CN105087640A

CN105087640A - 调节植物种子发育的基因及其应用

Info

Publication number: CN105087640A
Application number: CN201410222196.9A
Authority: CN
Inventors: 薛红卫; 林丽碧
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2034-05-23
Also published as: CN105087640B

Abstract

本发明涉及调节植物种子发育的基因及其应用。本发明首次提出，植物中miR535基因在调控植物种子发育中发挥重要作用，其能调控植物籽粒大小及重量，调控植株分蘖，以及调控植物颖壳发育。

Description

调节植物种子发育的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，更具体地，本发明涉及一种调节植物种子发育的基因及其应用。

背景技术

水稻等禾本科植物是人类重要的粮食作物之一，其耕种与食用的历史都相当悠久。稻米不仅营养价值高(包含了糖类、蛋白质、钙、磷、维生素B群)而且淀粉粒小且纤维素含量少，使其独具口感好又便于人体消化的优点。为了应对由全球人口的持续增长和生态环境恶化造成的全球性粮食短缺问题，育种家们致力于改良作物培育稳定高产的新品种。粒重作为水稻产量的三个主要因素之一(包括：每株有效穗数、每穗粒数和粒重)由粒长、粒宽和粒厚决定的，人们希望通过分析利用水稻种子大小的调控机理以有效地提高育种家门培育稳定高产作物的效率。另有充分的证据表明种子的大小与植物生长的许多方面，例如与小粒种子相比大粒品种在苗期能忍受更大的压力，而小粒品种在给定同样的能量下能结出更多的种子。尽管研究者认识到种子大小的发育不仅由内在的发育信号所控制，且经常受到外界环境信号的影响。但是目前对其中的分子机制知之甚少，因此探索决定植物种子大小和重量的遗传发育和分子机制具有重要意义。

近十多年来，研究者们利用图位克隆技术发现了一些与种子大小性状紧密相关的主效QTL。在水稻中，已经鉴定了GS3、GIF1、GW2、GW5和GW8五个控制谷粒大小的基因：GS3控制谷粒长度和重量，编码GS3转膜蛋白；GW2控制谷粒宽度和重量，编码环指泛素连接酶E3；GIF1控制谷粒充实度，编码细胞壁转化酶；GW5和GW8控制谷粒宽度和重量，编码多聚泛素结合核蛋白和转录因子。另有DNAMETHYLTRANSFERASE1(MET1)和DECREASEINDNAMETHYLATION1(DDM1)突变急剧减少DNA甲基化，导致亲本效应影响种子大小。

随着是一类重要的smallRNAs(sRNAs)分子—microRNAs(miRNAs)在禾本科植物中的发现，越来越多的证据表明不仅这些编码的蛋白产物的QTL基因可以影响了水稻的产量性状，miRNAs也被报道直接或间接地参与种子大小的调控。在水稻中过量表达OsmiR397会降低靶基因LAC的蛋白产物从而增大种子大小有效提高了水稻产量。玉米中也报道了与miR156相近的ZmmiR529调控靶基因TASSELSHEATH4控制分生组织建成影响籽粒发育。

miR156是一类广泛存在于绿色植物中的高度保守的小RNA。尽管目前尚未有其调控植物种子大小的证据，但是在多个物种中都已明确报道其靶向的SPL基因家族对花序及种子发育的调控作用。ShaokuiWang等人发现的控制水稻粒宽及产量的重要数量形状基因GW8-SPL16为OsSPL16家族成员。另有研究表明对于玉米花序形态建成具有重要作用的TEOSINTEGLUMEARCHITECTURE(TGA1)基因也隶属SPL家族。尽管这些证据提示miRNAs对植物种子发育具有重要作用，但相较于编码基因人们对二者的联系仍然知之不多。因此，本领域有必要进一步研究与种子发育相关的小RNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调节植物种子发育的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种提高植物产量、增大植物种子、增大植物种子颖壳或增加植物分蘖数目的方法，所述植物是禾本科植物，所述方法包括：上调植物中miR535基因或其前体的表达(即：使之过表达)。

