CN105254730A - 一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码基因与应用。所述提高植物耐盐耐旱性的蛋白的序列如SEQ？ID？NO.1所示，命名为MePMP3-2；编码上述蛋白的基因的序列如SEQ？ID？NO.2所示，命名为MePMP3-2基因。MePMP3-2基因编码的蛋白质定位于植物的细胞膜中，将该蛋白质的编码基因MePMP3-2导入植物中，可以提高转基因植物种子在ABA、NaCl和甘露醇处理下的萌发率；增加转基因植物在高盐和高甘露醇逆境下的根长及苗长；使转基因植物在干旱和高盐的胁迫下具有更高的存活率、较低的丙二醛(MDA)含量和较高的脯氨酸(Pro)含量；转基因植物中OsProT、OsP5CS、OsDREB2A和OsLEA3等逆境相关基因的相对表达量在逆境胁迫下均表现出不同程度的上调。

Description

一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
非生物逆境，如高温、干旱、高盐、碱性土壤、重金属以及过氧化逆境等，都严重威胁着农业生产，是造成世界范围内农作物减产的主要原因。植物的生长、发育以及农作物的产量、品质和后期生长等均受到非生物逆境胁迫的影响，而且全球范围内的主要作物60％的减产量是由非生物逆境的胁迫所导致。为了确保农作物持续稳定的高产，人类亟需培育出对干旱、高盐、过氧化等非生物逆境胁迫具有更高耐受能力的作物新品种。但通过传统的育种方法在改善农作物的性状和抗逆性的进展缓慢，而利用生物基因工程技术则具有良好的预见性、更高的效率，是培育具有耐逆性农作物新品种最有效的途径。利用现代分子生物学技术发现新的耐逆境基因，是培育抗逆性农作物新品种的关键所在。
干旱和高盐胁迫是限制谷类作物产量增加最主要的两个因素。为了适应这些不利环境带来的生存压力，植物进化出了多种多样的复杂的生物机制，调节许多逆境相关基因的表达，试图减少这些逆境对其造成的损伤。这些基因参与到不同的生物途径和过程中，包括逆境感知和信号转导，从而导致分子、生化、细胞、生理和形态的适应，最终使整个植物发生响应。到目前为止，已经有大量的逆境相关基因被克隆和鉴定，例如水稻Pro合成酶基因(OsP5CS；)、水稻Pro转运酶基因(OsProT)、水稻转录因子基因(OsDREB2A)和水稻胚胎晚期丰富蛋白基因(OsLEA3)。这些基因一旦被激活，则会影响MDA和Pro在细胞中的积累，从而使植物免受由于高盐、干旱和过氧化物等逆境胁迫所产生的伤害。MDA是反应脂质过氧化损伤程度最重要的指标。自由Pro的积累则是植物在遭受非生物逆境时最重要的反应机制，其作用在于通过改变细胞内的渗透势来维持植物的亚细胞结构，从而使植物免受逆境的伤害。
研究显示，大量的PMP3家族基因参与植物对逆境的反应过程。PMP3是一类广泛存在于在包括酵母、小型动物、水草和高等植物在内的多种生物体内的疏水性小蛋白，且以多基因家族的形式存在。大量实验结果表明，植物PMP3基因对包括高盐、干旱或者寒冷等在内的多种逆境有所反应，从而参与植物对逆境胁迫的响应过程。这些基因编码的蛋白质包括来自大麦的LeESI3(Lophopyrumelongatum)、来自水稻的OsRCI2-5、OsLti6a/b和R1G1B(Oryzasativa)、来自羊草的AcPMP3-1(Aneurolepidiumchinense)、来自水稻的AtRCI2A/B/D/F(Arabidopsisthaliana)、来自星星草的PutPMP3-1/-2(Puccinelliatenuiflora)和来自玉米的ZmPMP3-2/3/4(Zeamays)。有证据显示，PMP3基因的功能和反应根据其参与的不同的逆境反应途径而各有不同。例如蛋白质AtRCI2A可能参与水稻在非生物逆境下不依赖CBF/DREB1信号途径的反应过程，但是水稻中的OsLti6a蛋白则在低温逆境条件下受DREB转录因子的调节。报道显示，植物PMP3基因也能被一些信号分子所诱导表达，这些信号包括：ABA和H2O2，因此我们推测PMP3基因可能在植物ABA依赖型逆境反应过程中也发挥着重要的作用。
