CN102943084A - 水稻抗逆相关基因OsPP2C44及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种从水稻DNA片断中分离克隆的与水稻抗逆性相关的OsPP2C44基因。该基因编码的蛋白含有蛋白磷酸酶家族保守的催化结构域，为该基因家族PP2C类型成员。OsPP2C44基因受高盐、低温、高温以及ABA诱导表达，超表达OsPP2C44可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力，与水稻抗逆性相关。本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

Description

水稻抗逆相关基因OsPP2C44及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及一种与水稻抗逆性相关的基因，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因OsPP2C44及其应用，属于基因工程领域。 

背景技术

干旱缺水是造成全球粮食减产的重要因素之一。干旱胁迫严重影响植物生长和发育， 甚至造成植物死亡。水稻是重要的粮食作物之一，水稻需水占农业用水的65%，利用现代生物学技术研究植物抗旱的生理生化反应，克隆重要的抗旱基因，进而转入植物中培育抗逆性增强的作物新品种特别是培育节水抗旱的水稻新品种是缓解全球干旱缺水、人口增长带来的粮食生产压力的有效途径。 

植物在长期的进化过程中形成了一系列的适应机制来应对干旱等逆境胁迫。干旱胁迫下，植物一方面通过调节气孔关闭来减少水分蒸腾，同时通过促进根系生长来增加水分吸收，从而有效避免干旱胁迫对植物的伤害。同时，植物可通过合成有机大分子等渗透调节和保护的分子以及抗氧化酶类来增强自身对逆境的耐受能力。 

植物生理学、遗传学、分子生物学的研究使得植物的抗逆机制逐渐明晰，一些重要的抗逆基因被克隆。与抗逆相关的基因根据功能不同基本分为两类：一类是编码渗透调节蛋白、抗氧化酶、转运蛋白等功能蛋白的基因；另一类是编码转录因子、蛋白激酶等起调节作用蛋白的基因。 

蛋白的磷酸化和去磷酸化在细胞信号转导过程中扮演重要角色，其中蛋白去磷酸化的过程由蛋白磷酸酶负责。蛋白磷酸酶根据底物蛋白氨基酸残基的种类分为蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶，丝/苏氨酸蛋白磷酸酶依据它们不同的底物特异性及对特定抑制剂的不同敏感性来划分的主要分PP1 和PP2 两类。PP2 又按照亚基的结构、活力及对二价阳离子的依赖而被进一步分为3个亚类：PP2A、PP2B、PP2C。PP2C是一种单体蛋白磷酸酶，活力依赖Mg²⁺。植物中PP2C蛋白磷酸酶广泛参与植物抗病信号传导、植物创伤、抗病反应及ABA调控的抗逆信号途径等生长发育及抵抗生物与非生物胁迫反应。植物中已经发现的多种PP2C 类磷酸酶均参与ABA 通路的信号传导，拟南芥中的两种PP2C类磷酸酶-ABI1/2 便是直接从对ABA不敏感型的突变植株的基因中克隆到的。它们体现出的蛋白磷酸酶活力受ABA 的影响而升高，在它们高表达或活力提高以后又会使植株对ABA 的敏感性明显降低。 

本发明中的OsPP2C44基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段，在干旱、盐、外源ABA处理下的基因表达谱分析表明，该基因可响应逆境胁迫。超表达该基因的转基因水稻抵抗渗透胁迫的能力显著增强。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水稻抗逆相关基因OsPP2C44，及其编码的蛋白磷酸酶，具有典型的PP2C催化结构域，属PP2C类型，可响应逆境胁迫，超量表达后可提高转基因植物的抗渗透胁迫能力。 

本发明的再一目的是提供水稻抗逆相关基因OsPP2C44在提高水稻抗逆性中的应用。 

本发明从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它编码蛋白磷酸酶，具有典型的PP2C催化结构域，属于PP2C亚家族，因此命名为OsPP2C44。 

本发明分离和应用一种包含OsPP2C44基因的DNA片段，该基因能响应冷、盐、外源ABA等胁迫处理，发生表达变化。 

本发明采用的技术方案是，提供一种与水稻抗逆性相关的OsPP2C44基因，其中，所述OsPP2C44基因的序列如下列之一：SEQ ID NO: 1所示的DNA序列；与SEQ ID NO:1至少90%同源的DNA序列；功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。 

