CN115927403A - 一种霸王ZxPDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种霸王ZxPDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用，本发明通过构建含有ZxPDS报告基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体，该载体经农杆菌转化后，使霸王内源ZxPDS基因发生沉默，有效降低了霸王ZxPDS基因的表达水平。本发明建立了霸王ZxPDS的VIGS沉默体系，为开展霸王基因功能研究提供了新途径，并且应用该体系成功沉默了基因ZxOSCA1.2。

Description

一种霸王ZxPDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种霸王ZxPDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing，VIGS)，属于转录后基因沉默技术(Post-TranscriptionalGeneSilencing，PTGS)，是一种利用植物体内自身的抗病毒防御机制，通过将携带目的基因片段的病毒载体侵入植物后，利用沉默复合体中与目的基因互补的原理降低植物内源性基因表达水平，从而沉默植物基因，达到反向验证植物基因功能的目的。与其他遗传转化体系相比，VIGS技术因操作步骤简单，周期短，转化效率高，以及无需转化体系的特点，广泛应用于植物基因功能的研究。

霸王(Zygophyllumxanthoxylon)是蒺藜科霸王属的一种多年生肉质灌木，具有极强的抗旱性，是西北荒漠地区的建群种之一，具有防风固沙的能力，可以用来保护脆弱的沙漠生态系统；叶肉质化，茎、叶和果实可入药，有很高的药用价值。八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase，PDS)可以将无色的八氢番茄红素催化成有色的类胡萝卜素，是类胡萝卜素合成途径中的关键酶。PDS基因编码的蛋白主要位于植物叶绿体的类囊体膜上，其产物类胡罗卜素可以对叶绿体起到光保护的作用，当PDS基因沉默后，类胡罗卜素合成受阻，使得叶绿体失去了八氢番茄红素脱氢酶的光保护，导致叶绿素降解，出现光漂白现象，因为这种表型明显易分辨，经常作为病毒诱导的基因沉默的报告基因来建立体系，从而进行基因的功能研究，但是目前霸王的遗传转化体系尚未构建完善，这大大限制了霸王基因的功能研究，而且由于霸王是木本植物且叶片肉质，难以建立转化体系包括基因沉默体系。建立霸王的VIGS技术体系，可以极大简化程序提高转化效率，对霸王抗旱基因的筛选和揭示其抗旱原理有创新意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种霸王ZxPDS基因VIGS沉默体系及其构建方法和应用。

一种霸王ZxPDS基因特异性片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取霸王叶片RNA，并反转录为cDNA，用特异性引物PCR扩增并回收所述ZxPDS报告基因特异性核苷酸片段，所述ZxPDS基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将所述ZxPDS报告基因特异性片段连接至VIGS病毒载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2-ZxPDS；

(3)将包含重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的农杆菌菌液与包含pTRV1的农杆菌菌液等体积混合，加入质量分数为0.01％的Silwet，摇匀，制成混合菌液；

(4)用茎尖注射法将步骤(3)的混合菌液侵染霸王植株，即构建得到霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系；

(5)将浸染后的霸王植株避光培养24h，之后在光照30000lx，昼夜温度25℃/23℃，昼夜时间16h/8h，湿度60％的条件下培养，观察植株的表型，并检测霸王植株中ZxPDS的表达情况。

优选的，步骤(1)中所述特异性引物具体如下：

ZxPDS-XbaI-F：5’-GCTCTAGAGCAGAATACCTATCGCAAAC-3’，

ZxPDS-BamHI-R：5’-CGGGATCCACTCTTCAGTAACTCACCGC-3’。

优选的，步骤(2)中构建获得重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的方法为：

(4.1)对步骤(1)中的PCR产物进行电泳、切胶、纯化回收，将ZxPDS基因片段和pTRV2载体分别进行XbaI和BamHI双酶切；

(4.2)将双酶切后的ZxPDS基因片段与pTRV2载体片段连接，获得pTRV2-ZxPDS重组载体。

优选的，步骤(3)中，所述包含重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的农杆菌菌液的获得方法为：将pTRV2-ZxPDS重组载体转化GV3101农杆菌感受态细胞中，得到包含重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的农杆菌菌液。

