CN102994505A - 水稻osa-miR171a基因的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从水稻DNA片断中分离克隆的启动子MIR171aP，该启动子驱动osa-miR171a基因表达。启动子MIR171aP能响应干旱胁迫，与水稻抗旱性相关，该启动子主要在水稻根、节及花药中驱动基因表达，具有一定的组织特异性，本发明的水稻启动子可驱动基因组织特异性表达及改变所启动基因在干旱胁迫下的表达量。

Description

水稻 osa-miR171a 基因的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及水稻osa-miR171a基因的启动子MIR171aP的应用，利用此启动子可诱导基因组织特异性表达及改变所启动基因在干旱胁迫下的表达量。

背景技术

miR171在拟南芥等植物中的相关研究很早就有报道，但是在水稻中的研究相对较少。2002年David P. Bartel等从拟南芥幼苗和花中分别克隆了大量的小RNAs，Northern分析发现ath-miR171在花中表达量较高；2002年James C. Carrington等的研究发现，miR171在拟南芥、水稻和烟草的花中积累量相对比较高，而在叶和茎秆中表达量较少或不能被检测到；2005年Vincent L. Chiang等发现miR171在毛果杨茎杆中特异表达，可能参与了木质组织的形成，木质组织机械损伤胁迫导致ptr-miR171下降；miR171在小麦的各种组织中都有表达，特别是根中相对较高（孙其信，2007）；2009年薛红卫等对水稻miRNA做了表达谱分析，得出osa-miR171g/h在水稻根中选择性优先表达。可见miR171在不同植物的各个组织中表达量是有差异的。

本发明启动子MIR171aP克隆自水稻第6染色体。结合GUS染色及qRT-PCR结果可知，其主要在根、节及花药中表达，且对干旱胁迫有响应。

发明内容

本发明的目的在于提供osa-miR171a基因的启动子MIR171aP，该启动子主要在根、节及花药中表达，并且响应逆境胁迫。

本发明从水稻中分离克隆了osa-miR171a的上游调控区，并命名为启动子MIR171aP。

从水稻中分离克隆了osa-miR171a的上游调控区的启动子MIR171aP通过Plant-CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析可知，该启动子中存在多个抗逆相关的顺式作用元件，如ABRE（cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness），MBS（MYB binding site involved in drought-inducibility），TCA-element（cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness），TGACG-motif（cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness），这些保守序列的存在预示着该启动子与植物的抗逆性存在密切关系。

本发明采用的技术方案是，提供一种启动子MIR171aP，所述启动子MIR171aP序列表为下列之一：

如SEQ ID NO:1所示；

或基本上相当于SEQ ID NO:1所示的90%同源的DNA序列；

或功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

本发明还提供一种包含上述启动子MIR171aP的重组载体，其中，构建所述重组载选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体，所述表达的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

本发明还提供一种包含启动子MIR171aP的转化体，其中，所述转化体的宿主为植物，所述植物为水稻。

本发明还提供一种包含上述启动子MIR171aP在水稻旱胁迫中的应用。其采用的操作步骤是：a)、将所述的启动子驱动目的基因导入植物细胞、组织或器官；b)、再将转化后的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到响应干旱胁迫的转 基因植物，

本发明还提供一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP在驱动水稻基因特异表达中的应用，其中，所采用的操作步是： a)、将所述的启动子驱动目的基因导入植物细胞、组织或器官； b)、再将转化后的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到驱动目的基因在特定的组织部位表达的转基因植株。

实现上述技术方案采用的方法是，采用已克隆的MIR171aP启动子为探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子片段或其同源序列。也可以采用PCR技术，从基因组中扩增得到本发明的MIR171aP启动子片段以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含MIR171aP启动子的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得在根、节及花药中特异表达且对逆境响应的转基因植株。

本发明的技术效果是：本发明的MIR171aP启动子主要在根、节及花药中表达，因此以本发明MIR171aP启动子与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可使其下游基因主要在根、节及花药中表达。

本发明的MIR171aP启动子可响应干旱，调节下游基因表达。因此以本发明MIR171aP启动子与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可使其下游基因在干旱胁迫下的表达发生变化。

