CN102304176A - 水稻OsASIE1基因在增强植物耐盐性中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻OsASIE1基因在增强植物耐盐性中应用。本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在增强植物耐盐性中的应用、序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在增强植物耐盐性中的应用。本发明的实验结果表明，OsASIE1基因在受到高盐和干旱胁迫时表达量迅速增加，但受到低温胁迫时增加幅度较小；OsASIE1转录因子可以通过结合下游基因启动子区域的GCC box和DRE来调控下游基因的表达，参与植物胁迫应答反应；在水稻中超表达OsASIE1基因能够在一定程度上改善水稻耐盐胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。

Description

水稻OsASIE1基因在增强植物耐盐性中应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中水稻OsASIE1基因在增强植物耐盐性中应用。

背景技术

各种生物和非生物胁迫是影响水稻生长和产量的重要因素，发掘能够改善水稻抵抗逆境胁迫能力的基因将为基因工程改良水稻新品种打下基础。在长期进化过程中，植物在分子、细胞、生理和生物化学水平上发展出多种机制应对逆境胁迫，转录因子作为上游调控基因在植物的胁迫应答途径中扮演重要的角色。植物中参与胁迫应答反应的主要有AP2/EREBP、bZIP、NAC、MYB和WRKY转录因子家族。其中AP2/EREBP转录因子家族基因广泛参与植物的发育、激素信号转导、病原反应与干旱、高盐及低温等胁迫应答反应。该家族转录因子的共同特点是含有一个60个氨基酸左右的AP2结构域，它在与DNA结合中具有重要的作用。根据AP2结构域的特点，AP2/EREBP转录因子家族被分为：AP2、EREBP、RAV和其他共4个亚类。AP2成员含有2个重复的AP2结构域，而RAV成员含一个AP2结构域和一个类似B3结构域；EREBP亚家族成员含有一个AP2结构域，且有ERF和DREB/CBF两个分支。

研究表明，EREBPs转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫应答反应。ERFs类转录因子主要参与植物的生物胁迫应答反应，如病原反应、伤害反应、乙烯信号途径。最早发现的ERF转录因子是从烟草中分离得到的4个乙烯诱导病程相关(pathegenesis-related，PR)蛋白EREBP1-4，它们通过结合下游基因启动子区域的乙烯应答元件GCC box调控下游基因的表达。GCC box广泛存在于烟草和其他植物PR蛋白基因的5′UTR区域，核心序列是AGCCGCC。1997年，Zhou等在番茄中发现3个ERF蛋白(Pti-4、Pti-5和Pti-6)能够和疾病防御蛋白Pto相互作用，进一步验证了ERFs转录因子在植物的病原反应中具有重要作用。在植物中超表达一些ERFs基因亦能够提高植物的抗病能力，如ERF1、Pti4、ATERF1基因。最近的研究表明水稻中的ERF转录因子在乙烯应答、淹水胁迫应答、干旱胁迫应答等多种生物途径中起着正向调节作用。

DREBs转录因子在植物的冷、干旱、高盐、过氧化物等胁迫应答途径中具有重要的作用，参与不依赖于ABA的胁迫应答反应。DREBs转录因子通过结合下游基因启动子区的干旱应答顺式作用元件DRE/CRT而调控下游基因的表达。干旱应答顺式作用元件DRE(dehydration-responsive element)最早在逆境胁迫诱导基因rd29A的启动子区域被发现，核心序列为A/GCCGAC。与DRE相似的顺式作用元件CRT(C-repeat)则是在一个冷诱导基因cor15a的启动子区被发现，其核心序列是TGGCCGA。DRE/CRT被发现存在于多个受干旱和低温诱导的基因的启动子区域。在拟南芥、水稻等植物中超表达DREB家族的基因大多能提高植株应对非生物胁迫的能力。迄今为止，越来越多的DREBs基因从不同植物中被克隆。在水稻中发现的DREB基因有OsDREB1A-G、OsDREB2A、OsDREB2B，其中OsDREB1A、OsDREB1E、OsDREB1G、OsDRE B2A、OsDREB2B能够特异性地结合DRE。研究发现在拟南芥中超表达OsDREB1A能够提高拟南芥植株耐受低温、高盐和干旱的能力(Dubouzet J G，SakumaY，Ito Y，Kasuga M，Dubouzet E G，Miura S，Seki M，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.OsDREB genes in rice，Oryza sativa L.，encode transcription activators that function indrought-，high-salt-and cold-responsive gene expression.Plant J，2003，33：751-763)；在水稻中超表达OsDREB1G和OsDREB2B也能够明显地提高转基因水稻的抗旱性，而超表达OsDREB1E仅仅能够轻微地提高水稻抵抗干旱的能力(Chen J Q，Meng X P，ZhangY，Xia M，Wang X P.Over-expression of OsDREB genes lead to enhanced drought tolerancein rice.Biotechnol Lett，2008，30(12)：2191-2198)。

