CN102277358A

CN102277358A - 一种与水稻抗逆性相关的OsGRAS1基因、其启动子及其应用

Info

Publication number: CN102277358A
Application number: CN2010101978051A
Authority: CN
Inventors: 刘鸿艳; 丁雪峰; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI MUNICIPAL AGRICULTURAL BIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI MUNICIPAL AGRICULTURAL BIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明提供一种与水稻抗逆性相关的OsGRAS1基因、其启动子及其应用。该基因含有GRAS基因家族保守结构域，为该基因家族SCL类型成员。OsGRAS1基因受干旱、盐及外源ABA诱导表达，与水稻抗逆性相关。OsGRAS1P启动子序列的差异使其下游OsGRAS1基因受干旱、盐及外源ABA处理上调表达的响应时间及表达量发生变化，该启动子可用作逆境胁迫诱导的基因调控元件。本发明的水稻基因及其启动子对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

Description

一种与水稻抗逆性相关的OsGRAS1基因、其启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种与水稻抗逆性相关的基因，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因OsGRAS1、其启动子GRAS1P及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

水稻是我国的主要粮食作物之一，提高水稻的抗逆性对保障我国粮食产量稳定具有重要意义。利用基因工程这一分子育种技术，将抗逆基因转入当前广泛应用的优良水稻品种中，从而改良其抗逆性，培育既抗逆又高产优质的农作物新品种是水稻抗逆育种的有效途径之一。

利用转录因子来调节植物对逆境的响应是提高作物抗逆性的一个研究热点。在环境胁迫下，植物体通过信号传导，启动或关闭某些相关基因，以达到抵抗逆境的目的。植物感受干旱，干旱胁迫信号经过一系列传递过程，最后诱导特定功能基因的表达。至今，已克隆出一些与植物抗逆相关的转录因子。拟南芥中，已发现的转录因子有DREB1A～C和DREB2A～B，CBF1～3、Hs、AtGluR2、ATHB6、SCOF-1、Atmyb2等，水稻中的OsSNACl(Hu et al.，2006，)，烟草中的Tsi1等也为重要的转录因子。通过确定与植物抗逆性有关的信号传导中起关键作用的调控因子，从这些关键的调控因子着手，就有可能通过转基因方法有效地综合提高作物抗逆性。

GRAS转录因子家族为植物所特有，包括GAI(gibberellic acid insensitive)，RGA(repressor of GA1-3)，SCL(scarecrow like)三大类，具有多变的N-端和保守的C-端(Di Laurenzio et al.1996；Peng et al.1997；Silverstone et al.1998；Pysh et al.1999；Bolle 2004)。GRAS基因家族产物在C-端有显著的相似性，在大约110氨基酸残余N-端有高度保守的VHllD序列。保守的C端的结构域特点是含两个富含亮氨酸区域(LHRI及LHRII)及3个不同的氨基酸标签：VHIID、PFYRE及SAW。VHllD序列在家族的成员中已被广泛认识，尽管它不是绝对的保守：缬氨酸的替换，异亮氨酸和亮氨酸在1，3，4位置上发生置换，在VHllD模体的较大的区域内，P-N-H-D-Q-L残基是绝对保守的。PFYRE模体没有VHllD和SAW模体那么高度保守，但在此结构域中，序列表现较大的共线性，表明在家族成员间序列相似性水平较高。SAW模体主要有三对保守位点：R-E，W-G和W-W，其中W-W是绝对保守的，W-G和W-W之间的间隔则不是保守的。

到目前为止，已经分别从水稻和拟南芥中发现了57和33个GRAS基因，作为转录因子。GRAS蛋白参与植物根及腋芽的发育，根辐射方向结构分布，光信号转导，植物激素赤霉素信号转导和植物高度控制等多种重要的生理和发育过程。番茄的Lateral Suppressor(Ls)基因是GRAS家族成员，该基因控制着番茄的侧枝形成(Schumacher et al.，1999)。我国科学家克隆的控制水稻分蘖的基因MOC1也属GRAS家族，MOC1主要在腋芽中表达，功能是促进分蘖和促进腋芽的生长(Li et al.，2003)。

本发明中的OsGRAS1序列与该家族的其它成员比对结果表明，该基因具有该家族典型的结构域，属SCL类型。本发明OsGRAS1基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段，在干旱、盐、外源ABA处理下的基因表达谱分析表明，该基因可响应逆境胁迫，该基因启动子OsGRAS1P可调节基因对逆境的响应程度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水稻抗逆相关基因OsGRAS1，具有该家族典型的结构域，属SCL类型，可响应逆境胁迫。

本发明的另一目的在于提供所述水稻抗逆相关基因OsGRAS1的启动子GRAS1P，该基因启动子OsGRAS1P可调节基因对逆境的响应程度。

本发明的再一目的是提供含有水稻基因OsGRAS1在提高水稻抗逆性中的应用。

本发明从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它具有植物特有GRAS转录因子家族的保守结构域，因此命名为OsGRAS1。

本发明分离和应用一种包含OsGRAS1基因的DNA片段，该基因能响应冷、盐、外源ABA和PEG胁迫处理，发生表达变化。

本发明所述OsGRAS1基因DNA序列为序列表SEQ ID NO.1所示，或者与SEQID NO.1至少90％同源的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段。

