CN103397032B

CN103397032B - 一种非生物胁迫诱导型启动子

Info

Publication number: CN103397032B
Application number: CN201310336989.9A
Authority: CN
Inventors: 温小杰; 魏文杰; 郝晨阳; 蒲文; 苏姗姗; 刘旭; 张学勇
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2033-08-05
Also published as: CN103397032A

Abstract

本发明公开了一种非生物胁迫诱导诱导型启动子。本发明所提供的启动子为如下1）-4）中任一种DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）序列表中序列1的第470-2981位所示的DNA分子；3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明以pCAMBIA-1391z为原始载体，构建了以GUS基因为报告基因的表达载体并获得转水稻阳性株系，GUS活性分析表明，本发明所提供的Pro-TaFRA1启动子具有早期非生物胁迫诱导反应，能作为植物源的诱导型表达载体，在基因工程育种改良植物抗性中具有很好的应用前景。

Description

一种非生物胁迫诱导型启动子

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种非生物胁迫诱导诱导型启动子，特别涉及一种来源于小麦的非生物胁迫诱导诱导型启动子。

背景技术

干旱和高盐是影响作物生长和限制作物产量提高的主要非生物胁迫因素（Yamaguchi-ShinoZaki K.,Shinozki K.Characteriaztion of the expression of adesiccation-responsive rd29 gene of Aarbidopsis thaliana and analysis of its promoter intransgenic plants.Mol Gen Genet,1993，236:331-340.）。世界上有1/3的土壤属于干旱土壤，我国干旱区域约占国土面积的1/4，主要集中在西北内陆地区。盐渍土是各种盐土、碱土及其它不同程度盐化和碱化的土壤的总称，在世界各大洲都有分布，约占地球陆地面积的10%（Munns R.Physiological processes limiting plant growth in saline soils:some dogmas and hypotheses.Plant Cell and Env,1993,16:15-24.）。我国也存在大面积的盐碱地，约0.27亿ha，其中0.06亿ha为耕地，占耕地总面积的8.5%，是世界盐碱地大国之一（王宝山，赵可夫，邹琦.作物耐盐机理研究进展及提高作物抗盐性对策．植物学通报，1997，14：25-30.），主要分布在东部滨海地区。另一方面，由于灌溉不当，在干旱半干旱地区土壤盐渍化加剧。我国地域辽阔，干旱土壤和盐碱地分布广泛，又是干旱灾害频发的国家，2009-2010年我国西南多省遭遇百年一遇的夏、秋、冬、春四季连旱灾害，83%的耕地受旱，农作物严重减产甚至绝收，给农民的生产生活带来巨大影响。因此，改良农作物的抗逆性、选育抗逆新品种已经成为作物育种的一个重要任务。

近年来，随着现代分子生物学及基因工程的迅速发展，使人们从分子水平上深入开展植物与非生物逆境之间关系的研究成为可能，也为植物抗逆遗传改良开辟了新途径。但在开展转基因研究时，必需具备可使外源目的基因在转基因作物中高效特异表达、提高目的基因表达量的调控元件，其中启动子就是这些调控元件中最重要的一个。启动子是调控基因转录的一段DNA序列，是转录开始的部位，也是基因转录调控机制和表达模式中最关键的因子。按照启动子的作用方式和表达活性，可以将其分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子三类（王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术.1998,北京:科学出版社.）。组成型启动子已经广泛地应用于植物基因工程中，对其研究有着非常重要的意义，目前常用的有花椰菜花叶病毒（CaMV)35S启动子（Odell J.T.,Nagy F.,Chua N.H.Identification of DNA sequences required for activityof the cauliflower masaic virus 35S promoter.Nature,1985,313(6005):810-820.)、胭脂碱合酶基因（Nos)和章鱼碱合酶基因（Ocs)启动子，以及近年来从单子叶植物中克隆出的水稻肌动蛋白基因Act1启动子（Wang Y.,Zhang W.,Cao J.,et al..Characterization ofcis-acting elements regulating transcription from the promoter of a constitutively active riceactin gene.Mol Cell Biol,1992,12(8):3399-3406.)、玉米泛素基因Ubi1启动子（Christensen A.H.,Sharrock R.A.Maize polyubiquitin genes:structure,thermalperturbation of expression and transcript splicing and promoter activity following transfer toprotoplasts by electroporation.Plant Mol Biol,1992,18:675-681.)。但在组成型启动子的驱动下外源基因在植物各种组织中强烈表达，这些大量积累的异源蛋白或代谢产物使得植物原有的代谢平衡被打破，阻碍了植物的生长，甚至导致植物死亡（Miyao M.,Fukayama H.Metabolic consequences of overproduction of phosphoenolpyruvatecarboxylase in C3 plants.Arch Biochem Biophys,2003,414(2):197-203.）。同时根据Kumpatla et al.（Kumpatla S.,Chandrasekharan M.Genome intruder scanning andmodulation systems and transgene silencing.Trends Plant Sci,1998,3(3):97-104.）的报道，使用一种启动子驱动两个或多个外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。因此，为了更好的调控植物基因的表达，对组织器官特异型和诱导型的启动子研究成为了一种迫切的需求。