[1]ERFs和DREBs转录因子功能的差异主要体现在它们能够结合的顺式作用元件和调节的下游基因不同。有些EREBPs转录因子既能结合DRE，也能结合GCCbox，如TINY、TINY2、BnDREBIII、AtERF1、AtERF4、AtEBP和CBF1；而部分只能结合DRE，如CBF2/DREB1C和CBF3/DREB1A等。ERFs转录因子倾向于结合GCC box，DREBs转录因子则倾向于结合DRE。为了发掘影响两类转录因子结合的关键氨基酸，Sakuma等(Sakuma Y，Liu Q，Joseph G.DNA-binding specificity of the ERF/AP2domainof Arabidopsis DREB，transcription factors involved in dehydration-and cold-induciblegene expression.Biochem Biophy Res Commun，2002，290：998-1009)通过多序列比对分析发现拟南芥中的DREBs转录因子的AP2结构域第15和第20个氨基酸分别是缬氨酸(Val，V)和谷氨酸(Glu，E)，而ERFs转录因子的AP2结构域第15和20个氨基酸是丙氨酸(Ala，A)和天冬氨酸(Asp，D)，进一步研究表明Val-15和Glu-20特别是Val-15对于结合DRE有重要的作用，但不影响对GCC box的结合，这可能是造成ERFs和DREBs转录因子功能不同的原因。为了发掘影响GCC box结合的关键氨基酸，孙山等(Sun S，Yu J P，Chen F，Zhao T J，Fang X H，Li Y Q，Sui S F.TINY，a dehydration-responsiveelement(DRE)-binding protein-like transcription factor connecting the DRE-andethylene-responsive element-mediated signaling pathways in Arabidopsis.Biol Chem，2006，283：6261-6271)比较能够结合两种顺式作用元件的蛋白序列和只能结合DRE的蛋白序列发现两类蛋白的AP2保守区的第16个氨基酸不同，进一步研究表明Ser-16对于拟南芥中的DREB转录因子TINY结合GCC box是必不可少的。TINY既参与生物胁迫反应途径，也参与非生物胁迫途径，说明DRE介导的调控途径和GCC box介导的调控途径存在一定的重叠。

水稻中有些AP2/EREBP转录因子基因在受到非生物胁迫时表达量明显升高’其中大部分基因为DREBs和ERFs，这些基因很有可能与水稻的非生物胁迫应答反应相关。虽然近年来对于EREBPs转录因子参与非生物胁迫应答反应的机制有了较全面的研究，但是水稻中还有很多的EREBPs基因的功能未知。

发明内容

本发明的一个目的是提供序列表中序列2所示的蛋白在增强植物耐盐性中的应用。

本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在增强植物耐盐性中的应用。

本发明的另一个目的是提供序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在增强植物耐盐性中的应用。

本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在增强植物耐盐性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-5)中任一所述的基因：

1)序列表中序列1的自5′末端第703位-1083位所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的自5′末端第505位-1343位所示的DNA分子；

3)序列表中序列1所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)或4)所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物耐盐性中的应用也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为在pCUbi1390的多克隆位点间插入所述序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与目的植物相比耐盐性增强。

所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因是通过含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体导入目的植物中的。

所述重组表达载体为在pCUbi1390的多克隆位点间插入所述序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；

所述重组表达载体的构建过程中，使用增强子。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

本发明通过干旱、高盐、低温胁迫下OsASIE1基因在不同水稻品种中的表达差异，结合凝胶阻滞实验中其对顺式元件GCC box和DRE的结合情况，以及超表达水稻植株的表型变化，开展其基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻非生物胁迫应答的关系。结果表明，OsASIE1基因在受到高盐和干旱胁迫时表达量迅速增加，但受到低温胁迫时增加幅度较小；OsASIE1转录因子可以通过结合下游基因启动子区域的GCC box和DRE来调控下游基因的表达，参与植物胁迫应答反应；在水稻中超表达OsASIE1基因能够在一定程度上改善水稻耐盐胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为以实时定量PCR分析OsASIE1在非生物胁迫下的表达量差异。

图2为以实时定量PCR分析OsASIE1在典型抗逆水稻品种中胁迫前后的表达量差异。

图3为OsASIE1的AP2结构域结合GCC box和DRE元件的EMSA分析图谱。

图4为超表达OsASIE1提高了水稻抵抗盐胁迫的能力。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、过表达OsASIE1基因增强转基因水稻的耐盐性

日本晴(Nipponbare，Oryza sativa ssp.japonica)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Yongqing Jiao，Yonghong Wang，DaweiXue，Jing Wang，Meixian Yan，Guifu Liu，Guojun Dong，Dali Zeng，Zefu Lu，Xudong Zhu，Qian Qian and Jiayang Li(2010)Regulation of OsSPL 14by OsmiR156defines ideal plantarchitecture in rice.Nature Genetics，42，541-544)；