在酵母中，Pmp3p蛋白能够阻止外界环境中的Na+离子进入到细胞中，从而起到保护细胞膜的电位的作用。将植物的PMP3蛋白在酵母中异源表达后，能够弥补pmp3突变体所缺失的功能，说明植物中的PMP3蛋白可能也具有类似的作用。敲除水稻的AtRCI2A基因后，突变体植株对盐和Na+离子的敏感性增强而在水稻中过量表达AtRCI2A基因则具有相反的作用。而且，在羊草中，AcPMP3-1基因被定位在具有调节Na+和K+离子浓度的根冠中。虽然人们普遍认为PMP3基因间接参与调控了细胞对离子的吸收，但是其确切的作用机制仍然有待阐明。由于PMP3蛋白的分子质量普遍较小，它们是不可能形成离子通道的，因此人们对PMP3蛋白在逆境反应过程中的具体作用仍知之甚少。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码基因与应用。
所述提高植物耐盐耐旱性的蛋白的序列如SEQIDNO.1所示，命名为MePMP3-2蛋白，来源于木薯。
编码上述蛋白的基因的序列如SEQIDNO.2所示，命名为MePMP3-2基因。
所述植物重组表达载体含有上述的MePMP3-2基因。
优选地，所述植物重组表达载体是将所述的MePMP3-2基因插入空载体中而构建的植物重组表达载体，所述空载体选自pHB、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或pBY505。
优选地，所述植物重组表达载体是将所述的MePMP3-2基因插入到空载体pHB的多克隆位点而构建的植物重组表达载体，植物重组表达载体的序列如SEQIDNO.3所示，命名为pHB::MePMP3-2植物表达载体。
上述蛋白MePMP3-2、上述MePMP3-2基因和上述植物重组表达载体可用于培育耐旱和耐盐植物。所述植物为为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物为水稻。
下面对本发明作进一步说明：
MePMP3-2的氨基酸序列(SEQIDNO.1)，包括77个氨基酸，该蛋白质的分子量为8.65KD，等电点为4.94。生物信息学分析结果发现，MePMP3-2含有保守结构域PS01309([LIVF]-x-[STAC]-[LIVF](3)-P-[PF]-[LIVA]-[GAV]-[IV]-x(4)-[GKN])，分别是SEQIDNO.1中的第11-27位以及第33-50位的氨基酸组成的结构域。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。
SEQIDNO.2所述序列为编码MePMP3-2的全长cDNA序列，该序列共由743个碱基组成，其中，5’端未翻译区包括180个碱基，3’端未翻译区包括200个碱基(其中包括第271位-第399位碱基组成的内含子，不参与该蛋白质的编码)，编码区由231个碱基(第181位-第270位和第400-第543位)组成，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的MePMP3-2蛋白，编码区中，A占15.15％(35个)，C占25.54％(59个)，G占21.21％(49个)，T占38.09％(88个)，A+T占53.25％(123个)，C+G占46.75％(108个)。数据库搜索氨基酸与核苷酸序列发现，PMP3基因家族是目前已知基因中与MePMP3-2同源性最高的基因，虽然核苷酸序列的同源性较低，但是氨基酸的同源性达到53.8％，初步推测基因MePMP3-2属于PMP3基因家族。目前为止，尚未发现任何与该基因的相关的研究报道。
可用现有的植物表达载体构建含有MePMP3-2基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pHB、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pBY505或其它衍生植物表达载体。
使用MePMP3-2基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
上述植物重组表达载体是将上述的MePMP3-2基因插入pHB的多克隆位点，得到的植物重组表达载体。
将上述的MePMP3-2基因导入目的植物，得到耐旱和耐盐转基因植物，所述耐旱和耐盐转基因植物的耐旱和耐盐性高于目的植物。
