CN117986334A - 一种影响植物对黑斑病抗性的转录因子PpCBP60B及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种影响植物对黑斑病抗性的转录因子PpCBP60B及其编码基因和应用。该转录因子PpCBP60B的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因转录因子基因PpCBP60B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明将所述基因PpCBP60B转入到植物中进行过量表达，所得的转基因愈伤组织与野生愈伤组织相比能够有效提高转基因植株的抗黑斑病能力，细胞损伤更小；同时将其进行基因沉默，所得的转基因植物与野生株相比减弱了转基因植株的抗黑斑病能力，病斑直径更大。因此，本发明提供的转录因子PpCBP60B为培育抗黑斑病植物新品种以及提高植物对黑斑菌耐受性具有重要意义。

Description

一种影响植物对黑斑病抗性的转录因子PpCBP60B及其编码基 因和应用

技术领域

本发明属于功能基因技术领域，具体涉及一种影响植物对黑斑病抗性的转录因子PpCBP60B及其编码基因和应用。

背景技术

植物不能主动躲避不良环境的胁迫，因此植物进化出了一系列体内反应机制以应对各种不良环境的胁迫。植物有一套基因调控网络，在受到外界胁迫信号时，可以迅速诱导体内胁迫相关基因的表达，从而应对各种胁迫环境。转录因子是这一调控网络中至关重要的一环，它能相应各种外界信号，继而激活或者抑制下游基因的表达，从而调节植物对抗各种环境变化。

黑斑病是一类由黑斑菌侵染植物果实、叶片、花穗、枝干引致受侵染组织局部坏死的一类病害。其危害范围较广，对果树、蔬菜等农作物以及林木和花卉等由具有侵染致病性。黑斑菌的分生孢子可通过雨水、风、昆虫等传播，一年可频繁多次，并且黑斑菌可以在植物的叶片生长期、花期和果实期等不同生长阶段进行侵染，直接影响植物的生长和产量。因此，黑斑病的防治是农业种植中较为关注的问题。遗憾的是目前还未有关于如何调节转录因子表达来实现黑斑病的防治。

发明内容

针对背景技术提出的技术问题，本发明的目的在于提供一种转录因子PpCBP60B及编码该转录因子PpCBP60B的转录因子基因PpCBP60B和应用。研究表明，过表达所述的转录因子基因PpCBP60B使植物对黑斑病提高抗性，而敲除或沉默该基因后，使植物对黑斑病具有敏感性。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明请求保护一种转录因子PpCBP60B，该转录因子PpCBP60B的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明请求保护编码所述转录因子PpCBP60B的转录因子基因PpCBP60B，该转录因子基因PpCBP60B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第三方面，本发明请求保护用于扩增所述转录因子基因PpCBP60B的的引物，该引物包括核苷酸序列如SEQ IN NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IN NO:4所示的反向引物。

第四方面，本发明请求保护一种生物材料，该生物材料为含有所述转录因子基因PpCBP60B的生物材料，或用于干扰、抑制、沉默或敲除所述转录因子基因PpCBP60B的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

进一步，所述的含有转录因子基因PpCBP60B的生物材料为(1)～(7)中的至少一种：

(1)含有所述转录因子基因PpCBP60B的表达盒；

(2)含有所述转录因子基因PpCBP60B的重组表达载体；

(3)含有(1)所述表达盒的重组表达载体；

(4)含有所述转录因子基因PpCBP60B的重组菌；

(5)含有(1)所述表达盒的重组菌；

(6)含有(2)所述重组表达载体的重组菌；

(7)含有(3)所述重组表达载体的重组菌。

进一步，所述的用于干扰、抑制、沉默或敲除转录因子基因PpCBP60B的生物材料为病毒沉默载体或包含该病毒沉默载体的重组菌。

第五方面，本发明请求保护上述转录因子PpCBP60B、上述的转录因子基因PpCBP60B、或上述的生物材料在(Ⅰ)～(Ⅳ)中的应用：

(Ⅰ)提高植物黑斑病抗性；

(Ⅱ)下调植物黑斑病抗性；

(Ⅲ)培育抗黑斑病的植物新品种；

(Ⅳ)培育对黑斑病敏感的植物新品种。

进一步，在目标植物中过表达或超表达权利要求2所述的转录因子基因PpCBP60B以提高植物黑斑病抗性或培育抗黑斑病的植物新品种；或者在目标植物中沉默或敲除权利要求2所述的转录因子基因PpCBP60B以下调植物黑斑病抗性或培育黑斑病敏感的植物新品种。

