CN107475270A - 甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C - Google Patents

甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C Download PDF

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Abstract

本发明公开一种甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C。所述2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该基因直接参与了甘蔗细茎野生种抗旱应答过程，是与抗旱直接相关的基因。本发明为深入研究该基因在甘蔗细茎野生种中的抗旱机制奠定了基础。

Description

甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因 ScPP2C
技术领域
本发明属于生物分子克隆技术领域，具体涉及干旱胁迫下的甘蔗细茎野生种编码2C型蛋白磷酸酶的基因，并基于该基因的序列设计引物，通过半定量RT-PCR检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中差异表达的方法。
背景技术
甘蔗在生长发育过程中，会遭遇到低温、干旱等逆境胁迫，严重制约了甘蔗的生长、糖分及生物产量。因此，如何提高甘蔗对逆境胁迫的抗性、培育抗逆性强的新品种，已经成为甘蔗遗传育种研究的重要课题。甘蔗细茎野生种(Saccharum spontaneum L.)是甘蔗属中分布最广的一个种，又称割手密(Saccharum spontaneum L.)，为多年生草本植物，特点是纤维多，蔗汁少，空心，糖分低，优点是早熟、早花、易花，生势好，宿根性好，根群发达，有地下茎，早生快发，耐旱、耐瘠，抗逆性强，抗病虫害的能力强。(黄忠兴,周峰,王勤南,等.国内外割手密资源农艺性状表型遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报,2012,13(5):825-829；许文花,杨清辉.甘蔗割手密无性系抗旱性鉴定[J].亚热带农业研究,2005,1(1):22-26；徐建云,陈超君,钟健,等.甘蔗育种、引种新理念的探讨[J].广西蔗糖,2005(2):3-7.)，因此，通过发掘甘蔗细茎野生种割手密中的抗旱新基因，并从中克隆分离抗旱相关基因，对甘蔗抗旱育种具有重要意义。
2C型蛋白磷酸酶(Protein Phosphatase 2C，PP2C)是蛋白磷酸酶中的一大类，它广泛地参与基因转录调控、蛋白质翻译及翻译后修饰、细胞周期调节、细胞凋亡信号调控、支链氨基酸的代谢、植物的生长发育及环境胁迫应答等多种生物学过程。PP2C通过催化去磷酸化作用负调控蛋白激酶级联信号系统，作为调节因子直接或间接参与逆境胁迫的信号转导及生长发育过程(张继红,陶能国.植物PP2C蛋白磷酸酶ABA信号转导及逆境胁迫调控机制研究进展[J].广西植物,2015(6):935-941；胡晓丽,李德全.植物蛋白磷酸酶2C(PP2C)及其在信号转导中的作用[J].植物生理学报,2007,43(3):407-412.)。但是，在甘蔗属中尚未克隆到编码2C型蛋白磷酸酶的基因及其受到环境胁迫时功能的报道。
发明内容
本发明目的是为了提高现有栽培甘蔗品种的抗旱性，提高甘蔗的生物产量，并进一步扩大甘蔗种植区域(由水肥条件好的地区转移至干旱贫瘠地区)，提供一个新的甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C，还提供一对扩增该基因的引物，以及一种检测该基因在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫差异表达的方法，从而进一步为甘蔗抗旱性育种奠定基础并提供候选基因。
本发明从受干旱胁迫的甘蔗细茎野生种中利用RT-PCR技术克隆获得一个编码2C型蛋白磷酸酶的基因，在NCBI中经BLASTn比对分析，与已知的PP2C基因的同源性为95％，推测该基因编码的蛋白为2C型蛋白磷酸酶，故将该基因命名为2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
1.甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.扩增技术方案1所述的甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的引物，由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQID NO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，
3.一种检测技术方案1所述的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫差异表达的方法，包括(1)干旱处理，(2)总RNA的提取，(3)cDNA第一链的合成，(4)半定量RT-PCR技术检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫的差异表达情况，其特征是：
在所述的(1)干旱处理中：供试甘蔗细茎野生种苗分实验组和对照组，对照组按常规管理浇水；实验组分为3个处理，处理1：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行2d干旱处理；处理2：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行4d干旱处理；处理3：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行6d干旱处理；
在所述的(2)总RNA的提取中，分别收集经过2d、4d、6d干旱处理的甘蔗细茎野生种叶片和对照甘蔗细茎野生种叶片，分别置于各研钵中加液氮快速磨碎后，分别置于各离心管中，每100mg样品中加入1ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s后作为处理样品和对照样品，共3个处理样品和1个对照样品；然后将各处理样品和对照样品按常规进行总RNA提取；