典型耐旱旱稻品种IRAT109(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：San-Hong Liu，Bin-Ying Fu，Hua-Xue Xu，Ling-HuaZhu，Hu-Qu Zhai，Zhi-Kang Li(2007)Cell death in response to osmotic and salt stresses intwo rice(Oryza sativa L.)ecotypes，Plant Science，172，897-902)；

耐盐水稻FL478(请说明FL478的来源)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Harkamal Walia，Clyde Wilson^*，PascalCondamine，Xuan Liu，Abdelbagi M.Ismail，Linghe Zeng，Steve I.Wanamaker，JayatiMandal，Jin Xu，Xinping Cui，and Timothy J.Close(2005)Comparative TranscriptionalProfiling of Two Contrasting Rice Genotypes under Salinity Stress during the VegetativeGrowth Stage.Plant Physiology，139，822-835)；

耐冷水稻云南地方品种丽江新团黑谷(LTH)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：凌忠专，雷财林，王久林(2004)稻瘟病菌生理小种研究的回顾与展望，中国农业科学，37(12)：1849-1859)。

一、不同胁迫处理条件下OsASIE1基因在不同水稻品种中的表达差异

1、水稻品种日本晴的低温、高盐和干旱胁迫

水稻日本晴种子经消毒处理，37℃催芽3d，萌发后选发芽一致的种子播于塑料盒泡沫架上，每孔2粒，二叶前水培，二叶后用Yoshida营养液培养。于五叶期开始低温(4℃)、高盐(150mmol L^-1NaCl)和渗透胁迫(20％PEG)处理，并于胁迫处理0h、0.5h、3h、6h、12h、24h后取叶片，液氮速冻，-70℃低温保存。

2、抗逆水稻品种的低温、高盐和干旱胁迫

典型耐旱旱稻品种IRAT109、耐盐水稻品种FL478和耐冷水稻云南地方品种丽江新团黑谷(LTH)种子经消毒处理和催芽(37℃催芽3d)后，将耐旱旱稻品种IRAT109移入装土的盆中种植，将耐冷水稻云南地方品种丽江新团黑谷(LTH)和耐盐水稻品种FL478播种于塑料盒泡沫架上。五叶期分别进行干旱(断水至叶片全卷)、高盐(150mmol L^-1 NaCl，48h)和低温处理(4℃，48h)处理，并分别于处理前和处理后取叶片和根，液氮速冻，-70℃低温保存。

3、实时定量PCR分析

采用TRIZOL试剂提取实验样品总RNA。具体方法如下：

1)取水稻组织200mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5ml EP管中。

2)加入1ml TRIzol提取液震荡均匀，置室温5min。

3)每管中加入0.2ml氯仿(RNA专用)，摇震15s，置室温3min。

4)4℃下1200g/min离心15min。

5)仔细吸取上清水相，移至另一EP管。

6)加入0.5ml异丙醇(RNA专用)，轻柔摇匀后，置室温10min。

7)4℃下1200g/min离心10min。

8)去掉上清液，用75％乙醇(DEPC水配制)充分洗涤沉淀。

9)4℃下1200g/min离心5min。

10)去掉上清液，室温干燥5-10min，注意不要太干燥，最后加入DEPC水溶解。

RNA纯度的分析：用1％琼脂糖凝胶电泳快速检测提取的总RNA的完整性，电泳缓冲液和1％的琼脂糖凝胶需新鲜配制。紫外分光光度计检测所提总RNA在波长230nm、260nm、280nm处测光吸收值。结果：提取的总RNA用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明RNA样品电泳条带清晰，没有基因组DNA和蛋白质的污染，28S比18SrRNA条带亮度大约为2∶1，提取的RNA完整性较好。为进一步确定RNA质量，使用紫外分光光度计检测所提总RNA在波长230nm、260nm、280nm处测光吸收值，结果表明提取的RNA的A260/A230大于2.00，A260/A280在1.8-2.0之间，说明RNA纯度高，不存在酚类物质、蛋白质、多糖的明显污染。经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，RNA质量符合Real Time-PCR的实验要求。DNase I消化RNA中的基因组DNA：为了确保反转录所用模板中没有基因组DNA的污染，在反转录前用DNase I (Takara Code No.2270A)处理模板RNA，具体方法和步骤参照说明书。

反转录：

第一链cDNA的合成用反转录用试剂盒(Promega公司，Code no：A3500)，具体方法和步骤如下

1)取1μg RNA于0.2ml的EP管中，于70℃温育十分钟，短暂离心后置于冰上。

2)依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20μl的反应体系：

3)将反应体系于42℃温育30min。

4)将样品于95℃加热5min，冰上置5min，反应后保存在-20℃，使用前用无核酸酶的水稀释到100μl。

cDNA浓度的调节和Real Time PCR引物的效率分析：

为了使实验结果更为准确，在进行Real Time PCR分析前调整cDNA的浓度，分析设计的Real Time PCR引物的效率。

1)cDNA浓度的初步调整用半定量PCR完成，按下列组分配制PCR反应体系，每一个样品的cDNA配制4个体系。

PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40S，56℃复性30S，72℃延长45S，四个PCR反应体系分别运行25，26，27，28个循环。