第六方面，本发明请求保护检测所述转录因子基因PpCBP60B表达水平的试剂在评估植物对黑斑病及其致病菌抗性中的应用。

第七方面，本发明请求保护一种提高植物黑斑病抗性或培育抗黑斑病的植物新品种的方法，在目标植物中过表达或超表达所述的转录因子基因PpCBP60B以提高植物黑斑病抗性或培育抗黑斑病的植物新品种。

本发明所述的植物为双子叶植物，优选为蔷薇科植物，更进一步优选为梨，但不限于此。

本发明的有益效果：

本发明筛选了一种对黑斑病表现抗性的转录因子PpCBP60B，并提供了编码该转录因子PpCBP60B的转录因子基因PpCBP60B。研究过程中，本发明将所述转录因子基因PpCBP60B转入到梨愈伤组织中，所得的超表达转基因植物就表现出黑斑菌抵抗性状，基因PpCBP60B可作为黑斑菌抗性的标志物，预警植物的真菌感染。本发明敲除掉基因PpCBP60B或沉默基因PpCBP60B使其表达量降低，使植物表现出抗黑斑病感染性状。试验结果表明：基因PpCBP60B的转录水平在植物受到黑斑病菌处理后逐渐升高，表明转录因子基因PpCBP60B在植物抗黑斑病能力中起到重要作用。本发明将转录因子基因PpCBP60B转入到梨愈伤组织中，得到的转基因植物中转录因子基因PpCBP60B过量表达，所得的转基因愈伤组织与野生愈伤组织相比能够有效提高转基因植株的抗黑斑病能力，细胞损伤更小；同时将其进行基因沉默，所得的转基因植物与野生株相比能够降低转基因植株的抗黑斑病能力，病斑直径更大。可见，本发明提供的转录因子PpCBP60B及转录因子基因PpCBP60B对培育耐黑斑病新品种，以及植物对黑斑菌耐受性的研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的技术流程示意图。

图2为易感品种‘七月红香’和抗病品种‘威宁香面’中转录因子基因PpCBP60B(Pbr000282.1)分别在黑斑病处理下的表达模式。

图3为转录因子PpCBP60B的亚细胞定位。

图4为超表达转录因子基因PpCBP60B愈伤组织的鉴定结果。

图5为转录因子基因PpCBP60B沉默植株的鉴定结果；

图6为超表达转录因子基因PpCBP60B愈伤组织黑斑病处理的表型和生理测定结果；

其中，A为菌丝体在超表达PpCBP60B基因的梨愈伤组织和野生型梨愈伤组织上的生长速度对比；B为菌丝体在超表达PpCBP60B基因的梨愈伤组织和野生型梨愈伤组织上的病斑直径对比；C为超表达PpCBP60B基因的梨愈伤组织和野生型梨愈伤组织过氧化氢含量对比；D为超表达PpCBP60B基因的梨愈伤组织和野生型梨愈伤组织苯丙氨酸解氨酶PAL酶活对比：E为超表达PpCBP60B基因的梨愈伤组织和野生型梨愈伤组织几丁质酶酶活对比；E为为超表达PpCBP60B基因的梨愈伤组织和野生型梨愈伤组织POD酶活对比。

图7为转录因子基因PpCBP60B沉默植株黑斑病处理的表型和生理测定结果；

其中，A为PpCBP60B沉默植株叶片和对照组的病斑照片；B为PpCBP60B沉默植株叶片和对照组的病斑直径对比。

具体实施方式

本发明提供了一种影响植物对黑斑病抗性的转录因子PpCBP60B，该转录因子PpCBP60B的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

