする核酸は、配列番号2または3に定義される配列、またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸は、配列番号5または6に定義される配列、またはその機能的バリアントもしくは相同体を含む。
1つの実施形態において、この方法は、少なくとも1つのラッカーゼの遺伝子および／またはプロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、この突然変異は、野生型または対照のポリペプチドと比較してラッカーゼ核酸の発現を減少させる。さらなる態様において、該方法は、好ましくはmiR528（前駆体配列または成熟配列）の発現が減少または消失するように、miR528および／またはb遺伝子またはmiR528プロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含む。
好ましくは、突然変異は、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入される。あるいは、突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて突然変異が導入される。
別の実施形態では、本方法は、RNA干渉を用いて、少なくとも1つのラッカーゼ核酸、好ましくはラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を低減または消失させることを含む。
1つの実施形態において、本方法は、配列番号10において定義されるmiR528またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードする少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入し発現させることを含む。あるいは、本方法は、配列番号9（または15）を含むmiR528またはその機能的バリアントを導入することを含む。
好ましくは、当該植物は、対照または野生型の植物と比較して増加したリグニン含量によって特徴付けられる。
1つの実施形態において、野生型または対照植物と比較して、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベル、および／またはmiR528の発現もしくは活性が改変される。別の実施形態では、対照植物または野生型植物と比較して根の耐倒伏性が改変される。
本発明の別の態様において、収量、種子品質および茎強度のうちの少なくとも1つを向上させる方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、植物におけるリグニン含量を改変する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む方法が提供される。
本発明の別の態様では、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルの変化、および／またはmiR528の発現もしくは活性の変化によって特徴づけられる、遺伝子改変植物、その一部、または植物細胞が提供される。別の一実施形態では、当該植物は、改変されたリグニン含量によって特徴付けられる。
1つの実施形態において、当該植物は、野生型または対照植物と比較して、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の増加および／またはmiR528の発現もしくは活性の減少によって特徴付けられる。
好ましくは、当該植物は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を発現し、ここで該核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体が調節配列に動作可能に連結されたものをコードする。
より好ましくは、ラッカーゼ3をコードする核酸は、配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸は、配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含む。
別の実施形態では、当該植物は、少なくとも1つのmiR528阻害因子を発現する。1つの実施形態において、当該植物は、配列番号7もしくは16において定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を発現する。別の実施形態では、当該植物は、少なくとも1つのmiR528阻害因子を発現し、ここでmiR528阻害因子は、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである。
別の実施形態では、当該植物は、ラッカーゼ核酸をコードする少なくとも1つの核酸において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは、ラッカーゼ核酸はラッカーゼ3および5から選択され、突然変異はmiR528結合部位にある。好ましくは、突然変異は、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入される。あるいは、突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて突然変異が導入される。
一実施形態では、突然変異は、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置において導入される。
1つの実施形態において、当該植物は、野生型または対照植物と比較して、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の減少および／またはmiR528の発現もしくは活性の増加によって特徴付けられる。
1つの実施形態において、当該植物は、少なくとも1つのmiR528をコードする核酸配列を含む核酸構築物を発現する。好ましくは、そのmiR528が配列番号10に定義されるものもしくはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものであるか、または当該植物が配列番号9を含むmiR528もしくはその機能的バリアントを発現するものである。
好ましくは、当該植物は、ラッカーゼ核酸をコードする少なくとも1つの核酸における少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは、ラッカーゼ核酸はラッカーゼ3および5から選択され、その突然変異が野生型または対照ポリペプチドと比較してラッカーゼ核酸の発現を減少させる。より好ましくは、当該核酸は、配列番号1で定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4で定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードする。
さらなる態様において、当該植物は、好ましくはmiR528（前駆体配列または成熟配列）の発現が減少または消失するような、miR528および／またはb遺伝子またはmiR528プロモーターにおける少なくとも1つの突然変異を含む。
1つの実施形態において、突然変異は、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または、突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入される。
別の実施形態では、当該植物は、野生型または対照植物と比較して少なくとも1つのラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を減少させるRNAi分子を発現する。
好ましい一態様において、植物はトウモロコシである。
本発明の別の態様においては、植物の耐倒伏性が改変された植物を製造する方法であって、該方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法が提供される。1つの実施形態において、該植物は、野生型または対照植物と比較して改変されたリグニン含量を有する。より好ましくは、該植物は、植物の倒伏に対する抵抗性が増加されており、該方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む。
1つの実施形態において、本方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入し発現させることを含み、ここで、該核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体が調節配列に動作可能に連結されたものをコードする。好ましくは、ラッカーゼ3をコードする核酸は、配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸は、配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含む。
1つの実施形態において、本方法は、配列番号7もしくは16において定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を導入し発現させることを含む。好ましくは、調節配列は、構成的なまたは強力なプロモーターである。
別の実施形態では、少なくとも1つのmiR528阻害因子を用いてmiR528の活性を低下させる。好ましくは、miR528阻害因子は、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである。
別の代替的な実施形態では、本方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子に少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、該ラッカーゼポリペプチドは、miR528結合部位において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくはラッカーゼ遺伝子は、ラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、ラッカーゼ3遺伝子は、配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、ラッカーゼ5遺伝子は、配列番号4で定義されるポリペプチドをコードする。好ましい一実施形態では、配列番号3の位置1〜12から選択された少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択された少なくとも1つの位置に、少なくとも1つの突然変異が導入される。
1つの実施形態において、突然変異は、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または、突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入される。
別の実施形態では、該植物は耐倒伏性が低下しており、この方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を減少させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を増加させることを含む。好ましくは、ラッカーゼ遺伝子はラッカーゼ3および／またはラッカーゼ5から選択され、ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4で定義されるポリペプチドをコードする。
1つの実施形態において、この方法は、少なくとも1つのラッカーゼの遺伝子および／またはプロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、この突然変異は、野生型または対照ポリペプチドと比較してラッカーゼ核酸の発現を減少させる。
好ましくは、突然変異は、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入される。別の実施形態では、本方法は、RNA干渉を用いて、少なくとも1つのラッカーゼ核酸、好ましくはラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を低減または消失させることを含む。
別の実施形態では、本方法は、配列番号10で定義されるmiR528またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードする少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入して発現させることを含む。あるいは、本方法は、配列番号9もしくは15を含むmiR528またはその機能的バリアントを導入することを含む。
1つの実施形態において、本方法は、好ましくは対照または野生型植物と比較して、倒伏の変化を測定することをさらに含む。より好ましくは、本方法は、植物を再生させ、倒伏の変化をスクリーニングすることをさらに含む。
好ましい態様において、該植物はトウモロコシである。
本発明の別の態様では、上記のいずれかの方法によって取得されるか取得可能である植物が提供される。
さらなる態様において、配列番号7もしくは16において定義されるmiR528阻害因子またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。本明細書に記載される核酸構築物を含むベクターもまた提供される。
別の態様では、配列番号8で定義されるRNA配列を有するRNA分子またはその機能的バリアントを含むmiR528阻害因子が提供される。
本発明の別の態様では、本明細書に記載の核酸構築物、本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載のmiR528阻害因子を含む宿主細胞が提供される。好ましくは、宿主細胞は細菌または植物細胞である。
別の態様では、本明細書に記載される核酸構築物、ベクターまたはmiR528阻害因子を発現するトランスジェニック植物が提供される。最も好ましくは、該植物はトウモロコシである。
別の側面において、対照または野生型植物と比較して植物の耐倒伏性を向上させるための、本明細書に記載される核酸構築物、ベクターまたはmiR528阻害因子の使用が提供される。対照または野生型植物と比較して、植物におけるリグニン合成を調節し、リグニン含量を調節し、および／またはリグニン合成を促進させるための、本明細書に記載される核酸構築物、ベクターまたはmiR528阻害因子の使用もまた提供される。好ましくは、上記核酸構築物、ベクターまたはmiR528阻害因子は、対照または野生型植物と比較して植物中のリグニン合成を増加させ、および／またはリグニン含量を増加させる。より好ましくは、リグニン合成および／またはリグニン含量は、植物の茎および／または根において増加する。最も好ましくは、該植物はトウモロコシである。
本発明のさらなる態様において、少なくとも1つのmiR528遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメインをコードする核酸配列を含む、核酸構築物が提供される。あるいは、LAC3またはLAC5遺伝子に結合しmiR528結合部位におけるmiR528の結合を阻害または防止することができる少なくとも1つのDNA結合ドメインをコードする核酸配列を含む、核酸構築物が提供される。より好ましくは、ラッカーゼ活性は影響されない。
一実施形態では、核酸配列は、少なくとも1つのプロトスペーサーエレメントをコードし、ここで、プロトスペーサーエレメントの配列は、配列番号34、37、41、44、またはそのバリアントから選択される。別の実施形態では、核酸配列は、少なくとも1つのプロトスペーサーエレメントをコードし、ここで、プロトスペーサーエレメントの配列は、配列番号52、55、58もしくは61またはそのバリアントから選択される。
さらなる好ましい一実施形態では、構築物が、CRISPR RNA（crRNA）配列をコードする核酸配列をさらに含み、ここで、上記crRNA配列は、プロトスペーサーエレメント配列および追加的ヌクレオチドを含む。
より好ましくは、構築物が、トランス活性化RNA（tracrRNA）をコードする核酸配列をさらに含み、ここで、tracrRNAは好ましくは配列番号31において定義されるものであるかまたはその機能的バリアントである。
さらなる態様において、構築物は、少なくとも1つのシングルガイドRNA（sgRNA）をコードし、ここでsgRNAはtracrRNA配列とcrRNA配列とを含む。1つの実施形態において、sgRNAは、配列番号35、38、42、45から選択される配列もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。さらなる態様において、sgRNAは、配列番号53、56、59もしくは62から選択される配列もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。
1つの実施形態において、プロトスペーサーエレメントまたはsgRNAは、調節配列に作動可能に連結され、ここで、調節配列は好ましくはプロモーターであり、より好ましくは構成的プロモーターである。
さらなる態様において、核酸構築物は、CRISPR酵素をコードする核酸配列をさらに含む。好ましくは、CRISPR酵素はCasまたはCpf1タンパク質である。より好ましくは、Casタンパク質はCas9またはその機能的バリアントである。
別の実施形態では、核酸構築物はTALエフェクターをコードする。好ましくは、核酸構築物は、エンドヌクレアーゼまたはそのDNA切断ドメインをコードする配列をさらに含む。より好ましくは、エンドヌクレアーゼはFokIである。
本発明の別の態様では、シングルガイド（sg）RNA分子が提供され、このsgRNAはcrRNA配列とtracrRNA配列とを含む。1つの実施形態において、crRNA配列は、配列番号33、36、40、43から選択される少なくとも1つの配列またはそのバリアントに結合することができる。別の実施形態では、crRNA配列は、配列番号51、54、57もしくは60から選択される少なくとも1つの配列またはそのバリアントに結合し得る。
別の態様において、本明細書に記載の少なくとも1つの核酸構築物または本明細書に記載の少なくとも1つのsgRNAでトランスフェクトされた、単離された植物細胞が提供される。1つの実施形態において、この単離された植物細胞は、本明細書に記載されるようなプロトスペーサーエレメントまたはsgRNAを含む少なくとも1つの核酸構築物、および第2の核酸構築物でトランスフェクトされ、ここで、該第2の核酸構築物は、Casタンパク質、好ましくはCas9タンパク質またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む。この態様において、第2の核酸構築物は、sgRNA構築物の前、後、またはそれと同時にトランスフェクトされる。
本発明の別の態様では、遺伝子改変植物が提供され、該植物は、本明細書に記載のトランスフェクト細胞を含む。一実施形態では、sgRNAをコードする核酸及び／又はCasタンパク質をコードする核酸が安定な形態で組み込まれている。
本発明の別の態様では、植物における耐倒伏性を増加させる方法が提供され、該方法は、本明細書に記載される核酸構築物、または本明細書に記載されるsgRNAを、植物に導入し発現させることを含み、好ましくは、上記増加は、対照または野生型植物と対比される増加である。
さらなる態様において、本明細書に記載されるいずれかの方法によって取得されるあるいは取得可能な、植物が提供される。
別の態様では、植物における耐倒伏性を増加させるための、本明細書に記載の核酸構築物または本明細書に記載のsgRNAの使用が提供される。好ましくは、核酸構築物またはsgRNAは、植物におけるmiRNA528の発現および／または活性を低下させる。
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載された遺伝子組換え植物を得るための方法が提供され、該方法は以下を含む：
(a) 植物の一部を選定すること；
(b) 上記(a) の植物の一部の少なくとも1つの細胞を、本明細書に記載された核酸構築物または本明細書に記載されたsgRNA分子でトランスフェクトすること；
(c) トランスフェクトされた細胞（複数可）に由来する少なくとも1つの植物を再生させること；
(d) 上記植物において少なくとも1つのmiRNA528核酸の発現が減少していることを示す、 (c) に従って得られた1つ以上の植物を選択すること。
別の態様において、好ましくは野生型または対照植物と比較して、耐倒伏性が向上する植物を同定および／または選択する方法であって、植物または植物生殖質において、ラッカーゼ3の遺伝子および／またはプロモーター、ラッカーゼ5の遺伝子および／またはプロモーター、またはmiR528aおよび／またはbの遺伝子および／またはプロモーターにおける少なくとも1つの多型または突然変異を検出すること（ここで、該多型または突然変異は、該突然変異を伴わない植物と比較してラッカーゼ3および／または5の発現の増加および／またはmiR528の発現／活性の減少をもたらすものである）と、上記植物またはその子孫を選択することとを含む方法が提供される。
本発明の別の態様では、
(a) 配列番号1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；または
(b) 配列番号1に示すアミノ酸配列における1以上のアミノ酸残基の置換、および／または該アミノ酸配列からの1以上のアミノ酸残基の欠失、および／または該アミノ酸配列への1以上のアミノ酸残基の付加により配列番号1から導出されるアミノ酸配列を有する、植物リグニン合成関連タンパク質
である、タンパク質が提供される。
上記タンパク質のコード遺伝子も提供され、好ましくはこのコード遺伝子は、
(1) 配列番号3に示すコード領域を有するDNA分子；
(2) ストリンジェントな条件下で (1) のDNA配列とハイブリダイズし、かつ植物リグニン合成関連タンパク質をコードするDNA分子；および
(3) (1) のDNA配列に対して少なくとも90%均一であり、かつ植物リグニン合成関連タンパク質をコードするDNA分子
のうちのいずれか1つから選択されるDNA分子である。
さらに、上記の遺伝子を含む組換え発現ベクター、発現カセット、トランスジェニック細胞株または組換え株が提供される。
本発明の別の態様では、
(d1) 植物におけるリグニン合成の調節；
(d2) 植物の茎におけるリグニン合成の調節；
(d3) 植物におけるリグニン含有量の調節；
(d4) 植物の茎におけるリグニン含有量の調節；
(d5) 植物におけるリグニン合成の促進；
(d6) 植物の茎におけるリグニン合成の促進；
(d7) 植物におけるリグニン含有量の増加の促進;および
(d8) 植物の茎におけるリグニン含有量の増加の促進
のうちの少なくとも1つにおける、本明細書に記載のタンパク質の使用が提供される。
また、トランスジェニック植物の製造方法であって、上記遺伝子を出発植物に導入して、トランスジェニック植物を得る工程を含み、そのトランスジェニック植物は、出発植物と比較して、(f1) リグニン含有量の増加、または(f 2) 茎におけるリグニン含有量の増加という表現型を有する、方法も提供される。
トランスジェニック植物の製造方法であって、出発植物における上記遺伝子の発現を抑制して、トランスジェニック植物を得る工程を含み、そのトランスジェニック植物は、出発植物と比較して、少なくとも (g1) リグニン含有量の減少、または(g2) 茎におけるリグニン含有量の減少という表現型を有する、方法も提供される。
また、標的植物において、本明細書に記載のタンパク質の含有量および／または活性を増加させて、標的植物におけるリグニン含有量を増加させるか、または標的植物の茎におけるリグニン含有量を増加させることによる、植物育種方法も提供される。
また、標的植物において、本明細書に記載のタンパク質の含有量および／または活性を減少させて、標的植物におけるリグニン含有量を減少させるか、または標的植物の茎におけるリグニン含有量を減少させることによる、植物育種方法も提供される。
上述したタンパク質、遺伝子、組換え発現ベクターまたは方法の、植物育種における使用も提供される。
本発明の別の態様では、リグニン含有量が異なるトランスジェニック植物を育種する方法が提供される。1つの実施形態において、リグニン含有量が低減された植物の育種方法であって、特定のDNA分子Iを出発植物に導入して、出発植物よりもリグニン含有量が低いトランスジェニック植物を得る工程を含む方法が提供され、上記特定のDNA分子Iは、DNA分子AまたはDNA分子Bであり、DNA分子Aは配列番号15または9に示される配列を有するmiRNAをコードし、DNA分子Bは配列番号15または9に示される配列を有するmiRNAの前駆体RNAをコードする。
また、「配列番号15または9に示される配列を有するmiRNAの前駆体RNA」 が、配列番号14に示される配列を有するRNAである上記方法も提供される。
1つの側面において、特定のDNA分子Iは、具体的に、配列番号13に示される配列を有するDNA分子であり得る。
別の実施形態では、特定のDNA分子Iは、組換えプラスミドIによって出発植物に特異的に導入され得る。組換えプラスミドIは、具体的には、pCUBベクターのBamHI切断部位に特定のDNA分子Iを挿入することによって得られる組換えプラスミドであり得る。
別の実施形態では、上記方法により得られたトランスジェニック植物は、リグニン含有量が低下し茎の穿刺強度（puncture strength）が低下し、バイオエネルギーを生産するための原料として使用することができる。
また、リグニン含有量が増加したトランスジェニック植物を育種する方法であって、特定のDNA分子IIを出発植物に導入して、出発植物よりもリグニン含有量の高いトランスジェニック植物を得る工程を含む方法も提供され、ここで特定のDNA分子IIは、配列番号15または9に示される配列を有するmiRNAの発現を阻害するDNA分子である。1つの実施形態において、特定のDNA分子IIは、具体的には配列番号7に示される配列を有するDNA分子であり得る。
別の実施形態では、特定のDNA分子IIは、組換えプラスミドIIによって出発植物に特異的に導入され得る。組換えプラスミドIIは、具体的には、pCUBベクターのBamHI切断部位に特定のDNA分子IIを挿入することにより得られる組換えプラスミドであってもよい。
別の実施形態では、上記方法により得られたトランスジェニック植物は、増加したリグニン含有量、増加した茎の穿刺強度、および改善された耐倒伏性を有する。
一実施形態では、上記の出発植物のいずれかが、単子葉植物であり得る。単子葉植物は、イネ科植物、特にトウモロコシ、例えばトウモロコシ品種31等であり得る。
本発明の別の態様では、配列番号15または9に示される配列を有するmiRNAが提供される。配列番号15または9に示す配列を有するmiRNAの前駆体RNAも提供される。好ましくは、前駆体RNAは、具体的に、配列番号14に示す配列を有するRNAである。
配列番号14に示す配列を有するRNAも提供される。
配列番号15もしくは9に示す配列を有するmiRNAまたは配列番号14に示す配列を有するRNAをコードする遺伝子も提供される。好ましくは、その遺伝子は、具体的に、配列番号13に示す配列を有するDNA分子である。
さらに、上記の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。
リグニン含有量が低減された植物の育種における、上記のmiRNA、RNAまたは遺伝子の使用も提供される。
本発明の別の態様では、リグニン含有量が増加した植物の育種における、上記miRNAまたはRNAの発現を阻害する物質の使用が提供される。
本発明に係る遺伝子を含む組換えベクターも提供される。組換えベクターは、具体的には、pCUBベクターのBamHI切断部位に遺伝子を挿入することにより得られる組換えプラスミドである。配列番号5に示す配列を有するDNA分子を含む組換えプラスミドも提供される。
別の態様では、リグニン含有量が増加した植物の育種における、配列番号15もしくは9に示される配列を有するmiRNAまたは配列番号14に示される配列を有するRNAの発現を阻害する化合物の使用が提供される。配列番号15もしくは9に示す配列を有するmiRNAまたは配列番号14に示す配列を有するRNAの発現を阻害する化合物は、具体的には、干渉ベクターである。干渉ベクターは、配列番号7に示す配列を有するDNA分子を含む組換えプラスミドである。干渉ベクターは、具体的には、配列番号7に示す配列を有するDNA分子を、pCUBベクターのBamHI切断部位に挿入することにより得られる組換えプラスミドである。
配列番号7に示す配列を有するDNA分子を含む組換えプラスミドである、組換えプラスミド（干渉ベクター）も提供される。干渉ベクターは、具体的には、配列番号7に示す配列を有するDNA分子をpCUBベクターのBamHI切断部位に挿入することにより得られる組換えプラスミドである。
上記植物はいずれも単子葉植物であり得る。単子葉植物は、イネ科植物、特にトウモロコシ、例えばトウモロコシ品種31等であり得る。
以下の非限定的な図面において本発明がさらに説明される。
図1は、実施例1におけるZmMZS遺伝子の相対的発現レベルを示す。 図2は、実施例1における組織学的染色後の顕微鏡写真を示す。 図3は、実施例1で測定されたリグニン含有量を示す。 図4は、実施例2における根の組織学的染色後の顕微鏡写真を示す。 図5は、実施例2における第1節間の組織学的染色後の顕微鏡写真を示す。 図6は、実施例2で測定されたリグニン含有量を示す。 図7は、同定されたmiRNA発現レベルを示す。 図8は 、根中央部分の組織学的染色後の顕微鏡写真を示す。 図9は、第1節間の組織学的染色後の顕微鏡写真を示す。 図10は、測定されたリグニン含有量を示す。 図11は、測定された茎の穿刺強度を示す。 図12は、ポット試験における出穂期の植物の写真を示す。 図13は、ノザンブロット解析の結果を示す。