诱导型启动子在正常的生理状态下转录活性很低或不驱动基因的转录，但某些物理或化学信号的刺激，可大幅度地提高基因的转录水平，是提高植物抗性等为主要目的的基因工程所青睐的元件。可分为植物激素诱导型启动子、环境因子（光、热）诱导型启动子、生物胁迫诱导型启动子（病、虫害）、非生物胁迫（低温、干旱、盐）诱导型启动子。研究和应用最早的是拟南芥rd29A基因的启动子（Seki,M.,Narusaka,M.,Ishida,J.,Nanjo,T.,Fujita,M.,Oono,Y.,Kamiya,A.,Nakajima,M.,Enju,A.,Sakurai,T.,Satou,M.,Akiyama,K.,Taji,T.,Yamaguchi-Shinozaki,K.,Carninci,P.,Kawai,J.,Hayashizaki,Y.,and Shinozaki,K.Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsisgenes under drought,cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray.Plant J,2002,31:279-292.)。此外，还有组织特异性启动子，驱动基因的表达只发生在某些特定的器官或组织内位，能使目的基因的表达产物在一定空间积累。目前，已经从种子、花药、维管组织、块茎、叶肉等组织中分离得到了驱动外源基因的组织特异型启动子。

综上所述，启动子是基因工程表达载体的重要元件，研究启动子对于基因表达调控机制，改善作物的生产性状，如抗虫、抗病、抗逆等性状具有十分重要的意义。获得植物来源的新的启动子，特别是特异性诱导型启动子，可以为研究植物抗逆基因的表达和调控奠定基础，还可为基因工程方法改良提供有价值的核心元件，对基因工程育种的发展也具有经济、环保及生物安全等多方面的潜在价值（Venter M.Syntheticpromoters:genetic control through cis engineering.Trends Plant Sci,2007,12(3):118-124.）。

发明内容

本发明的目的是提供一种非生物胁迫诱导诱导型启动子。

本发明所提供的启动子，来源于小麦（Triticum aestivum L.），为如下1）-4）中任一种DNA分子：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列1的第470-2981位所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由3464个核苷酸组成。

含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

在本发明的中，所述重组载体为在pCAMBIA-1391z载体的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为Sal I和EcoR I。

所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因（来源于pCAMBIA-1391z载体）；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子（来源于pCAMBIA-1391z载体）。

所述DNA分子在启动目的基因在植物表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述启动目的基因在植物中表达，为在逆境胁迫条件下启动目的基因在植物中表达；更加具体为在逆境胁迫条件下启动目的基因在植物的根中表达。

所述逆境胁迫具体可为如下中的至少一种：盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫、ABA胁迫。

利用所述DNA分子培育转基因植物的方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤：

1）构建目的基因重组表达载体：将目的基因插入携带有所述DNA分子的所述重组载体，使所述DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；

2）将步骤1）构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到表达所述目的基因的转基因植物。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因（来源于pCAMBIA-1391z载体）。