MQTRYMERSNSMAREKRSLDSSSAEEGQPDRKRPALASVIVEALKVDSLQKLCSSLEPIL

RRVVSEEVERALAKLGPAKLTGRSSPKQIEGPDGRNLQLHFRSRLSLPLFTGGKVEGEWG

SAIPIVLIDANTKNVVTSGPESAVKLDVVVLEGDFNNEDDENWTEEEFESHVVKEREGK

RPLLTGDLQVTLKEGVGTLGELTFTDNSSWIRSRKFRLGLKVASGYCDNIRIREAKTDAF

TVKDHRGELYKKHYPPALNDEVWRLEKIGKDGSFHKRLNKAGIVTVEDFLRLVVRDSQ

RLRNILGSGMSNKMWDVLIQHAKTCLLGGKLYVYYPEDARNVGVVFNNIYELSGLITN

EQFYSADSLSEDQKVYVDGLVTKAYENWMHVMEYDGKSLLKQQKSPDVSLPEVPIASQ

DYPNSFDQQFTLPSLPASVSSEPPTMDSGLNVGGYTDGMANRFSVQSQNLNLSAPSQLD

GLSFPLQNQQPITSHQSQFQGNENMLALGPPQSSTSGFQNIGTSNPSSYRGAEDLFPEEEI

RMRSHEILENEDMQHLLRIFNMGGQGQGQGHGYGHASMNITEDNYPYSSPYMPTPQVNYSVDDQSRSSGKAVVGWLKLKAALRWGIFIRKKAAERRAQLVELDDSG(SEQ ID NO:1)。

本发明提供了编码上述转录因子PpCBP60B的转录因子基因PpCBP60B，该转录因子基因PpCBP60B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