优选为，本发明与水稻抗逆性相关的OsGRAS1基因，是SEQ ID NO.1中第16-1926位所示的DNA序列和相似性达90％的DNA序列。

本发明所述基因的编码蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示，或者SEQ ID NO.2序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体，在高或低的严谨条件下能与水稻OsGRAS1相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白。

可以采用已克隆的OsGRAS1基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组，mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsGRAS1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsGRAS1基因和OsGRAS1P启动子的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得对逆境响应的转基因植株。

本发明还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。

携带本发明OsGRAS1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

本发明OsGRAS1基因表达载体转化宿主是包括水稻在内的多种植物。

本发明从水稻中分离克隆了OsGRAS1的上游调控区，并命名为启动子OsGRAS1P。

本发明所述OsGRAS1基因的启动子OsGRAS1P序列为序列表SEQ ID NO.3所示，或者基本上相当于SEQ ID NO.3所示的70％同源的DNA序列。

优选为，所述OsGRAS1基因的启动子OsGRAS1P序列是SEQ ID NO.3所示1-1370bp序列和相似性达70％的DNA序列。

本发明所述OsGRAS1P启动子序列与120份水稻材料同源序列中的其它三种序列类型相比，缺少一个CAAT-box，多出一个TATAbox，和三个顺式作用元件，即一个MYB1LEPR(regulates defence-related gene expression)，一个NTBBF1ARROLB(Required for tissue-specific expression and auxin induction)和一个OSE2ROOTNODULE(organ-specific elements(OSE)characteristic of the promotersactivated in infected cells of root nodules)。

本发明所述OsGRAS1P启动子能在冷、盐、外源ABA和PGE处理下调节OsGRAS1基因的表达。

可采用已克隆的OsGRAS1P启动子为探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子片段或其同源序列。也可以采用PCR技术，从基因组中扩增得到本发明的OsGRAS1P启动子片段以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsGRAS1P启动子的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得对逆境响应的转基因植株。

本发明OsGRAS1P启动子可响应逆境，调节下游基因表达。因此以本发明OsGRAS1P启动子与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可使其下游基因在逆境下的表达发生变化。

本发明通过对水稻基因分离克隆及其对逆境胁迫的响应，提供了一种水稻DNA片断包含一个1934bp的编码基因OsGRAS1及其启动子OsGRAS1P。该基因含有GRAS基因家族保守结构域，为该基因家族SCL类型成员。OsGRAS1基因受干旱、盐及外源ABA诱导表达，与水稻抗逆性相关。OsGRAS1P启动子序列的差异使其下游OsGRAS1基因受干旱、盐及外源ABA处理上调表达的响应时间及表达量发生变化，该启动子可用作逆境胁迫诱导的基因调控元件。

本发明可以用于研究利用此基因遗传转化获得转基因植物的分子方法，及该启动子序列差异对此基因表达的影响。

本发明的水稻基因及其启动子对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

附图说明

图1-1和图1-2分别为本发明的OsGRAS1基因在苗期及幼穗分化期不同干旱条件下的表达水平；

图2为本发明的OsGRAS1基因在苗期冷、盐、PEG和外源ABA处理下的表达水平；

图3为本发明利用ClustalW2软件将OsGRAS1基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果；

图4为本发明的OsGRAS1基因超表达载体转化水稻植株的Southern blot检测；

图5为本发明的OsGRAS1基因超表达载体转化水稻植株的表达水平检测；

图6为本发明的OsGRAS1P启动子四种不同序列类型的比对结果；

图7-1，图7-2，图7-3，图7-4分别为本发明的OsGRAS1P启动子四种不同序列类型I，II，III，IV在冷、盐、外源ABA和PEG处理下，对其下游GRAS1基因表达水平的调控。

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

水稻基因OsGRAS1在胁迫条件下的表达分析

1.干旱胁迫处理

苗期：IRAT109种子催芽后，在发芽盒内水培生长。三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。待幼苗长至4叶后开始干旱处理。共设4种旱处理和对照。旱处理的方法是将幼苗从营养液中取出，用吸水纸吸干根表面水分后，置于干净滤纸上，在生长箱内(T＝28℃，RH＝70％，遮光)放置30min，3h，8h和20h，然后快速剪取叶片和根，投入液氮中冷冻后于-80℃保存用于RNA提取。

幼穗分化期：采用PVC根管法。根管内径20cm，高100cm，内装入细沙。将IRAT109种植在根管内，根管置于抗旱大棚内。分别设有水对照和干旱胁迫两种处理。有水对照保持根管表土湿润。干旱处理于植株开始进入幼穗分化时断水，同时去除根管管壁上小孔处的胶塞，以便排除根管内水分。分别于断水后2周(土壤含水量25％)、4周(土壤含水量13％)剪取剑叶、未抽出的幼穗及根，经液氮冷冻后于-80℃保存备用。

2.冷、盐、外源ABA和盐胁迫处理

种子催芽后，在发芽盒内水培生长。三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养一个月，当水稻苗长到三叶一心时做如下不同处理：冷胁迫，4℃处理0h，0.5h，6h，12h；盐胁迫，200mmol/LNaCl处理1h，6h，12h，24h；ABA处理，100umol/L ABA(脱落酸)溶液均匀地喷晒到水稻叶片上处理0h，0.5h，3h，12h，24h，20％PEG模拟干旱处理0h，0.5h，3h，12h，24h，48h。