2)取2μL PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像仪上照相后根据电泳条带的亮度粗略判断不同样品CDNA的浓度的差异并用ddH₂O进行调整，使所有样品的cDNA浓度基本一致。

3)设置梯度实验分析Real Time PCR引物的效率，梯度实验的Real Time PCR反应体系与正常的反应体系(步骤1.3.7)只有CDNA的浓度不同，cDNA的浓度梯度为每20μL加0、0.25、0.5、1、2、4μL第一链cDNA。通过分析引物在不同的cDNA浓度下得到的Ct值的差异以及溶解曲线判断设计引物的优劣。选择溶解曲线单一，Ct值的差异和模板的浓度变化较一致的引物用于Real Time PCR分析。

Real Time PCR分析：

Real Time PCR分析，所用OsASIE1的PCR引物如下：

F：5′-TGGTCTGATTTGGTAGCC-3′；R：5′-TCCAA GAACTGGCAGACGA-3′；内参基因Actin1引物序列为F：5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3′；R：5′-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3′。Real Time PCR的分析使用TaKaRa的SYBR PremixEx Taq试剂盒(Code no：DRR041A)，应用的Real Time PCR扩增仪为ABI PRISM7000/7300。

1)体系的配制使用8连管，按下列组份配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)，设置3个重复。

2)Real Time PCR反应，采用两步法PCR反应程序

数据分析：

用相对定量法计算目的基因相对表达量Rel.Exp＝2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝[(待测样品目的基因的Ct-待测样品看家基因的Ct)-(对照组目的基因的Ct-对照组看家基因的Ct)]。Ct(threshold cycle)值，即临介循环数，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，与模板cDNA的起始拷贝数成反比。相对定量计算法通过看家基因把目的基因归一化(normalization)，所得结果为待测基因相对于对照目的基因所改变的倍数，因此该计算方法减少了由于抽提RNA获得率的差异所引起的误差。

标准方差的计算用Excel完成，先用统计函数STDEV算出样品和对照的S值，再将两个S值算平方，算出(S₁ ²+S₂ ²)/3的值，进而算出X＝Power((S₁ ²+S₂ ²)/3，0.5)，最后算出方差＝(2^(-ddct-x)-2^(-ddct+x))/2。

结果：

日本晴中OsASIE1在低温、高盐和PEG胁迫下的表达量变化谱：结果如图1所示(图1中，cold：4℃处理(低温胁迫)；NaCl：

处理(盐胁迫)；PEG：20％PEG处理(渗透胁迫)，从图中可见，在3种胁迫下OsASIE1表达量都有增高，但是表达模式存在差异。在低温和PEG胁迫下，OsASIE1表达量均呈逐渐上升趋势，并在胁迫处理3h达最高水平。然而相比于低温胁迫，在PEG胁迫下OsASIE1表达量增加幅度较大，并且在胁迫后期仍能保持较高水平。在盐胁迫下OsASIE1呈逐步升高的趋势，并且表达量变化幅度较大，最高点到达20倍以上。以上结果表明OsASIE1参与水稻对低温、盐和干旱胁迫的早期应答，并在应答模式上存在差别。

OsASIE1在典型抗逆水稻品种中胁迫前后的表达差异：结果如图2所示(N：日本晴；L：丽江新团黑谷；F：FL478；I：IRAT109)，图2中A：冷胁迫下OsASIE1在日本晴(N)和丽江新团黑谷(L)中的表达量差异；图2中B：盐胁迫下OsASIE1在日本晴和FL478(F)中的表达量差异；图2中C：干旱胁迫下OsASIE1在日本晴和IRAT109(I)中的表达量差异。结果表明无论是在叶片中还是在根系中，OsASIE1在典型抗逆水稻品种中的表达模式与日本晴基本相同，而且在胁迫前后的表达量和日本晴相比差异也不太显著。然而，在胁迫前后OsASIE1在叶和根中的表达量变化稍有差异，在低温和干旱胁迫下，OsASIE1在根中的表达量增幅高于叶片；在盐胁迫下，OsASIE1在叶片中的表达量增幅高于根系。

二、凝胶迁移率实验(EMSA)

1、原核表达蛋白的制备

以PCR扩增出OsASIE1的AP2保守域(67～193aa)的基因编码序列(即序列表中序列1第703位-1083位所示的核苷酸序列)，并构建到质粒pET-32a(Novagen，USA，69015-3)中，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(TransGen Biotech，China，Cat.No：DR101)中进行蛋白表达，产物经His-trap柱子纯化(GE)，Miliproe超滤管浓缩和脱盐后，采用Bradford法测定蛋白浓度。具体方法如下：