本发明采用的技术方案可以用于研究利用此基因遗传转化获得转基因植物的分子方法，及该启动子序列差异对此基因表达的影响。

由于水稻基因及其启动子对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

附图说明

图1水稻苗期MIR171aP启动子在干旱胁迫下对osa-miR171a基因启动表达分析；

图2为本发明水稻MIR171aP启动子在各组织器官对osa-miR171a基因启动表达分析；

图3为本发明水稻MIR171aP启动子驱动GUS报告基因表达结果。

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 1

水稻苗期MIR171aP启动子在干旱胁迫下对osa-miR171a基因启动表达分析

1.选取材料

本实验以粳型旱稻品种IRAT109 (Oryza sativa L. ssp. Japonica，国外引进的旱稻品种，上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存)为基因表达量分析的实验材料。挑选饱满的IRAT109水稻种子，1%次氯酸钠消毒后，4℃条件下清水浸泡24小时。然后转入35-38℃环境里破胸20小时，待露白后置25-28℃环境下催芽至半粒谷长，胚根为谷粒长。选择Wagner’s规格（1/5000 a）大小的塑料小桶，采用穴播的方式，每个小桶种16株。正常条件下生长至五叶一心时进行旱处理，分别在旱处理前、旱处理后3d、5d、7d、9d、11d和复水后1h、3h、6h、12h、24h、48h取样。取样时，只选择倒数第二片叶片，用于总RNA的提取。

2. RNA提取与第一链cDNA合成

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1ml TRNzol-A⁺试剂（天根生化科技有限公司）的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100µl RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

反转录之前需用DNaseI消化所提取样品，反应体系如下：

试剂名称	使用量（µl）
		RNA	5（总量约1µg）
10×DNaseI Buffer	1
		DNaseI（5U/µl）	0.2
DEPC H2O	Up to 10 µl

37℃反应15min后，加入0.25µl 0.1M EDTA（保证终浓度>2mM），70℃温育10 min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：（1）DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20µl的反应体系：

试剂名称	使用量（µl）
		MgCl2（25mM）	4
Reverse 10× Buffer	2
		dNTP Mix（10mM）	2
RNasin® Inhibitor（40U/µL）	0.5
		AMV Reverse Transcriptase（25U/µl）	0.6
Oligo(dT)15Primer（500µg/ml）	1

（2）将上反应体系于42℃温育 15 min；

（3）然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；

（4）4℃或冰上放置5 min。

制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。

3.定量PCR分析

基因表达的定量分析使用Takara公司的SYBR^® Premix Ex Taq^TM （Perfect Real Time）试剂盒，和美国ABI PRISM^® 7000定量PCR仪进行。根据osa-miR171a前体序列设计定量引物。以水稻持家基因actin2为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。所用基因定量引物为qmiR171aF:5’-TATTGGTGAGGTTCAATCCGATG-3’和qmiR171aR:5’-CAATCAGATACTGATTTTACCACTGC-3’，内参基因定量引物为Actin2F:5’-TTCCTCATGCCATCCTGCGTCTG-3’和

Actin2R:5’-GTCCCTTACAATTTCCCGTTCAGC-3’。20 µl反应体系的配制：

试剂名称	使用量（µl）
		SYBR Premix Ex TaqTM（2x）	10
Prime F（2µM）	2
		Prime R（2µM）	2
cDNA	0.5
		Rox	0.4
ddH2O	5.1

反应条件为：95℃ 30s，然后在95℃ 5s，60℃ 31s，循环40次，并增设Dissociation Stage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^{- ΔΔ CT}法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图。

定量分析结果显示（图1），该启动子响应干旱胁迫。

实施例 2

水稻MIR171aP启动子在各组织器官对osa-miR171a基因启动表达分析，本实验选取粳型旱稻品种IRAT109苗期及成熟期的各部位组织，分别提取RNA，反转录成cDNA，然后通过定量分析MIR171aP启动子在各组织器官对osa-miR171a基因启动表达作用（具体操作同实施例1）。