3.RNA提取与第一链cDNA合成

采用植物叶RNA小量抽提试剂盒(离心柱法，上海华舜生物技术有限公司)分别提取苗期与生长后期各处理和对照的叶片、穗和根的总RNA，并测定各样品的RNA浓度(Beckman Coulter^TM

)。每个样品取15ug进行DNAase I(Invitrogen公司和Takara公司)消化，除去RNA中残留的DNA。用反转录试剂盒(Promega公司)将去除了DNA的RNA样品反转录合成cDNA第一链，于-20℃保存备用。

4.半定量与定量PCR分析

苗期与幼穗分化期的旱胁迫处量样品采用半定量PCR法分析：以水稻持家基因Actin(GenBank accession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计上游引物Acf：5’-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3’(SEQ ID NO.4)和下游引物Acr：5’-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3’(SEQ ID NO.5)。分别设置25、27、29、31四个PCR循环数进行RT-PCR，从每个样品中扩增持家基因。严格控制PCR反应体系的配制，确保各PCR管内体系的一致性。各取10ulPCR产物，在3％的TAE凝胶中电泳。DNA扩增带成像后，分析各条带的强度(Intensity)，确定各样品的最佳扩增循环数。然后，分别以各样品cDNA为模板，扩增OsGRAS1基因片段，扩增前引物Gf1为：5′TGAACGCATCCAAGGGTATGACAAGGT3′(SEQ ID NO.6)，扩增后引物Gr1为：5′AGGGCGGAATCCCGGCTGTGGTAAGTC3′(SEQ ID NO.7)。同时扩增参照基因Actin，取10ulPCR产物，在3％的TAE凝胶中电泳。DNA扩增带成像后，分析各条带的强度(Intensity)，以抗旱EST对参照基因的相对强度作为该基因的表达量。结果表明，OsGRAS1基因在苗期和幼穗分化期干旱处理后，表达量均有明显提高。对苗期的IRAT109进行干旱处理0.5h，3h，8h，20h，分别对OsGRAS1在叶中及根中的表达进行分析(图1-1)。发现OsGRAS1基因在叶中的表达量在0.5h时有所下降，其后呈上升趋势，并且在干旱胁迫处理20h时达到最大。在根中的表达量呈上升趋势，并且在干旱胁迫处理8h时达到最大，在20h又有所下降。对幼穗分化期进行干旱处理2周和4周，分别对OsGRAS1在叶、根及穗中的表达进行分析(图1-2)，发现干旱处理后在叶、根、幼穗中表达量均有明显提高，表达量最高时都能达到水处理的5-7倍。在干旱处理2周时，叶中OsGRAS1基因的表达呈现上升趋势，并且在干旱4周的时候达到最大，是同时期水处理的7倍。根中OsGRAS1基因的表达也呈现上升趋势，并且响应时间比叶中更短，在干旱2周的时候即达到最大值。

冷、盐、外源ABA和PEG胁迫处理样品采用定量PCR法分析：PCR反应使用美国ABI

7000定量PCR仪，使用Takara公司的定量PCR试剂盒。每一个PCR反应重复三次。反应体系包含SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)12.5μl，正反向引物各0.5μl，各种处理的cDNA模板1μl，加水补足体积至20μl。反应条件如下：反应条件如下：95℃1min，然后在95℃15s，62℃1min，循环40次，在每个循环中62℃1min读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他具体操作按仪器使用说明书。

定量分析结果显示(图2)，在盐、外源ABA及PEG处理下，OsGRAS1基因的表达量总体上呈现上升表达的趋势。盐胁迫下，OsGRAS1基因的表达量随时间延长，表达量上升。外源ABA处理，OsGRAS1基因的表达在30min内就达到对照的2倍，并持续到处理3h。在此之后表达量有所下降，但仍高于对照。在PEG处理的早期(30min)，OsGRAS1基因表达有所下降，随后明显增加，在处理48h时达到最高，是对照的3倍。OsGRAS1基因受到冷胁迫呈下降表达，表达量随处理时间的延长而减少。

实施例2

水稻OsGRAS1基因的克隆

1.幼苗培育

水稻(品种为“IRAT109”，国外引进的旱稻品种)为上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存，将水稻置于35℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA的分离：按照实施例1中的方法提取RNA。

3.基因的全长克隆

通过PlantQTL-GE查询获得水稻第4染色体抗旱QTL区间(RM241-RM349)内的抗旱相关EST。根据其中一条EST(Geneband accesionNo：CB096362)的序列信息，对水稻基因组及全长基因数据库进行BLAST搜索，获得其对应的全长cDNA(AK100784)和预测基因Loc_Os04g50060。根据预测信息设计上下游引物Gf2(5’GAAGATTCAAGAGTCATGTT3’)(SEQ ID NO.8)和Gr2(5’ACAGTTTGCTAGTTTGGTTCC3’)(SEQ ID NO.9)，从cDNA中直接克隆获得了OsGRAS1基因(1934bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI3730测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果经BLAST比对确认。

