CN111662924A - 一种调控水稻株型和种子粒重的基因编辑方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种调控水稻株型和种子粒重的基因编辑方法，具体地，本发明首次意外地发现，对miR156基因家族的N个成员(N≥2)进行敲除，居然可以显著改善植物性状。

Description

一种调控水稻株型和种子粒重的基因编辑方法
技术领域
本发明涉及农业和生物技术领域，具体地，涉及一种调控水稻株型和种子粒重的基因编辑方法。
背景技术
株型和千粒重是农作物产量的两大决定性因素。株型是决定谷物产量的综合性因素，它包括分蘖数、株高、叶长、叶夹角、穗型、茎秆直径等因素。良好的株型有利于密植、抗病、抗倒伏、群体通风和提高光合作用利用效率，是培育高产品种的关键因素。因此优良株型的选育是作物育种学家的重要课题。
水稻基因组中有11个miR156的表达基因(MIR156a–MIR156i，MIR156k和MIR156l)，可转录产生12种miR156前体序列，目前MIR156家族基因的功能分化情况尚不清楚。
因此，目前本领域迫切需要开发一种调控水稻株型和种子粒重的基因编辑方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控水稻株型和种子粒重的基因编辑方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过控制miR156表达水平或活性来调控植物性状的方法。更具体的，本发明提供一种通过降低或阻断或抑制miR156家族中至少一个基因的表达水平来调控植物的性状的方法，所述性状包括株型、千粒重、粒型、籽粒长度、或其组合。
本发明第一方面提供了一种改良植物的方法，包括步骤：
(i)对植物细胞或植物组织进行基因工程改造，从而使得miR156基因家族中的N个成员发生突变，其中N≥2(较佳地N≥3，更佳地，4-10，更佳地，4-8，更佳地，5-6)，所述miR156基因家族包括I类miR156s；
(ii)将经基因工程改造的植物细胞或植物组织再生成植株，对再生的植株进行性状测试，所述性状选自下组：株型、千粒重、粒型、籽粒长度、或其组合；
(iii)根据性状测试结果，选出具有所需性状特征的植株。
在另一优选例中，当N≥2(较佳地N≥3，更佳地，4-10，更佳地，4-8，更佳地，5-6)时，所述性状选自下组：株型、千粒重、粒型、籽粒长度、或其组合。
在另一优选例中，所述株型包括分蘖数、株高、叶长、叶夹角、穗型、茎秆直径。
在另一优选例中，所述所需性状特征选自下组：减少或增加分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加或降低株高、增加或减小茎杆直径、或其组合。
在另一优选例中，所述I类miR156s选自下组：MIR156d、MIR156e、MIR156h、MIR156i、MIR156f、MIR156g、或其组合。
在另一优选例中，所述miR156基因家族还包括II类miR156s。
在另一优选例中，所述II类miR156s选自下组：MIR156a、MIR156b、MIR156c、MIR156k、MIR156l、或其组合。
在另一优选例中，所述突变包括降低miR156基因家族中N个成员的表达或活性。
在另一优选例中，所述的突变包括一个或多个碱基的插入、缺失或替换。
在另一优选例中，用选自下组的方法进行突变：基因编辑、自然变异、诱变、或其组合。
在另一优选例中，所述“降低”是指将miR156基因家族中N个成员的表达或活性降低满足以下条件：
A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；
其中，A1为miR156基因家族中N个成员的表达或活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同miR156基因家族中N个成员的表达或活性。
在另一优选例中，所述的降低指与野生型miR156家族的成员的表达水平E0相比，所述植株中miR156家族的成员的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％。
在另一优选例中，所述的降低植株中miR156基因家族中N个成员的表达或活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术、或其组合。
在另一优选例中，所述的降低植株中miR156基因家族中N个成员的表达或活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、或其组合。