所述耐旱和耐盐转基因植物为耐高盐、耐甘露醇、耐PEG和/或耐干旱转基因植物。
上述的MePMP3-2基因是通过上述的植物重组表达载体导入目的植物中。携带有本发明的MePMP3-2基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
实验证明：MePMP3-2基因编码的蛋白质定位于植物的细胞膜中，将其转化入植物中可以提高转基因植物种子在ABA、NaCl和甘露醇处理下的萌发率；增加转基因植物在高盐和高甘露醇逆境下的根长及苗长；使转基因植物在干旱和高盐的胁迫下具有更高的存活率、较低的丙二醛(MDA)含量和较高的脯氨酸(Pro)含量；转基因植物中OsProT、OsP5CS、OsDREB2A和OsLEA3等逆境相关基因的相对表达量在逆境胁迫下均表现出不同程度的上调。
附图说明
图1PCR产物凝胶电泳图，M,DL2000PlusDNAmarker；N,无模板对照；1，2均为扩增产物；
图2酶切鉴定阳性克隆，M,DL2000PlusDNAmarker；1-3,不同克隆的酶切产物。
图3pHB::MePMP3-2植物表达载体图谱；
图4载体构建流程图；
图5表达载体pHB::MePMP3-2酶切鉴定图，M,DL15000PlusDNAmarker；1-2,不同克隆的酶切产物；
图6转基因植株PCR鉴定，M,DL2000PlusDNAmarker；1,阳性对照(pHB::MePMP3-2质粒)；2,无模板对照；3,野生型对照，4-17,转基因植株；
图7实时荧光定量qRT-PCR分析MePMP3-2基因在野生型及转基因株系中的表达水平。a,pHB::MePMP3-2载体的T-DNA区；b，实时荧光定量RT-PCR分析MePMP3-2基因在转基因株系和野生型中的表达水平；
图8MePMP3-2基因的转基因株系和野生型种子在ABA、NaCl、甘露醇和正常条件下的萌发情况；
图9MePMP3-2基因的转基因株系和野生型水稻在盐和甘露醇胁迫条件下的苗长和根长比较；a,b,c野生型(WT)和转基因株系(L-3、L-5)在1/2MS(a)、含有140mMNaCl(b)或400mMmannitol(c)的1/2MS培养基上生长7天；d,e野生型(WT)和转基因株系(L-3、L-5)的苗长和根长；
图10T3代转基因株系耐盐、耐旱性鉴定；a,c左侧正常条件下生长24天后的植株；a,c右侧140mMNaCl或者干旱处理6天后，恢复7天；WT,野生型；L-3和L-5,转基因株系L-3和L-5。b,d高盐或者干旱处理后恢复7天，植株的存活率；
图11MePMP3-2和水稻逆境相关基因OsProT,OsP5CS,OsDREB2A和OsLEA3在逆境下的表达分析；野生型和转基因株系经140mMNaCl或20％PEG-6000处理48小时后，采用qRT-PCR分析目标基因的相对表达量；将UBQ5基因作为内参；
图12MePMP3-2的表达在正常与干旱或者盐处理条件下对植物中MDA和Pro含量的影响；转基因株系和野生型在正常1/2MS培养基上生长3周后，转移到含有140mMNaCl或者20％PEG-6000的1/2MS培养基上继续生长48小时；然后取植株的叶片用来分析MDA(a)和Pro(b)的含量；
图13MePMP3-2::GFP基因片段的PCR扩増产物；M代表Marker；N无模板对照；1代表PCR产物；
图14PMD18::MePMP3-2::GFP质粒酶切鉴定；M代表Marker；1代表酶切产物；
图15pJIT163::MePMP3-2::GFP质粒酶切鉴定；M代表Marker；1,2代表酶切产物；
图16pCAMBIA1300::MePMP3-2::GFP瞬时表达载体图谱；
图17pCAMBIA1300::MePMP3-2::GFP载体构建流程图；
图18pCAMBIA1300::MePMP3-2::GFP质粒酶切鉴定；M代表Marker；1,2代表酶切产物；
图19MePMP3-2蛋白的亚细胞定位；a,融合基因CaMV35S::MePMP3-2::GFP的载体图；b，经农杆菌介导的瞬时表达法用携带有GFP和MePMP3-2::GFP基因的农杆菌菌液浸染洋葱表皮细胞。
具体实施方式
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、培育转基因水稻