図14は、N供給によるZmmiR528およびZmLAC発現の調節を示す。N供給による （A）ZmmiR528と（BおよびC）その標的の調節。葉と根からRNAが単離される前に、植物は、0.02、2または4 mMのCa(NO3)2を含む栄養溶液中で水耕栽培された。ZmmiR528とその標的の発現レベルはZmUBQ1のものに対して正規化された。NL、NS、およびNDはそれぞれ、N贅沢（N luxury）、N充足（N sufficiency）、およびN欠乏（N deficiency）を示す。値は生物学的複製4回の平均±SEである。同じ文字を伴う平均値は、最小有意差 （LSD）検定に従って p<0.01で有意差がなかった。 図15は、ZmLAC3およびZmLAC5がZmmiR528によって調節されることを示す。（A）N. benthamianaの葉における、ZmMIR528bとZmLAC3またはZmLAC5とを含む構築物の共発現。リアルタイムRT-PCRによって測定された発現レベルは、タバコ18S rRNAの発現レベルに対して正規化された。値は、3つの生物学的反復の平均±SEである。同じ文字を伴う平均値は、LSD検定に従ってp<0.01で有意差がなかった。（B）5′RACEによって決定されたZmLAC3およびZmLAC5のmRNA切断部位。数字は各部位での切断頻度を示す。 図16は、in situハイブリダイゼーション分析によって決定されたZmmiR528およびZmLAC5の発現パターンを示す。水耕栽培トウモロコシの根、茎およびシュートにおける (A) ZmmiR528および (B) ZmLAC5の転写物の蓄積。対応するセンスプローブを陰性対照として用いた。代表的な植物を撮影した。(A) および (B) のスケールバーは、それぞれ100μmおよび50μmである。
図17は、トウモロコシの耐倒伏性がZmmiR528の存在量に影響されることを示している。(A) 土壌生育のZmmiR528過剰発現（over expressing）トランスジェニックトウモロコシは、野生型またはトランスジェニックZmmiR528ノックダウン系統よりも、N贅沢条件下での倒伏に対してより感受性であった。代表的な植物を撮影した。WTは野生型（wild-type）。(B) 土壌栽培トウモロコシの茎の外皮貫通抵抗性に及ぼすZmmiR528存在量の影響。各遺伝子型の10体の植物を測定した。(CおよびD) 土壌栽培トウモロコシの茎におけるAcBrリグニン (C) 、セルロースおよびヘミセルロース (D) の含量に及ぼすZmmiR528存在量の影響。DWは乾燥重量（dry weight）を表す。値は生物学的複製4回の平均±SEである。同じ文字を伴う平均値は、LSD検定に従ってp<0.01で有意差がなかった。(E) スモールRNAノザンブロットで示された、WT、TMおよびOEトランスジェニックトウモロコシにおけるZmmiR528レベル。各サンプルからの5マイクログラムの低分子RNAを各レーンにロードした。U6をローディングコントロールとして示した。各レーンの下の数字は相対的発現比を示す。(F) AcBrリグニン含量に及ぼすZmmiR528存在量の影響。値は4つの生物学的複製の平均±標準誤差である。DWは乾燥重量を表す。同じ文字を伴う平均値は、 LSD検定に従ってP<0.01で有意差がなかった。(G) リアルタイムRT-PCRによって示された、WT、TMおよびOEトランスジェニックトウモロコシにおける対応するZmLAC3およびZmLAC5遺伝子転写物の検出。定量化はZmUBQ1の発現に対して正規化した。値は3回の生物学的複製の平均±標準誤差である。同じ文字を伴う平均値は、 LSD検定に従ってP<0.01で有意差がなかった。 図18は、土壌栽培トウモロコシにおけるZmLAC3の過剰発現によるリグニン含量の増加を示している。(A) ZmLAC3過剰発現トランスジェニックトウモロコシの茎のフロログルシノール染色。代表的な植物を撮影した。スケールバーは75μmを示す。(B〜E) は、ZmLAC3過剰発現トランスジェニックトウモロコシのAcBrリグニン含量 (B) 、外皮貫通抵抗性 (C) 、セルロース含量 (D) 、およびヘミセルロース含量 (E) を示す。DWは乾燥重量を表す。値は生物学的複製4回の平均±SEである。同じ文字を伴う平均値は、 LSD検定に従ってp<0.01で有意差がなかった。
図19は、(A) ZmLAC3 OEトランスジェニックトウモロコシにおけるZmLAC3のmRNAレベルを示す。リアルタイムRT-PCR定量化はZmUBQ1の発現に対して正規化した。値は生物学的複製4回の平均±標準誤差である。同じ文字を伴う平均値は、 LSD検定に従いP<0.01で有意差がなかった。また、 (B) ZmLAC3 OEトランスジェニックトウモロコシにおけるZmPAL転写産物も示している。発現レベルはZmUBQ1のレベルに対して正規化した。値は生物学的複製3回の平均±標準誤差である。同じ文字を伴う平均値は、 LSD検定に従いP<0.01で有意差がなかった。 図20は、WT、TMおよびOEトランスジェニックトウモロコシにおけるZmPAL転写物レベルに対するN供給の影響を示している。ZmPAL転写レベルに及ぼすZmmiR528存在量とN供給の影響。発現レベルはZmUBQ1のレベルに対して正規化した。値は生物学的複製3回の平均±SEである。同じ文字を伴う平均値は、 LSD検定に従いp<0.01で有意差がなかった。NL、NS、およびNDはそれぞれ、N贅沢、N充足、およびN欠乏を示す。
図21は、N贅沢条件下のトウモロコシの耐倒伏性におけるZmmiR528の役割について提唱されるモデルを示している。miR528のレベルの増加、およびZmLACとZmPALの存在量の減少が、N贅沢条件下でのトウモロコシの耐倒伏性の減少を説明することができた。矢印は正の調節を示し、端が平らな線は抑制を示す。 図22は、実施例7で使用されるsgRNAおよびhSpCas9の概略図を示す。 図23は、miR527ノックダウントランスジェニック植物と倒伏傾向性の植物とを交配した場合の、耐倒伏性への影響を示している。
次に、本発明についてさらに説明する。以下の節において、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。そのように定義された各態様は、反対のことが明確に示されない限り、他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であるとして示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であるとして示された任意の他の特徴と組み合わせることができる。
本発明の実施は、特に示されない限り、植物学、微生物学、組織培養、分子生物学、化学、生化学および組換えDNA技術、バイオインフォマティクスの従来の技術を利用し、それらは当業者の技量の範囲内である。そのような技術は文献で完全に説明されている。
本明細書中で使用される用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えばmRNA）、天然に存在する、変異した、合成のDNAまたはRNA分子、およびヌクレオチド類縁体を使用して生成されたDNAまたはRNAの類縁体を含むことが意図される。一本鎖でも二本鎖でもよい。このような核酸またはポリヌクレオチドは、構造遺伝子のコード配列、アンチセンス配列、およびmRNAもタンパク質産物もコードしない非コード調節配列を含むが、これらに限定されない。これらの用語は遺伝子も含む。用語「遺伝子」あるいは「遺伝子配列」は、生物学的機能に関連するDNA核酸を指すために広く使用される。したがって、遺伝子は、ゲノム配列におけるようにイントロンおよびエクソンを含み得、またはcDNAにおけるようにコード配列のみを含み得、および／または調節配列と組み合わせたcDNAを含み得る。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ペプチド結合により一緒に連結された任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を指す。
用語「miR528」は、マイクロ（mi）RNA分子を指す。成熟miR528のRNA配列を配列番号9および15に示す。成熟miR528をコードするDNA配列を配列番号10に示す。一例では、miR528は、本明細書で「ZmmiR528」とも呼ばれるトウモロコシmiR528である。トウモロコシには、miR528の2つのメンバーであるmiR528aとmiR528bがあり、それぞれ異なる遺伝子座によってコードされている。各遺伝子座は異なる前駆体配列（それぞれmiR528aおよびbに対応する配列番号32および39として示される）を有するmiR528を産生するが、産生される成熟配列は同一である。用語「前駆体」は、宿主細胞内でプロセスされて1つの鎖の成熟miRNAである部分的二本鎖の短いRNAを生成する前駆体RNAあるいはプレmiRNAを指す。
本発明の態様には組換えDNA技術が関わり、伝統的な育種方法による植物の作出のみに基づく実施形態は除外される。
本発明の1つの態様において、植物の耐倒伏性を改変する方法が提供され、該方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む。
一実施形態では、「改変する」とは、耐倒伏性を増加させることを意味し得る。別の実施形態では、「改変する」とは、耐倒伏性を減少させることを意味し得る。1つの実施形態において、増加または減少は、対照植物と比較して少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90または95%以上であり得る。一例では、増加のレベルは12から20%の間であり得る。
1つの実施形態において、耐倒伏性は、高窒素あるいは窒素リッチの条件下で改変される。一例では、高Nは300 kg尿素/ha以上と考えられる。代替的実施形態では、耐倒伏性は、平常条件下（例えば240〜300 kg尿素/ha）または低窒素条件下（180 kg尿素/ha以下、好ましくは180〜120 kg尿素/ha）で改変される。
本明細書中で使用される用語「倒伏に対する耐性」あるいは「耐倒伏性」は、「収穫性」とも表わされ得、植物茎の屈曲もしくは破損、または植物の傾斜（tilting over）を指し得る。あるいは、耐倒伏性の増加が倒伏性の減少と同等とみなされ得、耐倒伏性の減少が倒伏性の増加と同等とみなされ得る。
1つの実施形態において、倒伏は、植物の茎および／または植物の根において増加または減少される。
1つの例では、小区画（plot）について倒伏の重症度を視覚的に評点することができ、その場合、茎の倒伏は、穂以下での茎の破損によって見ることができ、根の倒伏は、トウモロコシの茎が30°Cを超える角度で傾斜していることによって見ることができる。
別の例では、耐倒伏性は、茎の強度という尺度から決定することができる。茎強度の1つの尺度は、外皮（rind）の貫通（penetration）もしくはペネトロメーター（penetrometer）抵抗性、あるいはRPRである（それは、スパイクまたは針で茎の外皮を貫くのに必要な力の測定である）。多くの研究が、外皮貫通抵抗性が圃場での茎倒伏と負に相関することを示してきた。1つの実施形態では、RPRが、対照植物と比較して、最大でまたは少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90または95%以上増加または減少され得る。一例では、増加のレベルは12から20%の間であり得る。
さらなる例において、耐倒伏性は、植物、好ましくは植物の茎および／または根におけるリグニン含有量の増加によって決定することができる。リグニンはセルロースに次いで二番目に豊富な生物学的ポリマーであり、茎の剛性と強度、および害虫と病原体に対する抵抗性にとって重要である（Boerjan et al., 2003；Bhuiyan et al., 2009；Zhang et al., 2014；Barros et al., 2015）。リグニンは、植物細胞壁におけるp‐クマリルアルコール（H単位）、コニフェリルアルコール（G単位）、およびシナピルアルコール（S単位）というの3種のモノリグノール前駆体の酸化重合によって生成されるフェニルプロパノイド由来重合体である（Vanholme et al., 2008）。一例では、リグニンポリマー総含有量を測定するために、植物材料を臭化アセチル（acetyl bromide：AcBr）による加水分解に供し、リグニン含有量を分析する。これはAcBr法として知られており、Fukushima and Hatfield (2004) によって記述されている。1つの実施形態において、リグニン含有量は、対照植物と比較して、最大でまたは少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90または95%以上増加または減少され得る。一例では、増加のレベルは12から20%の間であり得る。
さらなる例において、耐倒伏性は、植物、好ましくは植物の茎および／または根におけるセルロースおよび／またはヘミセルロース含有量の増加から決定することができる。一例において、セルロースおよび／またはヘミセルロース含有量は、修正NREL手順を用いて決定することができる（Sluiterら、2008に記載されているように）。1つの実施形態において、セルロースおよび／またはヘミセルロース含有量は、対照植物と比較して、最大でまたは少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90または95%以上増加または減少され得る。一例では、増加のレベルは12から20%の間であり得る。
したがって、一例では、耐倒伏性は、倒伏重症度の視覚的スコア、外皮貫通抵抗性、リグニン含有量および／またはセルロース／ヘミセルロース含有量のうちのいずれか1つまたは組み合わせの測定から決定することができる。耐倒伏性を測定するための他のパラメータは当業者に知られているであろう。
1つの実施形態において、本方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子のレベルまたは発現を増加させることによって、植物における耐倒伏性を増加させる。
本発明の別の側面では、特に倒伏条件下で、あるいは野生型もしくは対照植物に倒伏をもたらす条件に植物が曝される場合に、収量および／または茎の強度を増加させる方法が提供され、該方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む。一例において、倒伏条件は、野生型または対照植物において倒伏を引き起こすであろう強風、雨、過密、嵐による損傷などの任意の環境条件である。
「収量」 という用語は、一般に、典型的には特定の作物、地域、および期間に関して、測定可能な経済的有価値の生産物を意味する。植物の個々の部分が、その数、大きさおよび／または重量に基づいて、直接収量に寄与する。実際の収量は、年間の作物の1平方メートル当たりの収量であり、年間の総生産量（収穫された生産量と見積もられた生産量の両方を含む）を作付面積平方メートルで除して求められる。
収量は、対照植物または野生型植物と比較して増加される。例えば、収量は、対照または野生型植物と比較して、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%または20%、25%、30%、35%、40%、45%または50%増加する。
本発明のさらなる態様では、植物におけるリグニン含有量を改変する方法が提供され、該方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む。好ましい態様において、該方法は、植物中、好ましくは植物の茎または根中のリグニン含有量を増加させることを含み、該方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む。1つの実施形態において、リグニン含有量は、対照植物と比較して、最大でまたは少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90または95%以上増加または減少され得る。
本明細書で使用される場合、「発現を増加させること」とはヌクレオチドレベルの増加を意味し、本明細書で使用される場合、「レベルを増加させること」とは、少なくとも1つのラッカーゼのタンパク質レベルの増加を意味する。1つの実施形態において、少なくとも1つのラッカーゼの発現またはレベルまたは活性が、野生型または対照植物におけるそのレベルと比較した場合に、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%以上増加する。ラッカーゼのヌクレオチド発現またはタンパク質レベルを決定する方法は、当業者によく知られている。特に、増加は、当業者に知られる任意の標準的な技術によって測定することができる。例えば、ラッカーゼの発現および／またはタンパク質レベルの増加は、タンパク質および／または核酸レベルの測定値を含み得、限定されるものではないが例えば任意の形態のゲル電気泳動またはクロマトグラフィー（例えばHPLC）のような当業者に知られる任意の技術によって測定することができる。
ラッカーゼは銅を含有するオキシダーゼ酵素である。本明細書中で使用される場合、ラッカーゼは、植物リグニン合成関連タンパク質とも称され得る。好ましい実施形態では、ラッカーゼは、ラッカーゼ3（あるいはLAC3）およびラッカーゼ5（あるいはLAC5）から選択される。1つの実施形態において、植物はトウモロコシであり、ラッカーゼは、ZmLACCASE 3（ZmLAC3）またはZmLACCASE 5（ZmLAC5）と称され得る。あるいは、ZmLAC3は、本明細書においてZmMNSまたはZmMZSと呼ばれ得る。
本発明の1つの態様において、ラッカーゼタンパク質が提供され、ここで、該タンパク質は、
(a) 配列番号1もしくは4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；または
(b) 配列番号1に示されるアミノ酸配列における1以上のアミノ酸残基の置換および／または該アミノ酸配列からの欠失および／または該アミノ酸配列への付加により配列番号1から導出されるアミノ酸配列を有する植物リグニン合成関連タンパク質。
である。
(b) のタンパク質の精製および検出を容易にするために、配列番号1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質のN末端またはC末端に、表1に示すようなタグを付けることができる。
(b) のタンパク質は、人工的に合成してもよいし、そのコード遺伝子を合成した後の生物学的発現により得てもよい。(b) のタンパク質のコード遺伝子は、1つ以上のアミノ酸残基のコドンを欠失させること、および／または配列番号3に示すDNA配列中の1つ以上の塩基対のミスセンス変異を起こすこと、および／またはそのコード配列の5’末端および／または3’末端に上記表1に示すようなタグを付加することによって取得され得る。
本発明の別の態様では、単離されたラッカーゼ核酸またはDNA分子も提供される。一実施形態では、DNA分子は、以下のうちのいずれか1つから選択される。
(1) 配列番号3または6に示すコード領域を有するDNA分子；
(2) 配列番号2または5に示すゲノム配列を有するDNA分子；
(3)
ストリンジェントな条件下で (1) または (2) のDNA配列とハイブリダイズし、かつ植物のリグニン合成関連タンパク質またはラッカーゼタンパク質をコードするDNA分子；および
(4) (1)、(2)又は(3)のDNA配列に対して少なくとも25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%、又は少なくとも99%均一（あるいは「同一」)であり、かつ植物リグニン合成関連タンパク質又はラッカーゼをコードする DNA分子。
好ましくは、上記ストリンジェントな条件は、65℃でのDNAまたはRNAハイブリダイゼーション実験における0.1x SSPE（または0.1x SSC）および0.1% SDS溶液中のハイブリダイゼーションと洗浄とを含み得る。
本発明の別の態様においては、本明細書に記載のタンパク質、核酸またはDNA分子、好ましくはZmMZSを含む、組換え発現ベクター（本明細書では「核酸構築物」とも呼ばれる）、発現カセット、トランスジェニック細胞株、または組換え株が提供される。
本願明細書に記載されるラッカーゼ核酸、好ましくはLAC3（好ましくはZmMZS）またはLAC5を含む組換え発現ベクターは、既存の発現ベクターを使用して構築することができる。その発現ベクターは、バイナリーAgrobacterium tumefaciensベクターおよび微小発射体ボンバードメント用ベクターを含む。組換え発現ベクターがラッカーゼ遺伝子で構築される場合、増強プロモーター、構成プロモーター、組織特異的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかが転写開始ヌクレオチドの前に連結され得、それは単独でまたは他の植物プロモーターと組み合わせて使用され得る。さらに、組換え発現ベクターがラッカーゼ遺伝子で構築される場合、翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーを含むエンハンサーが含有され得る。これらのエンハンサー領域はATG開始コドンまたは隣接領域の開始コドンであり得るが、しかしながらこれは、全配列の適切な翻訳を確保するために、コード配列と共フレーム化される必要がある。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは広く利用可能であり、天然のものまたは合成のものであり得る。翻訳開始領域は、転写開始領域または構造遺伝子に由来し得る。トランスジェニック植物またはトランスジェニック微生物の同定およびスクリーニングを容易にするために、使用される発現ベクターは、例えば、植物もしくは微生物において色変化を生じる酵素もしくは発光化合物を発現する遺伝子、耐性抗生物質マーカー、または化学的耐性マーカー遺伝子を加えることによって処理され得る。導入遺伝子の安全性を考慮すると、植物または微生物は、選択的マーカー遺伝子を加えることなく表現型選択によって直接形質転換され得る。
具体的には、組換え発現ベクターは、pCUBベクターのBamHI切断部位に配列番号2、3、5、6のいずれかに示すDNA分子を挿入することによって得られる組換えプラスミドpCUB-ZmMZSであってもよい。
1つの実施形態において、本方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入し発現させることを含み、ここで、上記核酸は、調節配列に作動可能に連結された、上記のようなラッカーゼ3および／またはラッカーゼ5ポリペプチドをコードする。上記核酸構築物の使用は、核酸が導入された植物においてラッカーゼ3および／またはラッカーゼ5の発現、好ましくは過剰発現をもたらす。
好ましくは、ラッカーゼ3ポリペプチドは、配列番号1に定義されるもの、またはその機能的バリアントもしくは相同体である。従って、一実施形態では、ラッカーゼ3核酸は、配列番号1で定義されるポリペプチドまたはそのバリアントをコードする。より好ましくは、ラッカーゼ3核酸は、配列番号2もしくは3またはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなる。
好ましくは、ラッカーゼ5ポリペプチドは、配列番号4に定義されるもの、またはその機能的バリアントもしくは相同体である。従って、一実施形態では、ラッカーゼ5核酸は、配列番号4で定義されるポリペプチドまたはそのバリアントをコードする。より好ましくは、ラッカーゼ5核酸は、配列番号5もしくは6またはその機能的バリアントもしくは相同体を含むか、またはそれからなる。
用語 「バリアント」あるいは「機能的バリアント」は、配列番号1から47のいずれかに関して本明細書中で使用される場合、完全な非バリアント配列の生物学的機能を保持する、異型の遺伝子配列または遺伝子配列の一部を指す。機能的バリアントはまた、例えば保存されていない残基において、機能に影響を及ぼさない配列変化を有する、対象遺伝子の異型を含む。また、本明細書に示される野生型配列と比較して実質的に同一であり、すなわち、例えば保存されていない残基においていくつかの配列変異のみを有し、生物学的に活性である異型も包含される。コードされるポリペプチドの機能的特性に影響を与えない、所与の部位で異なるアミノ酸の産生をもたらす核酸配列の変化は、当技術分野でよく知られている。例えば、疎水性アミノ酸であるアラニンのコドンは、グリシンなど疎水性がより低い別の残基、またはバリン、ロイシン、もしくはイソロイシンなど疎水性がより高い残基をコードするコドンによって置換され得る。同様に、例えばグルタミン酸からアスパラギン酸のように１つの負に荷電した残基を別の負に荷電した残基に置換したり、アルギニンからリシンのように１つの正に荷電した残基を別の正に荷電した残基に置換したりする変化も、機能的に等価な産物を生成することが予期され得る。ポリペプチド分子のN末端およびC末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化もまた、ポリペプチドの活性を変えないと予想される。提案された修飾の各々は当業者の通常の技術の範囲内であり、コードされる生成物の生物学的活性の保持を決定することも同様である。
本明細書に記載される発明のいずれかの態様において使用される場合、「バリアント」あるいは「機能的バリアント」は、非バリアントの核酸またはアミノ酸の配列に対して、少なくとも25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の、全体的な配列同一性を有する。
2つの核酸配列またはポリペプチドは、以下に記述されるように対応が最大化するように整列されたときに、その2つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列がそれぞれ同じである場合に、「同一」であると言われる。2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」 または「同一性」パーセント という用語は、下記の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用して、または手動アラインメントと目視検査とによって測定され、比較ウィンドウにわたって対応が最大化するように比較および整列されたときに、同じであるか、または特定されたパーセンテージで同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、2つ以上の配列またはサブ配列を表す。配列同一性のパーセンテージがタンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一ではない残基位置は、しばしば保存的（conservative）アミノ酸置換によって異なることが認識され、そこでは、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質について補正するために上方に調整することができる。この調整を行うための手段は当業者によく知られている。配列比較のために、典型的には、1つの配列が基準配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および基準配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォールトのプログラムパラメータを使用することができ、あるいは別のパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの非限定的な例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。
さらなる態様において、本明細書で使用されるバリアントは、本明細書で定義されるラッカーゼポリペプチドをコードする核酸配列であって、本明細書で定義されるストリンジェントな条件下で配列番号2、3、5または6のいずれか1つにハイブリダイズすることができるものを含み得る。
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、他の配列に対してよりも、検出可能な程度強く標的配列に対してハイブリダイズする条件を意図している（例えば、バックグラウンドの少なくとも2倍）。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況によって異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーをコントロールすることによって、プローブに対して100%相補的である標的配列を同定することができる（相同性プロービング）。代替的に、配列におけるいくつかのミスマッチを許容するようにストリンジェンシー条件を調節して、より低い程度の類似性が検出されるようにすることができる（異種性プロービング）。一般に、プローブは、約1000ヌクレオチド未満の長さであり、好ましくは500ヌクレオチド未満の長さである。
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.5 M Naイオン未満であり、典型的には、pH 7.0〜8.3で約0.01〜1.0 M Naイオン濃度（またはその他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）については少なくとも約30°Cであり、長いプローブ（例えば50を超えるヌクレオチド）については少なくとも約60°Cである条件である。ハイブリダイゼーションの時間は、一般に約24時間未満、通常は約4〜12時間である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。一例において、ストリンジェントな条件は、65°CでのDNAまたはRNAハイブリダイゼーション実験における0.1x SPPE（または0.1xSSC）と0.1% SDSとの溶液中でのハイブリダイゼーションおよび洗浄を含み得る。
上記方法を含み、後述されるような植物、方法および使用を含む、本発明の全ての態様によれば、用語「調節配列」は、本明細書中では「プロモーター」と交換可能に使用され、全ての用語は、それらが結合される配列の発現をもたらすことができる調節性核酸配列を表わす広い文脈で解釈されるべきである。用語「調節配列」はまた、細胞、組織または器官において核酸分子の発現を付与、活性化または増強する合成融合分子または誘導体を包含する。
1つの実施形態において、プロモーターは、構成的な、または強力なプロモーターであり得る。
「構成的プロモーター」とは、少なくとも1つの細胞、組織または器官において、成長および発生の必ずしも全てではないがほとんどの段階のあいだ、かつほとんどの環境条件下で、転写的に活性であるプロモーターをいう。構成的プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（CaMV 35 Sまたは19 S）、イネアクチンプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、ルビスコスモールサブユニット、トウモロコシもしくはアルファルファのH3ヒストン、OCS、SAD1もしくは2、GOS 2、または発現を増強する任意のプロモーターを含む。