4.水稻OsGRAS1蛋白的序列信息与同源性分析

本发明新的水稻OsGRAS1全长cDNA的长度为1911bp，详细序列见SEQ IDNO.1第16-1926bp。根据全长cDNA推导出水稻OsGRAS1的氨基酸序列，共636个氨基酸残基，分子量为71655.98道尔顿，等电点(pI)为5.51。详细序列见SEQID NO.2。将OsGRAS1蛋白序列与已克隆的植物GRAS基因氨基酸序列进行比对(ClustalW2，在线比对：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)，结果见图3，GRAS家族高度保守的区域主要包括5个可识别的模体，在VHIID和SAW模体中绝对保守的碱基已用粗体标示，PFYRE模体中的P-F-Y-R-E也用粗体标示。本发明OsGRAS1具有GRAS家族特有的模体保守位点，聚类分析显示，OsGRAS1为SCL类型的GRAS基因。

实施例3

水稻基因OsGRAS1超量表达转化水稻

1.利用GATEWAY重组克隆技术构建含OsGRAS1基因的超量表达载体：

以实施例1中已获得含有旱稻IRAT109的OsGRAS1基因的pGEMT-Easy载体为模板，用前引物Gf3：5′AAAAAGCAGGCTATGTTGGATTCTGGTT 3′(SEQ ID NO.10)，后引物Gr3：5′AGAAAGCTGGGTCTAGTTTGGTTCCCAT 3′(SEQ ID NO.11)进行第一轮PCR扩增。再利用通用引物attB1 adapter：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’(SEQ ID NO.12)。attB2adapter：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3(SEQ ID NO.13)进行第二轮PCR扩增，扩增产物经回收纯化后，通过BP反应，将扩增产物片断克隆到入门载体pDONR207，筛选阳性克隆，通过LR反应，将目的基因重组克隆到GATEWAY超表达载体pCB4004(该载体是在中国科技大学向征斌研究员赠送的pCB2004基础上，将BASTA抗性基因(除草剂抗性基因)替换为潮霉素抗性基因改造而来，命名为pCB4004)。具体过程如下：

(1)第一轮PCR扩增

步骤时间温度循环次数

预变性 2分钟 98℃ 1

变性 10秒 98℃

退火 10秒 60℃ 10

延伸 1分钟/kb 68/72℃

(2)第二轮PCR扩增

取上述PCR产物10ul作为模板

步骤时间温度循环次数

预变性 1分钟 95℃ 1

变性 15秒 94℃

退火 30秒 45℃ 5

延伸 1分钟/kb 68/72℃

然后设置下一步的PCR程序。

步骤时间温度循环次数

变性 15秒 94℃

退火 30秒 55℃ 15-20X

延伸 1分钟/kb 68/72℃

最后取5ul电泳检测PCR质量。

(3)PCR产物的纯化

采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行纯化。

(4)BP重组反应

BP反应的目的在于将含有线性attB表达克隆或attB接头的PCR产物克隆到含有attP的供体载体上以产生入门克隆。重组反应可在0.5ml的离心管中进行，室温配制混匀。

组分用量

attB-PCR产物(＞10ng) 1-7ul

pDONR207载体(150ng/ul) 1ul

5X BP重组反应液 2ul

TE缓冲液(pH 8.0) 至10ul

25℃温浴1-16h。随后，在混合液中加1ul蛋白酶K 37℃温浴10min终止反应。最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌。重组大肠杆菌需在含庆大霉素平板上生长。挑取阳性克隆，进行PCR验证，然后抽提质粒。

(5)LR重组反应

重组反应可在0.5ml的离心管中进行，室温配制混匀。

组分用量

入门克隆(50-150ng) 1-7ul

目的载体(150ng/ul) 1ul

5X LR重组反应液 2ul

TE缓冲液(pH 8.0) 至10ul

25℃温浴1-16h。随后，在混合液中加1ul蛋白酶K 37℃温浴10min终止反应。最后取1-5ul LR反应液转化大肠杆菌。重组大肠杆菌需在含卡那平板上生长。挑取阳性克隆，进行PCR验证，然后抽提质粒。

2.农杆菌转化

根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600＝0.5时，4℃离心收集菌体，用500μl、0.1mol/L冰浴CaCl2重悬，冰浴30min后离心，去上清，用100ul，0.1mol/L冰CaCl2重悬后，于4℃保存。

农杆菌转化(冻融法)：

(1)向感受态农杆菌(100ul)中加入5ul植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；

(2)取出，加入400～800ul YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200r/min振荡培养3-5h；

(3)室温离心(5000r/min，5min)，保留100ul上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落。

(4)挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3.愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表5的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2，4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

4.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表5的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2ml 2，4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

5.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在1ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表5的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2ml 2，4-D(浓度1mg/ml)，配成100ml溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50ml)，高温高压灭菌。使用之前加入1ml 50％的葡萄糖和100μl AS(100mM)。

共培养培养基：采用表5的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0ml 2，4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20ml 50％的葡萄糖和1ml AS(100mM)。

6.筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表6的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2，4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1ml Hn和1ml Cn(100ppm)。

7.分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表6的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

8.生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表6的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

9.转化植株培养；待根系发达后，打开试管口，加入无菌水练苗2-3天后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表5基本培养基成分1

表6基本培养基成分2

10.超量表达植株的阳性检测(采用GE healthcare公司的Southern blot试剂盒)