一、重组表达载体的构建
1、MePMP3-2基因的克隆
①木薯总RNA提取
植物组织材料取材后，剪碎，迅速置于液氮中研磨成干粉状，取约100mg的粉末状材料，装入事先盛有1.0mLTRIzol提取液(Invitrogen)的1.5mL离心管中，盖紧管盖，摇动，使样品与TRIzol提取液充分混合。以低温记号笔编号后，置于-70℃超低温冰箱中冻存备用。
将-70℃超低温冰箱中冻存备用的样品取出后，冰浴5min，使样品的核蛋白完全裂解，按照200μl氯仿/mlTRIzol加入适量氯仿，用力震荡15s(注：此处禁用涡旋振荡仪，以免将基因组DNA震断)后室温放置15min，再4℃，12000g离心15min；小心吸取出上层水相，转入另一干净的离心管中；按照0.5ml异丙醇/mlTRIzol加入事先预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，置于-20℃沉淀10min；4℃，12000g离心10min；弃上清，此时RNA已沉于管底。在离心管中加入1mL事先预冷的75％乙醇，上下颠倒离心管，悬浮沉淀洗涤；4℃，8000g离心5min；弃上清，室温或真空干燥5-10min后(注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解)。加入50μlRNase-free的水，充分溶解，55-60℃处理5-10min。所提RNA经DNA酶(Fermentas)后，测OD值定量RNA的浓度，用作荧光定量PCR的模板和合成cDNA的第一链。
DNase消化的反应体系是：
置于37℃水浴30min。
②反转录反应
在无菌0.2ml的离心管中配置下列引物/模板RNA混合液，70℃温育10min后，迅速置于冰上2～5min，快速离心数秒，使引物/模板RNA的变性溶液集于管底。
cDNA第一链合成的反应体系是：
在上述离心管中配置下列反转录反应液后，42℃温育1h；随后再在70℃温育15min，置于冰上冷却，得到cDNA用于之后的PCR扩增。
③PCR体外扩增
通过木薯的生物信息学数据库http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#搜索该基因的的核苷酸序列，根据搜索到的序列采用VectorNTI11.0软件设计该基因的特异性PCR扩增引物，并在其5’端分别加上PstI和XbaI酶切位点。上游引物及下游引物如下：
MePMP3-2-F：5’-CTGCAGGTTTTAAAGAAAAATGCCTTCTCG-3’(SEQIDNO.4)，
MePMP3-2-R：5’-TCTAGACATAAAGAGTAAGAACAAGGC-3’(SEQIDNO.5)。
以木薯品种华南124的cDNA为模板，采用高保真的LATaq聚合酶进行PCR扩增。在灭菌的PCR管中建立如下反应体系：
反应程序为：95℃预变性4min：94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸45s，30cycles；72℃延伸5min。反应结束后，电泳检测PCR结果(图1)。
④PCR产物的纯化
电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒(天根)回收目的基因片断。
⑤DNA连接反应
参照pMD18-TVector(TaKaRa)说明书，按试剂盒要求建立连接反应体系：pMD18-TVector0.5μl，SolutionI4.5μl，回收基因片断2μl，ddH2O3μl，总反应体积10μl。16℃过夜连接。
⑥连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(热激法)
无菌条件下取5μl连接产物加到感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min。42℃热激90s，将离心管迅速转到冰浴中放置2-3min。加无抗生素的LB培养基800μl，37℃摇床(100-160rpm)，温和摇振1h左右。取200μl培养液涂于含抗生素50μg/ml的LB固体培养基上，在涂菌液之前首先加入X-Gal和IPTG涂匀，37℃倒置培养12-16h。