在一个优选例中，所述的禾本科植物包括(但不限于)：水稻、小麦、玉米、黑麦、高粱。

在另一优选例中，所述的miR535基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；或

所述的miR535前体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

在另一优选例中，所述上调植物中miR535基因或其前体的表达包括：将表达miR535基因或其前体的载体转入植物中。

在另一优选例中，所述方法包括：利用农杆菌转化法将表达miR535基因或其前体的载体转入植物中。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有能够在细胞内形成miR535前体的序列；

(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述能够在细胞内形成miR535前体的序列转入植物；和

(3)选择出转入了能够在细胞内形成miR535前体的序列的植物；

较佳地，所述的能够在细胞内形成miR535前体的序列的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

在另一优选例中，所述的表达载体中，利用强启动子驱动基因的表达。

在另一优选例中，所述的增大植物种子包括：增长植物种子粒长和增宽植物种子粒宽。

在本发明的另一方面，提供一种miR535基因或其前体的用途，用于：

提高植物产量；

增大植物种子；

增大植物种子颖壳；

增加植物分蘖数目；或

剪切植物细胞内的SPL3、SPL11、SPL12、SPL14或SPL16基因，下调这些基因的表达；

其中，所述植物是禾本科植物。

在本发明的另一方面，提供一种miR535基因或其前体的用途，用于增加植物种子外颖壳的细胞数或促进植物花器官发育，所述植物是禾本科植物。

在一个优选例中，所述的miR535基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；或

所述的miR535前体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

在本发明的另一方面，提供一种miR535基因或其前体的用途，用于作为鉴定植物产量性状、种子性状、颖壳性状或分蘖性状的分子标记。

在一个优选例中，若经检测植物组织中miR535基因或其前体表达高于一个特定值，则相对而言，所述植物的产量增加、植物种子增大、植物种子颖壳增大或植物分蘖数目增加。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指野生型植物中miR535基因或其前体表达量的平均值。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1表示OsmiR535与OsmiR156的序列比对。

图2表示同源小RNA：miR156、miR157、miR535在各物种中的分布的分析。

图3表示Q-RTPCR检测OsmiR535在不同时期花序(inflorescence)中的表达水平。

图4表示pOsMIR535::GUS转化植物后，植物花序组织中的GUS染色情况。

图5表示pUBI::OsMIR535转基因水稻籽粒增大。

图6表示统计pUBI::OsMIR535转基因材料籽粒的长度、宽度、高度及千粒重。

图7表示农杆菌瞬时转化验证miR535可以降低OsSPL12的mRNA水平。

图8表示qR-PCR的方法检测OsSPL家族成员。

图9表示构建抗剪切靶基因mOsSPL12的示意图。

图10表示qRTPCR转基因植株的鉴定。

图11表示pUBI::mOsSPL12转基因材料谷粒变小。A为谷粒对比照片；B为谷粒长宽高及千粒重的统计。

图12表示扫描电镜观察ZH11、pUBI::OsmiR535、pUBI::OsSPL12外颖细胞并统计。

图13表示OsSPL12蛋白亚细胞定位。

图14、miR535的前体的序列结构。

具体实施方式

本发明人以转基因技术为背景，研究了可能参与水稻种子大小调控的小RNA，从中获得了是一个古老又保守的小RNA——miR535。本发明首次提出，植物中miR535基因在调控植物种子发育中发挥重要作用，其能调控植物籽粒大小及重量，调控植株分蘖，以及调控植物颖壳发育。miR535通过SPL12基因调控植物种子发育的生物功能，从而实现植物品种改良。在此基础上完成本发明。

本发明中，所述“植物”是表达miR535(较佳地还表达其靶基因SPL)的植物；较佳地，所述植物包括但不限于：禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。优选的，所述的植物是禾本科植物。更优选的，所述植物包括(但不限于)：水稻、小麦、玉米、黑麦、高粱等。

本发明人意外地发现，miR535基因参与了对于植物性状的调控，特别是提高植物产量、增大植物种子、增大植物种子颖壳或增加植物分蘖数目。

本发明中，miR535基因还包括具有与SEQIDNO.1所示核苷酸序列高同源性的核苷酸序列。其中，所述高同源性是指同源性>60％；较佳地，同源性>80％；更佳地，同源性>90％或更高。