(1)基因组DNA提取(大样法)：液氮浸泡叶片，研磨成细粉，装入10ml离心管中，加4ml 56℃预热的1.5×CTAB混匀；快速置于56℃的水浴30min，中间颠倒数次；加入氯仿/异戊醇(24∶1)4ml，轻摇30min；4000rpm离心20min，吸取上清3ml至新离心管中(10ml)，加300uL10％的CTAB(56℃水浴预热)，以及3.3ml的氯仿/异戊醇(24∶1)，颠倒数次；4000rpm离心20min，吸取上清2.7ml至新离心管中(10ml)，加5.4ml1％CTAB(56℃预热)，轻摇沉淀DNA，4000rpm离心20min，弃上清，加入2ml含1ul RNA酶的1M NaCl溶液，56℃水浴过夜溶解，加入2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA，4000rpm离心5min，弃上清，75％乙醇清洗沉淀，晾干，加100ul灭菌水溶解DNA。

(2)基因组DNA酶切、电泳和凝胶预处理：

在2ml的离心管中加入以下组分：

DNA 20μL

HindIII(TAKARA) 5μL

10×M buffer(TAKARA) 30μL

Total 20μL

加水至总体积 300μL

混匀后37℃酶切过夜。酶切好的DNA样品在1％的琼脂糖凝胶中，低压(30V)电泳过夜。电泳结束后，将凝胶置于瓷盘中，切除加样孔及不含样品的多余部分，依次用下列溶液处理凝胶：0.25mol/L的HCl脱嘌呤处理10分钟，蒸馏水漂洗三次后，加入变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)，振荡变性30分钟。蒸馏水漂洗三次，加入中和液(1.5M NaCl，0.5M Trizma base)中和30分钟，蒸馏水漂洗三次。

(3)转膜

在瓷盘中加入适量转膜缓冲液20×SSC，将大小合适的滤纸用20×SSC浸透，并铺在玻璃板上搭成盐桥。将胶反面朝上置于滤纸上。胶周围用封口膜压边。

根据胶大小裁好硝酸纤维素膜，做好标记，正面向下，紧帖于胶上，防止气泡的产生。在膜上铺放浸过20×SSC，与膜同样大小的3层滤纸。然后铺放吸水纸，在吸水纸后压一块玻璃板，板上加1Kg左右的重物。转膜过夜。其间多次更换浸湿的吸水纸。转膜结束后，置于80℃中烘2小时。

(4)探针制备

使用潮霉素基因引物(Hyf：5′CGTTATGTTTATCGGCACTTTG3′(SEQ ID NO.14)，Hyr：5′TTGGCGACCTCGTATTGG3′(SEQ ID NO.15)扩增获得512bp的片段，并回收。将cross-linker按2∶8的比例稀释成工作液。使用前，将回收DNA用试剂盒中附带的蒸馏水稀释至10ng/ul，取10ul在沸水浴中变性5分钟，立即放入冰上冷却5分钟。依次加入10ul反应液，2ul标记试剂，并轻微混匀。再加入10ulcross-linker工作液，轻微混匀。离心机短暂离心，将液体收集至管底。37℃中反应30分钟。探针可以立即使用，或置于冰上2h内使用。

(5)杂交和检测

将杂交膜放入含30～40ml杂交液(1×AlkPhos Directtm hybridization buffer，0.5MNaCl，4％blocking reagent)的杂交管中，55℃预杂交30分钟，加入制备好的探针，混匀，杂交过夜。弃杂交液，加入55℃预热的洗液I(0.1％SDS，2M Urea，50mMNaH₂PO₄，150mM NaCl，1mM MgCl₂，0.2％Blocking reagent)，55℃洗脱10分钟。重复一次。加入洗液II(50mM Tris base，100mM NaCl，2mM MgCl₂)，常温下漂洗10分钟。重复一次。将膜转移到干净的封口膜上，将CDP-STAR均匀地滴到杂交膜上，上面用封口膜封好，去除多余的气泡和CDP-STAR。暗室中将杂交膜及底片放入暗盒中，依据所用的DNA浓度，曝光6～12小时。黑暗中依次将底片放入显影液，水，定影液中，即可见DNA谱带。显影时间以目的谱带清晰，而背景信号刚要出现时为宜(图4)。结果显示，OsGRAS1基因以不同的拷贝数插入到水稻基因组中：除单株2，4，17，19，22，24共6个为假阳性外，其余有14个为单拷贝，4个为两拷贝，没有发现更多拷贝数的转化植株。同时也说明，各转基因苗来自于不同的独立转化过程。

11.超量表达阳性植株中目的基因的表达水平检测

RNA提取及定量PCR方法见实施例1。

提取转基因T0代植物叶片RNA，采用定量PCR法检测了OsGRAS1超量表达植株中目的基因的表达水平(图5)，有7个的表达量超过40倍，其中株系16和21的表达量分别达到了110倍和88倍。

实施例4

1.水稻OsGRAS1P启动子分离克隆

通过在Gramene网站上将OsGRAS1基因与水稻基因组比对，并向5’端延伸获得OsGRAS1基因上游序列，设计引物Gpf1(5’-CGCATGAACGATGAATAACGA-3’(SEQ ID NO.16))和Gpr1(5’-TGATGTGGGGCTTGGGGTCG-3’(SEQ ID NO.17))，从IRAT109基因组DNA中扩增获得1518bp的片段，将此片段连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 3730测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果经BLAST比对确认，其中1-1332bp为OsGRAS1基因上游启动子序列，命名为OsGRAS1P。