在所述的(4)半定量RT-PCR技术检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫的差异表达情况中，RT-PCR反应体系为：总体积25μl，其中，2×SuperRealPreMix Plus 10μl，10μM引物QF 0.6μl，10μM引物QR 0.6μl，cDNA模板1μl，50×ROXReference Dye 0.6μl，RNase-free ddH2O 12.2μl，所述引物QF的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，引物QR的碱基序列如SEQ ID NO：5所示；PCR反应程序为：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环，检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种未干旱处理的对照和干旱处理2d、4d、6d的3个时期的差异表达情况。干旱处理2天的材料，其2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量明显高于对照组，是对照组的7倍，干旱处理4天的材料，其2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量又高于干旱处理2天的材料，是干旱处理2天的材料的2.43倍，而干旱处理6天的材料，其2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量急速下降；随着干旱胁迫时间的延长，所述2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量在急速升高后，其表达量又开始下调，该2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C属于干旱胁迫的诱导型表达基因。
本发明通过从干旱胁迫的甘蔗细茎野生种中获得命名为2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C，首次提供了甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C，利用2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的序列设计的引物，通过半定量RT-PCR检测了2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在不同干旱胁迫时间下的甘蔗细茎野生种叶片中的3个时期的差异表达情况，发现2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在没有干旱胁迫的情况下几乎不表达，而在干旱处理的3个时期中，均检测到了2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达，2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量随着处理时间先增加后降低，说明2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中受到干旱胁迫时表达量逐步增强、表达水平上调，到达一定峰值后逐步减弱，表达水平下调。因此，2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C属于甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的诱导型表达基因，表明从甘蔗细茎野生种中得到的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C直接参与了甘蔗细茎野生种抗旱应答过程。
采用本发明检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中差异表达的方法，可以检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种叶片中受干旱胁迫后的2d、4d、6d中的3个时期的表达情况，从而获得2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫后的表达谱，为认识2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的功能和深入研究2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中的抗旱机制奠定了基础和理论依据。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是上游引物GP-F的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是下游引物GP-R的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是引物QF的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：5所示的是引物QR的碱基序列。
附图说明
图1：甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的扩增结果。图中，M为DNA Marker，泳道0d：是对照0天干旱处理，泳道2d：2天干旱处理，泳道4d：4天干旱处理，泳道6d：6天干旱处理。
图2：2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫的差异表达检测图。图中，横坐标表示干旱处理天数，纵坐标表示2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C表达量。
具体实施方式
以下实施例用于对本发明作进一步说明。各实施例中无特殊说明的为常规方法。
实验材料：甘蔗细茎野生种(Saccharum spontaneum L.)种植于云南农业大学温室大棚中，以下实施例的实验试剂为市售产品。
实施例1甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的获得
一、设计扩增甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的引物
根据获得的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C信息SEQ ID NO：1，利用生物软件Primer5.0、Oligo 7设计引物，该引物由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，该引物送上海生工公司合成。
二、以干旱处理的甘蔗细茎野生种叶片提取总RNA
(1)样品的处理