本发明的另一种优选方案是，所述的OsPP2C44基因的序列为如下列之一： 

SEQ ID NO: 1中第263-1228位所示的DNA序列；或与SEQ ID NO: 1中第263-1228位所示的DNA序列相似性达90%的DNA序列。

本发明还提供一种包含OsPP2C44基因编码的蛋白，其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者为所述SEQ ID NO:2序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体。 

本发明还提供一种包含OsPP2C44基因编码的重组载体，其中，构建所述重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。 

本发明还提供一种包含OsPP2C44基因的一种植物转化体，其中，所述植物转化体的宿主为水稻。 

本发明另一优先方案是提供一种提高植物抗逆性中的应用，其中，所述抗逆性中应用的植物包含权利要求1或2所述OsPP2C44的基因，所述植物为水稻。 

 获得上述采用已克隆的OsPP2C44基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以采用PCR（polymerase chain reaction）技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsPP2C44基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到OsPP2C44基因，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得对逆境响应增强的转基因植株。 

本发明提供的载体携带本发明OsPP2C44基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。 

本发明OsPP2C44基因表达载体转化宿主是包括水稻在内的多种植物。 

本发明通过对水稻基因分离克隆及其对逆境胁迫的响应，提供了一种水稻DNA片断包含一个966bp的编码基因OsPP2C44。该基因含有蛋白磷酸酶基因家族典型的结构域，为该基因家族PP2C类型成员。OsPP2C44基因受干旱、盐及外源ABA诱导表达，与水稻抗逆性相关。 

本发明可以用于研究利用此基因遗传转化获得转基因植物的分子方法。 

本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种。 

附图说明

图1为本发明利用ClustalW2软件将OsPP2C44基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果； 

图2为本发明的OsPP2C44基因在水稻不同组织中的表达水平； 

图3为本发明的OsPP2C44基因在苗期水稻受到冷、热、盐、PEG和外源ABA处理时的表达水平； 

图4为本发明的OsPP2C44基因超表达载体转化水稻植株的Southern blot检测； 

图5为本发明的OsPP2C44基因超表达载体转化水稻植株的表达水平检测； 

图6为本发明OsPP2C44基因超表达转基因水稻与野生型水稻抵抗甘露醇模拟渗透胁迫比较分析。

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1  水稻OsPP2C44基因的克隆 

1．幼苗培育 

将水稻置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2．RNA的分离： 

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mL TRNzol-A+试剂（天根生化科技有限公司）的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μL RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3．逆转录合成第一链cDNA 

（1）反转录之前需用DNaseI消化所提取RNA样品，反应体系如下：

试剂名称	使用量（μL）
		RNA	5
10×DNaseI Buffer	1
		DNaseI（5U/μL）	0.2
DEPC H2O	Up to 10μL

37℃反应15min后，加入0.25μL 0.1M EDTA（保证终浓度>2mM），70℃温育10 min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

（2）第一链cDNA的合成参照 Promega 反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下： 

DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μL 的反应体系：

试剂名称	使用量（μL）
		MgCl2（25mM）	4
Reverse 10× Buffer	2
		dNTP Mix（10mM）	2
RNasin  Inhibitor（40U/μL）	0.5
		AMV Reverse Transcriptase（25U/μL）	0.6
Oligo(dT)15 Primer（500μg/mL）	1

将上反应体系于42℃温育 15 min；然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；4℃或冰上放置5 min。制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。

4．水稻OsPP2C44基因全长的扩增 

通过PlantQTL-GE查询获得水稻第4染色体抗旱QTL区间（RM241-RM349）内的抗旱相关EST。根据其中一条EST（Genebank accesion No: CA763677）的序列信息，对水稻基因组及全长基因数据库进行BLAST搜索，获得其对应的全长cDNA（AK070129）和预测基因LOC_Os04g52000。根据预测信息设计上下游引物PP2C44f2（5’ ATTGGACAGGACATGGTCGG 3’）和PP2C44r2（5’ CACAACTCACAGCCAAAACCA  3’），从cDNA中直接克隆获得了OsPP2C44基因，凝胶回收，连接到pGEMT-Easy载体上，鉴定后进行序列测定，测序结果经BLAST比对确认。结果显示本发明中的水稻OsPP2C44全长DNA的长度为1585bp，详细序列见SEQ ID NO:1，其中开放阅读框（ORF）为966bp，5’非翻译区（UTR）为262bp，3’非翻译区（UTR）为357bp。