2.水稻OsGRAS1P启动子序列多样性分析

将OsGRAS1P序列分别与两个已测序的水稻品种日本晴(粳稻)与93-11(籼稻)中的同源序列进行比对，发现OsGRAS1P在日本晴中的同源序列无差异，但在93-11中的同源序列存在较大片段的插入缺失差异。根据差异片段设计引物Gpf2(5′CACTTGACCACCTTGTTTGAT 3′(SEQ ID NO.18))和Gpr2(5′TAATGTGTGATGTGTTTGCTGTT 3′(SEQ ID NO.19))，在120份水稻品种中对该差异片段进行扩增与电泳检测，共获得了4种不同类型的带型，分别以I，II，III，IV表示。对4种带型进行了测序和序列比较分析，发现IRAT109的OsGRAS1P启动子序列比其它三种序列类型多了3个顺式作用元件：MYB1LEPR，GT1CORE，NTBBF1ARROLB(图6)。将四种带型各选择1个品种，进行冷、盐、外源ABA和PEG胁迫处理，分析其下游基因OsGRAS1的表达水平，由图7-1、7-2、7-3、7-4可见，IRAT109的OsGRAS1P(图7-4中IV型)对ABA和PEG处理较其余三种启动子序列类型更敏感，其下游OsGRAS1基因在ABA处理下的表达量上调表达的响应时间，和PEG处理下的上调表达量均高于其余三种启动子序列类型。

综上所述，尽管已引证一些具体实例对对本发明作了详细的说明，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。

序列表

<110>上海市农业生物基因中心

<120>一种与水稻抗逆性相关的OsGRAS1基因、其启动子及其应用

<130>OsGRAS1

<160>19

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1934

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>*primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>GAAGATTCAAGAGTCATGTT

<220>

<221>*CDS

<222>(16)..(1926)

<220>

<221>*primer_bind

<222>(1914)..(1934)