在另一优选例中，所述的基因编辑技术选自CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。
在另一优选例中，所述具有所需性状特征的植株选自下组：mir156dehi、mir156deghi、mir156defghi、mir156defghi、mir156defgh、mir156defgi、mir156dfgi、mir156efgi、mir156efgh、mir156eghi、mir156efg、mir156fgi、mir156ghi、mir156ei、mir156fg、mir156defij、或其组合。
在另一优选例中，所述具有所需性状特征的植株选自下组：mir156dehi、mir156defgh、mir156defghi、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：单子叶双子叶、双子叶植物、裸子植物、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：禾本科植物、豆科植物、十字花科植物、或其组合。
在另一优选例中，所述的植物包括：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草、番茄、白菜、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜、或其组合。
在另一优选例中，所述基因工程改造包括用一个或多个sgRNA介导的Cas9核酸酶对miR156基因家族的成员进行基因编辑。
在另一优选例中，所述基因编辑包括对选自下组的miR156基因家族的两种或两种以上的基因进行基因编辑：MIR156d、MIR156e、MIR156h、MIR156i、MIR156f、MIR156g、或其组合。
在另一优选例中，所述基因编辑还包括对选自下组的miR156基因家族的两种或两种以上的基因进行基因编辑：MIR156a、MIR156b、MIR156c、MIR156k、MIR156l、或其组合。
在另一优选例中，所述基因编辑包括对选自下组的miR156基因家族的两种或两种以上的基因进行基因编辑：MIR156d、MIR156e、MIR156h、MIR156i、MIR156f、MIR156g、MIR156a、MIR156b、MIR156c、MIR156k、MIR156l、或其组合。
本发明第二方面提供了一种基因工程的植物组织或植物细胞，所述植物组织或植物细胞中的miR156基因家族中的N个成员发生突变，其中N≥2(较佳地，N≥3，更佳地，N为4-10，更佳地，N为4-8，更佳地，N为5-6)，其中所述miR156基因家族包括I类miR156s。
在另一优选例中，所述突变包括降低miR156基因家族中N个成员的表达或活性。
本发明第三方面提供了一种制备基因工程的植物组织或植物细胞的方法，包括步骤：
将植物组织或植物细胞中的miR156基因家族中的N个成员发生突变，从而获得基因工程的植物组织或植物细胞，其中N≥2(较佳地，N≥3，更佳地，N为4-10，更佳地，N为4-8，更佳地，N为5-6)，其中所述miR156基因家族包括I类miR156s。
在另一优选例中，所述的方法包括以下步骤：
(1)向所述的植物组织或植物细胞中引入表达基因编辑工具的表达载体，使其与细胞内源性基因组整合并表达，所述基因编辑工具包括靶向和切割DNA的核酸酶以及靶向结合miR156基因的向导RNA；
(2)选择被编辑的植物细胞或组织。
在另一优选例中，所述的引入方法包括农杆菌侵染、基因枪法、电击发、聚乙二醇转化法、病毒转化、显微注射法。
在另一优选例中，所述表达载体进一步含有一种或多种筛选标记基因，抗生素基因(如抗氨苄青霉素或卡那霉素基因)、抗除草剂基因(如Bar基因、Gox基因)、荧光基因(如LacZ基因)、颜色反应报告基因(如GUS基因)。
本发明第四方面提供了一种制备基因工程的植物的方法，包括步骤：
将本发明第三方面所述方法制备的基因工程的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得基因工程的植物。
本发明第五方面提供了一种基因工程的植物，所述的植物是用本发明第四方面所述的方法制备的。
本发明第六方面提供了一种生产粮食的方法，包括步骤：
(i)种植农作物，所述农作物中miR156基因家族中的N个成员发生突变，其中N≥2(较佳地，N≥3，更佳地，N为4-10，更佳地，N为4-8，更佳地，N为5-6)，其中所述miR156基因家族包括I类miR156s；
(ii)收获所述农作物的粮食(谷物)。
在另一优选例中，所述农作物选自下组包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、高粱、小麦、或大豆。