「強力なプロモーター」 とは、遺伝子の増加されたまたは過剰な発現をもたらすプロモーターをいう。強力なプロモーターの例としては、CaMV-35S、CaMV-35Somega、ArabidopsisユビキチンUBQ1、イネユビキチン、アクチン、またはトウモロコシアルコール脱水素酵素1プロモーター（Adh-1）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される用語「動作可能に連結される」は、プロモーター配列が対象遺伝子の転写を開始することができるような、プロモーター配列と対象遺伝子との間の機能的連結を表す。
1つの実施形態において、子孫植物は、本明細書に記載される核酸構築物で安定的に形質転換され、植物細胞において遺伝的に維持される外因性ポリヌクレオチドを含む。この方法は、構築物が安定的に統合されていることを検証するステップを含み得る。この方法はまた、選択された子孫植物から種子を収集する追加の工程を含んでもよい。
別の実施形態では、本方法は、miR528の発現または活性を低下させることによって、植物における耐倒伏性を増大させる。
miR528は単子葉植物特異的miRNAである。イネでは、miR528は、L-アスコルビン酸オキシダーゼ（AO）、プラストシアニン様タンパク質、RING-H2フィンガーE3ユビキチンリガーゼVirE2相互作用タンパク質2、および、Fボックスドメイン及びロイシンリッチリピート含有タンパク質DWARF3を標的としている（Wu et al., 2017）。イネがウイルスに感染すると、 miR528はAGO18と優先的に結合し、AO活性の増強、基礎的な活性酸素種蓄積の増加、および抗ウイルス防御の増強をもたらす（Wu et al., 2017）。イネmiR528の構成的発現は、AAO（アスコルビン酸オキシダーゼ）およびCBP 1（銅イオン結合タンパク質1）の転写物を抑制することによって、ハイコヌカグサにおける塩分ストレスおよびN欠乏に対する耐性を増強する（Yuan et al., 2015）。しかし、ZmmiR528の予測される潜在的標的はイネのものとは異なるため、トウモロコシにおけるmiR528の機能的意義は不明のままである。さらに、トウモロコシには、miR528の2つのメンバーであるmiR528aとmiR528bがあり、それぞれ異なる遺伝子座によってコードされている。各遺伝子座は異なる前駆体配列（本明細書において配列番号32および39として示される）を有するmiR528を産生するが、産生される成熟配列は同一である（成熟miR528のRNAおよびDNA配列は、それぞれ配列番号9および10に示される）。本明細書では、トウモロコシにおけるリグニンの組成と含量がN供給によって有意に影響され、 ZmLACCASE3（ZmLAC3）とZmLACCASE5（ZmLAC5）がZmmiR528の真正な標的であることを示す。発明者らはまた、 ZmmiR528が、ZmLAC3およびZmLAC5のmRNAの存在量を負に調節することにより、トウモロコシのリグニン生合成および耐倒伏性に影響を及ぼすことも実証する。
miR528の「発現を減少させること」は、対照植物と比較したmiR528のヌクレオチド（DNAまたはRNA）レベルの減少を意味する。一例において、miR528の活性は、ラッカーゼ3および／5のタンパク質またはRNAのレベルを測定することによって評価することができる。1つの実施形態において、少なくとも1つのmiR528の発現または活性は、野生型または対照植物におけるレベルと比較した場合に、最大5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%もしくは90%減少し、またはそれより大きく減少する。「消失」とは、miR528が発現されない、または検出可能に発現されないことを意味する。miR528ヌクレオチド発現を測定する方法は、当業者によく知られている。特に減少は、当業者に知られる任意の標準的な技術によって測定することができる。例えば、発現レベルの低下は、核酸レベルの測定を含み得、例えば任意の形態のゲル電気泳動またはクロマトグラフィー （例えばHPLC）であるがそれらに限定されない、当業者に知られた任意の技術によって測定することができる。
1つの実施形態において、本方法は、少なくとも1つのmiR528遺伝子（例えば、本明細書に記述される少なくとも1つの前駆体配列または成熟miR528配列、例えば配列番号32、39、49または50）および／またはプロモーター配列に少なくとも1つの突然変異を導入して、本明細書の定義に従いmiR528が発現しない（すなわち、発現が消失する）かまたは発現が減少するようにすることを含み得る。あるいは、改変された遺伝子が機能的産物を発現しないように、すなわち、それがLAC3および／またはLAC5に結合できないように、少なくとも1つの突然変異をmiR528に導入し得る。この態様で、miR528の活性が低下または消失すると考えることができる。好ましくは、miR528の発現が消失する。この態様では、突然変異はノックアウト突然変異である。
別の実施形態では、miR528の活性を低下させることは、miR528がその標的すなわちLAC3およびLAC5に結合する部位を変異させて、miR528がLAC3および／またはLAC5のmRNAに結合しそれを分解できなくすることを含み得る。このことはひいてはLAC3およびLAC5のタンパク質レベルの増加をもたらす。
従って、1つの実施形態において、本方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子のmiR528結合部位に少なくとも1つの突然変異を導入することを含む。最も好ましくは、この方法は、LAC3および／またはLAC5のmiR528結合部位に少なくとも1つの突然変異を導入することを含む。一実施形態では、LAC3およびLAC5のmiR528結合部位の両方に突然変異が導入される。
LAC3におけるmiR528結合部位は以下の通りである。
CUCUGCUGCAUGCCCCUUCGA（配列番号20）
LAC5におけるmiR528結合部位は以下の通りである。
CUUCUCCGCAUGUCCCUUCCU（配列番号21）
好ましくは、突然変異は、LAC3および／またはLAC5へのmiR528の結合を妨げる任意の突然変異である。一例において、突然変異は、上述の配列番号20および／または21における1つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、および置換から選択され得る。一例において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチドが欠失または挿入される。1つの実施形態において、突然変異はサイレント突然変異である。より好ましくは、突然変異は、タンパク質のラッカーゼ（例えばオキシダーゼ）活性にも影響を及ぼさない。
1つの実施形態において、突然変異は、突然変異誘発または標的化ゲノム編集を用いて導入される。すなわち、一実施形態において、本発明は、方法、および上記のような遺伝子工学的方法によって生成された植物に係るものであり、天然に存在する品種は包含しない。
標的化ゲノム改変または標的化ゲノム編集は、標的化DNA二本鎖切断（DSB：double-stranded break）を用いて、相同組換え（HR：homologous recombination）媒介性の組換え事象によるゲノム編集を促進するゲノム工学技術である。部位特異的DNA DSBの導入を介した効果的なゲノム編集を達成するために、4つの主要な分類のカスタマイズ可能なDNA結合蛋白質を使用することができる：すなわち微生物可動遺伝因子由来のメガヌクレアーゼ、真核生物転写因子に基づくZFヌクレアーゼ、 Xanthomonas細菌由来の転写活性化因子様エフェクター（TALE：transcription activator-like effector）、およびII型細菌適応免疫系CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）由来のRNA誘導DNAエンドヌクレアーゼCas9である。メガヌクレアーゼ、ZF、およびTALEタンパク質はすべて、タンパク質-DNA相互作用によって特異的DNA配列を認識する。メガヌクレアーゼはヌクレアーゼドメインとDNA結合ドメインを統合するが、ZFとTALEの蛋白質はそれぞれ3または1ヌクレオチド (nt) のDNAを標的とする個々のモジュールからなる。ZFおよびTALEは、所望の組合せで組み立ててFokIのヌクレアーゼドメインに結合させて、特異的なゲノム遺伝子座に向けて核酸分解活性を導くことができる。
細菌のIII型分泌系を介して宿主細胞中に送達されると、TALエフェクターは核に入り、宿主遺伝子プロモーターのエフェクター特異的配列に結合し、転写を活性化させる。それらの標的特異性は、タンデムな33〜35アミノ酸反復の中心ドメインによって決定される。これに続いて、20アミノ酸からなる切断された単一の反復配列がある。調べられてきた天然TALエフェクターの大部分は12から27の完全反復を有する。
これらの反復配列は、 2つの隣接するアミノ酸、すなわちそれらの反復可変二残基 （RVD：repeat-variable di-residue）によってのみ互いに異なっている。RVD は、TALエフェクターがどの単一ヌクレオチドを認識するかを決定する。1つのRVDが1つのヌクレオチドに対応し、最もよく見られる4つのRVDはそれぞれ4つの塩基のうちの1つに優先的に結合する。天然の認識部位は、TALエフェクター活性に必要なTによってもっぱら先行されている。TALエフェクターはFokIヌクレアーゼの触媒ドメインに融合されて、ゲノム編集のためにin vivoで標的化DNA二本鎖切断 (DSB) を行うTALエフェクターヌクレアーゼ （TALEN：TAL effector nuclease）を創出することができる。ゲノム編集におけるこの技術の使用は、例えば米国特許第8,440,431号、米国特許第8,440,432号および米国特許第8,450,471号等、本技術分野において広く記述されている。Cermak Tらは、Golden Gateクローニング法と共に使用して複数のDNA断片を組み立てることができるカスタマイズされたプラスミドのセットを記述している。そこに説明されているように、ゴールデンゲート法は、IIS型制限エンドヌクレアーゼを使用し、これは、その認識部位の外側で切断を行って特有の4 bpオーバーハングを形成する。正しいアセンブリーによって酵素認識部位が除去されるので、同じ反応混合物中で消化とライゲーションを行うことによってクローニングが促進される。カスタムTALENまたはTALエフェクター構築物のアセンブリーは、2つの工程を含む：すなわち (i) 1〜10反復の中間体アレイへと反復モジュールをアセンブリーすること、および (ii) 中間体アレイを主骨格に連結して最終構築物を作製することである。従って、当技術分野で公知の技術を使用して、miR528の遺伝子もしくはプロモーターまたは本明細書に記載されるLAC3および／またはLAC5におけるmiR528結合配列を標的とするTALエフェクターを設計することが可能である。
本発明の種々の態様に従って使用することができる別のゲノム編集方法がCRISPRである。ゲノム編集におけるこの技術の使用は、例えば米国特許第8,697,359号明細書およびここに引用された参考文献など、本技術分野で広く記述されている。簡単に言えば、CRISPRは、侵入してくるファージやプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるCRISPR遺伝子座は、CRISPR媒介性核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コードRNAエレメント（sgRNA）と共に、CRISPR関連（Cas）遺伝子の組み合わせを含む。3つのタイプ（I〜III）のCRISPRシステムが、広範囲の細菌宿主に渡って同定されている。各CRISPR遺伝子座の重要な特徴の1つは、反復配列のアレイ（直接反復）のあいだに非反復配列の短い領域（スペーサー）が介在したものの存在である。非コードCRISPRアレイは転写され、直接反復内で切断されて、個々のスペーサー配列を含む短いcrRNAを生じ、それがCasヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に向かわせる。II型CRISPRは最もよく解析された系の一つであり、4つの連続したステップにおいて標的DNA二本鎖切断を行う。最初に、2つの非コードRNA、すなわちpre-crRNAアレイおよびtracrRNAがCRISPR遺伝子座から転写される。第二に、tracrRNAがpre-crRNAの反復領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含む成熟crRNAへのpre-crRNAのプロセシングを媒介する。第三に、成熟crRNA:tracrRNA複合体が、標的認識のための追加的な要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM ：protospacer adjacent motif）の隣で、crRNA上のスペーサーと標的DNA上のプロトスペーサーとの間のワトソン-クリック塩基対形成を介してCas9を標的DNAへと導く。最後に、Cas9が標的DNAの切断を媒介し、プロトスペーサー内で二本鎖切断を創出する。
従来型の遺伝子ターゲティングおよび他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼと比較して、CRISPR-Cas9システムの1つの主要な利点は、マルチプレックス化が容易であることであり、そこでは、単に、各々が異なる遺伝子をターゲティングする複数のsgRNAを使用することによって、複数の遺伝子を同時に変異させることができる。さらに、あるゲノム領域を挟んで2つのsgRNAが使用される場合には、その挟まれた部分を欠失または反転させることができる（Wilesら、2015）。
このようにCas9はII型CRISPR-Cas系の特徴をなす蛋白質であり、2つの非コードRNAであるCRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化crRNA（tracrRNA：trans-activating crRNA）の複合体によりPAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列モチーフに隣接するDNA標的配列に誘導される、大きな単量体DNAヌクレアーゼである。Cas9タンパク質は、RuvCおよびHNHヌクレアーゼに相同的な2つのヌクレアーゼドメインを含んでいる。HNHヌクレアーゼドメインは相補的DNA鎖を切断、RuvC様ドメインは非相補的DNA鎖を切断し、結果として、平滑な切断が標的DNAに導入される。sgRNAとともにCas9を異種発現させると、さまざまな生物の生細胞のゲノムDNAに部位特異的二本鎖切断（DSB）を導入することができる。真核生物への応用のために、元々は細菌Streptococcus pyogenesに由来するCas9のコドンを最適化したバージョンが使用されている。
シングルガイドRNA（sgRNA：single guide RNA）は、Cas9ヌクレアーゼと複合体を形成する、CRISPR/Cas系の第二成分である。sgRNAは、crRNAとtracrRNAを融合することにより創られた合成RNAキメラである。その5'末端に位置するsgRNAガイド配列がDNA標的特異性を付与する。したがって、ガイド配列を改変することにより、異なる標的特異性を有するsgRNAを作製することが可能である。ガイド配列の標準的な長さは20 bpである。植物では、sgRNAは、U6およびU3などの植物RNAポリメラーゼIIIプロモーターを用いて発現されてきた。したがって、当技術分野で公知の技術を用いて、miR528 aおよび／またはb、またはLAC3および／またはLAC5遺伝子におけるmiR528結合部位を標的（target）とするsgRNA分子を設計することが可能である。本明細書に記載される方法に従って使用され得るそのような適切なCRISPR構築物の例は、下記において記述される。
1つの実施形態において、本方法は、miR528遺伝子に標的化SNPまたは突然変異を導入するために、下記に詳細に定義されるsgRNA（および鋳型DNAまたはドナーDNA）の構築物を使用する。好ましくは、突然変異はmiR528の発現を減少または消失させる。あるいは、突然変異の結果として、miR528はもはやLAC3および／または5に結合できなくなる。以下に説明するように、二本鎖DNAにおけるsgRNA媒介性切り込み（snip）後の鋳型DNA鎖導入を使用して、相同性特異的修復を用いた遺伝子の特異的標的化突然変異（すなわちSNP）を生成することができる。
別の例では、sgRNA（例えば、本明細書に記載されるもの）は、例えばニッカーゼCas9、あるいはnCas9、あるいは「塩基エディター」（例えばシチジンデアミナーゼ、またはTadA（tRNAアデノシンデアミナーゼ）またはADARまたはAPOBECのようなデアミナーゼ等の酵素）に融合された「死んだ（dead）」Cas9（dCas9）等の、改変されたCas9タンパク質とともに使用され得る。これらの酵素は、1つの塩基を別の塩基に置換することができる。その結果、DNAは欠失せず、単一の置換が起こる（Kim et al., 2017；Gaudelli et al.,2017）。
一例において、配列番号35、38、42および／または45に示される、本明細書に記載される下記のsgRNA配列を用いて、miRNA 528 aおよび／またはmiRNA 528 bに突然変異が導入される。
別の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるようなsgRNA構築物を用いて、LAC3および／またはLAC5遺伝子におけるmiRNA 528結合部位に少なくとも1つの突然変異を導入する。あるいは、CRISPRシステムを使用して、LAC3またはLAC5におけるmiRNA 528結合部位を人工配列またはドナー配列で置換することができる。好ましくは、人工配列は、同義変異（すなわち、核酸配列を変化させるがアミノ酸配列を変化させない）である、miRNA結合部位における少なくとも1つの変異を含む。従って、miRNA 528は結合することも低効率で結合することもできないが、ラッカーゼのタンパク質機能は影響を受けない。この態様では、miRNA 528の活性が本明細書に記載されているように減少していると考えることができる。標的化DNA置換またはドナー配列を導入するためにCRISPRを使用する方法は、当技術分野で公知である（例えばZhao et al. 2016およびZhang et al. 2018参照）。しかしながら、一例において、sgRNA構築物が提供され、この構築物は、配列番号51（LAC3）、54（LAC3）、57（LAC5）または60（LAC5）から選択される少なくとも1つの配列を標的とする（それに結合できる）少なくとも1つの核酸配列またはそのバリアント（上記定義による）を含む、sgRNA構築物が提供される。より好ましくは、sgRNA構築物は、少なくとも1つのプロトスペーサー配列を含み、該プロトスペーサー配列は配列番号52（LAC3）、55（LAC3）、58（LAC5）、および61（LAC5）から選択される。より好ましくは、sgRNA構築物は、配列番号53（LAC3）、56（LAC3）、59（LAC5）、および62（LAC5）のうちの1つまたはそれらのバリアントから選択されるsgRNAをコードする核酸配列を含む。核酸配列は、好ましくは、プロモーターなどの調節配列に作動可能に連結され、その例は本明細書に記載される。sgRNA構築物はまた、Cas、好ましくはCas9またはCpf1など、本明細書に記載されるCRISPR酵素を含んでもよい。この例で、標的配列が配列番号51（LAC3）または57（LAC5）から選択されるか、配列番号52（LAC3）または58（LAC5）から選択されるプロトスペーサー配列、または配列番号53（LAC3）または配列番号59（LAC5）から選択されるsgRNA核酸配列である場合において、CRISPR酵素はCasタンパク質であり、好ましくはCas9である。あるいは、標的配列が配列番号54（LAC3）および60（LA5）から選択されるか、配列番号55（LAC3）または配列番号61（LAC5）から選択されるプロトスペーサー配列、または配列番号56（LAC3）または配列番号562（LAC5）から選択されるsgRNA核酸配列である場合において、CRISPR酵素はCpf1である。
さらに、LAC3またはLAC5遺伝子におけるmiRNA 528結合部位を置換するドナー配列を含む、ドナー配列構築物も提供される。一例において、ドナー配列は配列番号65を含み、好ましくは標的がLAC3である。別の例では、ドナー配列は配列番号66を含み、好ましくは標的配列はLAC5である。好ましい例では、ドナー配列は、本明細書に記載されるプロモーターのいずれかなどの調節配列に作動可能に連結される。しかし、別の実施形態では、ドナー配列は、sgRNA配列と同じ構築物上に存在し、同じまたは別々の調節配列の制御下に存在してもよい。
「crRNA」あるいは「CRISPR RNA」とは、プロトスペーサーエレメントとtracrRNAに相補的な追加的ヌクレオチドとを含むRNAの配列を意味する。
「tracrRNA」（トランス活性化RNA）とは、crRNAにハイブリダイズしてCas9のようなCRISPR酵素に結合し、それによってヌクレアーゼ複合体を活性化して、少なくとも1つのmiRNA 528核酸またはプロモーター配列のゲノム配列内の特定の部位に二本鎖切断を導入する、RNAの配列を意味する。
「プロトスペーサエレメント」 とは、ゲノムDNAの標的配列に相補的なcrRNA（あるいはsgRNA）の部分を意味し、通常は約20ヌクレオチド長である。これは、スペーサー配列または標的配列としても知られ得る。
「sgRNA」（シングルガイドRNA）とは、単一のRNA分子におけるtracrRNAとcrRNAとの組合せを意味し、好ましくはリンカーループ（tracrRNAとcrRNAを1つの分子に連結させる）も含む。「sgRNA」は「gRNA」と呼ばれることもあり、本文脈において、これらの用語は交換可能である。sgRNAまたはgRNAは、CasまたはCpf1ヌクレアーゼのために、標的特異性および足場／結合能力の両方を提供する。gRNAは、crRNA分子およびtracrRNA分子を含む二重RNA分子を指す場合がある。
「ドナー配列」とは、特定の置換または配列を標的配列に導入するために必要なすべての要素を含む核酸配列を意味し、好ましくは相同性依存修復あるいはHDR（homology-directed repair）を使用する。一実施形態では、ドナー配列は、標的配列と同一である少なくとも1つの、好ましくは左右の、アームによって隣接される。このアーム（複数可）はまた、ドナー配列がCas9/gRNAによって放出され得るように、PAMモチーフを含む2つのgRNA標的配列によってさらに隣接され得る。
「TALエフェクター」（転写活性化因子様 （TAL：transcription activator-like）エフェクター）あるいはTALEは、ゲノムDNA標的配列（例えば、miRNA 528の遺伝子もしくはプロモーターの配列内、またはLAC3もしくはLAC5におけるmiR528結合部位内の配列）に結合することができ、かつ、FokIなどのエンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合されてTALエフェクターヌクレアーゼまたはTALENSまたはメガヌクレアーゼを生成してmegaTALを創出することができるタンパク質配列を意味する。TALEタンパク質は、DNA結合を担う中央ドメイン、核局在化シグナル、および標的遺伝子の転写を活性化するドメインから構成される。DNA結合ドメインは複数の単量体からなり、各単量体は標的ヌクレオチド配列の1つのヌクレオチドに結合できる。単量体は33〜35アミノ酸のタンデム反復であり、その位置12および13に位置する2つのアミノ酸が高度に可変性である（反復可変二残基、RVD（repeat variable diresidue））。特異的ヌクレオチド1個の認識を担うのはRVDである。HDはシトシンを標的とし、NIはアデニンを標的とし、NGはチミンを標的とし、NNはグアニンを標的とする（ただし、NNはより低い特異性でアデニンにも結合し得る） 。
本発明の別の側面において、少なくとも1つのDNA結合ドメインをコードする核酸構築物が提供され、ここで、DNA結合ドメインはmiRNA 528遺伝子内の配列に結合することができ、該配列は配列番号33、36、40または43から選択される。本発明のさらなる態様においては、少なくとも1つのDNA結合ドメインをコードする核酸構築物が提供され、ここで、DNA結合ドメインはLAC3またはLAC5遺伝子内の配列に結合することができ、該配列は好ましくは配列番号51（LAC3）、54（LAC3）、57（LAC5）および60（LAC5）から選択される。
1つの実施形態において、上記構築物は、FokIなどの （SSN）配列特異的ヌクレアーゼ、またはCasもしくはCpf1タンパク質などのCRISPR酵素をコードする核酸をさらに含む。
1つの実施形態において、核酸構築物は、配列が配列番号34、37、41、44またはそのバリアントから選択される少なくとも1つのプロトスペーサーエレメントをコードする。あるいは、少なくとも1つのプロトスペーサエレメントは、配列番号52、55、58、および61またはそのバリアントから選択される。
さらなる態様において、核酸構築物は、crRNAコード配列を含む。上記で定義したように、crRNA配列は、上記で定義したプロトスペーサーエレメント、および好ましくはtracrRNAに相補的な追加的ヌクレオチドを含み得る。追加的ヌクレオチドのための適切な配列は、CasまたはCpf1タンパク質の選択によって規定されるので、当業者の知るところとなる。しかしながら、一例では、crRNAの配列または追加的ヌクレオチド配列は、配列番号48またはそのバリアントを含む。
別の実施形態では、核酸構築物は、さらに、tracrRNA配列を含む。ここでも、適切なtracrRNA配列は、Casタンパク質の選択によって規定されるので、当業者の知るところとなる。しかし一実施形態では、上記配列は、配列番号31で定義される配列またはそのバリアントを含むか、またはそれからなる。
さらなる態様において、核酸構築物は、sgRNA（あるいはgRNA）をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む。やはり既に議論したように、sgRNAは、典型的には、crRNA配列、tracrRNA配列、および好ましくはリンカーループのための配列を含む。1つの例において、sgRNA配列は、配列番号48またはそのバリアント、および好ましくは、本明細書において定義される配列のいずれかなどのプロトスペーサー配列を含む。好ましい実施形態では、核酸構築物は、配列番号35、38、42、45のいずれかに定義されるsgRNA配列またはそのバリアントをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、核酸構築物は、配列番号53、56、59および62のいずれかに定義されるsgRNA配列またはそのバリアントをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む。
さらなる態様において、核酸構築物は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位をコードする少なくとも1つの核酸配列をさらに含み得る。好ましくは、エンドリボヌクレアーゼはCsy4（別名Cas6f）である。核酸構築物が複数のsgRNA核酸配列を含む場合、構築物は、同数のエンドリボヌクレアーゼ切断部位を含み得る。別の実施形態では、切断部位はsgRNA核酸配列の5’である。従って各sgRNA核酸配列が、エンドリボヌクレアーゼ切断部位によって隣接される。
全体を通して使用される用語「バリアント」は、ヌクレオチドが上記配列の1つと実質的には同一であるヌクレオチド配列を指す。バリアントは、1以上のヌクレオチドの挿入、置換または欠失のような改変によって達成することができる。好ましい実施形態では、バリアントは、上記の配列のいずれかと少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有する。一実施形態では、配列同一性は少なくとも90%である。別の実施形態では、配列同一性は100%である。配列同一性は、当技術分野で知られる任意の配列アラインメントプログラムによって決定することができる。
本発明はまた、適切な植物プロモーターに作動可能に連結されたこれらの核酸配列の1つを含む核酸構築物に関する。適切な植物プロモーターは、構成的なまたは強力なプロモーターであってもよく、または組織特異的プロモーターであってもよい。1つの実施形態において、適切な植物プロモーターは、ケストルム黄化葉巻病ウイルス（CmYLCV）プロモーターまたはスイッチグラスユビキチン1プロモーター（PvUbi1） コムギU6 RNAポリメラーゼIII（TaU6） CaMV35S、コムギU 6またはトウモロコシユビキチン（例えばUbi1）プロモーターから選択されるがこれらに限定されない。1つの実施形態において、プロモーターはZmUbi（配列番号46）である。
本発明の核酸構築物はまた、CRISPR酵素をコードする核酸配列をさらに含み得る。「CRISPR酵素」とは、CRISPR系と会合することができるRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼを意味する。具体的には、このような酵素は、tracrRNA配列に結合する。1つの実施形態において、CRIPSR酵素は、Casタンパク質（CRISPR関連タンパク質）、好ましくはCas9またはCpf1、より好ましくはCas9である。特定の実施形態では、Cas9はコドン最適化されたCas9であり、より好ましくは、配列番号47に記載された配列またはその機能的バリアントもしくはホモログを有する。別の実施形態では、CRISPR酵素はCpf 1であり、配列番号64で定義されるCpf 1タンパク質またはその機能的バリアントもしくはホモログをコードする核酸配列を含む。より好ましくは、Cpf1配列は、配列番号63またはその機能的バリアントもしくはホモログを含むか、またはそれらからなる。別の実施形態では、CRISPR酵素は、C2c1、C2C2および／またはC2c3などのクラス2候補タンパク質のファミリーからのタンパク質である。1つの実施形態において、Casタンパク質は、Streptococcus pyogenes由来のものである。別の実施形態では、Casタンパク質は、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitides、Streptococcus thermophiles、またはTreponema denticolaのいずれか1つからのものであり得る。