<223>ACAGTTTGCTAGTTTGGTTCC

<400>1

gaagattcaa gagtcatgtt ggattctggt tcttatgatg atgttgacta tggggatttg 60

ttctccatcc ccaatccacc tgcgcctcac ttgctcaatt tccccctcca gttcttccct 120

tccaacggat tcatcagttc tgctgatgat tcccatagat caccagctgg tatgtttggc 180

tcgaccccaa gccccacatc aaccacaacc gagttggaaa attcagagga tctgtctgaa 240

tccgccgacg atgcggtcct agcatacatc aatcagtttc ttcttgaaga tgaggaagat 300

gaatcttgtc ctggcaccat cacatcggtg gaggactctg ccctcctcgc cgtcgagaag 360

ccattcgttg acatcctcac tgctagccaa gaggcctgtc aagagaattc ttggatagat 420

tcttgttgtg atttcacggg gaatggagga ttgcttgata cgttcacaac cacacatgcc 480

gcttgccagc cagcgccttg tgaatttgag aaggagaagg gggagtgtgc tgttcataaa 540

ggccggaaga acccgcatga tgattgccta ttgttcgagg aagagagcag gaggagcaag 600

cagttggcag tgtctgagga ggagactgtc agagagatgt ttgacaaggt gcttctgtgt 660

aatggcgaat gcgagctccg ggcaccactg ccagctgaag cacggaactg cggggtgtac 720

gtgaaaggat ctggaaataa gagaggccga aagaaaggaa aatctggagc atctgcagag 780

gatgatgcgg ttgatctcac taccctactc attcattgtg cccaggccgc tgcaatcgat 840

gatcaccgga actccaatga gttgctgaaa caaattaggc agcgttcttc tgcatatgga 900

gatgccggtc agaggttagc acattgtttt gctaatgcgt tggaggctcg gctagctggc 960

actggcagca acatttaccg ttcacttgct gccaagcgaa cttctgttta tgacatattg 1020

aatgcattca agctgtatgt tacagcatgc ccgttcaaga aaatatcgaa cttcttctcg 1080

atcgaagcca tcttgaacgc atccaagggt atgacaaggt tgcacattgt tgactatggt 1140

atacagtatg gattccagtg gccaatcttc ttccagcgga tctcgaagag acctggtggc 1200

cctccaagtg ttcgaatcac cggtgttgac ttaccacagc cgggattccg ccctgcacaa 1260

ctcattgagg cgacgggccg tcggttgcat gactatgccc gtatgttcaa tgttccattt 1320

gaataccatg ctattgctgc caagtgggac actatccgtg tcgaagatct taagatagac 1380

aaagacaagg atgaacttct tgttgttaac tgccttttcc ggatgagaaa catgatggac 1440

gaaatggtga cagatgacag cccaagaatg caggttctga agacaataag aaagatgaat 1500

ccaaatttgt tcatccatgg cgttgtcaat ggcacctaca atgcgccctt cttcgtgaca 1560

cgattcaagg aggctttgtt ctactactct tcactttttg atatgcttga aacaactgct 1620

tcacgggtcg acgaaaacag gctgctgata gaaagagatc tcttcggccg ggaagctctt 1680

aatgtggttg cttgtgaggg cactgagaga gtagaaagac cagagacgta caagcaatgg 1740

caggtgagga acatcagggc aggcttcaag cagctaccac tgaaccaaga gacggtgaag 1800

aaggcaagat acaaggtgaa gaaatcctac cacagggatt tcctagttga cgaagataac 1860

aaatggatgc tgcaaggttg gaaggggcgt atcatctttg ctctttcagc atgggaacca 1920

aactagcaaa ctgt 1934

<210>2

<211>636

<212>PRT

<213>0ryza sativa

<400>2

Met Leu Asp Ser Gly Ser Tyr Asp Asp Val Asp Tyr Gly Asp Leu Phe

1 5 10 15

Ser Ile Pro Asn Pro Pro Ala Pro His Leu Leu Asn Phe Pro Leu Gln

20 25 30

Phe Phe Pro Ser Asn Gly Phe Ile Ser Ser Ala Asp Asp Ser His Arg

35 40 45

Ser Pro Ala Gly Met Phe Gly Ser Thr Pro Ser Pro Thr Ser Thr Thr

50 55 60

Thr Glu Leu Glu Asn Ser Glu Asp Leu Ser Glu Ser Ala Asp Asp Ala

65 70 75 80

Val Leu Ala Tyr Ile Asn Gln Phe Leu Leu Glu Asp Glu Glu Asp Glu

85 90 95

Ser Cys Pro Gly Thr Ile Thr Ser Val Glu Asp Ser Ala Leu Leu Ala

100 105 110

Val Glu Lys Pro Phe Val Asp Ile Leu Thr Ala Ser Gln Glu Ala Cys

115 120 125

Gln Glu Asn Ser Trp Ile Asp Ser Cys Cys Asp Phe Thr Gly Asn Gly

130 135 140

Gly Leu Leu Asp Thr Phe Thr Thr Thr His Ala Ala Cys Gln Pro Ala

145 150 155 160

Pro Cys Glu Phe Glu Lys Glu Lys Gly Glu Cys Ala Val His Lys Gly

165 170 175

Arg Lys Asn Pro His Asp Asp Cys Leu Leu Phe Glu Glu Glu Ser Arg

180 185 190

Arg Ser Lys Gln Leu Ala Val Ser Glu Glu Glu Thr Val Arg Glu Met

195 200 205

Phe Asp Lys Val Leu Leu Cys Asn Gly Glu Cys Glu Leu Arg Ala Pro

210 215 220

Leu Pro Ala Glu Ala Arg Asn Cys Gly Val Tyr Val Lys Gly Ser Gly

225 230 235 240

Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Gly Lys Ser Gly Ala Ser Ala Glu Asp

245 250 255

Asp Ala Val Asp Leu Thr Thr Leu Leu Ile His Cys Ala Gln Ala Ala

260 265 270

Ala Ile Asp Asp His Arg Asn Ser Asn Glu Leu Leu Lys Gln Ile Arg

275 280 285

Gln Arg Ser Ser Ala Tyr Gly Asp Ala Gly Gln Arg Leu Ala His Cys

290 295 300

Phe Ala Asn Ala Leu Glu Ala Arg Leu Ala Gly Thr Gly Ser Asn Ile

305 310 315 320

Tyr Arg Ser Leu Ala Ala Lys Arg Thr Ser Val Tyr Asp Ile Leu Asn

325 330 335

Ala Phe Lys Leu Tyr Val Thr Ala Cys Pro Phe Lys Lys Ile Ser Asn

340 345 350

Phe Phe Ser Ile Glu Ala Ile Leu Asn Ala Ser Lys Gly Met Thr Arg

355 360 365

Leu His Ile Val Asp Tyr Gly Ile Gln Tyr Gly Phe Gln Trp Pro Ile

370 375 380

Phe Phe Gln Arg Ile Ser Lys Arg Pro Gly Gly Pro Pro Ser Val Arg

385 390 395 400

Ile Thr Gly Val Asp Leu Pro Gln Pro Gly Phe Arg Pro Ala Gln Leu

405 410 415

Ile Glu Ala Thr Gly Arg Arg Leu His Asp Tyr Ala Arg Met Phe Asn

420 425 430

Val Pro Phe Glu Tyr His Ala Ile Ala Ala Lys Trp Asp Thr Ile Arg

435 440 445

Val Glu Asp Leu Lys Ile Asp Lys Asp Lys Asp Glu Leu Leu Val Val

450 455 460

Asn Cys Leu Phe Arg Met Arg Asn Met Met Asp Glu Met Val Thr Asp

465 470 475 480

Asp Ser Pro Arg Met Gln Val Leu Lys Thr Ile Arg Lys Met Asn Pro

485 490 495

Asn Leu Phe Ile His Gly Val Val Asn Gly Thr Tyr Asn Ala Pro Phe

500 505 510

Phe Val Thr Arg Phe Lys Glu Ala Leu Phe Tyr Tyr Ser Ser Leu Phe

515 520 525

Asp Met Leu Glu Thr Thr Ala Ser Arg Val Asp Glu Asn Arg Leu Leu

530 535 540

Ile Glu Arg Asp Leu Phe Gly Arg Glu Ala Leu Asn Val Val Ala Cys

545 550 555 560

Glu Gly Thr Glu Arg Val Glu Arg Pro Glu Thr Tyr Lys Gln Trp Gln

565 570 575

Val Arg Asn Ile Arg Ala Gly Phe Lys Gln Leu Pro Leu Asn Gln Glu

580 585 590

Thr Val Lys Lys Ala Arg Tyr Lys Val Lys Lys Ser Tyr His Arg Asp

595 600 605

Phe Leu Val Asp Glu Asp Asn Lys Trp Met Leu Gln Gly Trp Lys Gly

610 615 620

Arg Ile Ile Phe Ala Leu Ser Ala Trp Glu Pro Asn

625 630 635

<210>3

<211>1518

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>*primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>CGCATGAACGATGAATAACGA