实施例2  水稻OsPP2C44蛋白的序列信息与同源性分析 

根据本发明新的水稻OsPP2C44的ORF推导出水稻OsPP2C44的氨基酸序列，共321个氨基酸，分子量为34700道尔顿，详细序列见SEQ ID NO: 2。通过NCBI网站的BLASTP程序比对得出(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=6ACDWHRB016

&mode=all)，OsPP2C44编码蛋白具有蛋白磷酸酶PP2C催化结构域，属于PP2C亚家族。

通过对水稻中的部分PP2C编码蛋白进行多序列比对（图1），我们发现，该蛋白的具有高度保守的PP2C催化结构域。 

实施例3  水稻基因OsPP2C44在各组织器官的表达分析 

1. 选取材料

IRAT109种植于水田，孕穗期取植株的根、茎、剑叶、叶鞘和穗进行分析。

2. RNA提取与第一链cDNA合成 

按照实施例1中的方法提取RNA与逆转录反应合成第一链cDNA。

3.定量PCR分析 

基因表达的定量分析使用Takara公司的SYBR? Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）试剂盒，和美国ABI PRISM? 7000定量PCR仪进行。根据OsPP2C44全长cDNA序列设计定量引物。以水稻持家基因actin（GenBank accession No. AY212324）为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。20 μL反应体系的配制：

反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设Dissociation Stage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图。

定量分析结果显示（图2），该基因在各组织器官中都有表达，叶鞘和茎中表达量较低。 

实施例4  水稻基因OsPP2C44在逆境胁迫下的表达分析 

1. 逆境胁迫处理

选取饱满的IRAT109种子，蒸馏水清洗，3% NaClO消毒10 min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液（国际水稻所标准营养液）。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时进行各种逆境和激素处理：20%PEG6000、200mM NaCl、4°C、42°C和100μM脱落酸(ABA)。分别在胁迫前、胁迫后3h、6h、12h、24h对逆境处理材料进行取样。在处理前、处理后0.5h、3h、6h、12h、24h对ABA处理样品取样。所有处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行。

2. RNA提取与第一链cDNA合成 

同实施例1。

3.定量PCR分析 

同实施例1。

结果显示：OsPP2C44对盐处理比较敏感，处理后3h内可被诱导表达，表达量明显上升，呈现出一个周期波动；对冷处理、热处理以及ABA则呈现缓慢响应的特点，在处理24h后表达达到最高；而PEG不能够诱导该基因的表达（图3）。这些结果表明，该基因能够受到盐、冷、热等逆境处理以及激素ABA的诱导表达，因而该基因在逆境应答反应中可能起着一定作用。 

实施例5 水稻基因OsPP2C44超量表达转化水稻 

1．利用GATEWAY重组克隆技术构建含OsPP2C44基因的超量表达载体：

以实施例1中已获得含有旱稻IRAT109的OsPP2C44基因的pGEMT-Easy载体为模板，用前引物PP2Cf3:5’- AAAAAGCAGGCTATGGTCGGGCGGA -3’，后引物PP2Cr3:5’- AGAAAGCTGGGTTCAGCAGCGGAATC -3’进行第一轮PCR扩增。再利用通用引物attB1 adapter: 5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’，attB2 adapter: 5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’进行第二轮PCR扩增，扩增产物经回收纯化后，通过BP反应，将扩增产物片断克隆到入门载体pDONR207， 筛选阳性克隆，通过LR反应，将目的基因重组克隆到GATEWAY超表达载体pCB4004。具体过程如下：

（1）第一轮PCR扩增

20μL反应体系如下： 

各反应成分	用量（μL）
		ddH2O	13.8
10×buffer	2
		dNTPs	1
引物F	1
		引物R	1
质粒	1
		Taq	0.2

扩增程序：98℃ 预变性 2min，98℃ 15s，60 ℃ 30s, 72℃ 2min， 10个循环。

（2）第二轮PCR扩增 

取上述PCR产物10μL作为模板，加入到下面PCR配置的40μL反应体系。

各反应成分	用量（μL）
		ddH2O	19.5
10× buffer	4
		dNTPs	2
引物F	2
		引物R	2
PCR产物	10
		Taq	0.5