本发明第七方面提供了一种调控植物性状的方法，包括步骤：降低植物体内miR156基因家族中N个成员的表达或活性，其中N≥2(较佳地N≥3，更佳地，4-10，更佳地，4-8，更佳地，5-6个)，所述miR156基因家族包括I类miR156s。
在另一优选例中，所述性状选自下组：株型、千粒重、粒型、籽粒长度、或其组合。
在另一优选例中，所述调控植物性状选自下组：减少或增加分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加或降低株高、增加或减小茎杆直径、或其组合。
在另一优选例中，所述的方法包括使植物体内miR156发生突变或添加miR156抑制剂的步骤。
在另一优选例中，所述miR156的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。
本发明另一方面，提供了一种降低miR156表达的方法，其步骤包括添加miR156抑制剂，并使其与miR156家族中的一个或多个基因结合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了MIR156基因编辑策略。(A)编辑MIR156基因的单sgRNA表达载体。箭头表示启动子；箭头后面的长方形框表示sgRNA表达序列；#，靶位点所用的PAM序列为CAG；*，靶位点第20位碱基与sgRNA不匹配。(B)II类MIR156s的多基因编辑策略。箭头表示启动子；箭头后面的长方形框表示sgRNA表达序列；*，靶位点第20位碱基与sgRNA不匹配。(C)MIR156编辑的靶位点选择。下划线表示Cas9的靶位点，框内序列对应于成熟miR156序列。
图2显示了I类MIR156基因突变改变水稻株型。(A)成熟期，野生型(NIP)、mir156fg、mir156deghi和mir156defghi的株型对比。标尺，10cm。(B)灌浆期，野生型(NIP)、mir156fg、mir156dehi、mir156deghi和mir156defghi的分蘖数对比。(C)成熟期，野生型(NIP)、mir156fg、mir156dehi、mir156deghi和mir156defghi的株高对比。(D)成熟期，野生型(NIP)、mir156fg、mir156dehi、mir156deghi和mir156defghi第二节茎秆直径对比。第二节指从上部数的第二节。(E)成熟期，野生型(XS134)、mir156fg、mir156dehi和mir156defghi的表型对比。标尺，10cm。(F)灌浆期，野生型(XS134)、mir156fg、mir156dehi和mir156defghi的分蘖数对比。*，与野生型差异的P值小于0.05；***，与野生型差异的P值小于0.001。NIP，野生型日本晴；XS134，野生型秀水134。
图3显示了I类MIR156基因突变增加种子粒长和千粒重。(A)野生型(NIP)、mir156fg和mir156defghi的粒型对比。标尺，2cm。(B)野生型(NIP)和mir156突变体种子粒长对比。(C)野生型(NIP)和mir156突变体种子粒宽对比。(D)野生型(NIP)和mir156突变体种子粒厚对比。(E)野生型(NIP)和mir156突变体种子千粒重对比。(F)野生型(XS134)、mir156fg和mir156dehi的粒型对比。标尺，2cm。(G)野生型(XS134)和mir156突变体种子粒长对比。(H)野生型(XS134)和mir156突变体种子粒宽对比。(I)野生型(XS134)和mir156突变体种子粒厚对比。(J)野生型(XS134)和mir156突变体种子千粒重对比。***，与野生型差异的P值小于0.001。NIP，野生型日本晴；XS134，野生型秀水134。
图4显示了II类mir156突变体和mir156abcdfghikl的株型分析。(A)成熟期，野生型(NIP)、mir156abc和mir156abckl的表型对比。标尺，10cm。(B)成熟期，野生型(XS134)、mir156abc和mir156abckl的表型对比。标尺，10cm。(C)灌浆期，野生型(NIP)和mir156abckl的分蘖数对比。(D)野生型(XS134)和mir156abckl的分蘖数对比。(E)成熟期，野生型(NIP)和mir156abcdfghikl的表型对比。标尺，10cm。(F)灌浆期，野生型(NIP)、mir156dehi、mir156defghi和mir156abcdfghikl的分蘖数对比。***，与野生型差异的P值小于0.001。NIP，野生型日本晴；XS134，野生型秀水134。