ATGCAGACGAGGTATATGGAGAGATCGAATAGCATGGCGAGGGAGAAGCGAAGTTTG

GATTCGTCTTCAGCTGAAGAAGGCCAGCCGGATAGGAAACGGCCTGCTCTCGCCAGT

GTAATTGTTGAAGCTCTCAAGGTGGATAGTCTGCAGAAGCTTTGCTCGTCACTGGAG

CCGATTCTACGCAGAGTTGTTAGTGAAGAGGTGGAGCGTGCTTTAGCAAAATTAGGC

CCTGCCAAACTTACTGGAAGGTCTTCTCCTAAACAAATTGAAGGGCCCGATGGAAGA

AACTTGCAGCTGCACTTTAGGTCCAGGTTGTCCCTTCCTCTTTTTACTGGTGGAAAAG

TAGAAGGGGAGTGGGGTTCTGCAATCCCTATTGTCTTGATTGATGCAAATACAAAGAA

CGTTGTGACATCAGGCCCGGAGTCAGCAGTGAAACTTGACGTTGTTGTGCTTGAAGG

TGATTTTAACAACGAGGATGATGAGAACTGGACTGAAGAAGAATTTGAGAGCCATGT

AGTAAAAGAGCGTGAAGGAAAGAGGCCACTTCTTACTGGCGATCTGCAAGTGACAC

TGAAGGAAGGTGTAGGAACACTAGGCGAATTGACATTTACCGATAATTCTAGCTGGAT

TAGGAGCAGGAAGTTTAGGCTAGGACTGAAAGTAGCCTCTGGCTATTGCGACAACAT

TCGTATACGCGAAGCAAAAACAGATGCCTTTACTGTTAAGGATCACCGTGGGGAATTA

TACAAGAAACACTACCCTCCTGCGTTAAATGATGAGGTCTGGAGATTGGAGAAAATT

GGAAAAGATGGCTCATTCCACAAGAGACTGAATAAAGCTGGAATTGTTACAGTTGAA

GACTTCCTGCGACTTGTGGTTAGAGACTCGCAGAGATTGCGGAATATTCTTGGAAGTG

GCATGTCGAATAAGATGTGGGATGTACTCATACAGCATGCAAAAACTTGTCTTCTTGG

CGGGAAACTCTATGTCTACTATCCTGAGGATGCAAGGAACGTTGGTGTTGTTTTTAAC

AATATCTACGAGTTGAGTGGCCTAATTACCAATGAACAATTTTACTCAGCTGATTCTCT

CTCGGAAGATCAGAAGGTCTACGTGGATGGTTTGGTAACAAAGGCATATGAGAACTG

GATGCATGTTATGGAGTACGATGGAAAGTCTCTTCTTAAGCAGCAGAAGAGTCCCGAT

GTTTCTCTACCTGAGGTCCCAATAGCCTCGCAGGATTATCCAAACTCATTTGATCAGC

AGTTCACTCTACCTAGCCTGCCAGCTTCAGTTTCTTCAGAACCGCCTACTATGGATTCT

GGCCTAAATGTGGGAGGTTATACTGACGGCATGGCTAACAGATTCTCGGTACAGTCAC

AGAATCTAAATCTCAGTGCTCCCAGTCAGCTCGATGGCTTGTCATTCCCTCTACAAAA

TCAGCAGCCTATCACTTCACACCAGTCTCAGTTTCAAGGAAATGAAAACATGCTTGC

CCTTGGTCCACCACAGTCGTCCACATCTGGGTTCCAGAATATTGGTACATCCAATCCAT

CTTCTTATAGGGGAGCCGAGGACCTCTTCCCAGAGGAAGAAATTCGTATGAGGAGCC

ACGAGATTCTCGAAAATGAAGATATGCAGCATCTACTTCGTATCTTTAACATGGGCGG

TCAGGGTCAGGGTCAAGGCCACGGTTATGGTCATGCCTCCATGAACATCACTGAAGA

CAATTATCCATATTCGTCACCATACATGCCCACTCCACAAGTGAACTACAGTGTTGATG

ATCAGAGCCGTTCATCTGGGAAAGCTGTTGTTGGCTGGCTCAAGCTCAAGGCAGCCC

TTAGATGGGGCATATTCATCAGAAAGAAGGCTGCTGAGAGACGGGCACAGCTTGTTGAGTTGGATGATTCAGGATAA(SEQ ID NO:2)。

本发明从杜梨中筛选到一种对黑斑病表现抵抗的转录因子基因PpCBP60B。本发明提供的抗生物逆境转录因子基因PpCBP60B在植物黑斑病胁迫中起正调控作用，在多种生物逆境对抗中具有重要作用。

本发明还提供了一种扩增所述转录因子基因PpCBP60B的引物，该引物包括核苷酸序列如SEQ IN NO:3(GAGAACACGGGGGACTCTAGA ATGCAGACGAGGTATATGG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IN NO:4(GCCCTTGCTCACCATGGATCC TGAATCATCCAACTCAACAAGCTGT)所示的反向引物。

本发明对所述引物的设计方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的生物合成公司合成即可。在本发明实施例中，所述引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

本发明提供了一种包含所述转录因子基因PpCBP60B的重组表达载体和用于沉默所述转录因子基因PpCBP60B的沉默载体。在本发明中，所述重组表达载体的骨架载体为表达质粒(PCMBIA1300)，所述沉默载体的骨架载体为病毒沉默载体(pTRV2)。重组表达载体PCMBIAI1300-PpCBP60B中PpCBP60B基因插入的多克隆位点为Xbal I和BamH I两个酶切位点。沉默载体pTRV2-PpCBP60B中PpCBP60B基因片段序列插入的多克隆位点为Xbal I和SmaI两个酶切位点。本发明对所述重组表达载体和沉默载体的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组表达载体和沉默载体的构建方法即可。

本发明提供了一种包含所述转录因子基因PpCBP60B或所述重组表达载体的重组菌。

在本发明中，所述重组菌的宿主优选包括农杆菌。本发明对所述重组菌的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组菌的制备方法即可。

本发明提供了所述转录因子PpCBP60B、所述转录因子基因PpCBP60B、所述重组表达载体、所述病毒沉默载体或所述重组菌在调节植物抗黑斑病中的应用。

在本发明中，所述植物优选为双子叶植物。所述植物优选包括愈伤组织和梨(例如杜梨)。本发明以杜梨为植物代表说明该基因PpCBP60B在调节植物抗黑斑病性能中的应用。实验证明，当植物中基因PpCBP60B高表达时，该植物对黑斑病的抗性较高，易抵抗黑斑病。当植物中基因PpCBP60B下调表达或沉默后，该植物抗黑斑病的性能降低，易发生黑斑病。同时实验证明，将所述的杜梨中的转录因子PpCBP60B或其编码基因或所述的引物对克隆的编码基因在植物中重组表达，得到的重组植物具有抵抗黑斑病的特性。将所述的杜梨中转录因子PpCBP60B或其编码基因或所述的引物对克隆的编码基因在植物中沉默，得到的植物抗黑斑病能力减弱。因此，以基因PpCBP60B为靶点，通过调节其表达量能够实现植物对黑斑病的抗性和抗病性调节(如图1本发明的技术流程示意图)。