(1)PCR扩増目的基因编码区：

所用引物分别为：

OsASIE1-AP2-F：5′-GCACTGCAGCAACTCCACATGCAGCGG-3′(下划线部分为Pst I酶切位点)；

OsASIE1-AP2-R：5′-TAAGGATCCCCTGGATGAGGCGTTCTTGG-3′(下划线部分为BamH I酶切位点)。

目的基因的扩增采用高保真酶KOD-Plus(TOYOBO Code no：KOD-201)，扩增体系为50μl，依照所列顺序加入以下试剂以建立一个50μl的反应体系：

PCR扩增反应程序为：95℃变性30s，退火30s，72℃延伸(1Kb/min)；34个循环后72℃延伸10min，然后4℃保存。

PCR程序结束后，取3μL PCR产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果获得了381bp的目的片段。

PCR产物的回收：

回收试剂盒采用TIANGEN公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型，Code no：DP209)，具体操作步骤见产品说明书。

将上述回收产物与克隆载体pMD18(Takara pMD18-T VECTOR试剂盒)连接后转化大肠杆菌进行测序。测序结果表明该PCR产物与Gramene数据库中OsASIE1基因(Os08g31580)序列AP2结构域相同(即序列表中序列1第703位-1083位所示的核苷酸序列)。

酶切连接和转化：

1)酶切

使用TaKaRa的限制性内切酶进行酶切反应，双酶切的体系为50μL。双酶切通用的Buffer和酶切温度在TaKaRa的网站上(www.takara.com.cn)查询。酶切3h后DNA和质粒pET-32a(Novagen，USA，69015-3)分别用DNA回收试剂盒和酒淀法回收。酶切反应体系如下：

2)连接

DNA片段和载体用T4连接酶(TaKARa Code：D2011A)连接，酶切回收DNA片段和酶切回收质粒的量约为1∶3，配制好反应体系后在16℃连接反应过夜。配制的反应体系如下：

3)转化

取15μL连接反应液与灭菌的1.5ml离心管中，加入冰上溶解的33μL DH5α(购自北京博迈德生物有限公司，产品目录号为CC02)并用枪吸打混匀，冰浴30min；42℃水浴热激1min，冰浴2min；加入1ml SOC培养基，37℃，200r恢复培养1h；8000g离心1min，收集菌液涂布到含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

4)阳性克隆的验证：挑取4个阳性克隆于含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，37℃，200r培养8-12h；PCR验证阳性克隆，得到的阳性克隆送公司测序。测序结果表明，在质粒pET-32a的Pst I和BamH I酶切位点间插入了序列表中序列1第703位到1083位所示的核苷酸序列，说明质粒构建正确，将重组质粒命名为pET-32a-ASIE1(AP2)。

质粒的提取：

质粒采用TIANGEN公司的质粒回收试剂盒(离心柱型，Code：DP 103)，具体操作步骤见产品说明书。

目的蛋白的制备：

(1)原核表达目的蛋白：

原核表达目的蛋白的步骤参照分子克隆实验指南并进行局部调整，具体实验步骤如下

1)将上述重组质粒pET-32a-ASIE1(AP2)转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(TransGen Biotech，China，Cat.No：DR101)。转化物涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜。

3)挑取单克隆，进行限制酶切分析和PCR分析验证阳性克隆。

4)进行预实验确定蛋白诱导最佳的IPTG浓度(1mM)、培养时间(3小时)及培养温度(28℃)。

5)分别挑取含有阴性对照质粒(即空质粒pET-32a)、重组表达质粒的克隆接种至5ml含50μg/ml氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养过夜。

6)转接1ml培养液于100ml含50μg/ml氨苄霉素的LB液体培养基中，在250ml的三角瓶中37℃，200r/min振荡培养至对数生长中期(A₅₅₀＝0.5-1.0)，大约2-3h。

7)在培养基中加入IPTG至终浓度1mmol/L，28℃，200r/min振荡培养3h，得到菌体。

(2)目的蛋白纯化样品的制备：

1)4℃，5000rpm离心10min收集上一步得到的菌体，去除上清液。

2)加入结合缓冲液(20mM磷酸钠(sodium phosphate)，0.5M NaCl，40mM咪唑(imidazole)，pH7.4)5ml重悬菌液，加溶菌酶、PMSF至终浓度1mg/ml、1mM，冰上孵育30min。

3)加入Triton X-100至终浓度1％，超声波破碎细胞至溶液不再粘稠。

4)4℃，5000g离心15min，回收上清并用0.45μM滤膜过滤。

(3)目的蛋白的纯化：

使用AKTA purifier仪器和1ml的His-trap HP柱子(GE，Code No.17-5247-01)纯化目的蛋白，具体实验步骤如下：

1)把His-trap HP柱子安装在AKTA purifier仪器上，用3-5倍柱体积的蒸馏水洗涤柱子。

2)用至少5倍体积的结合缓冲液平衡柱子，流速为1ml/min。

3)用注射器把前面制备的裂解物上清液(步骤4)上样。

4)用10-15倍柱体积结合缓冲液洗涤亲和柱，直到吸光率稳定。

5)用5-10倍体积的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠(sodium phosphate)，0.5M NaCl，500mM咪唑(imidazole)，pH7.4)洗脱目的蛋白，每份1ml分步收集。