Cas9またはCpf 1に関して本明細書で使用される用語「機能的バリアント」は、全長非バリアント配列の遺伝子配列の（例えばDNAエンドヌクレアーゼとして作用する）生物学的機能またはDNAに対する認識もしくは/および結合を保持する、異型のCas9またはCpf1の遺伝子配列または遺伝子配列の一部を意味する。機能的バリアントはまた、例えば非保存的残基など、機能に影響を及ぼさない配列変化を有する対象遺伝子のバリアントも含む。また、実質的に同一である、すなわち、本明細書に示される野生型配列と比較して例えば非保存的残基にいくつかの配列変異を有するだけであって生物学的に活性であるバリアントも包含される。1つの実施形態において、配列番号47または63の機能的バリアントは、配列番号47または63によって表されるアミノ酸に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の全体的な配列同一性を有する。さらなる態様において、Cas9タンパク質は、活性を改善させるために改変されている。
適切なホモログまたはオルソログは、配列比較および保存ドメインの同定により同定することができる。ホモログまたはオルソログの機能は本明細書に記載されるように同定することができ、したがって当業者は、植物において発現された場合にその機能を確認することができる。
さらなる態様において、Cas9タンパク質は、活性を改善させるために改変されている。例えば、一実施形態では、Cas9タンパク質は、D10Aアミノ酸置換を含み得、このニッカーゼは、gRNAに相補的であってgRNAによって認識されるDNA鎖のみを切断する。別の実施形態では、Cas9タンパク質は、代替的にまたは追加的に、H840Aアミノ酸置換を含み得、このニッカーゼは、sRNAと相互作用しないDNA鎖のみを切断する。この実施形態では、Cas9は、一対の（すなわち2つの）sgRNA分子（またはそのような対を発現する構築物）とともに使用され得、その結果、反対側のDNA鎖上の標的領域を切断することができ、特異性を100〜1500倍改善できる可能性がある。さらなる態様において、Cas9タンパク質は、D1135E置換を含み得る。Cas9タンパク質は、VQRバリアントであってもよい。あるいは、Casタンパク質は、両方のヌクレアーゼドメイン、すなわちHNHおよびRuvC様ドメインに突然変異を含むことによって触媒的に不活性であり得る。標的鎖を切断するかわりに、この触媒的に不活性なCasタンパク質は、sgRNA分子と共発現させた場合に、転写伸長プロセスを妨げて、不完全に翻訳されたタンパク質の機能を喪失させることに用いることができる。触媒的に不活性なタンパク質の例は、RuvCおよび／またはHNHヌクレアーゼドメインの点突然変異によって引き起こされる死んだ（dead）Cas9（dCas9）である（Komor et al., 2016およびNishida et al., 2016）。
さらなる態様において、Cas9などのCasタンパク質は、ヒストン修飾／DNAメチル化酵素などの抑制エフェクター、または、上記のように部位特異的突然変異誘発を行うためにシチジンデアミナーゼなどの塩基エディターとさらに融合され得る（Komor他）。後者では、シチジンデアミナーゼ酵素はdsDNA切断を誘導しないが、シチジンからウリジンへの変換を媒介し、それによってCからT（またはGからA）への置換を行う。
さらなる態様において、核酸構築物は、エンドリボヌクレアーゼを含む。好ましくはエンドリボヌクレアーゼはCsy4（別名Cas6f）であり、より好ましくはコドンを最適化したCsy4である。 1つの実施形態では、核酸構築物がcasタンパク質を含む場合において、核酸構築物は、Cas9などのcasタンパク質に対する5’末端P2Aフュージョン（自己切断ペプチドとして用いられる）として発現されるCsy4のような、エンドリボヌクレアーゼの発現のための配列を含み得る。
1つの実施形態において、casタンパク質、エンドリボヌクレアーゼおよび／またはエンドリボヌクレアーゼ-cas融合配列は、適切な植物プロモーターに動作可能に連結され得る。適切な植物プロモーターは既に上述したが、一実施形態ではZea Maysユビキチン1プロモーターであり得る。
CRISPRの核酸およびベクターシステムを製造するための適切な方法は公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるMolecular Plant（Ma et al., 2015, Molecular Plant, DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）に刊行されている。
発明の別の態様において、核酸構築物は、TALエフェクターをコードする少なくとも1つの核酸配列を含み、該エフェクターは、配列番号33、36、40もしくは43から選択されるmiRNA 528配列、配列番号51および54から選択されるLAC3におけるmiRNA 528結合部位、または配列番号57および60から選択されるLAC5におけるmiRNA 528結合部位を標的とする。TALエフェクターを設計する方法は、標的配列が与えられれば、当業者はよく理解しているであろう。適切な方法の例は、Sanjana et al.およびCermak T et al.に記載されており、両方とも参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、上記核酸構築物は、TALエフェクターをコードする2つの核酸配列を含んで、TALENの対を生成する。さらなる態様において、核酸構築物は、配列特異的ヌクレアーゼ（SSN：sequence-specific nuclease）をさらに含む。好ましくは、そのようなSSNは、FokIのようなエンドヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、TALENは、ゴールデンゲートクローニング法によって、単一のプラスミドまたは核酸構築物中にアセンブルされる。
本発明の別の側面において、sgRNA分子が提供され、該sgRNA分子は、crRNA配列およびtracrRNA配列を含み、crRNA配列は、配列番号33、36、40もしくは43から選択される少なくとも1つの標的配列またはそのバリアントに結合することができる。好ましくは、sgRNA分子は、配列番号35、38、42および45を含む核酸配列、ならびに配列番号72〜75から選択されるRNA配列を有する。
あるいは、sgRNA分子は、配列番号51、54、57および60から選択される少なくとも1つの標的配列に結合し得る。好ましくは、sgRNA分子は、配列番号53、56、59および62を含む核酸配列、ならびに配列番号76〜79から選択されるRNA配列を有する。
「バリアント」 は本明細書に定義される通りである。1つの実施形態において、sgRNA分子は、例えば、標的配列に対するまたはcrRNA配列とtracrRNAの安定性および／または結合親和性を高める、少なくとも1つの化学的修飾を含み得る。そのような修飾は当業者によく知られており、例えば、参照により本明細書に組み込まれるRahdar et al. 2015に記載される修飾を含むが、これらに限定されない。この例では、crRNAは、ホスホロチオエート骨格修飾、例えば、2’-フルオロ（2’-F）、2’-O-メチル（2’-O-Me）およびS-制約エチル（cET）置換を含み得る。
本発明の別の態様では、プロトスペーサーエレメント（配列番号34、37、41、44のいずれかに定義されるものまたはそのバリアント）をコードする単離された核酸配列が提供される。
本発明の別の態様では、本明細書に記載の少なくとも1つの核酸構築物でトランスフェクトされた、植物もしくはその一部、または少なくとも1つの単離された植物細胞が提供される。Cas9とsgRNAは、組み合わされてもよく、または別々の発現ベクター（または核酸構築物、そのような用語は互換的に使用される）中にあってもよい。言い換えると、1つの実施形態において、単離された植物細胞が、上記に詳細に記載されるようなsgRNAおよびCas9の両方を含む単一の核酸構築物でトランスフェクトされる。別の実施形態では、単離された植物細胞は、2つの核酸構築物、すなわち上で定義した少なくとも1つのsgRNAを含む第一の核酸構築物と、Cas9またはその機能的バリアントもしくはホモログを含む第二の核酸構築物とでトランスフェクトされる。第二の核酸構築物は、第一の核酸構築物の下、後、または第一の核酸構築物と同時にトランスフェクトされ得る。casタンパク質を含む別個の第二の構築物の利点は、少なくとも1つのsgRNAをコードする核酸構築物を、本明細書に記載される任意の型のcasタンパク質と対にすることができ、したがって（casとsgRNAとの両方が同じ核酸構築物上にコードされる場合のように）単一のcas機能に限定されないことである。
本発明の別の態様では、sgRNAおよびCas9の両方、またはsgRNA、Cas9、および上記に詳細に記載されたドナーDNA配列を含む単一の核酸構築物でトランスフェクトされた植物もしくはその一部、または少なくとも1つの単離された植物細胞が提供される。別の実施形態では、単離された植物細胞が、2つまたは3つの核酸構築物、すなわち上記で定義された少なくとも1つのsgRNAを含む第一の核酸構築物、Cas9またはその機能的バリアントもしくはホモログを含む第二の核酸構築物、および上記で定義されたドナーDNA配列を含む第三の核酸構築物でトランスフェクトされる。やはり、第二および／または第三の核酸構築物は、第一および／または第二の核酸構築物の前、後、またはそれと同時にトランスフェクトされ得る。
1つの実施形態では、CRSIPR酵素を含む核酸構築物がまず、少なくとも1つのsgRNA核酸を含む核酸構築物での第2のトランスフェクションの前にトランスフェクトされ、ゲノムに安定的に組み込まれる。別の実施形態では、植物もしくはその一部または少なくとも1つの単離された植物細胞が、Casタンパク質をコードするmRNAでトランスフェクトされ、本明細書に定義される少なくとも1つの核酸構築物で共トランスフェクトされる。
本発明で使用するためのCas9発現ベクターは、当技術分野で記述されているように構築することができる。一例において、発現ベクターは、配列番号47に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含み、該核酸配列は、適切なプロモーターに動作可能に連結されている。適切なプロモーターの例には、アクチン、CaMV35S、コムギU6またはトウモロコシのユビキチン（例えばUbi1）プロモーターが含まれる。
また、本発明の範囲には、上記の方法のいずれかにおける、上記の核酸構築物（CRISPR構築物）またはsgRNA分子の使用も含まれる。例えば、本明細書に記載されるように、miRNA 528の発現または活性を低下させるための、上記のCRISPR構築物またはsgRNA分子の使用が提供される。
従って、本発明のさらなる態様において、miRNA 528の発現および／または活性を減少させる方法が提供され、該方法は、植物に上記の構築物のいずれか1つを導入して発現させること、または上記のようなsgRNA分子を導入することを含む方法が提供される。言い換えると、本明細書に記載のようにmiRNA 528発現および／または活性を低下させる方法が提供され、該方法は、CRISPR／Cas9、特に本明細書に記載のCRISPR（核酸）構築物を用いて、内因性miRNA 528の遺伝子および／またはプロモーターあるいはLAC3および／またはLAC5遺伝子のmiRNA 528結合部位に少なくとも1つの突然変異を導入することを含む。
本発明の別の態様では、本明細書に記載される少なくとも1つのsgRNA分子でトランスフェクトされた、単離された植物細胞が提供される。
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載のトランスフェクト細胞を含む、遺伝子が改変または編集された植物が提供される。1つの実施形態において、核酸構築物（複数可）は、安定な形態で組み込まれ得る。別の実施形態では、核酸構築物（複数可）は組み込まれない（すなわち、一時的に発現される）。したがって、好ましい実施形態では、遺伝子改変植物は、sgRNAおよび／またはCas/Cpf 1タンパク質の核酸を有さない。言い換えれば、この植物はトランスジーンを有さない。
本明細書において言及される用語「導入」、「トランスフェクション」または「形質転換」は、使用される方法にかかわらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの移入を包含する。器官形成（organogenesis）によるか胚形成（embryogenesis）によるかにかかわらず、その後のクローン増殖が可能な植物組織が、本発明の遺伝子構築物で形質転換され得、そこから完全な植物が再生され得る。選択される具体的な組織は、形質転換されるその特定の種で利用可能であって最適なクローン増殖系に依存して変化する。組織標的の例としては、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根分裂組織）、および誘導された分裂組織（例えば子葉分裂組織および胚軸分裂組織）が挙げられる。次いで、得られた形質転換植物細胞を用いて、当業者に知られた方法で形質転換植物を再生することができる。植物ゲノムへの外来遺伝子の導入は形質転換とよばれる。植物の形質転換は現在多くの種で日常的な技術となっている。当業者に知られたいくつかの形質転換方法のいずれかを用いて、対象の核酸構築物またはsgRNA分子を適切な祖先細胞に導入することができる。植物組織または植物細胞からの形質転換および植物の再生について記述された方法は、一過性形質転換または安定的形質転換のために利用され得る。
形質転換方法としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離DNA取り込みを増加させる化学物質、植物へのDNAの直接注入（マイクロインジェクション）、実施例に記載されているような遺伝子銃（あるいは生物学的粒子送達システム（バイオリスティックス））、リポフェクション、ウイルスまたは花粉を用いた形質転換、およびマイクロプロジェクションが挙げられる。方法は、プロトプラストのためのカルシウム／ポリエチレングリコール法、超音波媒介遺伝子トランスフェクション、光学的またはレーザートランスフェクション、炭化ケイ素繊維を用いたトランスフェクション、プロトプラストのエレクトロポレーション、植物材料へのマイクロインジェクション、DNAまたはRNA被覆粒子射出、（非統合的）ウイルス感染などから選択することができる。Clough & Bent (1998) に記載され参照により本明細書に組み込まれるフローラルディップ／Agrobacterium真空浸潤法の使用を含むがそれに限定されない、Agrobacterium tumefaciens媒介形質転換を介してトランスジェニック植物を生産することもできる。
従って、1つの実施形態において、本明細書に記載される少なくとも1つの核酸構築物またはsgRNA分子が、上記の方法のいずれかを用いて、少なくとも1つの植物細胞に導入され得る。代替的な実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物のいずれかが、まず転写されて事前にアセンブルされたCas9-sgRNAリボヌクレオタンパク質を形成し、次いで、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションなどの上記の方法のいずれかを用いて少なくとも1つの植物細胞に送達され得る。
任意で、形質転換植物を選択するには、形質転換植物を非形質転換植物から区別できるように、原則として、形質転換で得られた植物材料を選択条件に付す。例えば、上記のようにして得られた種子を播種し、初期生育期間の後、散布等により適宜選択することができる。さらに別の可能性として、形質転換した種子だけが植物に成長できるように、適切な選択剤を用いて寒天プレート上で（適宜滅菌後に）種子を成長させることがある。実施例に記載されているように、適切なマーカーは、bar-ホスフィノスリシンまたはPPTであり得る。あるいは、限定されないが例えばGFP、GUS（β-グルクロニダーゼ）などであるが選択マーカーの存在について形質転換植物をスクリーニングする。他の例は当業者に容易に知られるであろう。あるいは、選択を行わずに、上記のようにして得られた種子を植えて育て、miRNA 528の発現、LAC3またはLAC5のタンパク質レベルまたはその結合が、当技術分野の標準的な技術を用いて適切な時期に測定される。この代替的方法は、トランスジーンの導入を回避するものであり、トランスジーンを有さない植物を生産するために好ましい。
DNAの移入および再生に続いて、例えばPCRを用いて目的遺伝子の存在、コピー数および／またはゲノム構成を検出しながら、推定上形質転換された植物を評価することもできる。それに代えてまたはそれに加えて、新規に導入されたDNAの組み込みと発現レベルを、サザン、ノザンおよび／またはウエスタン分析を用いてモニターすることができ、両方の技術は当業者によく知られている。
生成された形質転換植物は、クローン増殖または古典的育種技術などの種々の手段によって増殖させることができる。例えば、第一世代（あるいはT1）の形質転換植物を自家繁殖させ、ホモ接合性の第二世代（あるいはT2）の形質転換体を選択し、それからT2植物を古典的育種技術によってさらに繁殖させることができる。
上記のCRISPR構築物を使用するための具体的プロトコールは、当業者によく知られている。一例として、適切なプロトコールは、参照により本明細書に援用されるMa & Liu（「CRISPR/Cas-based multiplex genome editing in monocot and dicot plants」）に記述されている。
本発明のさらに関連する態様では、本明細書に記載されるような遺伝子組換え植物を得る方法が提供され、該方法は、
(a) 植物の一部分を選定すること；
(b) 上記のトランスフェクションまたは形質転換技術を用いて、(a) の植物の一部分の少なくとも1つの細胞を、本明細書に記載される少なくとも1つの核酸構築物または本明細書に記載される少なくとも1つのsgRNA分子でトランスフェクトすること；
(c) トランスフェクトされた細胞（複数可）に由来する少なくとも1つの植物を再生すること；
(d) miRNA 528の発現もしくは機能の低下、またはmiR528の結合の低下を示すラッカーゼ3もしくは5を示す、(c) に従って得られた1つ以上の植物を選択すること
を含む。
さらなる態様において、本方法は、miRNA 528の遺伝子もしくはプロモーター配列またはLAC3もしくはLAC5のmiR528結合部位におけるSSN（好ましくはCRISPR）誘導による突然変異について、遺伝子組換え植物をスクリーニングする工程も含む。1つの実施形態において、本方法は、形質転換植物からDNA試料を取得すること、および、DNA増幅を行って、少なくとも1つのmiRNA 528の遺伝子またはプロモーター配列における突然変異を検出することを含む。
さらなる実施形態では、本方法は、好ましくは（少なくとも1つのmiRNA 528の遺伝子もしくはプロモーター配列またはLAC3もしくはLAC5のmiR528結合部位における突然変異である）突然変異についてホモ接合である、安定なT2植物を生成することを含む。
少なくとも1つのmiRNA 528遺伝子配列またはLAC3もしくはLAC5のmiR528結合部位に突然変異を有する植物を、やはり少なくとも1つのmiRNA 528遺伝子またはLAC3もしくはLAC5配列のmiR528結合部位に少なくとも1つの異なる突然変異を含む別の植物と交配させて、miRNA 528遺伝子配列にさらなる突然変異を有する植物を得ることもできる。これらの組み合わせは当業者には明らかであろう。従って、この方法は、上述のように形質転換された単一のT1植物における相同体突然変異の数と比較して、全ての相同体またはより多数の相同体に突然変異を有するT2植物体を生成するために使用することができる。
上述の方法によって得られたまたは得られる植物もまた、本発明の範囲内である。
また、本発明の遺伝子改変植物は、例えば、本明細書に記載の遺伝子改変植物の花粉を使用して野生型もしくは対照植物に受粉させること、またはmiRNA 528の遺伝子もしくはプロモーター配列の少なくとも1つもしくはLAC3もしくはLAC5のmiR528結合部位に突然変異を含まない他の花粉を用いて本明細書に記載の植物の雌性生殖器に受粉させることを用いた交配により、本発明の配列のいずれかを移入することによっても得ることもできる。本発明の植物を得るための方法は、本段落に記載されたものに限定されない。たとえば、コムギの穂からの生殖細胞の遺伝学的形質転換を前述のように行うことができるが、ただしその後に植物体を再生する必要性を伴わない。
あるいは、より慣用的な突然変異誘発方法を用いて、miR528の遺伝子および／またはプロモーターまたはLAC3および／またはLAC5のmiR528結合配列に少なくとも1つの突然変異を導入することができる。これらの方法には、物理的突然変異誘発および化学的な突然変異誘発の両方が含まれる。当業者であれば、このような突然変異体を生成するためにさらなるアプローチを使用することができることを知り、そして突然変異誘発およびポリヌクレオチド改変のための方法は当技術分野においてよく知られている。例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492；Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382；米国特許第4,873,192号；Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)、およびそれらで引用されている参考文献を参照のこと。
1つの実施形態において、例えばT-DNA突然変異誘発（Agrobacterium tumefaciensのTプラスミド由来のT-DNA断片をDNAに挿入して、遺伝子機能の喪失または遺伝子機能の獲得の突然変異を引き起こす）、部位特異的ヌクレアーゼ（SDN：site-directed nuclease）または突然変異誘発因子としてのトランスポゾンを使用して、挿入突然変異誘発が使用される。挿入突然変異誘発は、遺伝子機能を破壊する代替的手段であり、目的の遺伝子への外来DNAの挿入に基づく (Krysan et al, The Plant Cell, Vol. 11, 2283-2290, December 1999参照) 。したがって、1つの実施形態において、T-DNAが挿入変異原として使用されて、miR528 aもしくはbの遺伝子もしくはmiR528プロモーターが破壊され、またはmiR528が結合できないようにLAC3および／またはLAC5のmiR528結合配列が破壊される。Arabidopsis ARE 1遺伝子を破壊するためにT-DNA突然変異誘発を使用する例がDownes et al. 2003に記載されている。T-DNAは、それが挿入される遺伝子の発現を破壊するだけでなく、突然変異をその後同定するためのマーカーとしても働く。挿入されたエレメントの配列は知られているので、種々のクローニング戦略またはPCRに基づく戦略を用いて、挿入が生じた遺伝子を回収することができる。一般に5〜25 kb程度の長さのT-DNA断片の挿入が遺伝子機能の破壊を引き起こす。もしT-DNA形質転換系統の十分に大きな集団が形成されれば、任意の目的遺伝子内にT-DNA挿入物をもつトランスジェニック植物を発見する可能性がかなり高い。T-DNAによる胞子の形質転換は、植物の細胞および組織をアグロバクテリウム細胞の懸濁液に曝露することが関わるアグロバクテリウム媒介法によって達成される。
この方法の詳細は当業者によく知られている。手短にいうと、アグロバクテリウムによる植物の形質転換は、細菌のプラスミド上にあるT-DNAとよばれる配列の、核ゲノムへの組込みをもたらす。T-DNA形質転換の利用は安定な単一挿入をもたらす。得られた形質転換系統のさらなる突然変異分析は簡単であり、個々の挿入系統のそれぞれを、挿入に隣接するDNAの直接的な配列決定および分析によって迅速に特徴づけることができる。
別の実施形態では、突然変異誘発は物理的突然変異誘発であり、例えば、紫外線、X線、ガンマ線、高速もしくは熱中性子またはプロトンの適用である。次いで標的集団をスクリーニングして、miR528結合部位に突然変異を有する植物を同定することができる。
本発明の種々の態様の別の実施形態では、本方法は、変異原を用いて植物集団に変異誘発することを含む。変異原は、速中性子照射、または化学的変異原であってもよく、例えば以下の非限定的なリストから選択される：メタンスルホン酸エチル（EMS）、メタンスルホン酸メチルメタン（MMS）、N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）、トリエチルメラミン（1'EM）、N-メチル-N-ニトロソ尿素（MNU）、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソサミン、N-メチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジン（MNNG）、ニトロソグアニジン、2-アミノプリン、7,12-ジメチルベンズ(a) アントラセン（DMBA）、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン（DEO）、ジエポキシブタン（BEB）等）、2‐メトキシ‐6‐クロロ‐9[3‐(エチル‐2‐クロロエチル)アミノプロピルアミノ]アクリジンジヒドロクロリド（ICR‐170）、又はホルムアルデヒド。この場合も、標的集団をスクリーニングして、miR528 aもしくはbの遺伝子もしくはmiR528プロモーターまたはLAC3もしくはLAC5のmiR528結合部位に突然変異を有する植物を同定することができる。
別の実施形態では、突然変異を作製および分析するために使用される方法は、targeting induced local lesions in genomes（TILLING）であり、これについてはHenikoff et al. 2004に概説されている。この方法では、例えばEMSのような化学的変異原で種子に変異誘発する。得られたM1の植物を自家受精させ、個体のM2世代を用いて変異スクリーニング用のDNA試料を調製する。DNA試料をプールし、マイクロタイタープレート上にアレイ化し、遺伝子特異的PCRに供する。PCR増幅産物は、野生型遺伝子と突然変異遺伝子の間のヘテロ二本鎖を同定する任意の方法を用いて、miR528 aもしくはbの遺伝子もしくはmiR528プロモーターまたはmiR528結合部位における突然変異についてスクリーニングすることができる。例えば、限定されるものではないが、変性高圧液体クロマトグラフィー（dHPLC：denaturing high pressure liquid chromatography）、一定変性キャピラリー電気泳動（CDCE：constant denaturant capillary electrophoresis）、温度勾配キャピラリー電気泳動（TGCE：temperature gradient capillary electrophoresis）、または化学的切断を用いる断片化によるものがある。好ましくは、野生型配列と突然変異配列との間のヘテロ二本鎖におけるミスマッチを優先的に切断するエンドヌクレアーゼと共にPCR増幅産物がインキュベートされる。切断生成物は、自動配列決定ゲル装置を用いて電気泳動され、標準的な市販の画像処理プログラムの助けを借りてゲル画像が分析される。miR528またはLAC3/LAC5に特異的な任意のプライマーを利用して、プールされたDNA試料内のmiR528またはLAC3/LAC5核酸配列を増幅し得る。ゲル上でPCR産物の検出を容易にするために、PCRプライマーは、任意の従来型標識方法を用いて標識され得る。別の実施形態では、突然変異を作成および分析するために使用される方法はEcoTILLINGである。EcoTILLINGは、TILLINGに類似する分子技術であるが、その目的が、誘発された突然変異ではなく所定の集団における自然の変異を明らかにすることである点で異なる。EcoTILLING法の最初の公表はComai et al .2004に記載された。
迅速なハイスループットスクリーニング手順はこのように、対応する非突然変異野生型植物と比較してmiR528結合への耐性または減少したmiR528発現を付与する突然変異を同定するための増幅産物の分析を可能にする。いったん目的の遺伝子に突然変異が同定されれば、その突然変異をもつM2植物の種子を成熟したM3植物へと成長させて、スクリーニングする。
miR528 aもしくはbの遺伝子、miR528プロモーター、またはLAC3および／もしくはLAC5のmiR528結合部位に突然変異を有する、このような方法によって得られたまたは得られる植物もまた、本発明の範囲内である。
さらなる態様において、本方法は、miR528阻害因子（阻害剤）を用いてmiR528の発現または活性を低下させることを含み得る。miR528阻害因子は、miR528の発現または活性を低下させることができる任意の分子である。1つの実施形態において、miR528阻害因子は、miRNA機能を抑制する核酸ベースの分子である。合成miRNA阻害剤は、成熟miRNAの逆相補体である配列を有し、さらに、RISC誘導切断を防止し、結合親和性を高め、核酸分解に対する耐性を提供するように化学的に修飾された、RNA分子を含み得る。合成miRNA阻害剤がmiRNA 528に結合する場合、その結合は非可逆的であり、したがって阻害剤は実際に内因性miRNAを隔離して、正常機能に利用できなくする（Robertsonら2010）。したがって、1つの実施形態において、miR528阻害因子は、miRNAに結合してそれを隔離することによって、miRNA 528の活性を低下させる。別の実施形態では、本明細書に記載されるように遺伝子編集を通してmiRNA発現が低下され得、そこでは、miR528単一ノックアウト植物が遺伝子編集によって生成され、次いで交配されてmiR528二重ノックアウト植物を生成する。