定量分析结果显示（图2），该启动子主要在水稻的根、节及花药中驱动基因表达，推测该启动子具有一定的组织表达特异性。

实施例 3

水稻MIR171aP启动子分离及克隆

1．幼苗培育

将水稻置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA。

2．启动子的克隆

首先，在Sanger数据库（http://microrna.sanger.ac.uk/）中查询osa-miR171a前体的序列注释信息，然后通过GRAMENE网站中（http://www.gramene.org/）下载得到osa-miR171a前体上游2000bp的序列，根据预测信息设计上下游引物：MIR171ApF（5’-CATAAACCAAACCCACAAAC-3’）

和MIR171aPR （5’-ACCGGGAATCAGGTCAAG-3’），从IRAT109基因组DNA中扩增获得1421bp的片段，将此片段连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye, Perkin-Elmer, USA)的方法，在ABI 3730测序仪(Perkin-Elmer, USA)上进行测序。测序结果经BLAST比对确认。具体操作步骤如下：

（1） 用IRAT109的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系（50μl）及条件如下：

10×Buffer	5μl
		dNTP（2mM）	4μl
Ex Taq（5u/μl）	0.4μl
		DNA模板	1μl
MIR171ApF（10mM）	1μl
		MIR171aPR（10mM）	1μl
ddH2O	Up to 50μl

反应条件：94℃5 min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35 cycles；72℃5min；4℃ HOLD。

（2） 回收（TianGen普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒）

a.柱的平衡：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

b.将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管；

c.向胶块中加入500μl溶胶液PN，50℃水浴至胶块完全溶解；

d.将溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

e.向吸附柱CA2中加入500μl漂洗液PW，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

f.重复步骤5；

g.12,000r/min离心2min，尽量除去漂洗液，打开吸附柱CA2的盖子，室温放置几分钟，使漂洗液中的酒精挥发干；

h.将吸附柱CA2放到干净的离心管中，向吸附膜中间悬空滴加40μl洗脱缓冲液EB或是ddH₂O，室温放置2min，12,000r/min离心30s，把溶液吸回吸附柱，再12,000r/min离心2min收集DNA溶液；

i.回收的DNA溶液-20℃保存备用。

（3）连接

反应成分	反应体积（μl）
		2×Rapid ligation buffer	5
pGEM -T Easy vector/双酶切后质粒	0.5
		目的片段	4
T4 DNA Ligase	0.5

混匀后16℃连接过夜，取5μl进行转化。

（4）转化

a.取预备好的100 μl感受态细胞，加入5μl连接液，混匀，冰浴30 min；

b.42℃热激，90 s，迅速置冰上3-5min；

c.加800 μl LB液体培养液（无抗生素），混匀，37℃，80-120 r/min培养1h复苏；

d.5000 r/min离心5 min，倒掉多余上清，保留100 μl，重悬菌体；

e.把菌液在加了相应抗生素的LB固体培养基平板上涂板，37℃倒置培养过夜(12-16 h)。

实施例 4

水稻MIR171aP启动子驱动GUS报告基因植物表达载体的构建

以实施例2中已获得的阳性克隆为模板，用加了HindIII酶切位点的引物eMIR171ApF（5’-aagcttAGGATAGGAGCATCCGACAG-3’）和加了BamHI酶切位点的引物eMIR171ApR（5’-cctaggATGATGAAAAGTGAGCTTGAAAG-3’）再进行一轮PCR扩增，回收纯化目的片段后，导入大肠杆菌，然后挑取阳性克隆扩繁，并提取质粒，经酶切后连入载体pCAMBIA1321（分别经HindⅢ/EcoRI酶切后的pBI121及pCAMBIA1300构建而得，其含有报告基因GUS）。具体操作步骤如下：

1． PCR、回收、转化同实施例2。

2. 测序正确的单克隆提取质粒（TianGen普通质粒小提试剂盒）。

(1) 柱的平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(2) 把过夜培养的菌液12,000r/min离心5min，倒掉上清；

(3) 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，悬浮菌体；

(4) 向离心管加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解（不要太剧烈，以免打断基因组DNA，而使质粒不纯，时间不应超过5min），此时菌液变得清亮粘稠；

(5) 向离心管加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次使菌体充分混匀，此时会出现白色沉淀；