基于上述基因PpCBP60B表达水平与植物对黑斑病的抗性及抗病性的关系，本发明提供了一种检测所述转录因子基因PpCBP60B表达水平的试剂在评估植物对黑斑病及其致病菌抗性中的应用。

本发明提供了一种超表达所述转录因子基因PpCBP60B表达的试剂在提高植物抗黑斑病性能或培育抗黑斑病的植物品种中的应用。所述试剂优选包括含PpCBP60B基因序列的超表达载体(PCMBIA1300-PpCBP60B)。

在本发明实施例中，通过生理指标测定，结果发现：超表达了PpCBP60B的梨愈伤组织相比于对照更能抵抗黑斑病的侵染，而沉默了PpCBP60B的杜梨叶片相比于对照更易受到黑斑病侵染。这表明基因PpCBP60B的上调表达有利于提高植物的抗黑斑病的性能，同时构建过表达基因PpCBP60B的转基因植物从而培育得到一种抗黑斑病的新品种。

本发明所述的室温为25±10℃。

下面结合实施例对本发明提供的一种影响植物对黑斑病抗性的转录因子PpCBP60B及其编码基因和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1杜梨转录因子基因PpCBP60B全长cDNA的克隆

从杜梨中筛选到一个转录因子基因PpCBP60B，根据转录因子基因PpCBP60B的序列和primer premier 5.0设计引物，用RT-PCR方法从杜梨上扩出其全长。详细步骤如下：cDNA第一链的合成参照TIANGEN反转录试剂盒的操作说明进行。所得的第一链cDNA用于转录因子基因PpCBP60B的扩增。PCR反应总体积50μl，其中杜梨cDNA 1μl，上下游引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)各2.5μl，taq酶1μl，Buffer 25μl，ddH₂O18μl。PCR按以下程序完成：1、94℃预变性3min；2、94℃变性30s，3、58℃退火30s，4、72℃延伸55s，步骤2-4重复35个循环；5、循环完成后72℃延伸10min，6、最后4℃保存30min。扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，按胶回收试剂盒使用说明步骤回收特异目的条带。

回收纯化的产物与PCMBIA1300载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为2:1连接。反应总体积是5μl，其中4.5μl的PCR纯化的产物，0.5μl载体，25℃连接30min，采用热激法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由上海生工生物工程有限公司完成)。

实施例2生物逆境条件处理下转录因子基因PpCBP60B的qRT-PCR分析

为了分析梨中基因PpCBP60B对黑斑病处理的响应模式，使用Real-time PCR技术对基因PpCBP60B的表达模式进行分析。采用成都福际生物技术有限公司Plant Total RNAIsolation Kit Plus提取RNA，DNA第一链的合成参照TANGEN反转录试剂盒的操作手册进行。在10μl的反应体系中有：5μl 2×SYBR Premix ExTaq，0.1μl cDNA，0.4μl引物(PpCBP60B的qRT-PCR引物为SEQ ID NO：5：(TCCAGGTTGTCCCTTCCTCT)和SEQ ID NO：6：(GTTTCACTGCTGACTCCGGG)；以UBQ为内参引物，序列具体见SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)，4.5μl水。

UBQ正向引物：5’-GCACAAGAAGGTGAAGCTCG-3’(SEQ ID NO：7)

UBQ反向引物：5’-ACTCAGCATTGGGGCACTC-3’(SEQ ID NO：8)

实时定量PCR的程序如表1所示：

表1实时定量PCR程序

结果见图2。砂梨‘威宁香面’和西洋梨‘七月红香’在黑斑病菌饼处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析所述编码基因的相对表达量。由图2可以看出，抗病品种中PpCBP60B基因对黑斑病有非常强烈的响应，且表达量呈上调趋势。