  

扩增程序：98℃ 预变性1min，98℃ 15s，45 ℃ 30s， 72℃ 2min，共10个循环，98℃ 15s， 55℃ 30s， 72℃ 2min，共25个循环。

反应结束后取5μLPCR产物进行电泳检测。 

（3）PCR产物的回收 

采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）进行纯化回收。

（4）BP重组反应 

BP反应的目的在于将含有attB接头的PCR产物重组到含有attP的供体载体上，以产生入门克隆。重组反应可在室温配制混匀，0.5mL的离心管中进行。反应体系如下：

试剂	用量
		attB-PCR product（>10ng）	3μL
pDONR207  vector (150 ng/μL)	1μL
		5×BP Clonase Clonase enzyme mix	1μL

25℃温浴16h左右，随后将BP反应液转化大肠杆菌感受态细胞。重组大肠杆菌需在含庆大霉素平板上生长。接着挑取单菌落以进行PCR验证，最后抽提质粒。

（5）LR重组反应 

重组反应可在室温配制，0.5mL的离心管中进行。反应体系如下：

试剂	用量
		Entry clone（50-150ng）	3 μL
Destination vector（150 ng/μL）	1 μL
		5×LR Clonase enzyme mix	1 μL

25℃温浴16h左右，然后将反应液转化大肠杆菌感受态细胞。转化完成的大肠杆菌液涂布在含有卡那霉素的平板上生长。接着挑取单菌落，进行PCR验证，然后送测序，测序结果与该基因cDNA序列比对以确认序列正确与否，最后提取质粒，即可转化农杆菌EHA105。

2. 农杆菌转化 

   （1）根癌农杆菌（EHA105）感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600=0.5时，4℃离心收集菌体，用500μL、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30 min后离心，去上清，用100μL，0.1 mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

（2）农杆菌转化（冻融法）： 

向农杆菌感受态细胞（100 μL）中加入5 μL植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30 min后，于液氮中速冻冷激2 min；加入400-800 μL YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200 r/min振荡培养3-5 h；室温离心（5000 r/min，5 min），保留100 μL上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2 天直至长出合适大小的菌落，挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3．愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75%的乙醇消毒1min，然后用次氯酸钠（1.5%有效浓度）溶液振荡消毒20 min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。 

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3 g脯氨酸、0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2.5 mL 2,4-D (浓度1 mg/mL)，配成1 L溶液，调pH至5.9，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。 

4. 继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。 

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5 g脯氨酸、0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2 mL 2,4-D （浓度1 mg/mL），配成1 L溶液，调pH至5.9，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。 

5. 农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌，挑取阳性单菌落，在1 mL农杆菌培养液（含抗生素）中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50 mL农杆菌培养液（含抗生素）中，28℃培养至OD600=0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30 min至OD600=0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20 min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5 d。 

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08 g水解酪蛋白酶、2 g蔗糖和0.2 mL 2,4-D（浓度1 mg/mL），配成100 mL溶液，调pH至5.4，分成两瓶 （每瓶50 mL），高温高压灭菌。使用之前加入1 mL 50%的葡萄糖和100 μL AS（100 mM）。 

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8 g水解酪蛋白酶、20 g蔗糖和3.0 mL 2,4-D （浓度1 mg/mL），配成1 L溶液，调pH至5.6，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20 mL 50%的葡萄糖和1 mL AS（100 mM）。 

6．筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。 

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2.5 mL 2,4-D （浓度1 mg/mL），配成1 L溶液，调pH至6.0，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1 mL Hn和1 mL Cn（100 ppm）。 

7．分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16 h/8 h光暗培养诱导分化芽（4-6周）。 

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.2 mg/L NAA、0.2 mg/L IAA、1.0 g水解酪蛋白酶和30 g蔗糖，配成1 L溶液，调pH至6.0，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。 

 8．生根培养：待芽长至2 cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16 h/8 h光暗培养，诱导生根。 

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30 g蔗糖，配成1 L溶液，调pH至5.8，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。 

9．转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。 

表1 基本培养基成分1 

表2 基本培养基成分2

    