(6) 12,000r/min离心5min，把上清转到吸附柱CP3，尽量不要吸出沉淀，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(7) 向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液PW，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(8) 重复步骤7；

(9) 12,000r/min离心2min，尽量除去漂洗液，打开吸附柱CP3的盖子，室温放置几分钟，使漂洗液中的酒精挥发干；

(10) 将吸附柱CP3放到干净的离心管中，向吸附膜中间悬空滴加50μl洗脱缓冲液EB或是ddH2O，室温放置2min，12,000r/min离心30s，把溶液吸回吸附柱，再12,000r/min离心2min收集质粒溶液；

(11) 回收的质粒溶液-20℃保存备用。

3. 用HindIII/BamHI分别双酶切上一步回收的质粒及载体pCAMBIA1321质粒，酶切体系如下：

质粒30μl

HindIII 1μl

BamHI1μl

1×K 5μl

ddH₂O Up to 50μl

混匀后37℃酶切3-6个小时，进行琼脂糖电泳检测，回收目的片段，载体不需要回收。

4. 酶切后的目的片段与载体pCAMBIA1321连接，并转入E.coli DH5α挑菌落，通过PCR鉴定阳性，取阳性菌液扩繁并提取质粒（同实施例2）

实施例 5

农杆菌转化

1. 根癌农杆菌（EHA105）感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600=0.5时，4℃离心收集菌体，用500ul、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30 min后离心，去上清，用100ul，0.1 mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

2. 农杆菌转化（冻融法）：

（1）向感受态农杆菌（100 ul）中加入5 ul植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30 min后，于液氮中速冻冷激2 min；

（2）取出，加入400~800 ul YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200 r/min振荡培养3-5 h；

（3）室温离心（5000 r/min，5min），保留100 ul上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2 天直至长出合适大小的菌落。

（4）挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

实施例 6

水稻MIR171aP启动子驱动GUS报告基因转基因水稻植株的获得

1．愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75%的乙醇消毒1min，然后用次 氯酸钠（1.5%有效浓度）溶液振荡消毒20 min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3 g脯氨酸、0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2.5 ml 2,4-D (浓度1 mg/ml)，配成1 L溶液，调pH至5.9，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。

2. 继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5 g脯氨酸、0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2 ml 2,4-D （浓度1 mg/ml），配成1 L溶液，调pH至5.9，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。

3. 农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在1 ml农杆菌培养液（含抗生素）中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50 ml农杆菌培养液（含抗生素）中，28℃培养至OD600=0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30 min至OD600=0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20 min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5 d。

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08 g水解酪蛋白酶、2 g蔗糖和0.2 ml 2,4-D（浓度1 mg/ml），配成100 ml溶液，调pH至5.4，分成两瓶（每瓶50 ml），高温高压灭菌。使用之前加入1 ml 50%的葡萄糖和100 μl AS（100 mM）。

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8 g水解酪蛋白酶、20 g蔗糖和3.0 ml 2,4-D （浓度1 mg/ml），配成1 L溶液，调pH至5.6，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20 ml 50%的葡萄糖和1 ml AS（100 mM）。

4．筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2.5 ml 2,4-D （浓度1 mg/ml），配成1 L溶液，调pH至6.0，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1 ml Hn和1 ml Cn（100 ppm）。

5．分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16 h/8 h光暗培养诱导分化芽（4-6周）。

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.2 mg/L NAA、0.2 mg/L IAA、1.0 g水解酪蛋白酶和30 g蔗糖，配成1 L溶液，调pH至6.0，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。

6．生根培养：待芽长至2 cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16 h/8 h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30 g蔗糖，配成1L溶液，调pH值至5.8，加入7 g琼脂粉，高温高压灭菌。

7．转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表1 基本培养基成分1

表2 基本培养基成分2

实施例 7

GUS组织化学染色

取遗传转化过程中分化的愈伤组织、转基因苗及水稻苗期、成株期不同组织，加入GUS染液，置于37°C恒温培养箱过夜，在75%的酒精中进行脱色处理，观察染色部位，并用普通数码相机或显微镜拍照记录结果。