实施例3转录因子PpCBP60B蛋白的亚细胞定位

根据转录因子PpCBP60B的编码基因的核苷酸序列和PCMBIA1300-GFP载体图，在基因序列前后分别加入Xba I和BamH I酶切位点。将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物扩增(SEQ IN NO:3和SEQ IN NO:4)，所用PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。基因3′去除了终止密码子，目的是让基因与GFP融合。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条带。用Xba I和BamH I限制性内切酶对PCMBIA1300-GFP载体质粒进行酶切，37℃酶切4小时后纯化回收。酶切过后的PCMBIA1300-GFP载体与凝胶回收PpCBP60B片段经重组连接酶连接，37℃连接30min，转化至大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性的菌液送至公司测序，提取测序结果正确菌液的质粒，将得到的重组载体命名为PCMBIA1300-PpCBP60B。

农杆菌介导烟草细胞瞬时转化：重组的PCMBIA1300-PpCBP60B载体质粒转化至含农杆菌感受态GV3101中，将活化的含重组质粒的农杆菌在含50mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的LB液体培养基，250rpm、28℃恒温摇床中扩繁。6000rpm离心10min，并用侵染液(100mL：10mL 100mM MgCl₂，10mL 100mM MES，75μL 200mM AS，ddH₂O 80mL)重悬至OD₆₀₀为0.8。室温孵育3～4h后侵染烟草叶片细胞。将侵染后的烟草避光培养24h。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM 780)拍照。

结果见图3。图3是所述转录因子PpCBP60B的亚细胞定位，根据细胞定位图能够得到PpCBP60B定位在细胞核。

实施例4愈伤的遗传转化

1.植物转化载体构建

根据PCMBIA1300载体的多克隆位点和PpCBP60B基因的编码区序列，加入酶切位点Xba I和BamH I，按照引物设计一般原则用primer primier5.0软件设计出上、下游PCR引物(SEQ IN NO:3和SEQ IN NO:4)。以PpCBP60B基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃，PCR反应体系及扩增程序与PpCBP60B基因克隆相同。在扩增过后进行胶纯化回收。PCMBIA1300载体双酶切反应体积为40μl，其中：有PCMBIA1300的载体质粒10μl，10×M缓冲液4μl，Xba I及BamH I各1μl，加双蒸水24μl。放置于37℃酶切3-4h后纯化回收。在连接反应体系中加入PpCBP60B基因与载体PCMBIA1300的摩尔比为2:1，反应总体积为10μl。其中含有：10×buffer 1μl，DNA重组酶1μl，双酶切回收的PpCBP60B基因4ul，双酶切回收的PCMBIA1300载体产物2μl，双蒸水2μl，在37℃反应30min得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素的LB固体平板中培养16h。将筛选出的阳性克隆挑点后摇菌，抽提质粒进行PCR鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为PCMBIA1300-PpCBP60B重组载体，应用冻融法将重组载体p1300-PpCBP60B导入到农杆菌GV3101中。

2.农杆菌介导的愈伤遗传转化步骤如下：

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB的平板上划线，置于28℃培养箱培养36～48小时，刮取划线菌斑，加入液体MS(2.37g/LMS+50g/L蔗糖+0.1mg/L IBA，pH＝5.8)培养基中，28℃转30min振荡培养，菌液浓度达到OD为0.8～1.0时加入表面活性剂sweet77 200μl/L作浸染。

(2)浸染：取状态良好野生型愈伤组织，然后浸泡于根癌农杆菌菌液中1h，避光培养24h。

3.转基因阳性苗的的筛选

按照上述方法得到转PpCBP60B基因愈伤组织转移到含50mg/L潮霉素和50mg/L特美汀的MS选择培养基上，置于22℃避光培养，生长一个月后挑选生长快的愈伤组织，移栽到新的培养基继代培养。

3.1转基因愈伤DNA提取

按照上述方法得到转PpCBP60B基因愈伤，把愈伤提取DNA，设计引物基因内引物进行PCR扩增鉴定阳性愈伤。

(1)取适量愈伤用液氮研磨至粉末状，然后加入500μl 65℃预热的CTAB(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，1.5mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA pH＝8.0，2％w/v(g/100ml)CTAB，65℃水浴充分溶解备用)和10μlβ-巯基乙醇，混匀。