1つの実施形態において、miR528阻害因子は、短いタンデム標的模倣物であり、配列番号8に定義されるRNA配列または（本明細書に定義される）その機能的バリアントと、配列番号7に定義されるDNA配列または（やはり本明細書に定義される）その機能的バリアントを含む。
従って、1つの実施形態において、本方法は、配列番号7または16において定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を導入し発現させることを含む。別の実施形態では、この方法は、配列番号8で定義されるRNA分子またはその機能的バリアントを導入することを含む。
本発明の別の局面において、miR528阻害因子をコードする単離された核酸が提供され、ここで、該miR528阻害因子は、配列番号7もしくは16に定義される核酸配列または本明細書に定義されるその機能的バリアントを含む。
さらなる態様において、RNA分子を含むmiR528阻害剤が提供され、ここで、該RNA分子は、配列番号8に定義されるRNA配列またはその機能的バリアントを含む。
さらなる態様において、調節配列に動作可能に連結された上記のmiR528阻害因子をコードする核酸配列を含む、核酸構築物が提供される。
miR528阻害因子をコードする核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に作動可能に連結されたものを含む核酸構築物を発現する、単離された細胞、好ましくは植物細胞またはAgrobacterium tumefaciens細胞も提供される。さらに、本発明は、本発明の核酸構築物またはmiR528阻害因子を発現する単離された植物細胞またはAgrobacterium tumefaciens細胞を含む培地に関する。
対照または野生型植物と比較して、植物における耐倒伏性、リグニンの含有量および／または合成のうちの少なくとも1つを増加させるための、上記の単離された核酸、miR528阻害因子、核酸構築物またはベクターの使用も提供される。リグニンの含有量および／または合成は、植物の茎および／または根において増加され得る。
代替的な実施形態では、本方法は植物の耐倒伏性を低下させる―すなわち倒伏が増加される。好ましくは、この方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を減少させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を増加させることを含む。上述したように、植物がバイオエネルギー利用の材料源として使用される場合、または植物が家畜の飼料として使用される場合には、倒伏の減少が有用となり得る。バイオ燃料生産のための植物の使用はリグニンの除去を必要とし、また飼料についてはリグニンが飼料作物の消化性に影響を及ぼすので、このような植物はリグニン含有量の減少を特徴とすることが好ましい。一実施形態では、植物はトウモロコシである。
さらなる実施形態では、ラッカーゼ遺伝子はラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1に定義されるポリペプチドまたはその機能的バリアントをコードし、ラッカーゼ遺伝子5は配列番号4に定義されるポリペプチドまたはその機能的バリアントをコードする。より好ましくは、ラッカーゼ3遺伝子は、配列番号2または3に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含む。同様に、好ましい実施形態において、ラッカーゼ5遺伝子は、配列番号5または6に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含む。
1つの実施形態において、この方法は、少なくとも1つのラッカーゼの遺伝子および／またはプロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、この突然変異は、野生型対照と比較してラッカーゼ核酸の発現または活性を減少または消失させる。1つの実施形態では、発現または活性が、野生型または対照植物におけるレベルと比較した場合に、最大5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%減少し、またはそれより大きく減少する。「消失」 とは、LAC3および／またはLAC5が発現されないか、または検出可能に発現されないことを意味する。好ましい態様において、そのような突然変異は、上記のように、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入される。代替的な実施形態では、このような突然変異は、やはり上述したように、突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて導入される。そのような実施形態において、本発明は、上記のような遺伝子工学的方法によって生じた方法および植物に関するものであり、天然に存在する品種を包含しない。
別の実施形態では、本方法は、少なくとも1つのラッカーゼ核酸、好ましくはLAC3および／または5の核酸の発現を減少または消失させるためにRNA干渉を使用することを含む。例えば、本明細書中に定義されるラッカーゼ核酸の発現は、当業者に知られている多数の遺伝子サイレンシング方法を使用して低減またはサイレンシングすることができ、それには例えばLAC3および／またはLAC5に対する低分子干渉核酸（siNA：small interfering nucleic acid）の使用があるがこれに限定されない。「遺伝子サイレンシング」 とは、RNA分子によって媒介される配列特異的相互作用を介した遺伝子の発現の抑制を表すために一般に用いられる用語である。減少の程度は、コードされた遺伝子産物の産生を完全になくす程度であり得るが、より一般的には、発現の消失は部分的であり、ある程度の発現が残っている。したがって、この用語は、発現の完全な「サイレンシング」を要すると解するべきではない。
1つの実施形態において、siNAは、RNA干渉を媒介することができる短干渉RNA（siRNA：short interfering RNA）、二本鎖RNA（dsRNA：double-stranded RNA）、マイクロRNA（miRNA：micro-RNA）、アンタゴミル（antagomir）および短ヘアピンRNA（shRNA：short hairpin RNA）を含み得る。
発現および／または活性の阻害は、当業者によく知られた技術（例えばノザンブロット法、RT-PCRなど）を用いてラッカーゼ3および／または5の転写物の存在および／または量を決定することによって測定することができる。
内因性の植物遺伝子を抑制するためにトランスジーンが使用され得る。このことは、ペチュニアにおいてカルコンシンターゼのトランスジーンが内因性カルコンシンターゼ遺伝子の抑制を引き起こしたときに最初に発見され、容易に見ることができる色素変化によって示された。その後、全てではないにしてもいかに多くの植物遺伝子がトランスジーンによって 「サイレンシング」され得るかが記述されてきた。遺伝子サイレンシングは、トランスジーンと、サイレンシングされる遺伝子との間の配列類似性を必要とする。この配列相同性は、サイレンシングされる標的遺伝子のプロモーター領域またはコード領域を含み得る。コード領域が関与する場合、遺伝子サイレンシングを引き起こすことができるトランスジーンは、コード配列RNAをセンスまたはアンチセンスのどちらかの方向に転写するプロモーターを伴って構築されたものであり得る。遺伝子サイレンシングの様々な例には、よく理解されていない異なる機序がおそらく関与している。異なる例において、転写の遺伝子サイレンシングまたは転写後の遺伝子サイレンシングがあり得、両方が本発明の方法に従って使用され得る。
遺伝子サイレンシングの機序と遺伝子工学におけるそれらの応用は、1990年代初期に植物で最初に発見されその後Caenorhabditis elegansで示されたが、文献で詳しく記述されている。
本発明の方法によるRNA媒介性遺伝子抑制またはRNAサイレンシングは、共抑制（co-suppression）を含み、これは、標的のセンスRNAまたはmRNA、すなわちラッカーゼ3および／または5のセンスRNAまたはmRNAの過剰発現が、関連遺伝子の発現レベルの低下をもたらすものである。トランスジーンと相同的内因性遺伝子のRNAが、協調的に抑制される。本発明の方法において使用される他の技術は、植物における内因性標的遺伝子の転写物レベルを減少させるアンチセンスRNAを含む。この方法では、RNAサイレンシングは、遺伝子座の転写には影響を及ぼさず、標的mRNAの配列特異的分解を引き起こすだけである。「アンチセンス」 核酸配列は、ラッカーゼタンパク質またはその一部をコードする「センス」核酸配列に相補的である、すなわち二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的であるかまたはmRNA転写物配列に相補的である、ヌクレオチド配列を含む。アンチセンス核酸配列は、サイレンシングされる内因性ラッカーゼ遺伝子に相補的であることが好ましい。相補性は、遺伝子の「コード領域」および／または「非コード領域」に位置し得る。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。用語「非コード領域」は、転写されるがアミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する5'および3'配列を指す（5'および3'非翻訳領域とも呼ばれる）。
アンチセンス核酸配列は、ワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸配列は、本明細書中で定義されるラッカーゼ3または5の核酸配列全体に相補的であり得るが、その核酸配列の一部のみ（mRNAの5'と3' UTRを含む）に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするmRNA転写物の翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。適切なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の長さは当技術分野で知られており、長さ約50、45、40、35、30、25、20、15または10ヌクレオチドまたはそれ以下から開始することができる。本発明によるアンチセンス核酸配列は、当技術分野で知られた方法を用いた化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸配列（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列）は、天然ヌクレオチドを使用して、または、分子の生物学的安定性を増加させるため、もしくはアンチセンスとセンスの核酸配列間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるために設計された様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸配列を生成するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例は、当技術分野においてよく知られている。アンチセンス核酸配列は、核酸配列がアンチセンス方向でサブクローニングされた（すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAが、対象の標的核酸に対してアンチセンス方向となる）発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る。好ましくは、植物におけるアンチセンス核酸配列の産生は、プロモーター、作動可能に連結されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびターミネーターを含む、安定に組み込まれた核酸構築物によって行われる。
本発明の方法におけるサイレンシングに使用される核酸分子は、mRNA転写物とハイブリダイズもしくは結合し、および／またはポリペプチドをコードするゲノムDNAに挿入し、それによって、例えば転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるもの、または、例えばDNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸配列の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介したものであり得る。アンチセンス核酸配列は、形質転換または特定の組織部位への直接注射によって植物に導入され得る。あるいは、選択された細胞を標的とするようにアンチセンス核酸配列を修飾して、次いで全身的に（systemically）投与してもよい。例えば、全身投与のためにアンチセンス核酸配列は、選択された細胞の表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するように、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸配列を連結することによって、修飾され得る。ベクターを用いてアンチセンス核酸配列を細胞に送達することもできる。
RNA干渉（RNAi）は、本発明の方法に従って使用され得るもう１つの転写後遺伝子サイレンシング現象である。これは二本鎖RNAによって誘導され、そのdsRNAと相同的なmRNAが特異的に分解される。これは、短い干渉RNA（siRNA）により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。RNAiの過程は、酵素DICERがdsRNAに遭遇し、それを小干渉RNA（siRNA）と呼ばれる断片に切断することから始まる。この酵素はRNase IIIヌクレアーゼファミリーに属する。タンパク質の複合体がこれらのRNA残余物を集めとり、そのコードをガイドとして用いて、標的mRNAのようなマッチする配列をもつ細胞内のRNAを探し出して破壊する。
人工および／または天然マイクロRNA（miRNA）を用いて、遺伝子発現および／またはmRNA翻訳をノックアウトすることができる。マイクロRNA（miRNA）miRNAは、典型的には19〜24ヌクレオチド長であり典型的には一本鎖である小さなRNAである。ほとんどの植物miRNAは、標的配列と完全なまたはほぼ完全な相補性を有する。しかし、最大5つのミスマッチを持つ天然ターゲットが存在する。これらは、Dicerファミリーの二本鎖特異的RNaseによって、特徴的な折り返し構造をもつ長い非コードRNAからプロセシングされる。プロセシングに際してそれらは、RNA誘導性サイレンシング複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）の主成分であるArgonaute蛋白質に結合することによりRISCに組み込まれる。miRNAは細胞質において核酸（大部分はmRNA）を標的とする塩基対を形成するので、RISCの特異性成分として作用する。その後の調節イベントには、標的mRNAの切断と破壊および／または翻訳阻害が含まれる。従ってmiRNA過剰発現の影響は、多くの場合、標的遺伝子のmRNAレベルの低下として反映される。人工マイクロRNA（amiRNA：artificial microRNA）技術がArabidopsis thalianaおよび他の植物に適用され、目的の標的遺伝子が効率的にサイレンシングされてきた。amiRNAについての設計原理は一般化されてウェブベースのツールに組み込まれている（http://wmd.weigelworld.org）。
従って、本発明の種々の態様によれば、ラッカーゼ核酸配列の発現を標的とし、遺伝子の発現またはその転写物の安定性を選択的に減少または阻害するように設計されたRNAi、shRNA、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、amiRNAまたは共抑制分子を導入するように植物を形質転換し得る。好ましくは、本発明の種々の態様に従って使用されるRNAi、snRNA、dsRNA、shRNA siRNA、miRNA、amiRNA、ta-siRNAまたは共抑制分子は、少なくとも17 nt、好ましくは22〜26 ntの断片を含み、配列番号2、3、5または6のいずれかに示される情報に基づいて設計することができる。効果的なsiRNAを設計するためのガイドラインは当業者に知られている。簡単に説明すると、標的遺伝子配列の短い断片（例えば、19〜40ヌクレオチド長）が、本発明のsiRNAの標的配列として選択される。標的遺伝子配列の短い断片は標的遺伝子mRNAの断片である。好ましい実施形態において、標的遺伝子mRNAからsiRNA分子候補として配列断片を選択するための基準は、1) 天然mRNA分子の5’または3’末端から少なくとも50〜100ヌクレオチドにある、標的遺伝子mRNA由来の配列、2) G/C含有量が30%〜70%、最も好ましくは約50%である標的遺伝子mRNA由来の配列、3) 反復配列（例えばAAA、CCC、GGG、TTT、AAAA、CCCC、GGGG、TTTT）を含有しない標的遺伝子mRNA由来の配列、4) mRNAにおいてアクセス可能な標的遺伝子mRNA由来の配列、5) 標的遺伝子に特有である、標的遺伝子mRNA由来の配列、6) 開始コドンから75塩基以内の領域は回避すること、を含む。標的遺伝子mRNA由来の配列断片は、上記で同定された基準の1つ以上を満たし得る。選択された遺伝子は、ヌクレオチド配列として、最適なオリゴヌクレオチドの設計のために上述の全ての変数を考慮する予測プログラムに導入される。このプログラムは、siRNAによって標的化されやすい領域についてmRNAヌクレオチド配列をスキャンする。この分析の結果物は、可能性のあるsiRNAオリゴヌクレオチドのスコアである。最も高いスコアが、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられ、それは典型的には化学合成によって作られる。mRNA標的領域に相補的なsiRNAに加えて、縮重siRNA配列を使用して相同領域を標的化することができる。本発明によるsiRNAは、当技術分野で知られる任意の方法によって合成することができる。RNAは、好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび従来型のDNA/RNA合成装置を用いて化学的に合成される。さらに、siRNAは、商業的なRNAオリゴヌクレオチド合成業者から入手することもできる。
本発明の態様によるsiRNA分子は、二本鎖であってもよい。一実施形態において、二本鎖siRNA分子は平滑末端を含む。別の実施形態では、二本鎖siRNA分子は、オーバーハングしたヌクレオチド（例えば1〜5ヌクレオチドオーバーハング、好ましくは2ヌクレオチドオーバーハング）を含む。いくつかの実施形態において、siRNAは、短いヘアピンRNA（shRNA）であり、siRNA分子の2本の鎖がリンカー領域（例えば、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー）によって接続され得る。本発明のsiRNAは、1以上の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル連結を含み得る。当技術分野でよく知られている化学修飾は、siRNAの安定性、利用可能性、および／または細胞取り込みを増加させることができる。当業者は、RNA分子に組み込まれ得る他のタイプの化学修飾を認識するであろう。
別の代替的な実施形態では、本方法は、配列番号10で定義されるmiRNAまたはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードする少なくとも1つの核酸を含む、核酸構築物を導入し発現させることを含む。好ましくは、核酸構築物は、少なくとも1つの核酸配列を含み、その核酸配列は配列番号9、32または39から選択される。別の実施形態では、核酸構築物は、配列番号32および39から選択される2つの核酸配列を含む。好ましくは、その核酸配列または複数の核酸配列の各々が、プロモーターなどの調節配列に作動可能に連結されている。適切なプロモーター配列の例は当業者に知られているが、上記にも記載されている。
さらなる代替実施形態では、本方法は、配列番号9を含むmiR528またはその機能的バリアントを導入することを含む。
本発明の別の態様では、遺伝子改変植物、その一部分、または植物細胞が提供され、該植物は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルの改変、および／またはmiR528の発現もしくは活性の改変によって特徴づけられるものである。好ましくは、該植物は、改変されたリグニン含有量によっても特徴付けられ得る。やはり、上述したように、「改変」は、増加または減少であると考えることができる。
1つの実施形態において、該植物は、上記のように、野生型または対照植物と比較して、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の増加および／またはmiR528の発現もしくは活性の減少によって特徴付けられる。
1つの実施形態において、該植物は、植物個体にとって「外因性」または「内因性」であるポリヌクレオチドを発現し、それは、性交配以外の手段によってその植物に導入されるポリヌクレオチドである。これを達成することができる手段の例は以下に記述される。1つの実施形態では、外因性核酸が植物において発現され、これは、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードする核酸、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードする核酸を含む核酸構築物であり、どちらのラッカーゼ配列も調節配列に動作可能に連結されている。
好ましくは、ラッカーゼ3をコードする核酸は、配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、そして好ましくは、ラッカーゼ5をコードする核酸は、配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含む。
別の実施形態では、植物はmiR528阻害因子を発現する。具体的には、一例において、植物は、配列番号7もしくは16に定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を発現し得る。調節配列は上述した。別の例において、miR528阻害因子は、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである。
別の実施形態では、植物は、ラッカーゼ核酸をコードする少なくとも1つの核酸における少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは、そのラッカーゼ核酸はラッカーゼ3および5から選択され、突然変異はmiR528結合部位にある。一実施形態では、突然変異がLAC3およびLAC5 miR528結合部位の両方に導入される。変異は、上記の変異誘発方法のいずれかを用いて導入することができる。
LAC3におけるmiR528結合部位は以下の通りである:
CUCUGCUGCAUGCCCCUUCGA (配列番号20)
LAC5におけるmiR528結合部位は以下の通りである:
CUUCUCCGCAUGUCCCUUCCU (配列番号21)
好ましくは、突然変異は、LAC3および／またはLAC5へのmiR528の結合を妨げる突然変異である。一例において、該突然変異は、上述の配列番号20および／または21における1つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、および置換から選択され得る。一例において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチドが欠失または挿入される。
さらなる代替的な実施形態において、植物は、miR528の発現が減少または消失するように、miR528 aおよび／またはbの遺伝子、またはmiR528プロモーターにおける少なくとも1つの突然変異を含む。やはり、突然変異は、上記の突然変異誘発方法のいずれかを使用して導入され得る。
本発明の別の態様では、野生型または対照植物と比較して、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の減少および／またはmiR528の発現もしくは活性の増加によって特徴づけられる、遺伝子改変植物が提供される。
本発明の別の態様においては、植物の耐倒伏性が改変された植物を製造する方法が提供され、該方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む。好ましくは、該植物はまた、野生型または対照植物と比較して改変されたリグニン含有量を有する。
好ましい態様において、該植物は、植物の倒伏に対する抵抗性が増加されており、該方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む。好ましくは、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させる工程は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入して発現させる工程を含み、この核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは相同体をコードする。
別の実施形態では、miR528の活性を低下させることは、miR528阻害因子を含む核酸構築物を植物に導入して発現させること、またはmiR528阻害因子を植物に発現させることを含む。好ましい実施形態では、核酸構築物は、miR528阻害因子をコードする核酸配列を含み、miR528阻害因子の配列は配列番号7または16に定義されるか、またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものである。調節配列は上述した。別の好ましい態様において、miR528阻害因子は、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである。
本発明のトランスジェニック植物を作製するための形質転換方法は当技術分野で公知である。したがって、本発明の種々の態様によれば、本明細書に記載された任意の核酸構築物が植物に導入され、トランスジーンとして発現される。核酸構築物は、形質転換（トランスフォーメーション）と呼ばれるプロセスによって上記植物に導入される。本明細書において言及される用語「導入」または「形質転換」は、移入のために使用される方法に関係なく、宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを移入することを包含する。器官形成によるか胚形成によるかにかかわらず、その後のクローン増殖が可能な植物組織が、本発明の遺伝子構築物で形質転換され得、そこから完全な植物が再生され得る。選択される具体的な組織は、形質転換されるその特定の種で利用可能であって最適なクローン増殖系に依存して変化する。組織標的の例としては、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根分裂組織）、および誘導された分裂組織（例えば子葉分裂組織および胚軸分裂組織）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、一時的にまたは安定して宿主細胞に導入することができ、例えばプラスミドとして、非組込み状態で維持され得る。あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。次いで、得られた形質転換植物細胞を用いて、当業者に知られる方法で形質転換植物体を再生することができる。
植物の形質転換は現在では多くの種で日常的な技術となっている。有利なことに、いくつかの形質転換方法のいずれかを使用して、目的の遺伝子を適切な祖先細胞に導入することができる。植物組織または植物細胞からの植物の形質転換および再生のために記述された方法は、一過性または安定な形質転換のために利用され得る。形質転換法としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離DNA取り込みを増加させる化学物質、植物へのDNAの直接注入、粒子銃射出、およびウイルスまたは花粉を用いた形質転換、およびマイクロインジェクションが挙げられる。方法は、プロトプラストのためのカルシウム／ポリエチレングリコール法、プロトプラストのエレクトロポレーション、植物材料へのマイクロインジェクション、DNAまたはRNA被覆粒子射出、（非統合的）ウイルス感染などから選択することができる。トランスジェニック作物植物を含むトランスジェニック植物は、好ましくはAgrobacterium tumefaciens媒介形質転換を介して生産される。
形質転換植物を選抜するためには、形質転換で得られた植物材料を選択条件にかけて、形質転換植物を非形質転換植物から区別できるようにする。例えば、上記のようにして得られた種子を植えて、初期生育期間の後、散布により適切な選抜に付すことができる。さらに別の可能性として、適切な選択剤を用いた寒天プレート上で（もし適切であれば滅菌後の）種子を成長させて、形質転換した種子だけが植物体に成長できるようにすることがある。あるいは、形質転換植物を選択マーカーの存在についてスクリーニングする。DNAの移入および再生に続いて、推定上形質転換された植物を、例えばサザンブロット分析を用いて、目的の遺伝子の存在、コピー数および／またはゲノム構成について評価することもできる。それに代えてまたはそれに加えて、ノザンブロット分析および／またはウェスタンブロット分析を用いて、新たに導入されたDNAの発現レベルをモニターすることができ、両方の技術は当業者によく知られている。
生成された形質転換植物は、クローン増殖または古典的育種技術などの種々の手段によって増殖させることができる。例えば、第一世代（あるいはT1）の形質転換植物を自家繁殖させ、ホモ接合性の第二世代（あるいはT2）の形質転換体を選択し、次いで、それらT2植物を古典的育種技術によってさらに繁殖させることができる。産生された形質転換生物体はさまざまな形態をとり得る。例えば、それらは、形質転換細胞と非形質転換細胞とのキメラ；クローン形質転換体（例えば、全ての細胞が発現カセットを含むように形質転換されている）；形質転換組織および非形質転換組織の接ぎ木（たとえば、植物において、形質転換した台木が形質転換していない穂木に接ぎ木される）であり得る。