10. 超量表达植株的阳性检测（采用GE healthcare公司的Southern blot试剂盒）

（1）基因组DNA提取（大样法）：液氮浸泡叶片，研磨成细粉，装入10mL离心管中，加4 mL 56℃预热的1.5×CTAB混匀；快速置于56℃的水浴30min，中间颠倒数次；加入氯仿/异戊醇（24:1）4 mL，轻摇30min；4000rpm离心20min，吸取上清3mL至新离心管中（10 mL），加300μL 10%的CTAB（56℃水浴预热），以及3.3 mL的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次；4000rpm离心20min，吸取上清2.7 mL至新离心管中（10 mL），加5.4 mL 1%CTAB（56℃预热），轻摇沉淀DNA，4000rpm离心20min，弃上清，加入2mL含1μL RNA酶的1M NaCl溶液，56℃水浴过夜溶解，加入2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA，4000rpm离心5min，弃上清，75%乙醇清洗沉淀，晾干，加100 μL灭菌水溶解DNA。

（2）基因组DNA酶切、电泳和凝胶预处理： 

在2mL的离心管中加入以下组分：

试剂	用量
		DNA	20μL
HindⅢ （TAKARA）	5μL
		10×M buffer (TAKARA)	30μL
ddH2O	Up to 300μL

混匀后37℃酶切过夜。酶切好的DNA样品在1%的琼脂糖凝胶中，低压（30V）电泳过夜。电泳结束后，将凝胶置于瓷盘中，切除加样孔及不含样品的多余部分，依次用下列溶液处理凝胶：0.25 mol/L的HCl脱嘌呤处理10min，蒸馏水漂洗三次后，加入变性液（1.5M NaCl，0.5M NaOH），振荡变性30min。蒸馏水漂洗三次，加入中和液（1.5M NaCl，0.5M Trizma base）中和30min，蒸馏水漂洗三次。

（3）转膜 

在瓷盘中加入适量转膜缓冲液20×SSC，将大小合适的滤纸用20×SSC浸透，并铺在玻璃板上搭成盐桥。将胶反面朝上置于滤纸上。胶周围用封口膜压边。

根据胶大小裁好硝酸纤维素膜，做好标记，正面向下，紧帖于胶上，防止气泡的产生。在膜上铺放浸过20×SSC，与膜同样大小的3层滤纸。然后铺放吸水纸，在吸水纸后压一块玻璃板，板上加1Kg左右的重物。转膜过夜。其间多次更换浸湿的吸水纸。转膜结束后，置于80℃中烘2h。 

（4）探针制备 

使用潮霉素基因引物（Hyg F：5' CGTTATGTTTATCGGCACTTTG3'，Hyg R：5' TTGGCGACCTCGTATTGG3'）扩增获得512bp的片段，并回收。将cross-linker按2:8的比例稀释成工作液。使用前，将回收DNA用试剂盒中附带的蒸馏水稀释至10ng/μL，取10μL在沸水浴中变性5min，立即放入冰上冷却5min。依次加入10μL反应液，2μL标记试剂，并轻微混匀。再加入10μL cross-linker工作液，轻微混匀。离心机短暂离心，将液体收集至管底。37℃中反应30min。探针可以立即使用，或置于冰上2h内使用。

（5）杂交和检测 

将杂交膜放入含30~40mL预杂交液的杂交管中，55℃预杂交30min，加入制备好的探针，混匀，杂交过夜。弃杂交液，加入55℃预热的洗液I，55℃洗脱10min。重复一次。加入洗液II，常温下漂洗10min。重复一次。将膜转移到干净的封口膜上，将CDP-STAR均匀地滴到杂交膜上，上面用封口膜封好，去除多余的气泡和CDP-STAR。暗室中将杂交膜及底片放入暗盒中，依据所用的DNA浓度，曝光6~12h。黑暗中依次将底片放入显影液，水，定影液中，即可见DNA谱带。显影时间以目的谱带清晰，而背景信号刚要出现时为宜（图4）。结果显示，OsPP2C44的转基因植株中以单拷贝插入为主，有2个双拷贝植株。同时也说明，各转基因苗来自于不同的独立转化过程。

11. 超量表达阳性植株中目的基因的表达水平检测 

RNA提取及定量PCR方法见实施例1。

提取转基因T0代植物叶片RNA，采用定量PCR法检测了OsPP2C44超量表达植株中目的基因的表达水平（图5），在检测的15株转基因植株中，有8株表达量超过20倍，3株超过40倍的植株。 