(2)在65℃水浴锅中加热30min，每隔10min取出上下轻轻颠倒混匀；10000g常温离心10min；取上清，加500μl氯仿异戊醇(氯仿：异戊醇体积比为24：1)，颠倒混匀；

(3)10000g离心10min，取上清液450μl至新的1.5ml离心管，加入450μl异丙醇，上下颠倒混匀。

(4)10000g，离心10min，弃去上清，用1mL 75％的乙醇漂洗2次，10000g，离心10min，将乙醇彻底去除，放在超净工作台通风干燥，直至DNA呈无色透明状。

(5)加入50μl超纯水，放置于65℃培养箱中溶解40min，做胶检测。

3.2阳性转基因愈伤检测

采用特异基因引物进行PCR扩增。反应程序及体系分别见表2、表3。采用基因上游引物和下游引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)进行PCR，在选取的转基因株系中能扩增出预期大小的片段的，表明它们为阳性转基因株系。

表2 PCR反应程序

步骤	94℃	58℃	72℃	4℃	循环数
						步骤1	3min				1
步骤2	30s	30s	55s		35
						步骤3			90s		1
步骤4			10min
						步骤5				30min

表3 PCR反应体系

反应组分	用量(μl)
		模板DNA	1
PCR Buffer	2
		dNTD Mix(2.5mmol/L)	1.6
右侧正向引物	1
		左侧反向引物	1
Taq DNA聚合酶(5U)	0.2
		无核酶水	13.2

如图4，转基因株系中都可以跑出目的条带，而WT中没有，表明所获得的愈伤是转基因阳性愈伤。

实施例5杜梨幼苗的瞬时转化

1.病毒诱导基因沉默载体构建

按照实施例4的方法构建病毒沉默载体。病毒沉默载体pTRV2双酶切位点为Xba I和Sma I，按照引物设计一般原则用primer primier5.0软件设计上、下游引物(SEQ ID NO：9：(AAGGTTACCGAATTCTCTAGA TCCAGGTTGTCCCTTCCTCT)和SEQ ID NO：10：(TGTCTTCGGGACATGCCCGGG CACGCTCTTTTACTACATGGCT))将PpCBP60B基因扩增并插入至该载体上的两个酶切位点中间，得到重组载体pTRV2-PpCBP60B，并转入农杆菌GV3101感受态中。

2.病毒诱导杜梨幼苗基因沉默

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB液体培养基中28℃，220rpm振荡培养12h。将培养后的菌液6000g离心10min收集菌体，用侵染液(10mM MgCl₂、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH 5.6)重悬沉淀，至浓度达到OD₆₀₀为0.8-1.0；

(2)菌液诱导：将调好OD值的菌液放在黑暗条件下，100rpm常温诱导4h；

(3)梨苗注射：pTRV1和pTRV2菌液按照1:1比例混合作为对照组，pTRV1和pTRV2-PpCBP60B菌液按照1:1比例混合作为实验组，分别注射苗龄30天，生长状况一致且健康状况良好的杜梨实生苗幼苗。

3.病毒诱导基因沉默抑制阳性苗鉴定

将注射完成后的梨苗在常温下黑暗处理12h，然后恢复正常培养10天，每个株系独立取样，提取对照组和实验组梨苗样品RNA，通过跑胶检测其结构完整，利用Nanodrop测定其浓度后(浓度均在200～1000ng/ul)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，再用梨的UBQ作为内参进行扩增。UBQ引物核苷酸序列为：

UBQ正向引物：5’-GCACAAGAAGGTGAAGCTCG-3’(SEQ ID NO：7)

UBQ反向引物：5’-ACTCAGCATTGGGGCACTC-3’(SEQ ID NO：8)

如图5，用UBQ扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，然后用PpCBP60B特异引物进行qRT-PCR检测，分析待检测株系的表达量，根据PpCBP60B基因的表达量，选择表达量较低的两个植株作为病毒沉默阳性株系。

结果见图5所示，利用基因特异引物和内参引物UBQ进行qRT-PCR检测基因沉默阳性植株的基因表达量。图5说明了病毒沉默杜梨幼苗阳性株系的PpCBP60B基因被沉默。