⑦阳性克隆的筛选及鉴定
1)阳性克隆的筛选
培养基中长出许多的蓝色和白色菌斑，待菌斑长到合适大小时，用灭菌的芽签挑取几个白斑，分别于含有50μg/mlAmp的LB液体培养基中振荡培养12-16h。
2)碱裂解法小量提取质粒DNA
3)阳性克隆鉴定
利用PstI和XbaI(上、下游引物所加酶切位点)，结果见图2。选取鉴定出的阳性克隆，送交公司测定序列。测序结果表明目的片段的DNA序列为序列表中序列1所示的自5’端第181位-第270位和第400-第543位的核苷酸序列，可编码序列2所示的蛋白。
2、构建重组表达载体
构建流程图如图4所示。
①载体材料
pHB::MePMP3-2植物表达载体构建流程：
将PCR扩增获得的MePMP3-2片段连接至克隆载体PMD18-T中后，经酶切鉴定并且测序正确后，同时用PstI和XbaI对连有MePMP3-2基因的载体PMD18-MePMP3-2和过表达载体质粒pHB进行酶切；回收MePMP3-2基因和载体片段；将MePMP3-2基因片段和载体片段用T4连接酶连接后，转化大肠杆菌感受态细胞DH10B，挑选单菌落扩大培养后，抽提质粒，选择PstI和XbaI双酶切进行鉴定，最终获得连接有MePMP3-2基因的过表达载体pHB::MePMP3-2；载体的构建流程详见图4。采用热激转化法将载体pHB::MePMP3-2转化到农杆菌EHA105菌株中。
目的基因与载体片段的连接反应体系如下：
反应条件：16℃连接过夜。
二、培育转基因水稻及其检测
1、转基因水稻的获得
1)表达载体转化农杆菌
将表达载体pHB::MePMP3-2利用热激法分别转化农杆菌EHA105(购于天根生化科技(北京)有限公司)，抽提质粒并进行酶切鉴定，采用方法与上述表达载体鉴定的步骤相同，结果表示表达载体pHB::MePMP3-2已经成功转化农杆菌。
2)水稻成熟胚愈伤组织培养
本研究的转化受体材料为水稻品种台北309，体操作如下：
挑选健康饱满的籽粒，剥去颖壳，置于37℃培养箱中过夜。取出种子，放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇进行表面灭菌5min，用无菌水冲洗1～2次后，再用次氯酸钠原液消毒45min。无菌水冲洗6～8次后，将种子置于灭菌的滤纸上晾干。再次挑去有霉变的种子，将健康的种子接种到诱导培养基上，尽量让胚的一半接触培养基。每皿22～26粒，置于25～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。3周后，挑选出活性较高的愈伤组织(表面干爽、结构致密)，去除愈伤组织附近的芽头和谷粒，转接到J3继代培养基上，继代培养1～2次，每次3周。
3)农杆菌介导法转化水稻愈伤组织
将含有目的基因的表达载体的农杆菌EHA105的菌液划LB板(Kan100mg/L+Chl34mg/L+Rif100mg/L)，28℃倒置培养2天后，挑取单菌落划LB板(Kan100mg/L+Chl34mg/L+Rif100mg/L)全皿，28℃倒置培养2天后，用共培养基(NBM+As0.1mM)将菌体洗下，调整体积至50mL，调整OD600值到大约0.5。从继代1～2次的愈伤组织，中挑选出表面干爽、结构致密的愈伤颗粒，置于灭菌的滤纸上风干至表面略微发白。将经过风干处理后的愈伤组织，转移到准备好的农杆菌菌液中浸泡30min，期间每隔5min摇晃一次。浸染结束后，用灭菌水冲洗6～8次，直至液体不浑浊，再用灭菌滤纸吸干愈伤组织上的水分，置于灭菌的滤纸上，再次将愈伤组织风干至表面略微发白。每皿共培养基(NBM+As0.1mM)上方放一张用液体共培养基浸湿滤纸，铺平，再将愈伤组织转移到其上，25～26℃下暗培养。3天后，将愈伤组织转入灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗6～8次，至液体不浑浊，再用灭菌水(含有的500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素)浸泡30min，期间每隔5min摇晃一次。用灭菌滤纸吸干愈伤组织表面的水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面略微发白。