本发明还提供包含miR535基因的多核苷酸序列的表达载体，优选植物表达载体；更优选适合于进行后续转基因操作(如应用农杆菌的转基因操作)的表达载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明还提供遗传工程化的宿主细胞，其含有miR535的多核苷酸序列或含有包含miR535多核苷酸序列的载体。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的miR535基因的用途，用于提高植物产量、增大植物种子、增大植物种子颖壳或增加植物分蘖数目；用于剪切植物细胞内的SPL3、SPL11、SPL12、SPL14或SPL16基因，下调这些基因的表达；或用于增加植物种子外颖壳的细胞数或促进植物花器官发育。过表达miR535可以实现上述性状的改良。较佳地，所述的植物是禾本科植物。

本发明还涉及miR535基因的上调剂及其用途。由于miR535的上调剂可调节miR535的表达和/或调节miR535的活性，因此，所述的miR535的上调剂也可通过对miR535的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。

任何可提高miR535的活性、增强miR535的稳定性、促进miR535的表达、延长miR535有效作用时间的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物产量、种子大小、分蘖数、颖壳大小的有效物质。

作为本发明的一种实施方式，miR535的核苷酸序列通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述miR535的植物细胞中，使所述的植物细胞表达miR535。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达miR535的植物。优选的，利用农杆菌转化法将miR535的编码基因转入植物中。

也可通过用强启动子驱动从而增强miR535基因的表达。或者通过增强子来增强该miR535基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验材料

1、植物品种

水稻(Oryzasativa)材料为粳稻日本晴(O.sativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare)。在人工气候室培养，生长条件为12h光照，28℃；12h黑暗，24℃。光量子通量密度为200～250μMm^-2s^-1。

2、菌株、质粒、试剂盒和化学品

2.1菌株

大肠杆菌(Escherichiacoli)：XL1-Blue，质粒转化受体菌(Stratagene，CA，USA)。

农杆菌(Agrobacteriumtrumefaciens)：EHA105，根癌农杆菌，用于水稻转化。GV3101，用于烟草转化。

2.2质粒载体

pMD18-T(TaKaRa，Dalian，China)，用于TA克隆，Amp^r。

pUBI1301(CAMBIA中心)，具有Km^r(菌株)和Hyg^r(植株)，用于构建表达载体。

pCAMBIA1300+pBI101质粒：具有Km^r(菌株)和Hyg^r(植株)。用于构建启动子区域驱动的GUS报告基因载体，研究基因的表达模式。pCAMBIA1300+pBI101构建：pBI101的GUS-NOS编码区的pCAMBIA1300的T-Boader和Ubipromoter之间位点。

PA7-GFP获自德国马普分子植物生理学研究所，用于构建融合载体，研究基因的亚细胞定位。

2.3引物及探针

所涉及的引物及探针如表1。

表1

2.4质粒构建

pOsMIR535::GUS如下构建：首先利用引物Promoter-miR535-F和Promoter-miR535-R以高保真酶KOD扩增MIR535上游1.2kb片段，产物经PST/XbaI酶切后连入pCAMBIA1300+pBI101质粒。

pUBI::OsMIR535如下构建：

miR535颈环结构基因序列：利用Clone-miR535-F和Clone-miR535-R从水稻ZH11的基因组中扩增获得(114bp)。其中含有可在细胞内形成发卡结构RNA前体的DNA序列，序列如下(94bp)：

GGCGGTGACAACGAGAGAGAGCACGCCGGTGCGGCGGTCACGGTGAGCCGGCCCGCGGCGGCGTACCTGCGTGCTTTCTC CGTTGTCACTGCC(SEQIDNO:2)。

该序列在转入细胞内后，可以形成RNA前体，颈环结构如图14所示；序列如下(94bp)：

GGCGGUGACAACGAGAGAGAGCACGCCGGUGCGGCGGUCACGGUGAGCCGGCCCGCGGCGGCGUACCUGCGUGCUUUCUC CGUUGUCACUGCC(SEQIDNO:3)。

将包含miR535颈环结构的基因序列用引物Clone-miR535-F和Clone-miR535-R以高保真KOD酶扩增，产物加A回收后克隆到pMD18-T(TaKaRa，Cat.D504A)中，应用KpnI将片段克隆到pUN1301(购自CAMBIA中心)的Ubiquitin启动子下游。