实施例6PpCBP60B转基因植株抗性鉴定

为了鉴定PpCBP60B转基因愈伤是否和抗黑斑病胁迫有关，将对照系和转基因系进行黑斑病逆境处理。结果表明，超表达PpCBP60B基因的梨愈伤组织相比野生型愈伤对黑斑病更加抵抗，表现在菌丝体在超表达PpCBP60B基因的梨愈伤组织上的生长速度显著慢于野生型(如图6A和图6B)，过氧化氢、几丁质酶CHI、苯丙氨酸解氨酶PAL、过氧化物酶POD都是可以衡量植物抗病原菌能力的生理指标，在受到黑斑病侵染后，PpCBP60B基因超表达愈伤的H₂O₂、CHI、PAL、POD活性均显著高于对照，而在侵染之前均无差异，因此，超表达了PpCBP60B基因的梨愈伤组织相比于对照更不易受到黑斑病的侵染(图6C-图6F)。

实施例7PpCBP60B病毒沉默植株抗性鉴定

为了研究PpCBP60B基因在应对黑斑病的功能，我们将PpCBP60B沉默植株以及对照的植株用无菌针穿刺处理，随后接种黑斑病菌饼，叶片置于25℃黑暗培养9天，结果显示，PpCBP60B沉默植株叶片的病斑直径相比于对照显著更大，综上所述，通过VIGS沉默PpCBP60B的杜梨相比于对照更易受到黑斑病的侵染(如图7)。

对以上结果的分析表明，PpCBP60B基因与植物抗黑斑病密切相关，过表达的PpCBP60B基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，维持细胞内离子平衡和渗透势稳态，从而提高植株的抗黑斑病能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种转录因子PpCBP60B，其特征在于，该转录因子PpCBP60B的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.编码权利要求1所述转录因子PpCBP60B的转录因子基因PpCBP60B，其特征在于，该转录因子基因PpCBP60B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.用于扩增权利要求2所述转录因子基因PpCBP60B的引物，其特征在于，该引物包括核苷酸序列如SEQ IN NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IN NO:4所示的反向引物。

4.一种生物材料，其特征在于，该生物材料为含有权利要求2所述转录因子基因PpCBP60B的生物材料，或用于干扰、抑制、沉默或敲除权利要求2所述转录因子基因PpCBP60B的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述的含有转录因子基因PpCBP60B的生物材料为(1)～(7)中的至少一种：

(1)含有所述转录因子基因PpCBP60B的表达盒；

(2)含有所述转录因子基因PpCBP60B的重组表达载体；

(3)含有(1)所述表达盒的重组表达载体；

(4)含有所述转录因子基因PpCBP60B的重组菌；

(5)含有(1)所述表达盒的重组菌；

(6)含有(2)所述重组表达载体的重组菌；

(7)含有(3)所述重组表达载体的重组菌。

6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述的用于干扰、抑制、沉默或敲除转录因子基因PpCBP60B的生物材料为病毒沉默载体或包含该病毒沉默载体的重组菌。

7.权利要求1中所述转录因子PpCBP60B、权利要求2中所述的转录因子基因PpCBP60B、或权利要求4～6中任一所述的生物材料在(Ⅰ)～(Ⅳ)中的应用：

(Ⅰ)提高植物黑斑病抗性；

(Ⅱ)下调植物黑斑病抗性；

(Ⅲ)培育抗黑斑病的植物新品种；

(Ⅳ)培育对黑斑病敏感的植物新品种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在目标植物中过表达或超表达权利要求2所述的转录因子基因PpCBP60B以提高植物黑斑病抗性或培育抗黑斑病的植物新品种；或者在目标植物中沉默或敲除权利要求2所述的转录因子基因PpCBP60B以下调植物黑斑病抗性或培育黑斑病敏感的植物新品种。

9.检测权利要求2所述转录因子基因PpCBP60B表达水平的试剂在评估植物对黑斑病及其致病菌抗性中的应用。

10.一种提高植物黑斑病抗性或培育抗黑斑病的植物新品种的方法，其特征在于，在目标植物中过表达或超表达权利要求2所述的转录因子基因PpCBP60B以提高植物黑斑病抗性或培育抗黑斑病的植物新品种。