将甘蔗细茎野生种苗种植在花盆内，将种植的甘蔗细茎野生种分为3个处理，处理1：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行2d干旱处理；处理2：待甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行4d干旱处理；处理3：待甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行6d干旱处理；所述干旱处理是：三个处理均先按正常隔1天浇一次透水，在各花盆中甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高，处理1连续2d不浇水，处理2连续4d不浇水，处理3连续6d不浇水。
在同一天分别收集已经干旱处理了的2d、4d、6d的3个时期的甘蔗细茎野生种叶片，分别置于研钵中加液氮快速磨碎，每100mg样品加入1ml TRIzol提取液于试管中，涡旋振荡15s，每个时期的取样为一个处理样品，共3个处理样品；3个处理样品均按如下方法操作：
(2)提取总RNA
①将步骤(1)所述的处理样品在18～22℃放置5min；加入氯仿，氯仿的用量为每使用1ml TRIzol加入200μl氯仿，盖好试管盖，涡旋振荡15s，18～22℃放置3min。
②4℃，12000rpm离心15min，此时溶液分为三层：黄色的是有机相，中间层和上层无色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相转移至另一新的无RNase离心管中。
③向得到的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，18～22℃放置20-30min。
④4℃，12000rpm离心10min，弃上清。
⑤加入DEPC水配制的体积分数为75％的乙醇溶液洗涤沉淀，用量为每使用1mlTRIzol，用1ml DEPC水配制的体积分数为75％的乙醇溶液。
⑥4℃，5000rpm离心3min，用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀即RNA；
⑦18～22℃晾干沉淀2-3min，加入30-100μl无RNase的双蒸水，充分溶解RNA后，置于-80℃冰箱保存。
(3)cDNA第一链的合成
①将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心(转速6000rpm，30s)以收集残留在管壁的液体。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
②按照以下体系的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心(转速6000rpm，15s)，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
gDNA去除反应体系：
5×gDNA Buffer 2μl
Total RNA 2μl
RNase-Free ddH2O补足到10μl。
③按照以下体系的反转录反应体系配制混合液：
反转录反应体系：
10×Fast RT Buffer 2μl
RT Enzyme Mix 1μl
FQ-RT Primer Mix 2μl
RNase-Free ddH2O补足到10μl。
④将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA用于后续实验，或低温-80℃保存。
(4)2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的扩增
以步骤二(3)④反转录获得的cDNA作为PCR反应的模板，以步骤一中设计的引物作为PCR反应引物，扩增甘蔗细茎野生种叶片中受干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C，PCR反应体系：Template 1μL；上游引物GP-F 1μL；下游引物GP-R 1μL；Buffer2μL；dNTP 2μL；Pfu酶0.5μL；ddH2O补足到20μL；总体积为20μL。PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸2min，35个循环；72℃,6min，后4℃保存。
(5)目的基因的回收
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，将凝胶中的目的条带进行胶回收，步骤如下：
①在紫外灯下将目的条带胶块切下，尽量将不含DNA片段的空白凝胶去掉后放入1.5ml离心管中；
②按每100μl胶块加入500μl溶胶液的比例向胶块中加入溶胶液，置60℃溶胶约10min，期间不断摇动；
③胶块完全溶解后将溶胶液转移到吸附柱中，18～22℃，12000rpm离心30s，去掉废液；
④向吸附柱中加入500μl漂洗液，18～22℃，12000rpm离心30s，倒掉废液；
⑤重复步骤4，倒掉废液后空管12000rpm离心2min完全去掉废液；
⑥将吸附柱移至干净的1.5ml的离心管中，18～22℃放置2min使其残存于漂洗液中乙醇的挥发干；
⑦向吸附柱膜中央加入30μl-50μl的洗脱缓冲液，18～22℃放置1-2min，12000rpm离心2min洗脱DNA，即获得甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C(见图1)，经测序，所获得甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的碱基序列与序列表中SEQ ID NO：1所示一致，表明通过上述方法所获得的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C为甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C。
实施例2本发明所提供的一种检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫差异表达的方法，包括以下步骤：
(1)干旱处理：
①将在花盆(花盆直径50cm，高度30cm)里种植的甘蔗细茎野生种分为实验组和对照组，实验组分3个处理，其中，处理1：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行2d干旱处理；处理2：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行4d干旱处理；处理3：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行6d干旱处理；所述干旱处理是：三个处理均先按正常隔1天浇一次透水，在各花盆中甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高，处理1连续2d不浇水，处理2连续4d不浇水，处理3连续6d不浇水。