本方法は、さらに、植物または植物細胞から、配列番号2、3、5、6および7から選択される核酸配列または配列番号1もしくは4で定義されるラッカーゼタンパク質をコードする核酸をゲノム中に含むトランスジェニック植物を再生すること、ならびに、該トランスジェニック植物に由来する子孫植物を得ることを含み、該子孫は、耐倒伏性、リグニン含有量、および収量のうちの少なくとも1つの増加を示す。
本発明の別の態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変植物を生産する方法が提供される。1つの実施形態において、本方法は、上記のように、好ましくは少なくとも1つの植物細胞の少なくとも1つのLAC3および／またはLAC5核酸のmiR528結合部位に、本明細書に記載された任意の突然変異誘発技術を用いて、少なくとも1つの突然変異を導入することを含む。好ましくは、上記方法は、変異された植物細胞から植物体を再生することをさらに含む。
したがって、一実施形態では、方法は、
(a) 植物の一部分を選定すること；
(b) 上記(a)の植物の一部分の少なくとも1つの細胞を、本明細書に記載される少なくとも1つの核酸構築物またはmiR528阻害因子でトランスフェクトすること、または
(c) トランスフェクトされた細胞（複数可）に由来する少なくとも1つの植物を再生すること；
(d) 上記(c) に従って得られ、LAC3および／またはLAC5の発現の増加、またはmiR528活性の低下を示す、1つ以上の植物を選択すること
を含む。
本方法は、好ましくはさらなる増殖のために、1つ以上の突然変異した植物細胞または植物体を選択することをさらに含むことができる。好ましくは、上記選択された植物は、少なくとも1つのLAC3および／またはLAC5核酸のmiR528結合部位において少なくとも1つの突然変異を含む。一実施形態では、上記植物は、耐倒伏性レベルの増加（あるいは倒伏の減少）、または好ましくは茎および／または根におけるリグニン含有量レベルの増加によって特徴付けられる。
選択された植物は、クローン増殖または古典的育種技術などの種々の手段によって増殖され得る。例えば、第一世代（あるいはT1）の形質転換植物を自家繁殖させ、ホモ接合性の第二世代（あるいはT2）の形質転換体を選択し、次いで、それらT2植物を古典的育種技術によってさらに繁殖させることができる。産生された形質転換生物体はさまざまな形態をとり得る。例えば、それらは、形質転換細胞と非形質転換細胞とのキメラ；クローン形質転換体（例えば、全ての細胞が発現カセットを含むように形質転換されている）；形質転換組織および非形質転換組織の接ぎ木（たとえば、植物において、形質転換した台木が形質転換していない穂木に接ぎ木される）であり得る。
本願明細書に記載されるいずれかの方法のさらなる実施形態において、本方法は、上記のように耐倒伏性、リグニン含有量、外皮貫通抵抗性、およびセルロース/ヘミセルロース含有量の増加のうちの少なくとも1つを測定して、トランスジェニックまたは遺伝子改変植物の表現型を評価する工程のうちの少なくとも1つ以上をさらに含むことができる。換言すれば、本方法は、所望の表現型について植物をスクリーニングする工程を含むことができる。
本発明のさらなる態様では、上記の方法によって得られたまたは得られる植物が提供される。
本発明のさらなる最終側面では、植物の集団をスクリーニングして、ラッカーゼ3および／または5の発現の増加、および／またはmiR528の発現／活性の低下、および／またはラッカーゼ3および／または5のmiR528結合部位における突然変異を有する植物を同定および／または選択する方法が提供される。このような植物は、野生型または対照植物と比較して、リグニン含有量が増加し、したがって、耐倒伏性のレベルが増加する。上述したように、栽培期に倒伏の条件が発生しない限り、ある品種が倒伏に抵抗性であるか否かを育種家、農家、作物試験者等が判断することは困難であるため、このようなスクリーニング方法は特に有用である。このように、個々の植物または品種を植える前にそれが耐倒伏性であるかどうかを決定できることは、著しい経済的利益をもたらす可能性がある。
特に、本方法は、ラッカーゼ3および／または5の遺伝子および／またはプロモーターにおける少なくとも1つの多型または突然変異を検出することを含むことができ、そのような突然変異はラッカーゼ3および／または5の発現レベルの増加をもたらし、または、そのような突然変異はmiR528結合部位に存在することによりラッカーゼ3および／または5へのmiR528の結合を妨げる。発現の増加またはmiR528結合の減少は、その突然変異を持っていない植物のものと比較した相対的なものであり得る。そのような植物を用いて、スクリーニングされる植物においてレベルを比較することができる閾値を決定することができる。あるいは、本方法は、miR528の発現を減少もしくは消失させるかまたはmiR528がその標的―つまりラッカーゼ3および／またはラッカーゼ5に結合できなくするような、miR528 aおよび／またはbの遺伝子および／またはそのプロモーターにおける少なくとも1つの多型または突然変異を検出することを含むことができる。ここでも、発現または活性のレベルは、突然変異を保有しない植物と比較した相対的なものであり得る。突然変異は、少なくとも1つの付加、置換または欠失であり得る。
多型または突然変異の存在を評価するための適切な試験は、当業者によく知られており、アイソザイム電気泳動、制限断片長多型（RFLP：Restriction Fragment Length Polymorphism）、ランダム増幅多型DNA（RAPD：Randomly Amplified Polymorphic DNA）、不定プライム化ポリメラーゼ連鎖反応（AP-PCR：Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction）、DNA増幅フィンガープリント法（DAF：DNA Amplification Fingerprinting）、配列特性化増幅領域（SCAR：Sequence Characterized Amplified Regions）、増幅断片長多型（AFLP：Amplified Fragment Length polymorphism）、単純反復配列（SSR：Simple Sequence Repeat；マイクロサテライトとも呼ばれる）、および一塩基多型（SNP：Single Nucleotide Polymorphism）を含むがこれらに限定されない。1つの実施形態において、コンペティティブ・アリル特異的PCR（KASP：Kompetitive Allele Specific PCR）遺伝子型タイピングが使用される。
一実施形態では、方法は、
a) 植物から核酸サンプルを得ること、および
b) 1つ以上のプライマー対を用いて、1つ以上のラッカーゼ3遺伝子および／またはプロモーター、ラッカーゼ5遺伝子および／またはプロモーター、またはmiR528 aおよび／またはbの遺伝子および／またはプロモーターのアリルの核酸増幅を行うこと
を含む。
さらなる態様において、本方法は、さらに、上記高いラッカーゼ3もしくはラッカーゼ5または低いmiR528発現／活性の多型のうちの少なくとも1つを含む染色体領域を、第2の植物または植物生殖質に移入交雑（introgress）させて、移入交雑された植物または植物生殖質を生成することを含み得る。好ましくは、ラッカーゼ3もしくはラッカーゼ5の発現もしくは活性が増加されるか、または上記第2の植物におけるmiR528の発現もしくは活性が減少もしくは消失され（対照植物または野生型植物と比較して）、より好ましくは、上記第2の植物は、上述したように耐倒伏性の変化を示す。
本発明のさらなる態様において、植物の耐倒伏性を変化させる、好ましくは増加させる方法が提供され、該方法は、
a) 上記の多型または突然変異の少なくとも1つを有する少なくとも1つの植物について、植物集団をスクリーニングすること；
b) 本願明細書に記載されるいずれかの方法によってラッカーゼ3および／または5の発現をさらに増加させるか、または本願明細書に記載されるいずれかの方法によって少なくとも1つのmiR528核酸の発現もしくは活性をさらに減少もしくは消失させること
を含む。
「さらに増加させること」または「さらに減少させること」 は、発現または活性のレベルを、上記の多型のうちの少なくとも1つを有する植物におけるレベルよりもそれぞれ高いまたは低いレベルまで増加または減少させることを意味する。そのような発現および／または活性の増加または減少は、対照植物におけるレベルと比較して10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%にも至り得る。
本明細書に記載される本発明の全ての態様による植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得る。好ましくは、植物は、作物植物またはイネ科植物である。作物植物とは、人間又は動物の消費又は使用のために商業規模で栽培される植物を意味する。好ましい態様において、植物は穀物である。
好ましい態様において、植物はトウモロコシである。一例において、トウモロコシは、「トウモロコシ品種zong 31」または「トウモロコシB73」であり得る。「トウモロコシ品種Zong 31」については、Yang Hui, Wang Guoying, Dai Jingrui, Research on the transformation of elite maize inbred lines Zong 3 and 31, Journal of Agricultural Biotechnology, 2001, No. 04を参照されたい。「トウモロコシB73」については、Gong Fuquan, Li Pinghua, Cloning of pyruvate phosphate dikinase gene in maize inbred line B73 and the effect of low nitrogen on the expression of PPDK, Journal of Tropical Biology, 2014, No. 4を参照されたい。
本明細書中で使用される用語「植物」は、完全な植物体、植物体の祖先および子孫、ならびに、種子、果実、シュート、茎、葉、根（塊茎を含む）、花、組織および器官を含む植物部分を包含し、ここで、上記のそれぞれが、本明細書中に記載される核酸構築物を含むか、または本明細書中に記載される突然変異を有する。用語「植物」はまた、植物の細胞、懸濁培養物、カルス組織、胚、分裂組織領域、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を包含し、やはり上記のそれぞれが、本明細書中に記載される核酸構築物または突然変異を含む。1つの例に限り、植物細胞は光合成ができない細胞である。たとえば、植物細胞は葉緑体を欠き得る。細胞はまた、葉ディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、巨大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば頂端分裂組織、腋芽、根分裂組織）、および誘導分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）を含む組織型のうちの1つからのものであり得る。
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の植物の収穫可能な部分にも及ぶが、種子、葉、果実、花、茎、根、根茎、塊茎および球根に限定されない。本発明の態様はまた、乾燥ペレットもしくは粉末、油、脂肪および脂肪酸、デンプンまたはタンパク質のような、そのような植物の収穫可能な部分に由来する、好ましくは直接的に由来する、製品にも及ぶ。本発明の植物の収穫可能な部分に由来し得る別の産物は、バイオディーゼルである。本発明はまた、本発明の植物またはその一部分を含む食品および食品サプリメントに関する。一実施形態では、食品は動物飼料であり得る。本発明のもう一つの側面では、本明細書に記載される植物またはその一部に由来する製品が提供される。
最も好ましい実施形態では、植物部分または収穫可能な産物は、種子または穀物である。従って、本発明のさらなる態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変植物から生産される種子が提供される。
別の実施形態では、植物部分は、本明細書に記載の遺伝子改変植物の花粉、繁殖体または子孫である。従って、本発明のさらなる態様では、本明細書に記載されるような遺伝子改変植物から産生される花粉、繁殖体または子孫が提供される。
本発明の全ての態様に従って本明細書で使用される対照植物は、本発明の当該方法に従って改変されていない植物である。したがって、1つの実施形態において、対照植物は、上記のように少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルが改変されていない、および／またはmiR528の発現もしくは活性が改変されていない。代替的な実施形態では、その植物は、上述のように遺伝子改変されていない。一実施形態では、対照植物は野生型植物である。対照植物は典型的には、改変植物と同じ植物種であり、好ましくは同じ遺伝学的バックグラウンドを有する。
以上の開示は、本発明の範囲内に包含される主題の一般的な説明を提供し、本発明を製造および使用する方法およびその最良の態様を含むが、当業者が本発明をさらに実施できるようにし、書面によるその完全な説明を提供するために、以下の実施例が提供される。しかし、当業者であれば、これらの実施例の詳細は本発明を限定するものと解釈すべきではなく、本発明の範囲は本開示に添付された特許請求の範囲およびその均等物から理解されるべきであることを理解するであろう。本開示を考慮すれば、本発明の種々のさらなる態様および実施形態が当業者には明らかであろう。
「および／または」は、本明細書で使用される場合、その2つの特定された特徴または構成要素のそれぞれの、他方を伴うまたは伴わない、具体的な開示と解される。例えば、「Aおよび／またはB」は、それらが本明細書に個別に記載されている場合と同じように、(i) A、(ii) B、ならびに (iii) AおよびB、の各々の具体的な開示として解釈されるべきである。
文脈上別段の指示がない限り、上述した特徴の説明および定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されず、記述される全ての態様および実施形態に等しく適用される。
前述の出願、およびそこで引用された、またはその出願中に引用された、すべての文献および配列アクセス番号（「出願引用文献」）および出願引用文献で引用または参照されたすべての文献、ならびに本明細書で引用または参照されたすべての文献（「本明細書引用文献」）および本明細書引用文献で引用または参照されたすべての文献は、本明細書または参照により本明細書に組み入れられる文献に言及される製品についての製造会社説明書、説明書、製品仕様書、および製品シートとともに、参照により本明細書に組み入れられ、本発明の実施に利用され得る。より具体的には、すべての参照文書は、個々の文書の各々が参照によって援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照によって援用される。
次に、以下の非限定的な実施例にて本発明を説明する。
実施例１：過剰発現植物の生産および同定
Ｉ．組換えプラスミドの構築
１．トウモロコシB73から全RNAを抽出し、逆転写してcDNAを得た。
２．ステップ1で得られたcDNAを鋳型として、F1とR1からなるプライマー対を用いてPCR増幅を行い、PCR増幅産物を得た。PCR増幅産物は、配列番号12に示される配列を有するように配列決定された。
F1（配列番号22）： 5’-GACTCTAGAGGATCCATGCCCCTTCGACAACGTC-3’；および
R1（配列番号23）： 5’-GGTACCCGGGGATCCTCAGCACTTGGGCATGTTAGG-3’。
３．pCUBベクターを制限エンドヌクレアーゼBamHIにより酵素的に切断し、線形化ベクターを得た。
４．ステップ3で得られた線形化ベクターを、ステップ2で得られたPCR増幅産物と共に、In-Fusionベースの相同組換に供して、組換えプラスミドpCUB-ZmMZSを得た。配列決定後、組換えプラスミドpCUB-ZmMZSは、配列番号3に示す配列を有するDNA分子がpCUBベクターのBamHI切断部位に挿入された構造を有することが判明した。
ＩＩ．トランスジェニック植物の生産
トウモロコシ品種Zong 31を出発植物として用いた。トウモロコシ品種Zong 31は野生型植物としても知られており、図ではWTによって示されている。
組換えプラスミドpCUB‐ZmMZSで出発植物を形質転換し、T0世代のトランスジェニック植物を得た。T0世代のトランスジェニック植物を同系交配させてT1世代の植物を得た。さらにT1世代の植物を同系交配させてT2世代の植物を得た。T2世代で得られたホモ接合性トランスジェニック系統を、ZmMZS遺伝子過剰発現系統と命名した。ZmMZS遺伝子を過剰発現する2系統（系統#3および#4）を無作為に選択し、その後の試験に用いた。
pCUBベクターで出発植物を形質転換し、T0世代のトランスジェニック植物を得た。T0世代のトランスジェニック植物を同系交配させてT1世代の植物を得た。さらにT1世代の植物を同系交配させてT2世代の植物を得た。T2世代で得られたホモ接合性トランスジェニック系統を、空ベクター形質転換系統と命名した。
ＩＩＩ．リアルタイム蛍光定量PCRによる検出
試験植物は、系統#3のT2世代の植物、系統#4のT2世代の植物、および出発植物であった。
各系統3個の植物体を使用し、結果を平均した。
水耕栽培条件下で7日間（発芽日から）生育させた試験植物の葉から全RNAを抽出し、F2とR2からなるプライマー対を用いてPCR増幅を行って、ZmMZS遺伝子の相対的発現レベルを同定した。Ubi遺伝子を内部基準遺伝子として用いた（内部基準遺伝子を同定するためのプライマー対はF3とR3からなるものであった）。
F2（配列番号24）： 5’-GCGTGTTGTTGTTAGCATTTGG-3’；
R2（配列番号25）： 5’-GGGTGATGTTCTTGTAGCCCTG-3’。
F3（配列番号26）： 5’-GCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3’；
R3（配列番号27）： 5’-CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3’。
結果を図1に示す。野生型植物と比較して、系統#3および#4の植物におけるZmMZS遺伝子の相対的発現レベルは著しく増加している。
ＩＶ．組織化学的染色
試験植物は、系統#3のT2世代の植物、系統#4のT2世代の植物、空ベクター形質転換系統のT2世代の植物ｍおよび出発植物であった。
水耕栽培条件下で30日間（発芽日から）生育させた試験植物の、第1節間、葉、および根の成熟領域をスライスし（スライスの厚さは50μmであった）、5%フロログルシンで2分間染色し、塩酸1滴を加え、顕微鏡下で観察した。
根の顕微鏡写真を図2Aに示す（スケールバーは75μm）。
葉の顕微鏡写真を図2Bに示す（スケールバーは75μm）。
第1節間の顕微鏡写真を図2Cに示す（スケールバーは75μm）。
系統#3および#4の植物の地上部および根の両方における染色強度は、野生型植物と比較してより濃い（すなわち、リグニン含有量が増加している）。空ベクター形質転換系統の植物の地上部と根の両方の染色強度は野生型植物のそれと一致している。
Ｖ．リグニン含量の測定
試験植物は、系統#3のT2世代の植物、系統#4の世代T2の植物、空ベクター形質転換系統の世代T2の植物、および出発植物であった。各系統3個の植物体を用い、結果を平均した。
成熟期間の受粉後7日目に、試験植物の第3節間を恒量になるまで80°Cで乾燥させ、それから粉砕して40メッシュふるいを通してふるいにかけて粉体を回収した。粉末約5 mgを10 mlガラス試験管に秤量し、Suzhou Keming Science and Technology Co., Ltdから入手可能なリグニン含量アッセイキットを用いてリグニン含量を測定した（臭化アセチル法、具体的な手順については取扱説明書を参照）。
リグニン含量（mg/g単位、ここでmgはリグニンの質量単位、gは乾燥ベースの粉末の質量単位）＝0.0735* (ΔA-0.0068) /W*Tであり、ここで、Aは280 nmにおける吸光度；ΔA＝試験チューブのA−ブランクチューブのA；Wはg単位での試料の質量；Tは希釈係数である。
その結果を図3に示す。野生型植物と比較して、系統#3の植物の茎においてリグニン含量は21.62%増加し、系統#4の植物の茎では40.10%増加している。野生型植物と比較して、空ベクター形質転換系統の植物の茎においてはリグニン含量に有意な変化はない。
実施例２：低発現植物の生産と同定
Ｉ．組換えプラスミドの構築
配列番号13に示す配列を有する二本鎖DNA分子をpCUBベクターのBamHI切断部位に挿入し、組換えプラスミドpCUB-ZmMZS-Riを得た。配列番号13に示す配列を有する二本鎖DNA分子は、配列番号14に示す配列を有するRNA分子を発現する。配列番号14に示す配列を有するRNA分子は、配列番号15に示す配列を有するRNAの前駆体RNAである。配列番号15に示す配列を有するRNAは、ZnMZS遺伝子を標的とするmiRNAである。
ＩＩ．トランスジェニック植物の生産
トウモロコシ品種Zong 31を出発植物として用いた。トウモロコシ品種Zong 31は野生型植物としても知られており、図ではWTによって示されている。
組換えプラスミドpCUB‐ZmMZS‐Riで出発植物を形質転換し、T0世代のトランスジェニック植物を得た。T0世代のトランスジェニック植物を同系交配させてT1世代の植物を得た。さらにT1世代の植物を同系交配させてT2世代の植物を得た。T2世代で得られたホモ接合トランスジェニック系統は、ZmMZS遺伝子低発現系統と命名された。ZmMZS遺伝子低発現系統（系統#5）を無作為に選択して後続の試験で使用した。
pCUBベクターで出発植物を形質転換し、T0世代のトランスジェニック植物を得た。T0世代のトランスジェニック植物を同系交配させてT1世代の植物を得た。さらにT1世代の植物を同系交配させてT2世代の植物を得た。T2世代で得られたホモ接合性トランスジェニック系統を、空ベクター形質転換系統と命名した。
ＩＩＩ．組織化学的染色
試験植物は、系統#5のT2世代の植物、空ベクター形質転換系統のT2世代の植物、および出発植物であった。
水耕栽培条件下で30日間（発芽日から）生育させた試験植物の第1節間と根の成熟領域とをスライスし（スライスの厚さは50μmであった）、5%フロログルシンで2分間染色し、塩酸1滴を加え、顕微鏡下で観察した。
根の顕微鏡写真を図4に示す（スケールバーは75μm）。
第1節間の顕微鏡写真を図5に示す（スケールバーは200μm）。
野生型植物と比べて、系統#5の植物の地上部と根の両方の染色強度は薄くなっている（すなわち、リグニン含量が減少している）。空ベクター形質転換系統の植物の地上部と根の両方の染色強度は野生型植物のそれと一致している。
ＩＶ．リグニン含量の測定
試験植物は、系統#5のT2世代の植物、空ベクター形質転換系統のT2世代の植物、および出発植物であった。
各系統の3個の植物体を用い、結果を平均した。
成熟期間の受粉後7日目に、試験植物の第3節間を恒量になるまで80°Cで乾燥させ、それから粉砕し、40メッシュふるいを通してふるいにかけて粉体を回収した。粉末約5 mgを10 mlガラス試験管に秤量し、Suzhou Keming Science and Technology Co., Ltdから入手可能なリグニン含量アッセイキットを用いてリグニン含量を測定した（臭化アセチル法、具体的な手順については取扱説明書を参照）。
リグニン含量（mg/g単位、ここでmgはリグニンの質量単位、gは乾燥ベースの粉末の質量単位）＝0.0735* (ΔA-0.0068) /W*Tであり、ここで、Aは280 nmにおける吸光度；ΔA＝試験チューブのA−ブランクチューブのA；Wはg単位での試料の質量；Tは希釈係数である。
その結果を図6に示す。野生型植物と比較して、系統#5の植物の茎においてリグニン含量は22.93%減少している。野生型植物と比較して、空ベクター形質転換系統の植物の茎においてはリグニン含量に有意な変化はない。
実施例３：組換えプラスミドの構築
pCUBベクターは、配列番号11に示す配列を有する環状プラスミドである。
Ｉ．配列番号13に示す配列を有する二本鎖DNA分子をpCUBベクターのBamHI切断部位に挿入して、組換えプラスミドpCUB-MIRを得た。この組換えプラスミドpCUB-MIRは、配列番号15に示す配列を有するmiRNAを過剰発現するプラスミドであった。配列番号13に示す配列を有する二本鎖DNA分子は、配列番号14に示す配列を有するRNA分子を発現する。配列番号14に示す配列を有するRNA分子は、配列番号15に示す配列を有するmiRNAの前駆体RNAであった。
ＩＩ．pCUBベクターのBamHI切断部位に、配列番号7に示す配列を有する二本鎖DNA分子を挿入して、組換えプラスミドpCUB-MIMを得た。配列番号7の218〜241位からのヌクレオチド配列中の「CTA」以外の部分は、配列番号15に示す配列を有するRNAに対応するDNAと逆相補的である。組換えプラスミドpCUB-MIMは、配列番号15に示す配列を有するmiRNAの発現を阻害するプラスミドであった。
実施例４：トランスジェニック植物の生産および表現型同定
Ｉ．トランスジェニック植物の生産
トウモロコシ品種Zong 31を出発植物として用いた。トウモロコシ品種Zong 31は野生型植物としても知られており、図ではWTによって示されている。
組換えプラスミドpCUB‐MIRで出発植物を形質転換し、T0世代のトランスジェニック植物を得た。T0世代のトランスジェニック植物を同系交配させてT1世代の植物を得た。さらにT1世代の植物を同系交配させてT2世代の植物を得た。T2世代で得られたホモ接合トランスジェニック系統を過剰発現系統と名付けた。過剰発現（OE：overexpressing）系統を無作為に選択し、その後の試験で使用した。
組換えプラスミドpCUB‐MIMで出発植物を形質転換し、T0世代のトランスジェニック植物を得た。T0世代のトランスジェニック植物を同系交配させてT1世代の植物を得た。さらにT1世代の植物を同系交配させてT2世代の植物を得た。T2世代で得られたホモ接合トランスジェニック系統を発現抑制系統とした。2つの発現抑制系統（TM-3およびTM-7）を無作為に選択し、その後の試験で使用した。
pCUBベクターで出発植物を形質転換し、T0世代のトランスジェニック植物を得た。T0世代のトランスジェニック植物を同系交配させてT1世代の植物を得た。さらにT1世代の植物を同系交配させてT2世代の植物を得た。T2世代で得られたホモ接合性トランスジェニック系統を空ベクター形質転換系統とした。
ＩＩ．miRNA発現レベルの同定
試験植物は、OE系統のT2世代の植物、TM‐3系統のT2世代の植物、TM‐7系統のT2世代の植物、および出発植物であった。各系統5個の植物体を用い、結果を平均した。
試験植物の葉から全RNAを抽出し、RTプライマーを用いて逆転写を行い、F 1およびR 1からなるプライマー対を用いてリアルタイム定量PCRを行って、配列番号15または9に示す配列を有するmiRNAの相対的発現レベルを検出した。Ubi遺伝子を内部基準遺伝子として用いた（内部基準遺伝子を同定するためのプライマー対はF2とR2からなるものであった）。
（配列番号28）RT: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCTC。
（配列番号29）F1: 5’-GTGGAAGGGGCATGCA-3；
（配列番号30）R1: 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
（配列番号26）F2: 5’-GCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3’；
（配列番号27）R2: 5’-CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3’。
結果を図7に示す。野生型植物と比較して、配列番号15に示される配列を有するmiRNAの発現レベルはOE系統の植物において有意に増加し、TM-3およびTM-7系統の植物において有意に減少した。
ＩＩＩ．組織化学的染色
試験植物はOE系統のT2世代の植物、TM‐3系統のT2世代の植物、TM‐7系統のT2世代の植物、空プラスミド形質転換系統のT2世代の植物、および出発植物であった。
水耕栽培条件下で30日間（発芽日から）生育させた試験植物の第1節間と根の成熟領域とをスライスし（スライスの厚さは50μmであった）、5%フロログルシンで2分間染色し、塩酸1滴を加えて、顕微鏡下で観察した。
根の顕微鏡写真を図8に示す（スケールバーは75μm）。
第1節間の顕微鏡写真を図9に示す（スケールバーは200μm）。
野生型植物と比較して、地上部と根の両方において、OE系統の植物では染色強度が薄くなり（すなわち、リグニン含量が減少している）、TM‐3およびTM‐7系統の植物では濃くなる（すなわち、リグニン含量が増加している）。空ベクター形質転換系統の植物の地上部と根の両方の染色強度は野生型植物のそれと一致する。
ＩＶ．リグニン含量の測定
試験植物は、OE系統のT2世代の植物、TM‐3系統のT2世代の植物、TM‐7系統のT2世代の植物、空プラスミド形質転換系統のT2世代の植物、および出発植物であった。各系統3個の植物体を使用し、結果を平均した。
成熟期間の受粉後7日目に、試験植物の第3節間を恒量になるまで80°Cで乾燥させ、それから粉砕し、40メッシュふるいを通してふるいにかけて粉体を回収した。粉末約5 mgを10 mlガラス試験管に秤量し、Suzhou Keming Science and Technology Co., Ltdから入手可能なリグニン含量アッセイキットを用いてリグニン含量を測定した（臭化アセチル法、具体的な手順については取扱説明書を参照）。