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现，对miR156基因家族(如I类miR156s)的N个成员(N≥2，较佳地，N≥3，更佳地，N为4-10，更佳地，N为4-8，更佳地，N为5-6)进行敲除，居然可以显著改良植物的某些性状，例如减少分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加株高、增加茎杆直径等。具体地，本发明首次利用基因敲除技术(如CRISPR/Cas9基因编辑技术)对水稻I类miR156s基因进行了敲除研究，发现通过对不同水稻I类miR156s基因家族成员的敲除，可以改良某些所需的农艺性状，其中，mir156dehi、mir156deghi、mir156defghi、mir156defghi、mir156defgh、mir156defgi、mir156dfgi、mir156efgi、mir156efgh、mir156eghi、mir156efg、mir156fgi、mir156ghi、mir156ei、mir156fg、mir156defij等突变体可减少分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加株高、增加茎杆直径等性状。并且，申请人首次发现，将I类miR156s和II类miR156s同时敲除，也可显著改良植物的某些性状，例如减少分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加株高、增加茎杆直径等。在此基础上，本发明人完成了本发明。
如本文所用，术语“I类MIR156s”、“II类MIR156s”指MIR156基因家族的亚型。
miR156基因
miRNA是一类由21～24核苷酸所组成的非编码RNA分子。它们起源于单链RNA前体基因，由RNA聚合酶II转录，形成茎环结构，最终剪切加工形成成熟miRNA。一些高度保守的miRNA其正确的时空积累对于维持植物正常的发育是必不可少的，如miR156。miR156的靶基因是被称作SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)的家族。SPL蛋白质家族是植物特有的一大类转录因子家族，具有高度保守的DNA结合区域-SBP结构域。
水稻基因组中有11个miR156的表达基因(MIR156a–MIR156i，MIR156k和MIR156l)，可转录产生12种miR156前体序列，其中pre-miR156h和pre-miR156j前体来自于同一个基因，该基因在本发明中被称为MIR156h。
已有的研究表明，miR156基因家族的基因有高度的保守性，并且对于植物的生长而言(尤其是株型、千粒重、粒型、籽粒长度)是至关重要的。本发明的研究提示，对单个miR156基因家族中的基因的改造(如敲除或下调)，不会表现出对植物性状(如株型、千粒重、粒型、籽粒长度)的改善。
在本发明中，MIR156基因家族成员，如I类MIR156s(包含MIR156d、MIR156e、MIR156h、MIR156i、MIR156f和MIR156g)，可调控株型和稻谷粒型，并且对种子休眠也有影响。
在本发明中，I类MIR156基因突变减少分蘖数、增加籽粒长度和千粒重、增加株高和茎秆直径。本发明将为水稻株型改良和产量提高提供重要的基因资源和方法。
在本发明中，miR156基因家族还包括II类MIR156s(包含MIR156a、MIR156b、MIR156c、MIR156k和MIR156l)。I类MIR156基因(即I类MIR156s)和II类MIR156基因(即II类MIR156s)同时突变也可改良植物性状，比如，可减少分蘖数、增加籽粒长度和千粒重、增加株高和茎秆直径。在本发明中，可对任何植物品种的I类MIR156基因的N个基因(N≥2，较佳地，N≥3，更佳地，N为4-10，更佳地，4-8，更佳地，5-6)进行敲除，代表性的植物包括，但并不限于：林业植物、农用植物，例如禾本科、十字花科、豆科等，如水稻、玉米、高粱、小麦、大豆、或其组合。
应理解，不同的植物中可能含有多个I类MIR156基因(即来自I类MIR156基因的多个基因)。在本发明中，所述的I类MIR156基因包括来自所述植物(或物种)的全部已知的MIR156基因，以及将来可能发现的MIR156基因，以及与这些MIR156基因具有同源性的同源基因。其中，所述的“具有同源性”指两个序列之间具有≥70％，较佳地≥80％，更佳地≥90％，最佳地≥95％相同性。
在其他植物中，一般地，I类MIR156基因的同源基因的通用名称为MIR156基因，也可在MIR156基因名称前加物种拉丁名缩写。比如，小麦MIR156基因也称为Tae-MIR156；玉米MIR156基因也称为Zea-mir156；在大豆MIR156基因也称为Soy-miR156。