②对照组的处理，种植在花盆里的甘蔗细茎野生种按常规隔1天浇一次透水。
(2)总RNA的提取
①样品处理
在同一天分别收集经2d、4d、6d干旱处理的3个时期的甘蔗细茎野生种叶片以及对照组甘蔗细茎野生种叶片，分别置于各研钵中加液氮快速磨碎后，分别置于各离心管中，每100mg样品加入1ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s后作为处理样品和对照样品，共3个处理样品和1个对照样品；
②提取总RNA
A、将处理样品或对照样品在18～22℃放置5min；加入氯仿，氯仿的用量为每使用1ml
TRIzol加入200μl氯仿，盖好管盖，涡旋振荡15s，18～22℃放置3min；
B、4℃，12000rpm离心15min，此时溶液分为三层：黄色的是有机相，中间层和上层无色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相转移至另一新的无RNase离心管中；
C、向得到的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，18～22℃放置20-30min；
D、4℃，12000rpm离心10min，弃上清；
E、加入DEPC水配制的体积分数为75％的乙醇溶液洗涤沉淀，用量为每使用1mlTRIzol用1ml DEPC水配制的体积分数为75％的乙醇溶液；
F、4℃，5000rpm离心3min，用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀即RNA；
G、15～30℃晾干沉淀2-3min，加入30-100μl无RNase的双蒸水，充分溶解RNA后，对照样品于-70℃保存，3个时期的处理样品分别于-80℃保存。
(3)cDNA第一链的合成
用逆转录试剂盒Fast Quant RT Super Mix(Tiangen,KR108)反转录获得cDNA第一链，参照说明书进行，具体操作步骤如下：
①将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心(转速6000rpm，15s)以收集残留在管壁的液体。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
②按照以下体系的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心(转速6000rpm，30s)，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
gDNA去除反应体系：
5×gDNA Buffer 2μl
Total RNA 2μl
RNase-Free ddH2O补足到10μl
③按照以下体系的反转录反应体系配制混合液。
反转录反应体系：
10×Fast RT Buffer 2μl
RT Enzyme Mix 1μl
FQ-RT Primer Mix 2μl
RNase-Free ddH2O补足到10μl
④将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀，42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA用于后续实验，或-80℃低温保存。
(4)半定量RT-PCR技术检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫的差异表达情况，实验在ABI公司7500荧光量PCR仪上进行，对干旱处理前后的基因表达情况进行分析(见图2)。
①RT-PCR反应体系：
引物QF的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，引物QR的碱基序列如SEQ ID NO：5所示。
②PCR反应程序：
95℃预变性15min，
95℃变性10s，
60℃退火32s，
40个循环。
③PCR检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种叶片未干旱处理的对照和干旱处理2d、4d、6d的3个时期的差异表达情况，从图中可以看出(见图2)，2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在叶片中的表达量存在明显差异，干旱处理2天的材料，其2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量明显高于对照组(0天干旱处理)，是对照组的7倍。干旱处理4天的材料，其2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量又高于干旱处理2天的材料，是干旱处理2天的材料的2.43倍，而干旱处理6天的材料的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量急速下降，由此可见，随着干旱胁迫时间的延长，本发明2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的表达量在急速升高后，其表达量又开始下调，该2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C属于干旱胁迫的诱导型表达基因。
结果分析：2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种叶片中的差异表达检测表明，2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在干旱处理的甘蔗细茎野生种叶片中表达显著上调，而在没有干旱处理的对照叶片中基本检测不到该基因的表达(图2所示)，从而验证了2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中是受干旱胁迫而诱导表达的，属于诱导型表达基因，而非组成型表达基因，且该2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种干旱处理后的3个时期中的表达量表现出了明显的差异，该基因的表达量随着处理时间先增加后降低，表明和验证了2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C直接参与了甘蔗细茎野生种抗旱应答过程，是与抗旱直接相关的基因，为发掘甘蔗细茎野生种中新的抗旱基因提供了理论依据。
序列表
<110> 云南农业大学
<120> 甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 951
<212> DNA
<213> 甘蔗细茎野生种(Saccharum spontaneum L.)