将愈伤组织转移到筛选培养基(J3+500mg/L头胞霉素+400mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素)上，25～26℃下暗培养。3周后，将长出抗性愈伤的愈伤组织转入新的筛选培养基中。两次筛选后，将长出抗性愈伤的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞霉素+400mg/L羧苄青霉素)中，置于25～26℃下培养，每天给予14h的光照，每3周更换一次分化培养基。当分化出的绿苗高约5～8cm时，将其转移到生根培养基(R)上，置于25～26℃下培养，每天给予14h的光照。3～4周后，打开瓶盖加入适量蒸馏水，在植物组织培养室内炼苗，3～7天后，将幼苗移入黑色桶子或实验田中。
4)转基因水稻T0代植株的PCR鉴定
通过农杆菌介导法转化愈伤组织获得转基因水稻株系后，利用PCR扩增技术鉴定所得株系是否为阳性转基因植株。采用CTAB法，分别提取各水稻株系叶片的DNA作为模板，通过对目的片段的特异性扩增引物(同上)进行PCR扩增。
反应体系如下：
热循环设置为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸30s，35cycles；72℃延伸35min。同时设置阴性无模板对照、阴性野生型对照和阳性质粒对照。
扩增后的琼脂糖凝胶电泳如图6。结果表明，所检测的19个株系中，有7个株系能够扩增出与目的片段大小一致的DNA条带(图6，250bp左右)。无模板对照和野生型对照均没有条带显示。多次重复试验表明，所得到的27个潮霉素抗性再生株系中，有10个株系是阳性转基因植株苗。
5)qRT-PCR检测阳性转基因株系中MePMP3-2的相对表达水平
基于PCR鉴定容易出现假阳性的事实，为了进一步确定目的基因已转入水稻中，并且检验目的基因的表达情况，从上述经PCR鉴定为阳性转基因的株系中随机选取5个株系，分别编号为L-1、L-2、L-3、L-4和L-5，另外选取野生型台北309为对照，利用实时荧光定量qRT-PCR，检测MePMP3-2在不同株系中的相对表达水平。RNA提取、cDNA第一链的合成及实时荧光定量qRT-PCR详细操作同上，所用引物MePMP3-2F:MePMP3-2R(序列同上)及内参引物UBQ5(序列如下：)
UBQ5-F5’-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3’(SEQIDNO.6)，
UBQ5-R5’-ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3’(SEQIDNO.7)。
实验结果表明(图7)，MePMP3-2基因在野生型水稻台北309中没有表达，不同转基因株系中MePMP3-2基因的相对表达量差异显著，其中L-3和L-5的相对表达量较高，因此选定这2个株系用于MePMP3-2基因的进一步功能研究。
2、检测分析
1)T3代转基因水稻株系在不同逆境处理下的萌发实验
挑选野生型台北309和两个转基因水稻株系L-3和L-5的饱满种子，去除颖壳、消毒后，点播在含有不同浓度ABA(0μM，4μM)、NaCl(0mM，140mM)和Mannitol(0mM，400mM)的固体1/2MS培养基上，置于25～26℃下培养，每天给予14h的光照，第7天统计萌发率。每个处理重复三次。
2)T3代转基因水稻株系在盐胁迫下的芽长与根长实验
挑选野生型台北309和两个转基因水稻株系L-3、L-5的种子脱壳消毒后，点播在含有不同浓度NaCl(0mM，140mM)和Mannitol(0mM，400mM)的固体1/2MS培养基上，置于25～26℃下培养，每天给予14h的光照，第7天统计萌发率。每个处理重复三次。
3)T3代转基因水稻株系在苗期耐旱性鉴定
分别挑选转野生型台北309和两个转基因水稻株系L-3、L-5的健康种子各100粒，去除颖壳、消毒后，点播在普通固体1/2MS培养基上，置于25～26℃下培养，每天给予14h的光照。待幼苗长到约12cm时，去掉培养瓶的盖子，加入适量蒸馏水，在植物组织培养室内炼苗，3～7天后，将幼苗移入实验室购置的蓝色盆中，盆中装有适量的泥土，自然条件下生长。当生长到45天左右时，去除盆中水层后，用含有140mMNaCl的液体1/2MS培养基浇灌6天后，正常浇水，同时设置无处理、自然生长作为对照，恢复30天后，统计各株系的存活率。