以水稻为例，已知至少有6个I类MIR156基因，即MIR156d、MIR156e、MIR156h、MIR156i、MIR156f和MIR156g。在本发明中，两个或多个MIR156基因可合并表述，例如“mir156fg”表示mir156f和mir156g。
在一优选实施方式中，所述水稻I类MIR156基因的敲除类型如下所示：mir156dehi、mir156deghi、mir156defghi、mir156defghi、mir156defgh、mir156defgi、mir156dfgi、mir156efgi、mir156efgh、mir156eghi、mir156efg、mir156fgi、mir156ghi、mir156ei、mir156fg、mir156defij。
基因工程
在本发明中，所述基因工程是指通过人工干预的方式对控制生物遗传信息的核苷酸进行改造和利用，从而获得新的遗传特性、或新品种、或新产品的技术，包括本领域所公开的所有基因改造技术，如基因诱变、转基因或基因编辑等方法。基因诱变的方法包括但不限于物理诱变(比如紫外线诱变)、化学诱变(比如吖啶类染料)、生物诱变(如病毒、噬菌体诱变)等。在一优选实施方式中，本发明的基因工程改造包括用一个或多个sgRNA介导的Cas9核酸酶对miR156基因家族的成员进行基因编辑。
改良植物的方法
在本发明中，还提供了一种改良植物的方法，包括步骤：
(i)对植物细胞或植物组织进行基因工程改造，从而使得miR156基因家族中的N个成员发生突变，其中N≥2(较佳地N≥3，更佳地，N为4-10，更佳地，N为4-8，更佳地，N为5-6)，所述miR156基因家族包括I类miR156s；
(ii)将经基因工程改造的植物细胞或植物组织再生成植株，对再生的植株进行性状测试，所述性状选自下组：株型、千粒重、粒型、籽粒长度、或其组合；
(iii)根据性状测试结果，选出具有所需性状特征的植株。
在本发明中，所述突变包括降低miR156基因家族(I类miR156基因)中N个成员的表达或活性。
在一优选实施方式中，所述“降低”是指将miR156基因家族中N个成员的表达或活性降低满足以下条件：
A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；
其中，A1为miR156基因家族中N个成员的表达水平或活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同miR156基因家族中N个成员的表达水平或活性。
在一优选实施方式中，所述的降低指与野生型miR156基因家族的成员的表达水平E0相比，所述植株中miR156基因家族的成员的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％。
在一优选实施方式中，所述的降低植株中miR156基因家族中N个成员的表达或活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术、或其组合。
在本发明中，根据性状测试结果，排除性状不好的植株。
在本发明中，还进一步包括步骤(iv)，对步骤(iii)选出的具有所需形状特征的植株作进一步的筛选，从而筛选出能够平衡种子休眠、株型、千粒重、粒型、籽粒长度等性状的植株，所述植株的综合性状表现最优。
生产粮食的方法
本发明还提供了一种生产粮食的方法，包括步骤：
(i)种植农作物，所述农作物中miR156基因家族中的N个成员发生突变，其中N≥2(较佳地，N≥3，更佳地，N为4-10，更佳地，N为4-8，更佳地，N为5-6)，其中所述miR156基因家族包括I类miR156s；
(ii)收获所述农作物的粮食(谷物)。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次发现通过对不同植物(如水稻)miR156基因家族(如I类miR156基因)成员的敲除，可以显著地减少分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加株高、增加茎杆直径，并且同时还可增强种子休眠。
(b)本发明首次对不同植物(如水稻)miR156基因家族(如I类miR156基因)成员的敲除后的性状进行测试，挑出具有所需性状特征(如减少分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加株高、增加茎杆直径)的植株。
(c)本发明首次发现mir156dehi、mir156deghi、mir156defghi、mir156defghi、mir156defgh、mir156defgi、mir156dfgi、mir156efgi、mir156efgh、mir156eghi、mir156efg、mir156fgi、mir156ghi、mir156ei、mir156fg、mir156defij突变体可增强种子休眠。