优选的，所述包含重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的农杆菌菌液OD₆₀₀为0.5-1.5。

一种霸王ZxPDS基因特异性片段在沉默霸王ZxPDS基因中的应用。

一种利用所述构建方法获得的沉默体系在沉默霸王ZxPDS基因中的应用。

一种利用所述构建方法获得的沉默体系在沉默霸王ZxOSCA1.2基因中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明首次构建木本旱生植物霸王VIGS沉默体系，获得了具有能够使霸王ZxPDS基因沉默的体系。使用该体系沉默霸王基因，不需要遗传转化，易于操作，表型出现快，可以快速验证霸王基因的功能，为霸王基因功能的研究奠定了基础。

2、本发明所述沉默体系能够有效降低霸王ZxPDS基因的表达水平，叶绿素含量下降，出现沉默症状。

3、本发明叶片沉默率能达到40％，将叶片沉默率稳定在较高水平，通过对探索不同菌液浓度的影响，在保持较高成活率的基础上，白化率提高到40％。

4、利用本发明的体系还成功沉默了霸王OSCA基因家族中的ZxOSCA1.2基因，ZxOSCA1.2基因沉默植株抗旱性减弱，成功验证了ZxOSCA1.2基因的功能。

附图说明

图1为ZxPDS基因特异性片段PCR产物电泳图；

图2为菌液PCR筛选电泳图；

图3为菌液质粒测序结果与ZxPDS报告基因特异性沉默片段的对比图；

图4为ZxPDS基因沉默的表型图；

图5为ZxPDS基因沉默的TRV病毒检测图；

图6为ZxPDS基因沉默的相对表达量图；

图7为ZxPDS基因沉默的叶绿素含量图；

图8为菌液质粒测序结果与ZxOSCA1.2基因特异性沉默片段的对比图；

图9为ZxOSCA1.2基因沉默的相对表达量图；

图10为ZxOSCA1.2基因沉默植株的气孔图；

图11为ZxOSCA1.2基因沉默植株的气孔开度图；

图12为ZxOSCA1.2基因沉默植株干旱处理后的相对含水量图；

图13为ZxOSCA1.2基因沉默植株干旱处理后的的失水率图；

图14为ZxOSCA1.2基因沉默植株干旱处理后的的叶绿素含量图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例所用材料的信息如下：

TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒(北京全式金生物公司)；PrimeScript^TMRTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(宝日医生物技术有限公司)；

GXLDNA Polymerase试剂盒(宝日医生物技术有限公司)；Kan、Rif、MES、AS(上海生工生物工程股份有限公司)；氯化镁(科密欧化学试剂有限公司)；Silwet(索莱宝生物科技有限公司)。

本发明采用的霸王种子采自于甘肃民勤沙生植物园(102°36′25.37″E)，种植在山西师范大学生命科学学院实验中心培养箱中。种植方法：挑选饱满健康的霸王种子，先用蒸馏水冲洗5次，然后用75％酒精浸泡10min，再用蒸馏水冲洗5次，冲洗干净后将种子置于铺有滤纸的一次性培养皿中，加入少量蒸馏水，放在室温下等待萌发，待种子萌发出1cm左右的芽时，将其种植于已灭菌的珍珠岩中，第一次先浇透水，之后每隔两天浇一次霍格兰营养液，在光照30000lx，昼夜温度25℃/23℃，昼夜时间16h/8h，湿度60％的光照培养箱中培养。。

实施例1构建霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系

(1)ZxPDS全长基因序列的获得

首先，依据霸王转录组数据库基因注释信息得到八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase，PDS)mRNA序列信息，设计用于沉默ZxPDS基因的特异性核酸片段。