35S::miR156如下构建：以水稻ZH11的基因组为模板，将miR156基因用引物Clone-miR156-F和Clone-miR156-R以高保真KOD酶扩增，平端连入1301P(在PCAMBIA1301的10782BstXC插入CAMV35S启动子和多克隆位点(MCS：KpnI，SmaI，BamHI，XbaI，SalI，PstI)后获得1301P)的35S启动子下游。

35S::miR535如下构建：以水稻ZH11的基因组为模板，将miR535基因用引物Clone-miR535-F和Clone-miR535-R以高保真KOD酶扩增，平端连入1301P的35S启动子下游。

35S启动子驱动OsSPL12cDNA表达的质粒如下构建：以水稻ZH11的基因组为模板，将OsSPL12cDNA基因用引物OsSPL12-ORF-F和OsSPL12-ORF-R以高保真KOD酶扩增，平端连入1301P的35S启动子下游。

35S启动子驱动OsSPL14cDNA表达的质粒如下构建：以水稻ZH11的基因组为模板，将OsSPL14cDNA基因用引物OsSPL14-ORF-F和OsSPL14-ORF-R以高保真KOD酶扩增，平端连入1301P的35S启动子下游。

pUBI::mOsSPL12如下构建：定点突变采用两轮PCR的方法，第一轮分别用RmOsSPL12-1+RmOsSPL12-3与UnOsSPL12-2+RmOsSPL12-4进行扩增，第二轮选用第一轮的PCR产物进行再扩增。突变产物经PCR测序验证，将片段克隆到pUN1301的Ubiquitin启动子下游

2.5其他

核酸分子量标准DL2000，DL15000(TaKaRa)；

质粒抽提试剂盒(QIANGEN)；

快速限制性内切酶(Fermentas；Thomo)；

T4DNA连接酶(Promega)；

KOD-plusDNA聚合酶(ToYoBo)；

ReverseTranscriptionSystem(TaKaRa)；

脱氧核苷酸引物(Sangon，上海)；

Trizol及RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；

SYBRGreenI反应试剂(ToYoBo)；

GUS底物X-GluA(X-glucronide，B-6650，Sigma公司)用二甲基甲酰胺(DMF)作溶剂，配成40mg/ml的母液，-20℃保存。反应缓冲液100mMNaH₂PO₄/Na₂HPO₄，0.5mMK₃[Fe(CN)₆]，0.5mMK₄[Fe(CN)₄]，10mMEDTA。

实验方法

1、植物材料鉴定

1.1水稻基因组DNA的提取

使用CTAB法(2％CTAB，1.4M/LNaCl，20mMEDTA，100mM/LTris.HCl，PH8.0)提取：

(1)取2cm的水稻叶片放入2mL的离心管中，用液氮冷冻后用研磨机磨碎后加入200μL的CTAB抽提液。

(2)65℃加热45min。

(3)加入等体积氯仿，混匀，室温静置10min。

(4)12000rpm，离心15min，取上清至新的EP管。

(5)加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min。

(6)12000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀两次。

(7)离心弃上清后，干燥，用适量的水溶解。

PCR鉴定使用30μL体系，以前文所述基因组DNA为模板，用潮霉素或卡那霉素特异性的引物Hyg-1/Hyg-2、NptII-1/NptII-2，60℃退火，72℃延伸40s。1.5％琼脂糖电泳检测PCR产物。

1.2SouthernBlot鉴定T-DNA插入数目

(1)CTAB法提取野生型和突变体DNA，并测量其浓度。

(2)用KpnI、HindIII、XbaI三种酶配制200μL单酶切体系。其中每个酶切体系加入30μgDNA和10μl酶于37℃酶切至基因组DNA主带消失。酶切完全后两倍体积乙醇和十分之一体积的3M醋酸钠沉淀1h，溶至30μL水中。