6)每份样品取20μl进行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析目的蛋白的洗脱分布。

7)用Miliproe 4000超滤管脱盐和浓缩蛋白。

Bradford法测定蛋白质浓度：

选择纯化后经验证条带单一、浓度较大的几管目的蛋白采用Bradford法测定蛋白浓度。具体和方法如下：

1)配制考马斯亮兰G-250染色液：取考马斯亮兰G-250100mg溶于50mL 95％乙醇中，加100mL 85％磷酸，加水稀释至1L。

2)配制牛血清白蛋白标准原液：在分析天平上精确称量0.1g结晶牛血清白蛋白于小烧杯内，加入少量去离子水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量去离子水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成1000μg/mL的牛血清白蛋白标准原液。

4)分别取8支试管，编号，按下表加入试剂，混匀，室温放置5～30分钟。

5)绘制标准曲线：用723分光光度计在595nm处比色。记录1～6管所读吸光值，以蛋白质含量(μg)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

6)计算蛋白质含量：根据样品吸光值在标准曲线上查出对应蛋白质浓度。

结果：测定得到样品1的蛋白浓度约为0.85μg/μl，样品2的蛋白浓度为0.92μg/μl。

2、目的DNA序列及突变序列的制备

将顺式作用元件GCC box(CATAAGAGCCGCCACT)和突变序列(CATAAGATCCTCCACT)，DRE序列(ATACT ACCGACATGAG)和突变序列(ATACTACTGATATG AG)串联重复3次。以化学合成法分别合成双链后，将其等量混合(单链浓度100nmol L^-1)，95℃温育10min后慢慢冷却，复性为双链。EMSA实验：

ENSA实验使用invitrogen的EMSA试剂盒(Code no：E33075)。具体方法和步骤如下：

结合反应体系的配制：

1)在把EMSA试剂盒的组分E(Componentn E)、目的蛋白及目的DNA放置在冰上使之完全融化。按下列组分配制目的蛋白和目的DNA的结合反应体系：

2)对照体系是把目的蛋白和突变DNA序列孵育在一起，按下列组分配制反应体系，把配制好的结合反应体系轻柔的混匀，在室温下孵育20min。

非变性聚丙烯酰胺凝胶分离混合反应体系：

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳使用罗氏的mini-4电泳槽，具体方法和步骤如下：

1)配制6.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶，在小烧杯中混合以下组分(以下用量可以制备两片凝胶板)

将配置好的凝胶灌制至两块玻璃板中间，立即插入1块干净的梳子，室温至少凝固1h。

2)制备0.25×TBE 1200ml，4℃保存。

3)预电泳：在上用预冷的0.25×TBE在80V冰上预电泳1h。上样前用电泳缓冲液把加样空冲洗干净。

4)样品的准备：在结合反应体系孵育20min后，加入2μL组分D(Component D，6×EMSA gel-loading solution)，轻柔混匀。

5)电泳：将所有样品(12μL)加入加样空中，100V低温电泳90min。

用SYBR Green使凝胶核酸染色，具体方法如下：

1)溶解SYBR Green EMSA凝胶染色浓缩液组分A(SYBR Green EMSA gel stainconcentrate，Component A)，待其到室温时后，涡旋使之混匀，然后稍微离心收集溶液至管底。

2)稀释SYBR Green EMSA凝胶染色浓缩液：每一块凝胶取5μL组分A(10000×)用1×TBE Buffer稀释至50ml，剩余的组分A重新放入-20℃保存。

3)染色：把凝胶放在聚丙烯酰胺(PP)材质的塑料容器里，每块凝胶加入50ml稀释好的1×SYBR Green EMSA染色液，使染色液充分覆盖凝胶；把染色容器放在震荡器上轻微震荡(50rpm)，使凝胶在染色液中孵育约20min，整个染色过程避光进行。

4)洗胶：倒掉染色液，用150ml的去离子水洗涤凝胶两次，每次约10秒以去除多余的染色液。

凝胶成像：

使用蓝盾502可见光凝胶投射仪进行凝胶的观察并照相。结果如图3所示，图3中A：OsASIE1的AP2结构域结合GCC box(泳道1为自由DNA；泳道2～泳道5为80ng GCC box加入0.25、0.5、1.0、1.5μg目的蛋白；泳道6为mGCC Box加入1.5μg目的蛋白)。图3中B：OsASIE1的AP2结构域结合DRE(泳道1为自由DNA；泳道2～泳道4为80ng DRE加入0.5、1.0、1.5μg目的蛋白；泳道5为mDRE加入1.5μg目的蛋白)。结果表明OsASIE1蛋白的AP2结构域能够结合GCC box和DRE序列，但是无法结合其突变序列。推测OsASIE1通过特异结合GCC box和DRE顺式元件以调节下游基因的表达，参与相关生物胁迫和非生物胁迫反应。