(2)ZxPDS基因特异性片段的克隆

以全长基因序列为模板，设计用于扩增ZxPDS基因特异性片段的引物ZxPDS-XbaI-F和ZxPDS-BamHI-R，其核苷酸序列分别为：ZxPDS-XbaI-F：5’-GCTCTAGAGCAGAATACCTATCGCAAAC-3’(SEQ ID NO.3)，ZxPDS-BamHI-R：5’-CGGGATCCACTCTTCAGTAACTCACCGC-3’(SEQ ID NO.4)。

使用TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒提取霸王叶片RNA，使用PrimeScript^TMRTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板利用设计的引物ZxPDS-XbaI-F和ZxPDS-BamHI-R扩增ZxPDS特异性片段，ZxPDS特异性片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其大小为437bp。采用

GXL DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增。PCR扩增体系和程序如下：

表1 PCR扩增体系

表2 PCR扩增程序

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到ZxPDS特异性片段，如图1所示。结果表明：扩增到单一条带，且条带的位置正确。

(3)对PCR产物切胶纯化回收，将ZxPDS和pTRV2载体分别进行双酶切，反应体系如下：

表3双酶切反应体系

将上述体系混合均匀后，37℃酶切2h。

(4)将双酶切后的ZxPDS基因片段与pTRV2载体片段连接，16℃连接过夜。

表4连接反应体系

(5)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布在含抗性的LB固体培养基(含50μg/mLKan)上，37℃培养箱中倒置培养，过夜。

(6)挑取8个单克隆抗性菌落，进行菌液PCR，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，图中1～6号为扩增ZxPDS片段，初步认定连接正确，提取菌液质粒送至北京华大公司测序，测序结果与ZxPDS沉默片段进行比对，比对结果如图3所示，第一行为ZxPDS报告基因特异性沉默片段，第二行为pTRV2-ZxPDS重组载体测序结果，序列比对是一致的，说明重组病毒载体构建成功。

(7)将上述构建好的pTRV2-ZxPDS重组载体通过热激转化至GV3101农杆菌感受态细胞中，得到pTRV2-ZxPDS农杆菌菌液，即为转化后的阳性农杆菌菌液，保存于-80℃冰箱。

(8)混合菌液的制备

1)分别取10μL的含pTRV1、pTRV2和pTRV2-ZxPDS农杆菌菌液，各加入到10mLYEB液体培养基(含50μg/mL的Kan和25μg/mL的Rif)中，28℃，200r/min，避光，初次摇菌24-36h。

2)菌液浑浊后，再加入20-30mL YEB培养液(含50μg/mL的Kan和25μg/ml的Rif)，28℃，200r/min，避光，二次摇菌12-24h。

3)菌液浑浊后，用超速离心机4000r/min离心10min，倒掉YEB上清液。

4)制备侵染液(现配现用)：10mmol/LMES，200μmol/lAS，10mmol/L氯化镁，无菌水定容至500mL，调pH至5.6。

5)在离心后的菌块中加入少量侵染液，用枪头打散菌块，再加入适量的侵染液，将菌液OD₆₀₀浓度调至1.0，将调好的pTRV1分别与pTRV2和pTRV2-ZxPDS菌液等体积混合摇匀，避光静置3h，加入0.01％Silwet，摇匀，用于侵染霸王植株。

5.1)侵染方法如下：

本发明采用茎尖注射法侵染霸王植株，选取生长良好且健壮的具有两片子叶的霸王植株，用1mL注射器将菌液浓度OD₆₀₀是1.0的pTRV2菌液和pTRV2-ZxPDS菌液分别注入霸王植株的茎尖分生组织中。

将VIGS侵染的霸王植株放在培养箱中避光培养24h，之后在光照30000lx，昼夜温度25℃/23℃，昼夜时间16h/8h，湿度60％的光照培养箱中正常培养。在这期间，每2天浇一次营养液，保证水分和养分充足，每天观察植株的表型和生长状况并记录。