リグニン含量（mg/g単位、ここでmgはリグニンの質量単位、gは乾燥ベースの粉末の質量単位）＝0.0735* (ΔA-0.0068) /W*Tであり、ここで、Aは280 nmにおける吸光度；ΔA＝試験チューブのA−ブランクチューブのA；Wはg単位での試料の質量；Tは希釈係数である。
その結果を図10に示す。野生型植物と比較して、系統OEの植物の茎ではリグニン含量は21.62%減少し、TM‐3系統の植物の茎では42.15%増加し、TM‐7系統の植物の茎では28.96%増加している。野生型植物と比較して、空ベクター形質転換系統の植物の茎においてはリグニン含量に有意な変化はない。
Ｖ．茎の穿刺強度の決定
茎の穿刺強度はトウモロコシの耐倒伏性と明らかに相関し、茎の強度と耐倒伏性を包括的に反映することができる。
試験植物は、OE系統のT2世代の植物、TM‐3系統のT2世代の植物、TM‐7系統のT2世代の植物、空プラスミド形質転換系統のT2世代の植物、および出発植物であった。各系統20個の植物体を使用して、結果を平均した。
成熟期の受粉後7日目に、具体的には、AWOS‐SL04茎強度試験機を用いて、1.0 mm2の断面積を有する試験ヘッドを、茎の短軸方向に沿って地上部第3節間の中央部に垂直に挿入し、試験データを読み取って記録することによって、試験植物の穿刺強度を測定した。
結果を図11に示す。野生型植物と比較して、茎の穿刺強度はOE系統の植物で22.15%減少し、TM‐3系統の植物では18.97%、TM‐7系統の植物では21.45%増加している。野生型植物と比較して、空ベクター形質転換系統の植物の茎の穿刺強度に有意な変化はない。
ＶＩ．ポット実験
試験種子は、OE系統のT3世代の種子、TM‐3系統のT3世代の種子、TM‐7系統のT3世代の種子、空プラスミド形質転換系統のT3世代の種子、および出発植物の種子であった。
プラスチック製フラワーポット（直径32.5 cm * 高さ26 cm）を用い、各ポットに14.0 kgの土を満たした。その後、基本肥料を施用し、発芽後の試験種子をポットに植えて、屋外で培養した。
図12は、出穂期の植物の写真を示す。風に吹かれた場合、OE系統の植物は曲がった茎を示しているが（茎の機械的強度が小さくなったことを示している）、TM‐3およびTM‐7系統の植物、野生型植物、ならびに空ベクター形質転換系統の植物は直立したままである（茎の機械的強度がより高いことを示す）。
実施例５：標的遺伝子の決定
Ｉ．5’RACE試験
GRMZM2G367668、GRMZM2G169033、GRMZM2G148937、GRMZM2G178741、GRMZM2G039381、GRMZM2G062069、GRMZM2G043300、およびGRMZM2G004106を含む8つの遺伝子が、配列番号15又は9に示される配列を有するmiRNAの候補標的遺伝子であると事前に予測され、各候補標的遺伝子を順次検証した。
トウモロコシB73の全RNAを抽出し、GeneRacer（商標）キットを用いて各候補標的遺伝子について5'RACE試験を行った。このプロセスは、標的遺伝子mRNA産物への5'RACEリンカーのライゲーション、cDNAへの逆転写、ネステッドPCR、および特異的断片のクローニングと配列決定を含んだ。詳細については使用説明書を参照。
結果は、該miRNAの切断部位がGRMZM2G367668転写産物とGRMZM2G169033転写産物に存在することを示す。GRMZM2G367668転写産物の対応するDNAが配列番号16に示されており、miRNAの切断部位はGRMZM2G367668転写産物のヌクレオチド222〜242の間に位置する。GRMZM2G169033転写産物の対応するDNAが配列番号17に示されており、miRNAの切断部位は、GRMZM2G169033転写産物のヌクレオチド302〜322の間に位置する。
ＩＩ．ノザンブロット解析
試験植物は、OE系統のT2世代の植物、TM-3系統のT2世代の植物、TM-7系統のT2世代の植物、実施例4で作製した空プラスミド形質転換系統のT2世代の植物、および出発植物であった。
苗段階の試験植物の根を採取し、全RNAを抽出してノザンブロット分析を行った（GRMZM2G169033転写産物のためのプローブを配列番号18に、GRMZM2G367668転写産物のためのプローブを配列番号19に示す）。
結果を図13に示す。OE系統の植物では、GRMZM2G169033およびGRMZM2G367668の転写産物のレベルは著しく減少した。GRMZM2G169033およびGRMZM2G367668の転写産物のレベルは、TM‐3およびTM‐7系統の植物では著しく増加した。これらの結果は、GRMZM2G169033転写産物とGRMZM2G367668転写産物が該miRNAの標的遺伝子であることを示している。
実施例６：マイクロRNA528は窒素贅沢条件下でリグニン生合成を調節することによりトウモロコシの耐倒伏性に影響を及ぼす。
Ｉ．トウモロコシ実生のリグニンの組成と含有量はN供給に影響される。
上述したように、中国ではN贅沢条件下での倒伏がトウモロコシ収量を減少させる。倒伏はリグニンに関係し得るため、また、異なるN条件下でのトウモロコシのリグニンの組成と含量に関する定量的データが不足しているため、発明者らはまず、チオ酸分解を用いて、トウモロコシのリグニン組成に及ぼすNの影響を測定した。N充足と比較して、N欠乏は、トウモロコシ実生のシュートにおいてH、GおよびS単量体の生成を大きく誘導した（表2）。対照的に、N贅沢は、これらの単量体の生成を有意に抑制した（表2）。それに加えて、シュートにおけるS/G比は、N供給が制限された場合には高く、N供給が過剰の場合には低かった（表2）。
NL、NS、およびNDはそれぞれ、N贅沢（N luxury）、N充足（N sufficiency）、およびN欠乏（N deficiency）を示す。H、G、Sはそれぞれ、p-クマリルアルコール、コニフェリルアルコール、シナピルアルコールである。DWは乾燥重量（dry weight）。値は生物学的複製4回の平均±SEである。同じ文字を伴う平均値は、LSD検定に従って p<0.01での有意差がない。
また、臭化アセチル（AcBr）分析（Iiyama and Wallis, 1990）を用いて、トウモロコシ実生の総リグニン含有量に及ぼすN供給の影響を定量化した。AcBr分析は、チオ酸分解と一致して、トウモロコシ実生のシュート中の総リグニン含有量がN贅沢によって減少するがN欠乏によって増加することを示した（表2）。チオ酸分解とAcBrの結果は、30日齢の水耕栽培トウモロコシの茎と葉のフロログルシノール染色によって確認された。まとめると、これらの結果は、トウモロコシのリグニンの組成と含有量がN供給によって影響されることを示している。
ＩＩ．ZmmiR528はN供給により調節される
トウモロコシには、ZmMIR528aとZmMIR528bというZmmiR528ファミリーの2つのメンバーがあり、それらの成熟配列は同一である。TGA1／TGA4およびNAC4を含むN応答性転写因子によって認識されるいくつかのモチーフ（Vidal et al., 2013, Alvarez et al., 2014）を、ZmMIR528aおよびZmMIR528bの1.5 kbプロモーター領域に見出し得る。発明者らの以前のシークエンシングデータも、ZmMIR528aとZmMIR528bの両方がN欠乏により有意に下方調節されることを示していた（Zhao et al., 2012）。ZmmiR528の発現がN供給によりどのように調節されるかを明らかにするために、N贅沢およびN欠乏下で水耕栽培したトウモロコシを用いた時間経過実験を行った。ステムループqRT-PCRは、シュートにおけるZmmiR528の発現がN贅沢によって誘導されるがN欠乏によっては減少されることを示し（図14A）、これは、N贅沢およびN欠乏に応答した総リグニン含有量の変化（表2）とは逆である。言い換えれば、N贅沢はZmmiR528発現を増加させ総リグニン含有量を減少させた一方、N欠乏はZmmiR528発現を低下させ、総リグニン含有量を増加させた。
ＩＩＩ．ZmLAC3およびZmLAC5はZmmiR528の標的である
ZmmiR528の潜在的標的には、ZmLAC3、ZmLAC5、いくつかのカプレドキシン（GRMZM2G043300、GRMZM2G004106、およびGRMZM2G039381）、ならびにホメオボックス転写因子22 ZmHB22（GRMZM2G178741）が含まれる（Zhang et al., 2009）。ZmLAC3とZmLAC5のみが、N贅沢とN欠乏の条件に応答してZmmiR528とは逆の発現パターンを示したことから（図14BおよびC）、クプレドキシンとZmHB22は、ZmmiR528の標的ではないか、またはそれらは翻訳レベルでZmmiR528に調節されることが示唆された。そこで、さらなる分析のためにZmLAC3とZmLAC5を選択した。ZmmiR528がZmLAC3およびZmLAC5の発現を調節できるかどうかを決定するために、我々はNicotiana benthamianaにおいて一時的共発現アッセイを行った。N. benthamianaにおける2日間の共発現の後、RNAを抽出して、ZmLAC3およびZmLAC5の転写産物をqRT-PCRにより分析した。ZmLAC3およびZmLAC5の転写産物の存在量は、ZmMIR528bと共発現させた場合には有意に減少した（図15A）。加えて、トウモロコシ実生からのRNAを用いて5′RACE（rapid amplification of cDNA ends）アッセイを行うことにより、ZmLAC3およびZmLAC5における予測標的部位を決定した（図15B）。総合すると、これらの結果は、トウモロコシにおいてZmLAC3とZmLAC5はZmmiR528の真の標的であることを示している。
ＩＶ．ZmmiR528は主に維管束組織で発現する
ZmmiR528の空間的分布に関する情報はその機能への洞察を提供できるので、異なるトウモロコシ組織におけるZmmiR528の発現パターンをqRT-PCRにより検討した。ZmmiR528は、10番目の葉（下から）で高度に発現し、節間では中程度に、成体トウモロコシ植物の根では低いレベルで発現していた。対照的に、ZmLAC3とZmLAC5の発現パターンは、ZmLAC5が節間でも高度に発現していたことを例外として、ZmmiR528のそれと反対であった。
ZmmiR528の発現パターンをin situハイブリダイゼーション分析によりさらに調べた。ZmmiR528は、トウモロコシの葉と茎の篩部、および側根の維管束領域において特異的に検出された（図16A）。ZmLAC5の発現レベルはトウモロコシ節間でも高かったことから、トウモロコシ茎におけるZmLAC5の発現パターンもin situハイブリダイゼーションによって調べた。ZmmiR528とは異なって、ZmLAC5転写物はトウモロコシ茎の繊維に蓄積し（図16B）、ZmmiR528によるZmLACの負の調節をさらに示唆した。
Ｖ．ZmmiR528はN贅沢条件下でトウモロコシの耐倒伏性に影響する
ZmmiR528の機能を調べるために、構成的ユビキチンプロモーターの制御下でZmmiR528を過剰発現するトランスジェニックトウモロコシ系統を作出した。野生型（WT）トウモロコシにおけるZmmiR528の高レベルの発現のため（Zhao et al., 2012）、1系統（OE）のみが得られた（図17E）。ZmmiR528ファミリーは2つのメンバーを有するため、CRISPR/Cas9システムを用いてZmmiR528機能喪失変異体を生成することは困難である。したがって、Yanら (2012) によって記述されたようにZmMIR528aおよびZmMIR528bを標的とする短いタンデム標的模倣体を設計し、トウモロコシに導入した。ZmMIR528aおよびZmMIR528bの破壊の有効性を低分子RNAノザンブロット分析により検証し、2つの独立ノックダウン系統（TM-3およびTM-7）をその後の分析のために選択した（図17E）。ZmLAC3とZmLAC5のmRNA量は、ZmmiR528過剰発現により減少したが、ZmmiR528ノックダウンにより増加し（図17G）、ZmLAC3とZmLAC5がZmmiR528により直接調節されることがさらに実証された。
N供給によるZmmiR528の調節および維管束組織におけるその特異的発現は、リグニン生合成におけるその潜在的役割を分析することを我々に促した。興味深いことに、ZmmiR528存在量は、水耕栽培したトウモロコシ実生のリグニン含有量と負に相関したが、セルロースおよびヘミセルロースの含量とは負に相関しなかった（図17F）。リグニン含有量はWTよりTMトランスジェニックトウモロコシの方が約1.5倍高かった（図17F）。加えて、WTまたはTMトランスジェニックトウモロコシの篩部と比較して、OEトランスジェニックトウモロコシ茎の篩部では細胞数がより少なく細胞直径はより大きかったことから、OEトランスジェニックトウモロコシでは篩部細胞がより緩く配置されていることが示唆された。従って、我々はN贅沢条件下におけるトランスジェニックトウモロコシ植物の耐倒伏性を評価した。OEトランスジェニックトウモロコシは、N贅沢条件下において、WTまたはTMトランスジェニックトウモロコシよりも倒伏しやすかった（図17A）。この表現型と一致して、外皮貫通抵抗性とAcBrリグニン含量はWTまたはTMトランスジェニックトウモロコシよりOEトランスジェニックトウモロコシの方がはるかに低かった（図17BおよびC）。TMおよびOEトランスジェニックトウモロコシのセルロースとヘミセルロースの含量はWTのものと同様であった（図17D）。これらの結果は、ZmmiR528が、リグニン含量に影響することによってN贅沢条件下でトウモロコシの耐倒伏性に影響することを示している。
ＶＩ．トウモロコシにおけるZmLAC3の過剰発現はリグニン含有量を増加させる
ラッカーゼは多くの生物に見出される銅含有糖タンパク質である。Arabidopsisの維管束発生の際のリグニン重合においてラッカーゼは必要とされペルオキシダーゼと非重複的に機能することが示されている（Zhao et al., 2013）。トウモロコシのリグニン生合成におけるZmmiR528の機能をさらに調べるために、ZmmiR528標的の1つであるZmLAC3を構成的ユビキチンプロモーターの制御下で過剰発現するトランスジェニックトウモロコシ植物を作出した。2つのトランスジェニック系統（#3および#4）を、それらの高レベルのZmLAC3発現に基づいて、さらなる分析のために選抜した（図19A）。WTおよびZmLAC3OEトランスジェニックトウモロコシの実生の茎および葉のフロログルシノール染色は、ZmLAC3の過剰発現がリグニン含量を増加させることを示した（図18A）。例えば、N贅沢およびN充足条件下でのリグニンの異所性沈着が、ZmLAC3OEトランスジェニックトウモロコシの茎表皮で明らかであったが、WTトウモロコシの茎表皮では見られなかった（図18A）。AcBr分析に基づくと、N贅沢条件下での成熟茎中のリグニン含有量は、WTと比べてZmLAC3OEトランスジェニックトウモロコシで11%〜20%高かった（図18B）。外皮貫通抵抗性も、WTトウモロコシと比べてZmLAC3OEトランスジェニックトウモロコシではより高かった（図18C）。ZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシにおける観察と一致して、ZmLAC3の過剰発現は、N贅沢条件下で、WTトウモロコシと比較してもセルロースおよびヘミセルロースの含有量には影響しなかった（図18DおよびE）。
ＶＩＩ．ZmmiR528とN供給はZmPALの発現に影響する
ZmmiR528媒介性シグナリング経路における分子的事象への洞察を得るために、RNA配列決定（RNA‐seq）を用いて、 WTおよびZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシの全トランスクリプトームプロファイルを比較した。十分にNを供給した15日齢の水耕栽培近交系とトランスジェニックトウモロコシの葉から全RNAを抽出した。各遺伝子型について3個の生物学的複製物があり、Illuminaハイスループット配列決定技術を使用してライブラリーの配列を決定した。これらの6つのRNAライブラリーは2億8000万超の生の読取りデータをもたらした。トウモロコシゲノムにマッピングできなかった配列は捨て、完全にマッピングされたものだけをさらに解析した。各遺伝子の存在量は、100万のマッピングされた読取りデータ当たりキロベース当たりの断片数として表した（Trapnellら、2010）。およそ2328個の遺伝子が、非ストレス条件下でWTと比較してZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシにおいて統計学的に有意な発現変化を示した。差次的発現遺伝子（DEG：differentially expressed gene）のうち、1048個はZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシにおいて下方調節され、1281個は上方調節されていた。UniProtデータベースに対してBLAST検索を実行することにより（http://www.uniprot.org/blast/）、1932個のDEGに機能的アノテーションを付けた。DEGのうち、UDPグリコシルトランスフェラーゼ72B1（UGT72B1）は、モノリグノールのグルコースコンジュゲーションを触媒することが報告されており、Arabidopsisにおいて正常な細胞壁リグニン化のために必須である（Linら、2016）。AtABCG29はリグニン生合成に関与するp‐クマリルアルコール輸送体である（Alejandro et al., 2012）。トウモロコシにおけるこれら遺伝子の対応オーソログであるGRMZM2G156026およびGRMZM2G366146の転写産物は、ZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシにおいて有意に上方調節されていた。遺伝子オントロジー（GO（Gene Ontology）；http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/）分析は、これらアノテーション付きDEGが主にGO:0006950（ストレスに対する反応；p=1.70E-6）、GO:0019748（二次代謝プロセス；p=6.80E-6）、GO:0044271（細胞性窒素化合物生合成プロセス；p=0.0008）、GO:0005618（細胞壁；p=2.60E-14）、およびGO:0030054（細胞間結合；p=5.60E-10）に関与することを示した。
GRMZM2G170692とGRMZM2G334660は、それぞれフェニルアラニンアンモニアリアーゼ7（PAL7）とPAL8をコードするので、我々の注意を引いた。PALは、フェニルアラニンからモノリグノールを生成する一連の酵素反応の第一段階を触媒するだけでなく、フェニルプロパノイド-窒素サイクルの鍵となる要でもある（Canton et al., 2005, Vanholme et al., 2008）。N充足条件下で、ZmmiR528はZmPAL7とZmPAL8の発現に負に影響し、すなわち、ZmPAL7とZmPAL8のmRNAレベルは、ZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシで最も高く、続いてWTおよびZmmiR528 OEトランスジェニックトウモロコシの順であった（図20）。これらの結果は、ZmLAC3OEトランスジェニックトウモロコシにおいてさらに検証された（図19B）。N欠乏は、WT、ZmmiR528 OE、およびTMトランスジェニックトウモロコシにおいてZmPAL7およびZmPAL8の発現を有意に誘導し、最も高い誘導はZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシで観察された（図20）。N贅沢条件下では、ZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシにおけるZmPAL7およびZmPAL8の発現レベルはN充足条件下のものと同様であった。対照的に、WTとZmmiR528 OEトランスジェニックトウモロコシの発現レベルはN贅沢条件下で有意に低下した（図20）。別の7つのZmPALの発現レベルも、リアルタイムRT-PCRによってこれらのトランスジェニックトウモロコシ系統において測定された。ZmPAL7およびZmPAL8と一致して、ZmPAL1およびZmPAL3のmRNAレベルは、N供給、ZmmiR528、およびZmLAC3存在量によって調節された（図20および19B）。
ＶＩＩＩ．検討
トウモロコシは植物の発生と進化を研究するための重要なモデルであるが、おそらく形質転換効率が低いことおよびトランスジェニックトウモロコシのための遺伝学的バックグラウンドが限られていることのために、トウモロコシの研究はイネとシロイヌナズナの研究よりも遅れている。現在まで、トウモロコシにおいて機能的に特徴づけられたmiRNAはZmmiR156（Chuck et al., 2007a）、ZmmiR164（Li et al., 2012)、ZmmiR166（Juarez et al., 2004）およびZmmiR172（Lauter et al., 2005, Chuck et al., 2007b）だけである。本研究で我々は、ZmmiR528が、ZmLAC3とZmLAC5のmRNAの存在量を負に調節することにより、N贅沢条件下のトウモロコシのリグニン生合成と耐倒伏性に影響を与えることを見出し、Nとリグニン生合成との間の関係への重要な洞察を提供した。
N贅沢条件下での倒伏は、中国においてトウモロコシ収量を制限する主要な問題である。ポプラでは、木部の二次細胞壁のリグニンはN贅沢条件下で減少したが、N制限条件下では一貫して堆積した（Camargo et al., 2014）。飼料草では、N施肥によってリグニン含量が増加する（Collins et al., 1990）。ここで我々は、N処理がトウモロコシにおけるリグニンの組成と含量に及ぼす影響を定量化した。N贅沢はトウモロコシ実生におけるH、GおよびS単量体の生成および総リグニン含量を有意に抑制した。TGA1/4およびNAC4転写因子は、硝酸応答ネットワークの鍵となる調節因子である（Vidal et al., 2013, Alvarez et al., 2014）。これらの転写因子に対応する結合部位がZmMIR528a/bの1.5 kbプロモーター領域に認められたことから、ZmMIR528a/bの発現がN処理によって調節され得ることが示唆され、ステムループqRT-PCRによってこの仮説が検証された。ZmMIR528a/bはZmLAC3とZmLAC5を直接切断することができ、リグニン含量は、ZmmiR528ノックダウン変異体とZmLAC3過剰発現トランスジェニックトウモロコシで特に増加した。リグニンの異所性沈着がこれら系統の茎表皮で明らかであった。モノリグノール生合成遺伝子はArabidopsisのlac 4 lac 11 lac 17三重変異においてほとんど影響を受けなかったが（Zhao et al., 2013）、本研究において、ZmmiR528のノックダウンおよびZmLAC3の過剰発現はPAL発現レベルを有意に増加させた。N贅沢条件下で、ZmPAL発現レベルは、WTまたはZmmiR528 OEトランスジェニックトウモロコシと比べてZmmiR528 TMトランスジェニックトウモロコシではるかに高かった。まとめると、miR528のレベルの増加およびZmLACとZmPALの存在量の減少が、N贅沢条件下でのトウモロコシの耐倒伏性の低下を説明することができた（図21）。
すでに述べたように、miRNA528は単子葉植物特異的なmiRNAである。miRNA528の成熟配列（5’-UGG AAG GGG CAU GCA GAG GAG-3’）はイネとトウモロコシで同じであるが、これらの種におけるmiRNA 528の機能は異なる。イネでは、OsmiR528はAOを下方調節することにより免疫応答に貢献する（Wu et al., 2017）。我々はN.benthamianaにおける共発現および5’ RACEを用いて、トウモロコシではイネとは対照的に、ZmLAC3とZmLAC5がZmmiR528の真正な標的であることを決定した。ZmLAC3の過剰発現はトウモロコシのリグニン含量を増加させ、これはZmMIR528a/b TMトランスジェニックトウモロコシの表現型と一致した。さらに、ZmmiR528は、トウモロコシの葉と茎の篩部に特異的に発現される。まとめると、我々の結果は、ZmLAC3およびZmLAC5を調節することにより、ZmmiR528はトウモロコシのリグニン生合成に影響を与えることを示している。
ラッカーゼの転写調節はArabidopsisの二次壁形成のために重要である（Mitsuda et al., 2007, Zhou et al., 2009, Wang et al., 2010）。ArabidopsisはmiRNA 528を欠くが、リグニン生合成に関係する重要な機能を提供する他のmiRNAを持っている。例えば、ArabidopsisにおけるmiRNA408の過剰発現はLAC13およびARPNのmRNAレベルを下方調節し、栄養成長を増加させる（Zhang and Li, 2013）；miRNA397bは、リグニン生合成に関与するラッカーゼを調節することによりArabidopsisにおけるリグニン含有量と種子数の両方を制御する（Wang et al., 2014）；そしてmiRNA857は、LAC7の調節を通じてArabidopsisにおける維管束組織の二次成長を調節する（Zhao et al., 2015）。したがって我々は、リグニン生合成の転写後調節は単子葉植物と双子葉植物の間で保存されていると推測する。
トウモロコシは、人間にとっての食料源であるだけでなく、バイオ燃料生産のための重要な原料であり、家畜のための飼料作物でもある。バイオ燃料生産のためのトウモロコシの利用はリグニンの除去を必要とし、リグニンは飼料作物の消化性に影響を及ぼす（Zhou et al., 2009）。ZmmiRNA528 OEトランスジェニックトウモロコシはリグニン含量を減少させたので、バイオ燃料生産または飼料のために有用となり得る。最も重要なことに、本研究の結果は、ZmmiR528とZmLACのモジュールがN贅沢条件下でのトウモロコシの倒伏を減少させるために改変され得ることを示している。
ＩＸ．方法
植物材料と生育条件
均一サイズの種子を10% H2O2中で20分間、表面滅菌した。連続通気を伴う飽和CaSO4溶液にそれらを6時間浸漬した後、種子を、粗い珪砂の中で、2枚の葉が見えるまで発芽させた。その実生を、Zhao et al. (2012)に記述されているように水耕栽培して、N充足（4 mM NO3 -、フル強度Hoagland栄養溶液中の濃度）、N贅沢（8 mM NO3 -）、またはN欠乏状態（0.04 mM NO3 -）に対する反応を評価した。N贅沢条件下での耐倒伏性を測定するためにトウモロコシは土壌中でも栽培した。土壌培養のためには、植物を、10 kgの土を含むポット中で自然条件下で70日間栽培した。植え付け前に、尿素6.2 g、過燐酸石灰12.1 g、および硫酸カリウム5.5 gを各ポットの土に混ぜた。尿素肥料の量はポット試験では実用的な投入量の約2倍であった。トウモロコシのV6ステージで、さらに2 gの尿素を各ポットに適用した。
コンストラクトおよびトランスジェニックトウモロコシの作出
3’ UTRを含まないZmLAC3のcDNAをPCRによって増幅した。ZmMIR528b配列を囲み折り返し構造を含む約80 bpの断片をゲノムDNAから増幅した。ZmmiR528ノックダウン変異体であるZmmiR528 TMを作製するために、ZmMIR528aおよびZmMIR528bを標的とする短いタンデム標的模倣体を、Yan et al. (2012)に記述されているように設計した。増幅断片を、BamHI制限部位を用いIn-Fusion反応を介して、イネユビキチンプロモーターの制御下にあるpCUBベクターにクローニングした。
CaMV 35Sプロモーター制御下にStreptomyces hygroscopicusのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ (bar) 遺伝子を含む構築プラスミドを、A. tumefaciens EHA105にエレクトロポレーションした。トウモロコシ近交系ZZC01の未成熟胚を、China National Seed GroupのLife Science and Technology CenterにおいてEHA105との共培養により形質転換した。ビアラホスの濃度を徐々に増加させて形質転換体を選択した。20超の独立のトランスジェニック事象が生成し、単一コピーまたは低コピー数を有する事象を、自殖またはトウモロコシ近交系ZZC 01と交配する手順に進めてT1種子を生産した。リアルタイムqRT-PCR分析に続いて、トランスジーンの発現が確認されたT1植物を自家受粉させてT2種子を作出した。T2ホモ接合系統を全ての実験に使用した。
リグニン、セルロース、およびヘミセルロースの含量の分析
15日齢の水耕栽培トウモロコシ植物の様々な部分と、V9成長ステージの土壌栽培トウモロコシの下から3番目の節間から試料採取した。試料を45℃で7日間乾燥させ、それから微粉末に粉砕した。リグニン組成はチオアシドリシスによって決定した（Lapierre et al., 1995）。AcBr法を用いて、Fukushima and Hatfield (2004)に記述されているように総リグニン含量を測定した。セルロースおよびヘミセルロースの含量は修正NREL手順（Sluiter et al., 2008）を用いて測定した。
維管束構造の組織化学的解析
15日齢の水耕栽培トウモロコシの同じ位置の葉および30日齢の水耕栽培トウモロコシの根上の茎の最初の2 cmから試料採取した。これらの試料の維管束構造を、以前に記述されたように（Berthet et al., 2011）Wiesner染色によって可視化した。
RNA分析
TRIzol試薬（Invitrogen）を使用して、近交系およびトランスジェニックトウモロコシから総RNAを抽出した。ZmmiR528の定量のためには、以前記述されたように（Chen et al., 2005）ステムループqRT-PCRを実施した。リアルタイムRT-PCRと切断部位マッピングはZhao et al. (2012)に記述されたように行った。
N. benthamianaにおける一過性発現
プライマーを用いて、折り返し構造を含むZmLAC3、ZmLAC5、およびZmMIR528bの全長cDNA配列を増幅した。増幅された断片は、In-Fusion反応を介しBamHI制限部位を用いてpCPBベクターにクローニングした。Li et al. (2008)に記述されたように、プラスミドをA. tumefaciens GV3101にエレクトロポレーションし、タバコの表皮細胞に一時的に発現させた。浸潤の2日後に葉を収穫し、上記のようにRNA分析に供した。