三、OsASIE1超表达水稻植株获得及表型鉴定

1、载体构建和遗传转化

根据日本晴序列全长设计引物，通过反转录从IRAT109中扩增获得OsASIE1的基因全长cDNA，同时在5′和3′端加上Pst I、BamH I酶切位点，扩增引物为：

F：5′-GCACTGCAGATGGCAGCTGCTATAGAAGG-3′(下划线部分为Pst I酶切位点)；

R：5′-TAAGGATCCGTTATTGTTGTTGAGCAGC-3′(下划线部分为BamH I酶切位点)，扩增产物经Pst I和BamH I酶切纯化后，回收目的DNA片段(845bp)；同时，用PstI和BamH I酶切表达载体pCUbi1390(含有UbI quitin 1启动子)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Hao Peng，Qian Zhang，YadongLi，Cailin Lei，Ying Zhai，Xuehui Sun，Daye Sun，Ying Sun，Tiegang Lu(2009)A putativeleucine-rich repeat receptor kinase，OsBRR1，is involved in rice blast resistancePlanta，230：377-385)，回收载体大片段。将上述回收的目的DNA片段与回收的载体大片段进行连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pCUbi1390的Pst I和BamH I酶切位点间插入了序列表中序列1第505位-1340位所示的OsASIE1基因片段，OsASIE1基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示，该基因的编码区为序列表中序列1自5’末端第505-1340位核苷酸，该序列所编码的OsASIE1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。证明质粒构建正确，将重组载体命名为pCUbi1390-ASIE1。

用农杆菌(EHA105)介导的遗传转化法，以日本晴为受体材料，进行遗传转化，具体方法如下：

1、愈伤诱导

取适量成熟的水稻种子，脱壳后，先用70％酒精清洗消毒1min，期间不断地摇荡，再用15％的次氯酸钠消毒处理30min(可置于摇床上振荡)；最后用无菌蒸馏水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种。将消毒处理后的种子接种于含有2.0mg/L的2，4-D的诱导培养基(具体组成见表1)中，28℃暗培养30-40天。培养获得的愈伤在继代培养基(具体组成见表1)上扩大培养，每2周继代一次，直至胚性愈伤形成。

2、制备携带有表达质粒载体pCUbi1390-ASIE1的农杆菌

(1)CaCl₂制备EHA 105农杆菌感受态

1)将-70℃保存的农杆菌EHA 105(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Ruifang Yang，Qicai Tang，HuimeiWang，XiaoboZhang，Gang Pan，HongWang and Jumin Tu(2011)Analyses of two rice(Oryza sativa)cyclin-dependent kinase inhibitors and effects of transgenic expression of OsiICK6on plantgrowth and development，Annals ofBotany，107：1087-1101)菌液解冻，划线接菌于LB+利福平(50mg/l)固体培养基。

2)挑取农杆菌单克隆接种于5ml LB+利福平(50mg/l)液体培养基，28℃，200r/min培养过夜。

3)取1ml培养物于30ml LB+利福平(50mg/l)液体培养基中继续培养，直至OD 600为0.5-1。

4)4℃，5000r/min，离心8min，去上清，用纸巾吸干余液。

5)用预冷的0.05M CaCl₂溶液(灭菌)悬浮菌体(旋转或轻轻斡旋)，冰浴30min。

6)4℃，5000r/min，离心8min。

7)弃去上清液，用纸巾吸干余液。

8)用1ml预冷的0.05M CaCl₂重悬，分装成100μL/管，每管中加入100μL预冷的甘油(40％)，液氮中速冻后至-70℃保存。

(2)质粒转化农杆菌(热激法)

1)取100μL农杆菌感受态细胞于无菌预冷的1.5ml离心管中。

2)加入10ng重组质粒pCUbi1390-ASIE1(约3μL)，用枪轻轻吸打混匀，冰浴放置30min。

3)取出离心管在液氮中速冻4min，取出后立即在37℃热激4min，置冰上5min。

4)加入1ml LB培养基，于28℃，200r/min培养4h。

5)取100μL菌液涂布于筛选固体LB培养基(含50mg/L卡那霉素，25mg/l利福平)，待平板晾干后倒置，28℃暗培养2d。

(3)PCR检测阳性克隆

用牙签挑取单克隆于含有相关抗生素(50mg/L卡那霉素，25mg/l利福平)的1mlLB液体培养基中，其中每个基因挑取4-8个单克隆，28℃暗培养12-24h，进行PCR检测阳性克隆，所用引物对为引物F和引物R，获得846bp扩增条带的为阳性克隆。将获得的阳性克隆菌液等比例加入40％灭菌甘油，混匀，经液氮速冻后保存在-70℃冰箱里或直接用来对水稻进行农杆菌侵染、遗传转化。