5.2)表型观察结果如下：

VIGS处理霸王植株后，每天观察WT(野生型)、pTRV2(空载)、pTRV2-ZxPDS(ZxPDS报告基因沉默)植株的生长情况和表型变化，记录植株的成活和白化情况并拍照。如图4所示，pTRV2-ZxPDS菌液处理的植株叶片出现白化现象。

5.3)病毒检测及定量检测结果如下：

取pTRV2-ZxPDS处理的白化叶片和同等部位pTRV2空载和WT植株的叶片，用TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒提取霸王叶片RNA，并反转为cDNA，用TRV1-F：5’-GGAACGCAGTTTGTTGATCC-3’(SEQ ID NO.5)，TRV1-R：5’-GTTCACTCTTCTTCCCACCA-3’(SEQ IDNO.6)，和TRV2-F：5’-GTGGCTTGACGACACTAATG-3’(SEQ ID NO.7)，TRV2-R：5’-CAAACGCCGATCTCAAACAG-3’(SEQ ID NO.8)特异性引物进行PCR扩增检测病毒的存在，如图5所示，WT植株的叶片未检测到pTRV1和pTRV2病毒，pTRV2空载植株和pTRV2-ZxPDS处理植株的叶片均能检测出来，说明TRV病毒已成功侵染霸王植株并复制传播。用ZxPDS-F：5’-CTCAGCAGATCAGAGCAAAG-3’(SEQ ID NO.9)，ZxPDS-R：5’-GAGAACAGCACCTTCCATTG-3’(SEQID NO.10)定量引物进行qRT-PCR检测ZxPDS基因表达量的变化，如图6所示，pTRV2-ZxPDS处理的白化叶片与WT和pTRV2空载植株的叶片相比，ZxPDS基因的表达量极显著降低(P<0.01)，说明ZxPDS基因沉默成功。

5.4)叶绿素含量测定：

称取pTRV2-ZxPDS处理的白化叶片和同等部位pTRV2空载和WT的叶片各0.01g，剪成细条状，分别放入5ml乙醇：丙酮为1:1的溶液中，避光处理48h，期间轻晃几次，直至叶片变白。取上清液测量，以乙醇：丙酮为1:1的溶液作为对照，用紫外分光光度计在波长652nm下测定吸光度，根据公式计算叶绿素含量。叶绿素总含量(mg/g)＝(OD₆₅₂×V)/(34.5×W)，式中OD₆₅₂为波长652nm下的吸光值，V为提取液的体积，W为叶片鲜重。如图7所示，pTRV2-ZxPDS处理的植株与pTRV2空载植株和WT植株相比，叶绿素含量极显著降低(P<0.01)。

实施例2

实施例2与实施例1的不同之处在于，OD₆₀₀的浓度为0.5，其他步骤与条件均与实施例1相同。

实施例3

实施例3与实施例1的不同之处在于，OD₆₀₀的浓度为1.5，其他步骤与条件均与实施例1相同。

实施例4

用上述建好的霸王VIGS体系验证ZxOSCA1.2基因的功能，提取霸王叶片RNA，反转为cDNA，使用ZxOSCA1.2-XbaI-F：5’-GCTCTAGAAACAGCCCATCCCAGAAGAG-3’(SEQ ID NO.11)和ZxOSCA1.2-BamHI-R：5’-CGGGATCCGCATTCCTTTTCTTGTTGGC-3’(SEQ ID NO.12)引物PCR扩增ZxOSCA1.2基因特异性核苷酸片段，ZxOSCA1.2基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，将ZxOSCA1.2基因特异性片段连接至VIGS病毒载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2-ZxOSCA1.2，测序结果如图8所示，将转化后的阳性农杆菌菌液与pTRV1菌液按菌液等体积混合，加入0.01％Silwet，摇匀，制成混合菌液；用茎尖注射法将混合菌液侵染霸王植株；将浸染后的霸王植株避光培养24h，之后在光照30000lx，昼夜温度25℃/23℃，昼夜时间16h/8h，湿度60％的条件下培养，观察植株的表型，并检测霸王植株中ZxOSCA1.2的表达情况，并用10％PEG对霸王植株进行干旱胁迫处理48h，通过测定气孔、相对含水量、失水率和叶绿素含量等相关指标来验证，结果表明，pTRV2-ZxOSCA1.2沉默植株与WT和pTRV2空载植株相比，ZxOSCA1.2基因的表达量极显著降低(P<0.01)，如图9所示，干旱处理后，与WT和pTRV2空载植株相比，ZxOSCA1.2沉默植株的气孔开度不变，如图10和图11所示，相对含水量极显著降低(P<0.01)，如图12表示，失水率极显著升高(P<0.01)，如图13表示，叶绿素含量极显著降低(P<0.01)，如图14表示，说明ZxOSCA1.2沉默植株抗旱性减弱，用霸王VIGS体系验证了ZxOSCA1.2基因的功能。