<220>

<221>*primer_bind

<222>(1499)..(1518)

<223>TGATGTGGGGCTTGGGGTCG

<400>3

cgcatgaacg atgaataacg aaacatatac gtacagcttt tgtcggactc aaaaaattcg 60

tactctcttc gtcaaattaa actaatctag tataagattg gaacattata ttaaaatata 120

tttattttat atcagcttat tttggaatgg ttgtattaat tcaattcgga taacatgacg 180

gaggactgtt atcgtcgttg gttgcatcaa caaggctcaa cctaaaagca caattatctg 240

ttgcagaaaa tcctccacct tcgcatcctg tcctgttgag acctgaggta cccttgcagt 300

ggtgcatccc cctttctttc ccacttgacc accttgtttg attaatcgct taaaagctgc 360

aggtgtacta atgaaagtag tactagtata cttaaccaat tgaccatact cttcctagaa 420

tggcgaagag caaatttaat agtaaagctc actgcttact ataaatttag agttaactta 480

tataataagt tagttgtaag gttaacttta ttttttctat aaggttaact ttattttttc 540

cattctctct ctttctcact ccataaattt aatgcatatt ttttggaggt tgtgtggagc 600

taactcttgc atgagagcca atactaccca cttttcctta tctctcttcc acataaagta 660

tatagtttgc ttatagccca ttattatcct tgctcttatg agggggggcg attagttaac 720

gttaagcacg cttttacgag cgagaagaca ggctgtcacg cttttaacag caaacacatc 780

acacattaat caattcgcct ccagcaccaa gccaaccgag gctcttggga gttgggagtt 840

gggactccct gtgcctctcc tctccaccgc aacgaccaca aatcaccatc tgctttctag 900

tttcttcctg aagttctgcg tcataaaggc aaaaatccaa gattgatttt ggatgaaaaa 960

gactgcagtg cttagcaagt gttctgttct tggagtcgca agctgcggct agctagcaag 1020

caagcagctt tttttttttc gcagatcttg gtgaagagcc tgttcttcca tggctttcgc 1080

tttgtgaggt aacatgtgtt ttttacattc tggaatatga gtaggagtat atacttgaaa 1140

caataaggta ccatggcatg cttgtaaaat ttctatacca tagcaccgtc agatttttat 1200

ggtaaaaaag aacagatttt tatggtattt gttcagttct ctttagtgag atccttgtgt 1260

ttaatttgca gagaaaaggg tattgttagt cagtaagtaa aagggtggat cttgttcgaa 1320

gattcaagag tcatgttgga ttctggttct tatgatgatg ttgactatgg ggatttgttc 1380

tccatcccca atccacctgc gcctcacttg ctcaatttcc ccctccagtt cttcccttcc 1440

aacggattca tcagttctgc tgatgattcc catagatcac cagctggtat gtttggctcg 1500

accccaagcc ccacatca 1518

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cttcctcatg ccatcctgc 19

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcaagcttct ccttgatgtc c 21

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tgaacgcatc caagggtatg acaaggt 27

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

agggcggaat cccggctgtg gtaagtc 27

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gaagattcaa gagtcatgtt 20

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

acagtttgct agtttggttc c 21

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

aaaaagcagg ctatgttgga ttctggtt 28

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

agaaagctgg gtctagtttg gttcccat 28

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cgttatgttt atcggcactt tg 22

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ttggcgacct cgtattgg 18

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cgcatgaacg atgaataacg a 21

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tgatgtgggg cttggggtcg 20

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cacttgacca ccttgtttga t 21

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

taatgtgtga tgtgtttgct gtt 23

Claims

1.一种与水稻抗逆性相关的OsGRAS1基因，其特征在于，其为SEQ ID NO.1中所示的DNA序列，或者与SEQ ID NO.1至少90％同源的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段。

2.根据权利要求1所述的OsGRAS1基因，其特征在于，其为SEQ ID NO.1中第16-1926位所示的DNA序列和相似性达90％的DNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的OsGRAS1基因，其特征在于，其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示，或者SEQ ID NO.2序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。

4.一种水稻启动子，它是权利要求1-3任意一项所示编码基因的启动子，其特征在于，其DNA序列是序列表SEQ ID NO.3所示，或者基本上相当于SEQ IDNO.3所示的70％同源的DNA序列。

5.根据权利要求4所述的水稻启动子，其DNA序列是SEQ ID NO.3所示1-1370bp序列和相似性达70％的DNA序列。

6.一种含有权利要求4或5所述水稻启动子的植物表达载体。

7.一种由权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.根据权利要求7所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为包括水稻在内的多种植物。

9.权利要求1-3任意一项所述基因在用于提高水稻抗逆性中的应用。