(3)制作无EB的1.0％琼脂糖胶。将酶切过的DNA加入适量上样缓冲液后上样。

(4)转膜和杂交方法见分子克隆。

2、基因表达的分析

2.1水稻RNA提取

(1)取水稻材料(约100mg)于2ml离心管中液氮速冻，用振荡器磨碎后迅速加入1mlTrizol，混匀，室温放置5min。

(2)12000rpm，离心15min，取上清至新的EP管。

(3)加入300μl三氯甲烷，震荡混匀，12000rpm，离心15min。

(4)取上清，加入等体积异丙醇-20℃沉淀30min。

(5)12000rpm，离心10min，70％乙醇洗涤沉淀两次。

(6)于超净台干燥5min，溶于20-50μlRNasefreewater。

(7)Nanodrop2000/2000C检测RNA质量。A₂₆₀/A₂₈₀应当在1.8-2.0之间。

2.2Real-timeRT-PCR检测

嵌合荧光法：

(1)取1μg水稻总RNA进行反转录，稀释后分装，-70℃保存。反转录按照大连宝生物工程公司提供的方法进行(RNAPCRKitVer.2.1)。

(2)取Real-timeRT-PCR检测cDNA，扩增使用SYBRGreenI反应试剂。

LNAmiRNA探针法荧光定量：

(1)添加1μL的miRNA特异茎环引物替代oligodT和随机六聚体引物到20μL反转录体系，进行4个以下miRNA反转录实验的时候，可以将miRNA的特异性反转录引物混在一起同时反转，qPCR步骤时，再取出cDNA分开添加对应的miRNA探针和引物预混液。其它步骤如上。

(2)PCR反应采用罗氏双标探针5’端标记的发光基团是FAM，3’端标记的猝灭基团BHQI。

以OsACTIN为内标参考，基因表达量(X)以X/OsACTIN表示。数据分析采用Bio-Rad软件计算出基因表达的相对拷贝数，然后与对照进行比较。独立实验重复三次，取各组数据的平均值和方差。绘制图表，引物序列见表1。

2.3miRNAsNorthernBlot

该实验使用的试剂均用DEPC水配制(除杂交液与洗膜液)，玻璃器皿都在180℃烘8h，所有离心管、枪头都在121℃下高压灭菌40min。具体步骤如下：

(1)提取总RNA后定量，每个样品准备30-50μgRNA上样。

(2)准备40ml丙烯酰胺工作液中加入200μl10％过硫酸胺，17.5μlTEMED。立即倒入玻璃板，插上电泳梳。

(3)半小时后拔去电泳梳，用1×TBE清洗上样孔。

(4)安装好装置，加入1×TBE缓冲液。

(5)上样前将尿素加入上样缓冲液至饱和，随后将样品与上样缓冲液混合，于68℃保温5min，冰上放置5min，使样品变性，解除RNA高级结构。

(6)10-15V/cm胶的长度计算所需电压,电泳3-4h。

(7)将PAGE胶取出，电转膜安置如下：负极，三层滤纸，胶，Hybond-N+尼龙膜(Amesham)，三层滤纸，正极。加入0.5×TBE，60mA2-3h。

(8)尼龙膜经6×SSC溶液短暂漂洗，紫外交联(120mJ)，夹在两层滤纸之间，80℃烘烤1h，备用。

(9)37℃杂交液预杂交1-2h(采用Roche的DigEasyHyb杂交液)。

(10)加入末端标记法标记的同位素探针，42℃杂交过夜。

(11)45℃用洗膜液洗膜15min，重复一次。

(12)将杂交膜用保鲜膜封好后于室温压磷屏。

(13)检测磷屏信号强度。探针序列见表1。

2.4OsmiR535基因启动子驱动GUS报告基因双元表达载体的构建

根据水稻基因组中OsMIR535基因的启动子区域序列设计引物正向Promoter-miR535-F，反向Promoter-miR535-R，以水稻ZH11DNA为模板，将OsMIR535启动子包括转录起始点在内的2500bp片段通过PCR克隆到PCAMBIA1300+PBI101载体的PSTI和XbaI位点中，构建成含有OsMIR535启动子区域-GUS报告基因的双元表达载体p1300OsMIR535::GUS，并利用农杆菌EHA105转化ZH11。

2.5GUS组织化学分析

经过Hyg抗性和PCR筛选后，取转基因植株的幼苗、茎、幼叶、成叶、小分蘖、0.5mm/2.5mm/10mm/20cm花序等组织器官进行GUS检测。样品放入GUS反应缓冲液中，浸入，37℃保温。每隔半个小时在解剖镜下观察显色效果。当显色强度足够后，吸出GUS反应缓冲液，加入70％乙醇脱色，每隔数小时更换一次。拍摄时用50％(v/v)甘油替换70％(v/v)乙醇。