3、农杆菌侵染

1)将携带有表达质粒载体pCUbi1390-ASIE1的农杆菌划线于含有抗生素(50mg/L卡那霉素、25mg/l利福平)的LB固体培养基表面，28℃，200r/min培养过夜。

2)用灭过菌的牙签挑取单克隆菌落，接种到5ml含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃震荡培养到OD600＝0.5。

3)取活化好的的新鲜菌液按1∶100的比例接种到25ml相同的YEB液体培养基中，在相同条件下培养至OD600＝0.5。

4)菌液在5000g，4℃下离心10min收集菌体，弃去上清液；加入25ml 10mM的MgSO₄悬浮菌体，并用移液枪轻轻吸打使其充分悬浮，在5000g，4℃下离心10min重新收集菌体，弃去上清液。

5)用25ml含有200μM乙酰丁香酮(AS)的AA-AS浸染培养基(具体组成见表1)重新悬浮。

6)将生长状态良好的胚性愈伤从继代培养基中转移至表面覆有无菌滤纸的培养皿中(愈伤切成0.3-0.4mm大小)，在超净工作台上风干10-20min。

7)将干燥的胚性愈伤浸入含有上述菌液的50ml离心管中20min，期间每隔5min摇荡一次；之后倒掉菌液，将愈伤取出置于无菌滤纸上风干10-20min，然后转移至表面铺有无菌滤纸的含有200μM乙酰丁香酮(AS)的共培养基(具体组成见表1)中，25℃黑暗条件下共培养3d。

8)收集表面没有明显农杆菌的愈伤组织，用含600mg/l头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸取多余水分。

9)将愈伤组织转入筛选培养基(含500mg/l头孢霉素和50mg/l潮霉素的N6培养基)(具体组成见表1)上继续筛选2-3次，每次两周。最终得到生长良好的鲜黄色潮霉素抗性愈伤组织。

3、转化体植株再生

取新鲜潮霉素抗性的愈伤，将愈伤组织分割成2mm的小块，接于预分化培养基(具体组成见表1)中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养8-9天后将已分化出不定芽的愈伤组织后转入再生培养基(具体组成见表1)(250mL组培瓶)上，继续光照培养。等到不定芽长成4-6cm高的小苗后再转移到生根培养基(具体组成见表1)中，在28℃，光照培养间(12h光照/12h黑暗)条件下培养约15天，得到转化体植株，移到温室种植并收获其种子(T₁代)。

同时，用上述方法得到转空载体对照水稻植株。设未转化的日本晴为野生型对照水稻植株。

表1获得OsASIE1超表达水稻植株所用的培养基组成

2、转基因植株表型鉴定

选用T₁代转基因超量表达植株各家系的种子、在加潮霉素(100mg L^-1)的1/2MS培养基上发芽，去除阴性种子。将发芽的种子播到96孔PCR板中，以Yoshida营养液水培，培养条件为光照/黑暗为16/8h，光照条件25℃，黑暗条件23℃，光强30000lx，4周后用150mmol L^-1NaCl处理。同时，以转空载体对照水稻和野生型日本晴作为对照。实验设3次重复。实验共获得14个转基因株系，结果如图4所示(图4中WT为野生型日本晴；line 1、line 2、line 3、line 5、line 10、line 17为转基因株系；OsASIE1-ox为转OsASIE1基因水稻植株)，图4中A为：转基因和野生型植株的表型；从图中可见，与野生型植株相比，OsASIE1超表达转基因植株较矮小。图4中B为：转OsASIE1基因植株中OsASIE1的表达量结果；从图中可见，转OsASIE1基因植株中OsASIE1的表达量明显高于野生型日本晴。选择株系1、2、5、10、17生长4周的T₁幼苗进行

处理。图4中C为：150mmol L^-1NaCl处理2d植株表型；从图中可见，处理2d后野生型植株的叶片大部分萎蔫，而转基因植株的生长状态好于野生型日本晴。图4中D和E为：150mmol L^-1NaCl处理后恢复3d植株表型。从图中可见，恢复3d后转基因植株大都生长出新叶，而野生型植株较少有新叶的生长。而且转空载体对照水稻的表型与野生型日本晴一致。

Claims (10)

1.序列表中序列2所示的蛋白在增强植物耐盐性中的应用。

2.序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在增强植物耐盐性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-5)中任一所述的基因：

1)序列表中序列1的自5′末端第703位-1083位所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的自5′末端第505位-1343位所示的DNA分子；

3)序列表中序列1所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)或4)所述的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

3.含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物耐盐性中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体为在pCUbi1390的多克隆位点间插入所述序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

5.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

6.一种培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与目的植物相比耐盐性增强。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述序列表中序列2所示的蛋白的编码基因是通过含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体导入目的植物中的。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为在pCUbi1390的多克隆位点间插入所述序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；

所述重组表达载体的构建过程中，使用增强子。

10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。

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