in situハイブリダイゼーション
ZmmiR528のin situハイブリダイゼーションはTrevisan et al. (2012)に記述されたように行った。ZmLAC5プローブについては、高い特異性を有する385 bp断片を増幅し、pGEM-T-easyベクター（Promega）にクローニングした。対応するセンスプローブおよびアンチセンスプローブを、T7またはSP6 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって作製した。ZmLAC5のin situハイブリダイゼーションは、以前記述されたように行った（Zhang et al., 2007）。
破断荷重の測定
V9成長ステージにおける土壌栽培トウモロコシの下から3番目の節間を測定に用いた。茎を破断するのに必要な力をマイクロテスタ (AWOS‐SL 04) で記録した。各遺伝子型10個の植物を測定し、すべての測定は同じ条件下で行った。
細胞の数とサイズ
各遺伝子型について篩部細胞の数と直径を決定するために、下から2番目の葉の同じ部分を、0.1 Mリン酸緩衝液 (pH 7.2) 中の2.5%グルタルアルデヒドにおいて4°Cで一晩固定し、1% OsO4中で2時間、後固定した。80 kVで稼働しているHT7700透過型電子顕微鏡 (日立) で電子トモグラムを収集した。Image Pro Plus 6.0を用いて篩部細胞直径を測定した。
実施例７：CRISPR/Cas9媒介によるmiRNA 528 aおよびbの編集。
MIRNA528の2つ別個のgRNA対が産生された
528a: TCAGGGTCAGTTTGCTCTGCTGG（配列番号33）、
TGCGCAGTTGCCCTGTGATGAGG（配列番号36）
528b: TCTCTAGTTCTGGGAGTTCCTGG（配列番号40）および
AAAACTCAGAAGCGCAACCGAGG（配列番号43）
その後、In-Fusion反応によりHindIII制限部位を用いてpCPBベクターに断片をクローニングした。sgRNAとhSpCas9の模式図を図22に示す。
実施例９：フィールドスタディ
miR528ノックダウントランスジェニック（雌）植物を作製し、これらを、倒伏傾向の雄と交配した。その後、F1世代を、倒伏傾向の近交系と戻し交配した。図23の写真に示されているように、得られた植物は、開花が遅れるなどのネガティブな表現型を伴うことなく、倒伏傾向の植物と交配された野生型（WTxハイブリッド）と比べて、圃場での倒伏が増加していた（倒伏条件にさらされた場合）。これら耐倒伏性植物は新しいハイブリッドを作出するために雄親または雌親として使用され得る。
参考文献

Claims (108)

  1. 植物における耐倒伏性を改変する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法。
  2. 前記方法が、植物における耐倒伏性を増加させ、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択される、請求項1または2に記載の方法。
  4. 少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入して発現させることを含み、前記核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体が調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
  5. ラッカーゼ3をコードする核酸が配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸が配列番号5または6に定義される配列もしくはその機能的バリアントもしくは相同体を含む、請求項4に記載の方法。
  6. 配列番号7もしくは16に定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を導入して発現させることを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
  7. 前記調節配列が構成的プロモーターまたは強力なプロモーターである、請求項4または6に記載の方法。
  8. miR528の活性が、少なくとも1つのmiR528阻害因子を使用して減少される、請求項2に記載の方法。
  9. 前記miR528阻害因子が、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである、請求項8に記載の方法。
  10. 前記方法は、
    少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子に少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、ここでラッカーゼポリペプチドが、miR528結合部位において少なくとも1つの突然変異を含み、および／または、
    miR528および／またはbの遺伝子またはmiR528プロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含む、
    請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
  11. 前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、前記ラッカーゼ3遺伝子が配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、前記ラッカーゼ5遺伝子が配列番号4で定義されるポリペプチドをコードする、請求項10に記載の方法。
  12. 少なくとも1つの突然変異が、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号2の位置191〜211から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置に導入される、請求項10に記載の方法。
  13. 前記突然変異が、標的化ゲノム修飾、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入される、請求項12記載の方法。
  14. 前記突然変異が、突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて導入される、請求項12に記載の方法。
  15. 前記方法は、植物における耐倒伏性を減少させ、前記方法が、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を減少させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を増加させることを含む、請求項1に記載の方法。
  16. 前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、前記ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1に定義されるポリペプチドをコードし、前記ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4に定義されるポリペプチドをコードする、請求項15に記載の方法。
  17. 少なくとも1つのラッカーゼの遺伝子および／またはプロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、前記突然変異が、野生型または対照ポリペプチドと比べてラッカーゼ核酸の発現を減少させる、請求項15または16に記載の方法。
  18. 前記突然変異が、標的化ゲノム修飾、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入される、請求項17記載の方法。
  19. 突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて導入される、請求項17に記載の方法。
  20. RNA干渉を用いて、少なくとも1つのラッカーゼ核酸、好ましくはラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を減少または消失させることを含む、請求項15または16に記載の方法。
  21. 前記方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入して発現させることを含み、前記核酸は配列番号10に定義されるmiR528またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、請求項15または16に記載の方法。
  22. 前記方法は、配列番号9を含むmiR528またはその機能的バリアントを導入することを含む、請求項15または16に記載の方法。
  23. 前記植物が、対照植物または野生型植物と比べて増加したリグニン含量を有する、請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
  24. 野生型または対照植物と比べて、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベル、および／またはmiR528の発現もしくは活性が改変される、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
  25. 対照植物または野生型植物と比べて根の耐倒伏性が改変される、請求項1〜24のいずれかに記載の方法。
  26. 前記植物がトウモロコシである、請求項1〜25のいずれかに記載の方法。
  27. 収量、種子品質および茎強度のうちの少なくとも1つを向上させる方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む、方法。
  28. 植物におけるリグニン含量を改変する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法。
  29. 少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の改変された発現もしくはレベル、および／またはmiR528の改変された発現もしくは活性によって特徴づけられる遺伝子改変植物、その一部分、または植物細胞。
  30. 前記植物が、改変されたリグニン含量によって特徴付けられる、請求項29に記載の遺伝子改変植物。
  31. 野生型または対照植物と比べて、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の増加および／またはmiR528の発現もしくは活性の減少によって特徴づけられる、請求項29または30に記載の遺伝子改変植物。
  32. 前記植物は少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を発現し、前記核酸が、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体が調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、請求項31に記載の遺伝子改変植物。
  33. ラッカーゼ3をコードする核酸が配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸が配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含む、請求項32に記載の遺伝子改変植物。
  34. 前記植物が、配列番号7もしくは16で定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を発現する、請求項31に記載の遺伝子改変植物。
  35. 前記調節配列が構成的プロモーターまたは強力なプロモーターである、請求項32または34に記載の遺伝子改変植物。
  36. 前記植物が少なくとも1つのmiR528阻害因子を発現する、請求項31に記載の遺伝子改変植物。
  37. 前記miR528阻害因子が、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである、請求項36に記載の遺伝子改変植物。
  38. 前記植物が、ラッカーゼ核酸をコードする少なくとも1つの核酸において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは、前記ラッカーゼ核酸がラッカーゼ3および5から選択され、かつ前記突然変異が、miR528結合部位にある、および／または、miR528および／またはb遺伝子もしくはmiR528プロモーターにおける少なくとも1つの突然変異である、請求項31に記載の遺伝子改変植物。
  39. 前記突然変異が、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入されたものである、請求項38に記載の遺伝子改変植物。
  40. 前記突然変異が、突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて導入されたものである、請求項38に記載の遺伝子改変植物。
  41. 前記突然変異が、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置に導入されている、請求項38〜40のいずれかに記載の遺伝子改変植物。
  42. 前記植物が少なくとも1つのmiR528阻害因子を発現し、前記miR528阻害因子が配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである、請求項31に記載の遺伝子改変植物。
  43. 野生型または対照植物と比べて、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の減少および／またはmiR528の発現もしくは活性の増加によって特徴づけられる、請求項29または30に記載の遺伝子改変植物。
  44. 前記植物が、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を発現し、前記核酸が配列番号10に定義されるmiR528もしくはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードするか、または、前記植物は、配列番号9を含むmiR528もしくはその機能的バリアントを発現する、請求項43に記載の遺伝子改変植物。
  45. 前記植物が、ラッカーゼ核酸をコードする少なくとも1つの核酸において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは、前記ラッカーゼ核酸がラッカーゼ3および5から選択され、前記突然変異が、野生型または対照ポリペプチドと比べて前記ラッカーゼ核酸の発現を減少させる、請求項44に記載の遺伝子改変植物。
  46. 前記核酸が、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードする、請求項45に記載の遺伝子改変植物。
  47. 前記突然変異が、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入されたものである、請求項45または46に記載の遺伝子改変植物。
  48. 前記植物が、野生型または対照植物と比べて少なくとも1つのラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を減少させるRNAi分子を発現する、請求項43に記載の遺伝子改変植物。
  49. 前記植物がトウモロコシである、請求項29〜48のいずれかに記載の遺伝子改変植物。
  50. 植物の耐倒伏性が改変された植物を作製する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法。
  51. 前記植物が、野生型または対照植物と比べて改変されたリグニン含量を有する、請求項50に記載の方法。
  52. 前記植物が、増加された耐倒伏性を有し、前記方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む、請求項50に記載の方法。
  53. 前記方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入し発現させることを含み、前記核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体が調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、請求項52に記載の方法。
  54. ラッカーゼ3をコードする核酸が配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントまたは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸が配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントまたは相同体を含む、請求項53に記載の方法。
  55. 配列番号7もしくは16に定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を導入し発現させることを含む、請求項50〜52のいずれかに記載の方法。
  56. 前記調節配列が構成的プロモーターまたは強力なプロモーターである、請求項53または55に記載の方法。
  57. 少なくとも1つのmiR528阻害因子を用いてmiR528の活性が減少される、請求項52に記載の方法。
  58. 前記miR528阻害因子が、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである、請求項57に記載の方法。
  59. 前記方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子に少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、ラッカーゼポリペプチドが、miR528結合部位において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1に定義されるポリペプチドをコードし、ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4に定義されるポリペプチドをコードする、請求項50〜52のいずれかに記載の方法。
  60. 少なくとも1つの突然変異が、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置に導入される、請求項59に記載の方法。
  61. 前記突然変異が、標的化ゲノム修飾、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入される、請求項59記載の方法。
  62. 前記植物が、減少された耐倒伏性を有し、前記方法は少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を減少させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を増加させることを含む、請求項50に記載の方法。
  63. ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3および／またはラッカーゼ5から選択され、ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4で定義されるポリペプチドをコードする、請求項62に記載の方法。
  64. 前記方法は、少なくとも1つのラッカーゼの遺伝子および／またはプロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、前記突然変異が、野生型または対照ポリペプチドと比べてラッカーゼ核酸の発現を減少させる、請求項62または63に記載の方法。
  65. 前記突然変異が、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入される、請求項64記載の方法。
  66. RNA干渉を用いて、少なくとも1つのラッカーゼ核酸、好ましくはラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を減少または消失させることを含む、請求項62記載の方法。
  67. 前記方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入し発現させることを含み、前記核酸は、配列番号10に定義されるmiR528またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、請求項62に記載の方法。
  68. 前記方法は、配列番号9を含むmiR528またはその機能的バリアントを導入することを含む、請求項67に記載の方法。
  69. 前記方法は、好ましくは対照植物または野生型植物と比較して、倒伏の変化を測定することをさらに含む、請求項50〜68のいずれかに記載の方法。
  70. 植物体を再生し、倒伏の変化についてスクリーニングすることをさらに含む、請求項50〜69のいずれかに記載の方法。
  71. 前記植物がトウモロコシである、請求項50〜70のいずれかに記載の方法。
  72. 請求項50〜71のいずれかにより取得されたかまたは取得可能な、植物。
  73. 配列番号7または16で定義されるmiR528阻害因子またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
  74. 請求項73に記載の核酸構築物を含むベクター。
  75. 配列番号8で定義されるRNA配列を有するRNA分子またはその機能的バリアントを含む、miR528阻害因子。
  76. 請求項73に記載の核酸構築物、請求項74に記載のベクター、または請求項75に記載のmiR528阻害因子を含む宿主細胞。
  77. 前記宿主細胞が細菌または植物細胞である、請求項76に記載の宿主細胞。
  78. 請求項73に記載の核酸構築物、請求項74に記載のベクター、または請求項75に記載のmiR528阻害因子を発現する、トランスジェニック植物。
  79. 前記植物がトウモロコシである、請求項78に記載のトランスジェニック植物。
  80. 対照植物または野生型植物と比べて植物における耐倒伏性を増加させるための、請求項73に記載の核酸構築物、請求項74に記載のベクター、または請求項75に記載のmiR528阻害因子の使用。
  81. 対照植物または野生型植物と比べて、植物におけるリグニン合成を調節し、リグニン含量を調節し、および／またはリグニン合成を促進させるための、請求項73に記載の核酸構築物、請求項74に記載のベクターまたは請求項75に記載のmiR528阻害因子の使用。
  82. 請求項73に記載の核酸構築物、請求項74に記載のベクターまたは請求項75に記載のmiR528阻害因子が、対照または野生型植物と比べて植物におけるリグニン合成を増加させ、および／またはリグニン含量を増加させる、請求項81の使用。
  83. リグニン合成および／またはリグニン含量が、植物の茎および／または根において増加される、請求項81または82に記載の使用。
  84. 少なくとも1つのmiR528遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメイン、または少なくとも1つのラッカーゼ3遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメイン、または少なくとも1つのラッカーゼ5遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメインをコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
  85. 前記核酸配列が少なくとも1つのプロトスペーサーエレメントをコードし、前記プロトスペーサーエレメントの配列が、配列番号34、37、41、44もしくは52、55、58、もしくは61から選択されるか、または配列番号34、37、41、44、52、55、58、もしくは61と少なくとも90%同一である、請求項84に記載の核酸構築物。
  86. 前記構築物が、CRISPR RNA（crRNA）配列をコードする核酸配列をさらに含み、前記crRNA配列が、プロトスペーサーエレメント配列および追加的ヌクレオチドを含む、請求項84または85に記載の核酸構築物。
  87. 前記構築物が、トランス活性化RNA（tracrRNA）をコードする核酸配列をさらに含み、好ましくは前記tracrRNAが配列番号31で定義されるものであるかまたはその機能的バリアントである、請求項84〜86のいずれかに記載の核酸構築物。
  88. 前記構築物が少なくとも1つのシングルガイドRNA（sgRNA）をコードし、前記sgRNAが前記tracrRNA配列及び前記crRNA配列を含み、前記sgRNAは、配列番号35、38、42、45もしくは53、56、58もしくは62から選択される配列またはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなる、請求項84〜87のいずれかに記載の核酸構築物。
  89. 前記構築物がプロモーターによって作動可能に連結されている、請求項84〜88のいずれかに記載の核酸構築物。
  90. 前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項89に記載の核酸構築物。
  91. 前記核酸構築物が、CRISPR酵素をコードする核酸配列をさらに含む、請求項84〜90のいずれかに記載の核酸構築物。
  92. 前記CRISPR酵素がCasまたはCpf1タンパク質である、請求項91に記載の核酸構築物。
  93. 前記Casタンパク質がCas9またはその機能的バリアントである、請求項92記載の核酸構築物。
  94. 前記核酸構築物がTALエフェクターをコードする、請求項84に記載の核酸構築物。
  95. 前記核酸構築物が、エンドヌクレアーゼまたはそのDNA切断ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項84または94に記載の核酸構築物。
  96. 前記エンドヌクレアーゼがFokIである、請求項95に記載の核酸構築物。
  97. crRNA配列およびtracrRNA配列を含み、前記crRNA配列が、配列番号33、36、40、43から選択される少なくとも1つの配列、もしくは配列番号51、54、57もしくは60から選択される少なくとも1つの配列、またはそれらのバリアントに結合することができる、シングルガイド（sg）RNA分子。
  98. 請求項84〜96のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸構築物、または請求項97に記載の少なくとも1つのsgRNAでトランスフェクトされた、単離された植物細胞。
  99. 請求項84〜90のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸構築物と第二の核酸構築物とでトランスフェクトされた、単離された植物細胞であって、前記第二の核酸構築物は、Casタンパク質、好ましくはCas9タンパク質またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む、単離された植物細胞。
  100. 前記第二の核酸構築物は、請求項84〜90のいずれかに記載の核酸構築物の前、後、またはそれと同時にトランスフェクトされる、請求項99に記載の単離された植物細胞。
  101. 請求項98〜100のいずれかに記載のトランスフェクトされた細胞を含む、遺伝子組換え植物。
  102. sgRNAをコードする核酸および／またはCasタンパク質をコードする核酸が安定な形態で組み込まれている、請求項101に記載の遺伝子組換え植物。
  103. 植物における耐倒伏性を増加させる方法であって、前記方法は、請求項84〜96のいずれかに記載の核酸構築物または請求項97に記載のsgRNAを植物に導入して発現させることを含み、好ましくは、前記増加が対照または野生型植物と比べた増加である、方法。
  104. 請求項103に記載の方法によって取得されたかまたは取得可能な、植物。
  105. 植物における耐倒伏性を増加させるための、請求項84〜96のいずれかに記載の核酸構築物または請求項97に記載のsgRNAの使用。
  106. 前記核酸構築物またはsgRNAが、植物におけるmiRNA528の発現および／または活性を減少させる、請求項105に記載の使用。
  107. 請求項31に記載の遺伝子組換え植物を取得する方法であって、
    (a) 植物の一部分を選定すること；
    (b) 前記(a) の植物の一部分の少なくとも1つの細胞を、請求項84〜96のいずれかに記載の核酸構築物または請求項97に記載のsgRNA分子でトランスフェクトすること；
    (c) 前記トランスフェクトされた細胞（複数可）に由来する少なくとも1つの植物を再生すること；
    (d) 前記植物において少なくとも1つのmiRNA528核酸の発現の減少を示す、前記(c)に従って得られた1つ以上の植物の選択すること
    を含む、方法。
  108. 好ましくは野生型または対照植物と比べて、増加された耐倒伏性を有する植物を同定および／または選択する方法であって、
    前記方法は、、
    植物または植物生殖質において、ラッカーゼ3の遺伝子および／またはプロモーター、ラッカーゼ5の遺伝子および／またはプロモーター、または、miR528 aおよび／またはbの遺伝子および／またはプロモーターにおける少なくとも1つの多型または突然変異を検出することと、
    前記植物またはその子孫を選択すること
    を含み、
    前記多型または突然変異は、前記突然変異を伴わない植物と比べてラッカーゼ3および／または5の発現の増加および／またはmiR528の発現／活性の減少をもたらす、
    方法。
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