对比例1

对比例1与实施例1的不同之处在于，向叶片中注入pTRV2菌液和pTRV2-ZxPDS菌液，其他步骤与条件均与实施例1相同。

对比例2

对比例2与实施例1的不同之处在于，OD₆₀₀的浓度为0.2，其他步骤与条件均与实施例1相同。

对比例3

对比例3与实施例1的不同之处在于，OD₆₀₀的浓度为2.0，其他步骤与条件均与实施例1相同。

表5实施例和对比例的沉默情况

由表5可知，实施例1-3的白化率均优于对比例1-3，本申请的沉默率为30-40％，优于对比例1-3的沉默率。

本发明使用低龄实生苗茎尖注射，首次构建木本旱生植物霸王ZxPDS基因VIGS沉默体系，获得了具有能够使霸王ZxPDS基因沉默的体系。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种霸王ZxPDS基因特异性片段，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取霸王叶片RNA，并反转录为cDNA，用特异性引物PCR扩增并回收所述ZxPDS报告基因特异性核苷酸片段，所述ZxPDS基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将所述ZxPDS报告基因特异性片段连接至VIGS病毒载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2-ZxPDS；

(3)将包含重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的农杆菌菌液与包含pTRV1的农杆菌菌液等体积混合，加入质量分数为0.01％的Silwet，摇匀，制成混合菌液；

(4)用茎尖注射法将步骤(3)的混合菌液侵染霸王植株，即构建得到霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系。

(5)将浸染后的霸王植株避光培养24h，之后在光照30000lx，昼夜温度25℃/23℃，昼夜时间16h/8h，湿度60％的条件下培养，观察植株的表型，并检测霸王植株中ZxPDS的表达情况。

3.根据权利要求2所述的一种霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述特异性引物具体如下：

ZxPDS-XbaI-F：5’-GCTCTAGAGCAGAATACCTATCGCAAAC-3’，

ZxPDS-BamHI-R：5’-CGGGATCCACTCTTCAGTAACTCACCGC-3’。

4.根据权利要求2所述的一种霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，步骤(2)中构建获得重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的方法为：

(4.1)对步骤(1)中的PCR产物进行电泳、切胶、纯化回收，将ZxPDS基因片段和pTRV2载体分别进行XbaI和BamHI双酶切；

(4.2)将双酶切后的ZxPDS基因片段与pTRV2载体片段连接，获得pTRV2-ZxPDS重组载体。

5.根据权利要求2所述的一种霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述包含重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的农杆菌菌液的获得方法为：将pTRV2-ZxPDS重组载体转化至GV3101农杆菌感受态细胞中，得到包含重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的农杆菌菌液。

6.根据权利要求5所述的一种霸王ZxPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，所述包含重组病毒载体pTRV2-ZxPDS的农杆菌菌液OD₆₀₀为0.5-1.5。

7.一种权利要求1所述的一种霸王ZxPDS基因特异性片段在沉默霸王ZxPDS基因中的应用。

8.一种利用权利要求2-4所述的构建方法获得的沉默体系在沉默霸王ZxPDS基因中的应用。

9.一种利用权利要求2-4所述的构建方法获得的沉默体系在沉默霸王ZxOSCA1.2基因中的应用。

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