实施例 6 

转基因水稻的苗期甘露醇处理。

将超量表达转基因家系种子去壳消毒（75%酒精处理1 min，1.5%NaClO处理20 min，无菌水清洗5次），在含有50mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上发芽，野生型对照晚一天播于不含潮霉素的1/2 MS 培养基上。待发芽2～3天后挑选发芽好且长势一致的种子，分别转移到含有0，150 mmol/L甘露醇的1/2 MS培养基上，在光照培养室生长7～10天后观察表型，并测量植株的株高以及鲜重。处理过程中观察表型并拍照。 

实验结果可以看出，正常生长条件下，OsPP2C44转基因植株与野生型植株没有明显的差异；在渗透胁迫后，野生型植株生长明显受到抑制，转基因植株的生长也受到一定程度的抑制，但长势明显优于野生型植株（图6-a），胁迫后3个转基因株系的植株鲜重、株高显著高于野生型植株的鲜重、株高（图6-b，c） 该结果表明超表达OsPP2C44提高了水稻苗期对高渗胁迫的抗性。 

综上所述，尽管已引证一些具体实例对本发明作了详细的说明，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。 

序列表

<110>  上海市农业生物基因中心

<120>  一种与水稻抗逆性相关的OsPP2C44基因及其编码蛋白与应用

<130>  OsPP2C44

<160>  19    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1585

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

<220>

<221>  *CDS

<222>  (263)..(1228)

<220>

<400>  1

gaacttcttt tttctcttct tcttctcctc cattccattc catttctcct cacgctaccg      60

ccacaggtgt ccgcgccgcg agaggcctcg ggctcggctg gtggtggaag aatcggatca     120

ggagaagcaa accaagggat agaaattcct ccccccagaa gatctctcat ccccgtgcgc     180

tgctgctgct gtgtcgtcgt cgtcgtcggg agtggggagc gagcgagcga gctggtctgt     240

gtccgtggtg attggacagg acatggtcgg gcggatggag cggcagtcgg cgtcgtcgtc     300

ggcgtcatgc tccccctcct cctccgccgc cggcacctcc tcctcgtctt cggcctgcgg     360

gggcaagaag cggcccgaca tactcaacat gatccggagt gcaacatgcc ttgattcgtc     420

atctaccgat accggcaagg ggaggagtaa gcagtcaagc aacaaagtga ctcatggatt     480

ccacttggtg gaagggaaat ctgggcatga catggaggac taccatgtgg cagagtacaa     540

gtatgacaag agccatgagc ttggtctctt tgccattttt gatggtcact tgggagacag     600

tgttccaagt tacttgaaag ctaacctttt ctgcaacata ctgaaagagc ctatcttctg     660

gactaaccct caggaagcaa ttaagaatgc ataccgctct acaaacaaat atattttgga     720

gaatgccaaa caacttggac ctggtggttc aacagcagtt actgctattg tcgttgatgg     780

aaaggatatg tgggtagcaa atgtaggtga ttcaagagct gttgtgtgtg aaagaggtgc     840

tgctaatcag ctcactgttg accatgaacc tcatacaact aatgaaaggc agaggattga     900

gaagcagggt ggctttgtaa caacatttcc tggtgatgtt ccccgggtaa atggtcagct     960

tgctgttgcg agggcctttg gggaccaaag cctcaaggcg cacttgagtt cagaacctga    1020

tgttaggcat gtaccaataa gttcaagcat agagttcgtc atacttgcca gcgatggact    1080

atggaaggta atgaagaacc aggaagccgt cgatcttgtg aagtcgatca aggaccccca    1140

ggcagcagcg aagcgactga cgaccgaagc gcttgcgagg aagagcaagg acgacatctc    1200

ctgcatcgtc atccgattcc gctgctgaac acccgcttcg caacattgtc tctgcgtttc    1260

tcttcgttcc gattgaattt gtgtggtggt gctgaaaaaa gatggtttac ctatagtatg    1320

tagctgttgt gaacagaccc tagagatgag atatgttagc aaggacaaaa ctggagatgt    1380

tcaaacttgt gggttcagta gcgagtagtg agtgtgtgca gggtggtggt gggcggtggt    1440

gattcgtctg tgcatacata caccagcata aactgtttta tcaatcgaac ggggcgtgca    1500

ggttgttgcc gttgtgtaca tacattgttg cttggttttg gctgtgagtt gtgaaatggt    1560

agtagtccca gtcatgtgtc atggc                                          1585

<210>  2

<211>  321

<212>  PRT

<213>  Oryza sativa

<400>  2

 Met Val Gly Arg Met Glu Arg Gln Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser Cys