1. 配制Gus染色液，配方如下：

2. 将水稻的不同组织加入Gus染色液后，置于37°C恒温培养箱过夜。

3. 倒掉染色液，加入75%酒精脱色，然后观察染色部位，记录，拍照。

GUS染色结果显示（图3），该启动子主要在水稻的根、节及花药中驱动基因表达，其染色结果同图1。

综上所述，尽管已引证一些具体实例对对本发明作了详细的说明，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，做各种变化或修正是显然的。

序列表

<110>上海市农业生物基因中心

<120>水稻osa-miR171a基因的启动子及其应用

<130> MIR171aP

<160> 1

<170>PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1433

<212> DNA

<213>水稻（Oryza sativa）

<220>

<221>primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> CATAAACCAAACCCACAAAC

<220>

<221>primer_bind

<222> (1404)..(1421)

<223> ACCGGGAATCAGGTCAAG

<400> 1

cataaaccaaacccacaaacacacacacgagaaagagaaagcaaaattcagagagagaga 60

gagagagaaagcaattacacaatgcgatgcaacgcaacgagccccaatgcgcgagagctc 120

ggcgatgtcccctggcgcggcgccatggcagggccgctttgccgccgctgtccccgctcg 180

gcttcgcaggtgttcgatccccattgattactgctgctgctggccaccaccaccactagc 240

taggccaccatcagttcaattttggttaagaaaaggcgagaaacgccattaagaaattac 300

aaagatcaattcggagatatcgagagaggaggagacggatttacgtgcaagctagctggt 360

gctcccgattaagaaactggccgccttttgtacggacactccgatcgagctgagagcatt 420

cttcagtttcttcgtcgtcgttctaggcacacacattctgcgctcctgcccccgatgcgc 480

attccctgtgtcgtctagcttcttcttctccttcgatttccttctagtacgattgctgtg 540

gctgtcgaaaattaattaattaattaatgttatatatataatcacgtaaattaaaaggaa 600

tttgatgatttgaccgatggttttctctttatcttatgttttttattctctgaattgatt 660

ggcattcttcccaactgttttcgcccgcgaaacgctcgacctaccccactattgtatgca 720

tgctgaccatgcagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagag 780

agatctgtatatatcttttggtctgctcgtcttcatcattctgctcactaccccctctcc 840

catggagatcgagccaggccggaacgagtgcctctctctccgagctgcctcctcctattt 900

catggctcccttcccccttcgccatctccgtgccctacctgcaaatccactgtgctagct 960

agctagctaccttcctcgtcgccttcattctgaataattctgatcgatctctgatctgtc 1020

tccatctctgcataacttctgaacaatatgcagatttgagtgagactgagctagtcagtc 1080

gatcgtcatcgtttatgtcagtctcgcagatcgatggagagtcaacaacaacagcgacgt 1140

cttgtgagatcttacatgtaagtcatttgggaggacagtgcgctacatgaagcttccaat 1200

taaccctagcaataacacacacacacaccacttcatgtgcagacagccaaaagtcgcttt 1260

ggttcgccactaaccatttctattgtttctatatgttatctgcttgtgaataacaactga 1320

cgcgtacggttgatggagattgatcagctagagctatgcgcagatcgatatatccgggat 1380

atgtatagatgtttttcagttagttatatatctagcttgacctgattcccggt 1433

Claims (11)

1.水稻osa-miR171a基因的启动子MIR171aP，其特征在于，所述启动子具有下列 核苷酸序列之一：

SEQ ID NO:1中所示的DNA序列；

与SEQ ID NO:1至少90%同源的DNA序列；

功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

2.一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP的重组载体。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，构建所述重组载选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于构建重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

5.一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP的转化体。

6.根据权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主为植物。

7.根据权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述植物为水稻。

8.一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP在水稻旱胁迫中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的操作步骤：

a)、将所述的启动子驱动目的基因导入植物细胞、组织或器官，

b)、再将转化后的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到响应干旱胁迫的转基因植物。

10.一种包含权利要求1所述启动子MIR171aP在驱动水稻基因特异表达中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用的操作步骤：

a)、将所述的启动子驱动目的基因导入植物细胞、组织或器官，

b)、再将转化后的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到驱动目的基因在特定的组织部位表达的转基因植株。

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