(d)本发明首次发现，将I类miR156s和II类miR156s同时敲除，也可显著改良植物的某些性状，例如减少分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加株高、增加茎杆直径等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-A LaboratoryMannual,Melody S.Clark编,Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻MIR156基因
为敲除MIR156基因，我们首先构建了6个特异靶向MIR156基因的单sgRNA表达载体，其中载体vector I(表达sgRNA1)靶向6个基因(MIR156d–MIR156i)，载体vector II(表达sgRNA2)靶向MIR156f和MIR156g，其他四个载体(分别表达sgRNA3–sgRNA6)靶向剩余的五个基因(MIR156a、MIR156b、MIR156c、MIR156k和MIR156l)(图1A和1C)。这些载体的转基因受体为粳稻品种日本晴和秀水134，其中秀水134是中国东南地区广泛推广的优良品种。所有材料的田间表型分析均在上海和杭州进行。
实施例2 mir156fg突变微调分蘖数
通过vector II我们获得了大量的mir156fg突变体，其中日本晴背景下的有36个株系，秀水134背景下的有25个株系。在日本晴背景下，mir156fg的分蘖数常常比野生型微少；除分蘖数和种子粒型外，未发现野生型和mir156fg间存在其他明显的差异(图2A–2D)。在秀水134背景下，野生型和mir156fg的分蘖数没有明显差异；除种子粒型外，未发现野生型和mir156fg间存在其他明显的差异(图2E和2F)。不同背景下表型显现的差异可能来源于日本晴和秀水134分蘖能力的差异。日本晴是一个分蘖能力比较强的品种，因此微弱的分蘖减少可以被观测到；而秀水134的分蘖能力较弱，在相同的栽培条件下，其分蘖数往往不到日本晴的一半，因此mir156fg突变对分蘖数的影响不易在秀水134品种上展现出来。
实施例3 MIR156d、MIR156e、MIR156h和MIR156i调控综合株型
通过载体vector I我们获得了mir156dehi、mir156deghi和mir156defghi三种突变组合。在日本晴和秀水134背景下，每种突变组合都有至少18个独立的株系，同一突变组合内不同株系的表型类似。这三种突变体的分蘖数呈现不同程度的减少，其大小顺序为mir156dehi>mir156deghi>mir156defghi(图2A、2B、2E和2F)。除分蘖数之外，mir156dehi、mir156deghi和mir156defghi株型的其他方面类似；与野生型相比，他们都表现出株高增加和茎秆粗壮的表型(图2A和2C–2E)。
在日本晴背景下，通过miR156fg和mir156dehi的杂交，我们还获得了mir156defghi、mir156defgh、mir156defgi、mir156dfgi、mir156efgi、mir156efgh、mir156eghi、mir156efg、mir156fgi、mir156ghi和mir156ei等突变体，这些突变体的分蘖数呈现不同程度的减少，而株高呈现不同程度的增加(表1)。
表1 I类mir156突变体的分蘖数、株高和主穗籽粒数
Figure BDA0002400143530000121
Figure BDA0002400143530000131
a,b,c与野生型对比的P值分别小于0.05、0.01和0.001；每个植株3个最大的稻穗用来统计主穗籽粒数；NIP，野生型日本晴。
实施例4 I类MIR156基因突变增加种子粒长和千粒重
在日本晴和秀水134背景下，I类MIR156基因突变增加种子粒长和千粒重，而对种子粒宽和粒厚没有明显的影响(图3A–3J)。在mir156fg、mir156dehi和mir156defghi三种突变组合中，其种子粒长和千粒重的大小顺序为：mir156defghi>mir156dehi>mir156fg(图3B、3E、3G和3J)。
实施例5 II类MIR156基因突变对株型和种子粒型未有显著影响