4)T3代转基因水稻株系苗期耐干旱性鉴定
分别挑选转野生型台北309和两个转基因水稻株系L-3、L-5的健康种子各100粒，去除颖壳、消毒后，点播在普通固体1/2MS培养基上，置于25～26℃下培养，每天给予14h的光照。待幼苗长到约12cm时，去掉培养瓶的盖子，加入适量蒸馏水，在植物组织培养室内炼苗，3～7天后，将幼苗移入实验室购置的蓝色盆中，盆中装有适量的泥土，自然条件下生长。当生长到45天左右时，去除盆中水层后，停止浇水至叶片自然卷曲，正常浇水，同时设置无处理、自然生长作为对照，恢复30天后，统计各株系的存活率。
5)NaCl、PEG等逆境条件下的植物材料处理
分别挑选转野生型台北309和两个转基因水稻株系L-3、L-5的健康种子各100粒，去除颖壳、消毒后，点播在普通固体1/2MS培养基上，置于25～26℃下培养，每天给予14h的光照。待幼苗长到约12cm时，去掉培养瓶的盖子，加入适量蒸馏水，在植物组织培养室内炼苗，3～7天后，将幼苗移入液体1/2MS培养基中，自然条件下生长。当生长到30天左右时，改加含有140mMNaCl和20％PEG-6000的液体1/2MS培养基，处理24小时后。将取叶片，迅速置于液氮中研磨成干粉状，装入事先装有1mLTRIzol培养液的1.5mL离心管中，混匀后储存于-70℃超低温冰箱中备用。
取样后，自然条件下恢复30天，统计各株系的存活率。
同时设置无处理、自然生长作为对照。
6)耐NaCl、PEG等逆境相关基因的实时荧光定量PCR检测
总RNA提取及第一链cDNA合成参照2.4和2.5中的方法。qRT-PCR选用 GreenqPCRSuperMix-UDG试剂盒(Invitrogen)，选取UBQ5基因作为内参基因，合成的第一链cDNA作为模板。通过实时荧光定量PCR分析了OsRD29A,OsP5CS,OsDREB2A,OsLea3基因的相对表达水平,实验中所使用的引物参见表2.1。qRT-PCR反应仪器选用ABI7900HT(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)。反应程序为：95℃预变性10min,；94℃变性15s,58℃退火30s,72℃延伸30s；共40个循环。相对定量的计算方法参照2.6中的方法。
7)MDA和Proline含量测定
分别挑选转野生型台北309和两个转基因水稻株系L-3、L-5的健康种子各100粒，去除颖壳、消毒后，点播在普通固体1/2MS培养基上，置于25～26℃下培养，每天给予14h的光照。3周后，去掉培养瓶的盖子，加入适量蒸馏水，在植物组织培养室内炼苗，3～7天后，将幼苗分三组：一组移入含有200mMNaCl中处理2天，另一组自然干旱至卷叶后，剩下的一组做无处理对照。每个样品三个重复。
MDA测定：各株系取0.5g(W)叶片，加入2ml事先预冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，于冰上研磨成匀浆。将匀浆、研钵中剩余的组织用缓冲液洗净，一并移入离心管中，再用缓冲液定容至5ml。4℃，4500g离心10min，测量上清液(MDA提取液)的体积(V)。吸取2ml(V2)的MDA提取液于试管中(空白为2ml缓冲液)，加入3ml0.5％的TBA溶液后，放入沸水中煮沸10min(自溶液中有小气泡产生开始计时)后，立即将试管放入冰上静置片刻。4℃，4500g离心10min，取上清液并测量其体积(V1)。上清液于532nm、600nm波长下测定吸光度。MDA(nmol·g-1)＝6.452×(A532－A600)×(V1×V÷V2×W)。式中，V1为反应液总量(ml)，V2为反应液中的提取液数量(ml)，V为提取液总量(ml)，W为植物样品重量(g)。