1               5                   10                  15     

 

Ser Pro Ser Ser Ser Ala Ala Gly Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ala Cys

            20                  25                  30         

 

Gly Gly Lys Lys Arg Pro Asp Ile Leu Asn Met Ile Arg Ser Ala Thr

        35                  40                  45             

 

Cys Leu Asp Ser Ser Ser Thr Asp Thr Gly Lys Gly Arg Ser Lys Gln

    50                  55                  60                 

 

Ser Ser Asn Lys Val Thr His Gly Phe His Leu Val Glu Gly Lys Ser

65                  70                  75                  80 

 

Gly His Asp Met Glu Asp Tyr His Val Ala Glu Tyr Lys Tyr Asp Lys

                85                  90                  95     

 

Ser His Glu Leu Gly Leu Phe Ala Ile Phe Asp Gly His Leu Gly Asp

            100                 105                 110        

 

Ser Val Pro Ser Tyr Leu Lys Ala Asn Leu Phe Cys Asn Ile Leu Lys

        115                 120                 125             

 

Glu Pro Ile Phe Trp Thr Asn Pro Gln Glu Ala Ile Lys Asn Ala Tyr

    130                 135                 140                

 

Arg Ser Thr Asn Lys Tyr Ile Leu Glu Asn Ala Lys Gln Leu Gly Pro

145                 150                 155                 160

 

Gly Gly Ser Thr Ala Val Thr Ala Ile Val Val Asp Gly Lys Asp Met

                165                 170                 175    

 

Trp Val Ala Asn Val Gly Asp Ser Arg Ala Val Val Cys Glu Arg Gly

            180                 185                 190        

 

Ala Ala Asn Gln Leu Thr Val Asp His Glu Pro His Thr Thr Asn Glu

        195                 200                 205            

 

Arg Gln Arg Ile Glu Lys Gln Gly Gly Phe Val Thr Thr Phe Pro Gly

    210                 215                 220                

 

Asp Val Pro Arg Val Asn Gly Gln Leu Ala Val Ala Arg Ala Phe Gly

225                 230                 235                 240

 

Asp Gln Ser Leu Lys Ala His Leu Ser Ser Glu Pro Asp Val Arg His

                245                 250                 255    

 

 

Val Pro Ile Ser Ser Ser Ile Glu Phe Val Ile Leu Ala Ser Asp Gly

            260                 265                 270        

 

Leu Trp Lys Val Met Lys Asn Gln Glu Ala Val Asp Leu Val Lys Ser

        275                 280                 285            

 

Ile Lys Asp Pro Gln Ala Ala Ala Lys Arg Leu Thr Thr Glu Ala Leu

    290                 295                 300                

 

Ala Arg Lys Ser Lys Asp Asp Ile Ser Cys Ile Val Ile Arg Phe Arg

305                 310                 315                 320

 

Cys

Claims (8)

1.一种与水稻抗逆性相关的OsPP2C44基因，其特征在于，所述OsPP2C44基因的序列如下列之一：

SEQ ID NO: 1所示的DNA序列；

与SEQ ID NO:1至少90%同源的DNA序列；

功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

2.根据权利要求1所述的OsPP2C44基因，其特征在于，所述的OsPP2C44基因的序列为如下列之一：

SEQ ID NO: 1中第263-1228位所示的DNA序列；

或与SEQ ID NO: 1中第263-1228位所示的DNA序列相似性达90%的DNA序 

列。

3.一种包含权利要求1或2所述OsPP2C44基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者为所述SEQ ID NO:2序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体。

4.一种包含权利要求1或2所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，构建所述重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

6.一种包含权利要求1或2所述OsPP2C44基因的一种植物转化体。

7.根据权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主为水稻。

8.一种提高植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述抗逆性中应用的植物包含权利要求1或2所述OsPP2C44的基因，所述植物为水稻。

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