通过其他四个载体(分别表达sgRNA3–sgRNA6)，我们获得了mir156a、mir156b、mir156c、mir156ac、mir156bc、mir156abc、mir156k和mir156l等突变体。在日本晴和秀水134背景下，这些突变体在株型和种子粒型上与野生型未有明显差异。为进一步研究这五个基因的功能，我们构建了一个同时表达sgRNA3–sgRNA6的多基因编辑载体(图1B)。通过农杆菌介导的转化方法，我们获得了纯合的mir156abcl和mir156abckl突变体，其中mir156abcl每个背景下至少有26个株系，mir156abckl每个背景下各有5个株系。通过连续三个种植季的表型观测，我们发现mir156abcl和mir156abckl在株型和种子粒型上与野生型未有明显差异(图4A–4D、图3B–3E和图3G–3J)。
在日本晴背景下，通过基因枪介导的共转化方法，我们获得了两个株系的mir156abcdfghikl突变体(除MIR156e外，其他10个MIR156基因同时突变)。另外通过mir156abckl和mir156defghi的杂交，我们获得了另一个mir156abcdfghikl株系(日本晴背景)。通过细致的表型观测，我们发现mir156abcdfghikl的分蘖数少于mir156dehi，但略多于mir156defghi(图4F)。mir156abcdfghikl成年期株型其他方面与mir156dehi、mir156defij和mir156defghi未有明显的差别(图4E)。与野生型相比，mir156abcdfghikl的种子粒长和千粒重也显著增加，但其粒长和千粒重不比mir156defghi大(图3B和3E)。
这些结果说明MIR156a、MIR156b、MIR156c、MIR156k和MIR156l等五个基因在株型和粒型调控上的功能不显著。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种改良植物的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)对植物细胞或植物组织进行基因工程改造，从而使得miR156基因家族中的N个成员发生突变，其中N≥2，所述miR156基因家族包括I类miR156s；
(ii)将经基因工程改造的植物细胞或植物组织再生成植株，对再生的植株进行性状测试，所述性状选自下组：株型、千粒重、粒型、籽粒长度、或其组合；
(iii)根据性状测试结果，选出具有所需性状特征的植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述所需性状特征选自下组：减少或增加分蘖数、增加籽粒长度、增加千粒重、增加或降低株高、增加或减小茎杆直径、或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述I类miR156s选自下组：MIR156d、MIR156e、MIR156h、MIR156i、MIR156f、MIR156g、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述miR156基因家族还包括II类miR156s。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述II类miR156s选自下组：MIR156a、MIR156b、MIR156c、MIR156k、MIR156l、或其组合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变包括降低miR156基因家族中N个成员的表达或活性。
7.一种基因工程的植物组织或植物细胞，其特征在于，所述植物组织或植物细胞中的miR156基因家族中的N个成员发生突变，其中N≥2，其中所述miR156基因家族包括I类miR156s。
8.一种制备基因工程的植物组织或植物细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
将植物组织或植物细胞中的miR156基因家族中的N个成员发生突变，从而获得基因工程的植物组织或植物细胞，其中N≥2，其中所述miR156基因家族包括I类miR156s。
9.一种制备基因工程的植物的方法，其特征在于，包括步骤：
将权利要求8所述方法制备的基因工程的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得基因工程的植物。
10.一种生产粮食的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)种植农作物，所述农作物中miR156基因家族中的N个成员发生突变，其中N≥2，其中所述miR156基因家族包括I类miR156s；
(ii)收获所述农作物的粮食(谷物)。
11.一种调控植物性状的方法，其特征在于，包括步骤：降低植物体内miR156基因家族中N个成员的表达或活性，其中N≥2，所述miR156基因家族包括I类miR156s。
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