GUS反应缓冲液(RichardA.JeffersonandW.Bevan，1987)：100mMNaH₂PO₄；10mMEDTA；0.5mMK₃[Fe(CN)₆]；0.5mMK₄[Fe(CN)₆]和0.1％(v/v)TritonX-100。

用NaOH调节PH至7.0。临用前加入X-Glue至浓度为0.5mg/mL。

3、miRNA功能验证

3.1mRNA的纯化

用Trizol试剂提取总RNA后，使用OligotexTM-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(TaKaRa公司)纯化mRNA。

3.25’RACE验证靶基因的剪切位点

5’RACE方法验证miRNAs靶基因剪切的步骤如下：

(1)使用T4RNA连接酶(货号D2050，TaKaRa，Japan)，将RNA连接头与断裂RNA的3’末端连接。RNA连接头的序列：5-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3’。

(2)在11℃条件下反应16h后，加入2μL的0.5MEDTA终止反应。

(3)以Oligo(dT)18为引物，用M-MLV逆转录酶(C28025-011，Invitrogen)反转录连接产物。

(4)用基因特异的引物5’RACE_Os06g49010(CTGCTGCCATTGCCAGGATG(SEQIDNO:44))分别与连接头所包含的通用引物RACE_P(CGACTGGAGCACGAGGACACTGA(SEQIDNO:45))、巢式引物Nested_P(CGACTGGAGCACGAGGACACTGA(SEQIDNO:46))进行二轮扩增。

(5)将所得DNA片段连入pMD18-T载体(TaKaRa)，转化到大肠杆菌(E.coliXL1-blue)菌株中。挑选单克隆后，提取质粒进行测序。

3.3农杆菌介导的烟草瞬间转化实验

(1)挑取转化目标质粒的GV3101农杆菌单菌落于5mLLB液体培养基中250rpm过夜培养。第二天，按照1/50的比例放大接种到50mL液体LB培养基(添加20μM乙酰丁香酮，10mMMES，PH5.7)中，28℃培养16-20h。4℃5,000rpm离心5min，菌体用转化液重悬(10mMMgCl₂，10mMMES，PH5.7，150μM乙酰丁香酮)，室温放置至少3h。

(2)按照不同比例将农杆菌悬液混合，其中35S::MIR156/35S::MIR535(包括对照组)OD₆₀₀～0.75，35S::ARF的浓度为OD₆₀₀～0.1。取生长4周的烟草，用针头轻轻在叶片背面点一个小洞。用2mL无菌注射器将农杆菌混合液由小洞注射入叶片。每片叶片10-15个点，使农杆菌侵染整个叶片。将烟草避光培养3天，随后收取材料抽提RNA。

4、转基因植株的表型分析

4.1水稻转化及转基因植株的鉴定

将p1300OsMIR535::GUS和pUBI::OsmiR535载体通过农杆菌介导转化水稻野生型ZH11幼胚中，抗性筛选转化苗炼苗后移入人工气候室。获得T0代植株后，通过PCR和RT-PCR分别在DNA及RNA水平确认有外源基因插入的阳性株系。进一步利用SouthernBlot确认独立的转基因株系用于下一步表型观察及分析。

4.2扫描电镜观察水稻颖壳

成熟的水稻种子37℃烘干一周后用于扫描电镜观察。首先将样品黏于铜台上，使需要观察的水稻外表面朝上。材料喷今后在扫描电镜(HITACHIS-450，ScanningElectronMicroscope)下观察。

5、蛋白亚细胞定位

(1)载体构建。根据基因的前体区设计引物(OsSPL12-PA7-FCCGCTCGAGCATGGCTTCTTTTGGGATGAACTG(SEQIDNO:47)和OsSPL12-PA7-RGGACTAGTCCGTGCAGATGGCCATAGCCGG(SEQIDNO:48))，扩增出OsSPL12前体连入PA7载体的XhoI和SpeI位点。测序正确后进行洋葱表皮细胞转化。