<400> 1
atggtcggcc ggatggagcg gcagaccgcg tcgtcgtcag cgtcatgttc cccctccgcc 60
gccgcctcct cctcggcctg cggcggcaag aagcggcctg atatcctcaa catgatccgg 120
aatgcagcct gtcttaattc gtcatctact gataccggca agggaaggag taaattgtca 180
accaacaaag ttacacatgg attccacctg gtggaaggca aatccggcca tgacatggaa 240
gactaccatg tggcagagta caagtatgtg aagaaccatg agcttggtct ctttgccatt 300
tttgatggcc atttaggaaa taaggtgcca agttacctga aagctaacct ttttagcaac 360
ataatgaaag agcctctctt ctggtctagt cctcaagaag caataaagaa tgcatactgc 420
tctacaaaca aatatattct agaaaatgcc aaacaacttg gaccaggtgg ttcaacagca 480
gttactgcta ttgtagttga tggtaaggac atgtggatag caaatgtagg tgactctcga 540
gctgttgtgt gtgaaagagg cgctgctaat cagctcactg ttgaccacga gcctcataca 600
actaatgaaa gacagaggat tgaaaagcac ggtggttttg taacgacatt tcctggtgat 660
gttcctcggg tgaatggcca gcttgctgtt gctagggcat ttggtgacca aagcctcaag 720
gcccacttga gctctgaacc tgacattaga catgtaccaa taaactcaaa tatagagttc 780
gtcatacttg ccagtgatgg attgtggaag gtaatgaaga accaagaggc agttgatctc 840
gtaaagtcaa tcaaggatcc ccaggcagca gcaaagcgat tgacaactga agcgttggca 900
aggaagagca aggacgatat ctcttgtatt gtcatccgtt tccgctgctg a 951
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgagcaagtt ctgtcttcat cca 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggcagatg attacagaca c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgttgtgtg tgaaagaggc g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcacccgagg aacatcacca 20

Claims (3)

1.甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C，其碱基序列如SEQID NO：1所示。
2.扩增权利要求1所述的甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C的引物，由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQID NO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种检测权利要求1所述的2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫差异表达的方法，包括(1)干旱处理，(2)总RNA的提取，(3)cDNA第一链的合成，(4)半定量RT-PCR技术检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫的差异表达情况，其特征是：
在所述的(1)干旱处理中：供试甘蔗细茎野生种苗分实验组和对照组，对照组按常规管理浇水；实验组分为3个处理，处理1：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行2d干旱处理；处理2：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行4d干旱处理；处理3：待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行6d干旱处理；
在所述的(2)总RNA的提取中，分别收集经过2d、4d、6d干旱处理的甘蔗细茎野生种叶片和对照甘蔗细茎野生种叶片，分别置于各研钵中加液氮快速磨碎后，分别置于各离心管中，每100mg样品中加入1ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s后作为处理样品和对照样品，共3个处理样品和1个对照样品；然后将各处理样品和对照样品按常规进行总RNA提取；
在所述的(4)半定量RT-PCR技术检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫的差异表达情况中，RT-PCR反应体系为：总体积25μl，其中，2×SuperReal PreMixPlus 10μl，10μM引物QF 0.6μl，10μM引物QR 0.6μl，cDNA模板1μl，50×ROX Reference Dye0.6μl，RNase-free ddH2O 12.2μl，所述引物QF的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，引物QR的碱基序列如SEQ ID NO：5所示；PCR反应程序为：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环，检测2C型蛋白磷酸酶基因ScPP2C在甘蔗细茎野生种未干旱处理的对照和干旱处理2d、4d、6d的3个时期的差异表达情况。
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