Proline测定：各株系取0.5g叶片，剪碎，置于试管中，加入5ml3％磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水中煮10min后，取出试管，冷却至室温后，吸取2ml上清液，加入2ml冰乙酸和3ml显色液(0号调零管：2ml冰乙酸+3ml显色液+2ml去离子水)，于沸水中煮40min。取出冷却后，向各试管加入5ml甲苯，充分振荡混匀以萃取红色物质。静置，待分层后吸取甲苯层，以0号管为对照在波长520nm下比色。从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量。Y＝(C*V)/(A*W)式中：C为提取液中脯氨酸含量(由标准曲线求得)，V为提取液总体积，A为测定时所吸取的体积，W为样品量，Y为脯氨酸含量。
8)MePMP3-2基因的亚细胞定位
构建表达载体pCAMBIA1300::MePMP3-2::GFP。采用农杆菌介导法侵染洋葱表皮细胞，观察融合蛋白在洋葱细胞中的表达，从而对MePMP3-2基因进行亚细胞定位。
实验材料为：乙酰丁香酮、Sillwet-77、1/2MS培养基、洋葱等。
具体实验操作如下：
将含有目的基因的表达载体的农杆菌EH105的菌液划LB板(Kan100mg/L+Chl34mg/L+Rif100mg/L)，28℃倒置培养2天后，挑取单菌落划LB板(Kan100mg/L+Chl34mg/L+Rif100mg/L)全皿，28℃倒置培养2天。用悬浮液(含5％g/V蔗糖+100mg/L乙酰丁香酮+0.02％Sillwet-77)将菌体洗下，调整体积至50mL，调整OD600值到1～1.5。
洋葱去外表皮，取中间层洋葱表皮切成1㎝的方块状，放入含有6mL农杆菌悬浮液的培养皿中，28℃下暗培养6～12h。然后再转移到固体1/2MS培养基(30g/L蔗糖，0.7g/L琼脂，PH5.7)上共培养。1～2天后，将侵染好的洋葱块放入灭菌水中漂洗，然后用镊子将洋葱的内表皮剥下来，平铺在载玻片上，LeicaMZ16FA荧光显微镜(LeicaMicrosystems,Germany)下观察融合蛋白的分布情况，并拍摄照片。
大量的实验结果表明，MePMP3-2基因编码的蛋白质定位于植物的细胞膜中，将该蛋白质的编码基因MePMP3-2导入植物中，可以提高转基因植物种子在ABA、NaCl和甘露醇处理下的萌发率；增加转基因植物在高盐和高甘露醇逆境下的根长及苗长；使转基因植物在干旱和高盐的胁迫下具有更高的存活率、较低的丙二醛(MDA)含量和较高的脯氨酸(Pro)含量；转基因植物中OsProT、OsP5CS、OsDREB2A和OsLEA3等逆境相关基因的相对表达量在逆境胁迫下均表现出不同程度的上调。

Claims (10)

1.一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白，其特征在于，所述蛋白的序列如SEQIDNO.1所示，命名为MePMP3-2蛋白。
2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQIDNO.2所示，命名为MePMP3-2基因。
3.一种植物重组表达载体，其特征在于，所述植物重组表达载体含有权利要求2所述的基因。
4.如权利要求3所述的植物重组表达载体，其特征在于，所述植物重组表达载体是将权利要求2所述的基因插入空载体中而构建的植物重组表达载体，所述空载体选自pHB、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或pBY505。
5.如权利要求4所述的植物重组表达载体，其特征在于，所述植物重组表达载体是将权利要求2所述的基因插入到空载体pHB的多克隆位点而构建的植物重组表达载体，植物重组表达载体的序列如SEQIDNO.3所示，命名为pHB::MePMP3-2植物表达载体。
6.如权利要求1所述提高植物耐盐耐旱性的蛋白在培育耐旱和耐盐植物中的应用。
7.如权利要求2所述基因在培育耐旱和耐盐植物中的应用。
8.如权利要求3所述植物重组表达载体在培育耐旱和耐盐植物中的应用。
9.如权利要求6至8任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为为双子叶植物或单子叶植物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述单子叶植物为水稻。
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