(2)利用PDS-1000/He型基因枪将包裹好的DNA轰击洋葱内表皮，之后将培养皿封口，置于28℃下的暗处培养过夜。

(3)荧光观察。撕下洋葱内表皮放在载玻片上，盖上盖玻片后倒置放在激光共聚焦扫描显微镜(CarlZeissLSM510)的载物台上进行观察和拍照。

实施例1、靶向OsSPL家族成员的OsmiRNA

靶基因的预测需要先将miRNAs序列与水稻所有mRNAs序列进行比对，并计算两者之间的错配分数。靶基因的选择标准是错配分数≤4，并且最小自由能比率≥0.73。由此计算获得两个靶向OsSPL的miRNA家族：OsmiR156和OsmiR535。尽管miR535与OsmiR156家族成员存在4～7个碱基的差异，二者预测的剪切位点却几乎完全重合，这一发现表明，miR535是调控SPL家族成员的另一关键因子，如图1所示的OsmiR535与OsmiR156的序列比对。进一步分析表明OsmiR156对OsSPL家族中的11个成员有精确匹配，而OsmiR535则靶向属于亚IIf类OsSPL3、OsSPL4、OsSPL11和OsSPL12。

OsmiR535序列：5’-UGACAACGAGAGAGAGCACGC-3’(SEQIDNO:1)。

利用PMRD(PlantMicroRNADatabase)数据库，本发明分析序列相近的miR156、miR157、miR529和miR535在小立碗藓(Physcomitrellapatens)，松树(Pinustaeda)，云杉(Piceaglauca)，拟南芥(Arabidopsisthaliana)，杨树(Populustrichocarpa)，水稻(Oryzasativa)，玉米(Zeamays)等不同物种中的分布。分析结果如图2所示，miR535与miR156在小立碗藓(Physcomitrellapatens)及多种古老物种中都有分布，说明两者属于早期进化出的小RNA且具有一定的保守性。miR156广泛分布于各类植物物种，而miR535主要集中在单子叶植物及裸子植物等早期进化物种中，且与miR157呈互补趋势。

实施例2、OsmiR535表达模式分析

为了研究OsmiR535的生物功能，本发明首先用qRT-PCR的方法检OsmiR535在不同时期的顶端组织中的表达。结果如图3所示，表明在营养生长阶段检测不到OsmiR535的表达，而随着顶端组织逐渐开始分化生殖器官，OsmiR535的积累量显著积累。

构建pOsMIR535::GUS进一步分析OsmiR535在不同组织及不同发育时期的花序组织中的表达情况，如图4所示，与Q-RTPCR的结果相似，OsmiR535在幼苗、叶片、叶鞘及叶原基中的表量都很低，而在各个花序组织中则由显著积累。值得一提的是OsmiR535在起始发育的分蘖中也有表达。OsmiR535特异的表达模式表明其参与并起到OsSPL家族成员在生殖发育中的作用。

实施例3、OsmiR535的生物功能分析

为了研究OsmiR535在水稻生殖器官发育中的作用，本发明构建了pUBI::OsMIR535转基因水稻，随后在OsMIR535过量表达的转基因株系(pUBI::OsMIR535-39，pUBI::OsMIR535-40，pUBI::OsMIR535-48)中发现水稻籽粒显著增大，如图5所示。

对三个独立的转基因株系(pUBI::OsMIR535-39(L39)，pUBI::OsMIR535-40(L40)，pUBI::OsMIR535-48(L48))及对照ZH11籽粒的粒长、粒宽、粒厚及千粒重进行统计，结果如图6所示，显示转基因材料的籽粒长度及宽度都显著大于对照野生型，千粒重则极显著地大于对照。

实施例4、OsmiR535降低靶基因转录本水平

植物中miRNAs多通过高精确的匹配靶向并剪切目标基因mRNA发挥功能。为了明确OsmiR535的确具有剪切mRNA的能力，将野生型OsSPL12cDNA和OsSPL14cDNA用35S启动子驱动分别与对照质粒1301P、35S::miR156及35S::miR535混合通过农杆菌瞬时转化体系转入烟草。瞬转3天后提取总RNA并分析了miR156、miR535、OsSPL12及OsSPL14的表达水平。结果如图7所示，表明OsSPL12和OsSPL14的mRNA积累量在引入35S::miR156和35S::miR535后都急剧降低。

为了回答pUBI::OsMIR535转基因材料中OsSPL家族成员是否受影响，本发明人选取了OsSPL3、OsSPL4、OsSPL11、OsSPL12、OsSPL14和OsSPL16进行qRTPCR检测(引物如表1)，实验结果如图8所示，结果表明与野生型相比pUBI::OsMIR535中OsSPL12的mRNA积累量显著下调，而其他的家族成员也有不同程度变化。以上结果表明miR535通过OsSPL12或多个靶基因调控种子发育。

实施例5、过量表达抗剪切靶基因mOsSPL12造成水稻籽粒变小

由于OsSPL家族成员在蛋白水平具有较高的同源性，并且具有相似的表达特征。为了克服miR156与miR535对OsSPL12的剪切，在不改变氨基酸序列的前提下进行定点突变，获得相应的抗剪切突变cDNA(mOsSPL12，如图9所示，突变位点位于OsSPL12开放阅读框的第1142-1164位，由GCGTGCTCTCTCTCTTCTGTCA(SEQIDNO:49)突变为CCGGGCCCTGAGCTTGCTCAGC(SEQIDNO:50))，将该cDNA克隆到PUN1301载体的SmaI位点中，使之在Ubiquitin启动子的驱动下，重组载体转化野生型水稻ZH11生物学功能。由于靶基因和miR156与miR535的结合能力降低，mOsSPL12转录本可以在植物体内积累。利用Q-RTPCR的方法对转基因植株进行了分子鉴定，如图10所示，结果显示，在强表达启动子驱动下mOsSPL12在转基因植株(pUBI::mOsSPL12-1～5)中明显增强。

转基因植株的表型观测结果显示，如图11A所示，强表达转基因植株的谷粒(pUBI::mOsSPL12-1(L1)、(pUBI::mOsSPL12-2(L2)、(pUBI::mOsSPL12-5(L5))明显比对照小。通过对转基因水稻和对照成熟种子的粒长、粒宽、粒厚、千粒重的测量和比较，如图11B所示，结果表明转基因植株种子的粒长、粒宽、粒厚、千粒重都发生了显著变化。

实施例6、miR535及其靶基因与颖壳发育的关系

为了在细胞层面研究miR535及其靶基因对颖壳发育的影响，本发明用扫描电镜方法观察并分析了制作野生型ZH11、pUBI::OsmiR535、pUBI::OsSPL12外颖壳的细胞数，如图12所示，表明与野生型相比，pUBI::OsmiR535及pUBI::OsSPL12在细胞大小没有显著差异，而是细胞数目分别显著增加和减少。统计数据如图12下图所示。

实施例7、OsSPL12蛋白亚细胞定位

利用洋葱表皮细胞观察OsSPL12-GFP融合蛋白的瞬间表达，激光共聚焦显微镜观察的结果如图13所示，显示该融合蛋白在洋葱表皮细胞内呈颗粒状分布。与其蛋白预测结果一致，该蛋白定位在洋葱表皮细胞的细胞核中。

本发明利用转基因技术和分子生物学技术首次发现OsmiR535在调控水稻种子发育中的重要作用。过量表达OsmiR535使种子在长、宽、厚及千粒重都得到显著增加。本发明进一步表明OsmiR535靶向的SPL家族中的12号成员，是其调控水稻种子大小的重要下游基因。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种提高植物产量、增大植物种子、增大植物种子颖壳或增加植物分蘖数目的方法，所述植物是禾本科植物，其特征在于，所述方法包括：上调植物中miR535基因或其前体的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的miR535基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；或

所述的miR535前体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上调植物中miR535基因或其前体的表达包括：将表达miR535基因或其前体的载体转入植物中。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用农杆菌转化法将表达miR535基因或其前体的载体转入植物中。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(3)选择出转入了能够在细胞内形成miR535前体的序列的植物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的增大植物种子包括：增长植物种子粒长和增宽植物种子粒宽。

7.一种miR535基因或其前体的用途，用于：

提高植物产量；

增大植物种子；

增大植物种子颖壳；

增加植物分蘖数目；或

其中，所述植物是禾本科植物。

8.一种miR535基因或其前体的用途，用于增加植物种子外颖壳的细胞数或促进植物花器官发育，所述植物是禾本科植物。

9.如权利要求7-8任一所述的用途，其特征在于，所述的miR535基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；或

所述的miR535前体的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

10.一种miR535基因或其前体的用途，用于作为鉴定植物产量性状、种子性状、颖壳性状或分蘖性状的分子标记。