在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物；所述单子叶植物具体可为水稻。

在本发明的一个实施例中，所述水稻具体为水稻品种Kitaake。

扩增所述DNA分子（启动子）的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，所述引物对具体为：

5’-GTCGACACCGGCTATGTTGAG-3’；

5’-GAATTCGACAAGTAGAGACGGAA-3’

本发明以pCAMBIA-1391z为原始载体，构建了以GUS基因为报告基因的表达载体并获得转水稻阳性株系，GUS活性分析表明，Pro-TaFRA1启动子具有早期非生物胁迫诱导反应，能作为植物源的诱导型表达载体，在基因工程育种改良植物抗性中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为转基因水稻的PCR鉴定结果。其中，A为转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1的T1代转基因水稻的PCR检测结果；B为转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFbox2的T1代转基因水稻的PCR检测结果。A-B中，显示有扩增目的条带（箭头所指大小）的鉴定阳性的植株。

图2为转基因水稻的Southern鉴定结果。其中，A为转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1的T1代转基因水稻的Southern检测结果；B为转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFbox2的T1代转基因水稻的Southern检测结果。A和B中，左图均为Hind III酶切结果，右图均为杂交结果；泳道N表示非转基因水稻（阴性对照），泳道M为marker；其余泳道为T1代转基因水稻的不同株系，有条带的为获得的阳性株系（条带的多少为插入基因的拷贝数），没有条带的为阴性植株。

图3为在非生物胁迫条件下，两个启动子（Pro-TaFRA1和Pro-TaFbox2）驱动的GUS基因表达量检测结果。A：盐处理；B：PEG处理；C：冷处理；D：ABA处理。A-D中，纵坐标的相对表达量即为GUS基因的相对表达量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的培养基和溶液的配制：

NB基本培养基（1L）的配制方法如下：KNO₃ 2830mg，(NH₄)₂SO₄ 463mg，KH₂PO₄400mg，MgSO₄·7H₂O 185mg，CaCl₂·2H₂O 166mg，FeSO₄·7H₂O 27.85mg，Na₂-EDTA37.25mg，MnSO₄·4H₂O 10mg，H₃BO₄ 3mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，KI0.75mg，盐酸硫胺素（VB1）10mg，盐酸吡哆醇（VB6）1mg，烟酸（VB5）1mg，肌醇100mg，水解酪蛋白(CEH)300mg，谷氨酰胺500mg，脯氨酸500mg，蔗糖30g，植物胶2.6g，定容到1L；pH调整为5.8，121℃灭菌20min。

NBco共培养基：NB基本培养基添加2,4-D 2mg/L和100μM的乙酰丁香酮（简称AS），调整pH5.5。

预筛选培养基NBps：NB基本培养基添加2,4-D 2mg/L和头孢霉素500mg/L，调整pH为5.8。

筛选培养基NBs：NB基本培养基添加2,4-D 2mg/L，头孢霉素500mg/L，Hyg30mg/L，调整pH为5.8。

MS基本培养基：取50mL MS大量元素(20×)、5mL MS微量元素(200×)、5mL铁盐(200×)、5mL MS有机成分(200×)，混匀，加蔗糖30g，用1mol/L的NaOH调pH值到5.8，固体MS再加7g琼脂粉，定容至1000mL，121℃灭菌20min；

MS大量元素(20×)(1000mL)：NH₄NO₃ 33000mg，KNO₃ 38000mg，CaCl₂·2H₂O 8800mg，MgSO₄·7H₂O 7400mg，KH₂PO₄ 3400mg；

MS微量元素(200×)(1000mL)：KI 166mg，H₃BO₃ 1240mg，MnSO₄·7H₂O 4460mg，ZnSO₄·7H₂O 1720mg，Na₂MoO₄·2H₂O 50mg，CuSO₄·2H₂O 5mg，CoCl₂·2H₂O 5mg；

铁盐(200×)(1000mL)：FeSO4·7H₂O 5560mg，Na₂·EDTA·2H₂O 7460mg；

MS有机成分(200×)(1000mL)：肌醇(Inositol)20000mg，甘氨酸(Glycine)400mg，烟酸(Nicotinic acid)100mg，盐酸硫胺素(Vitamin B₁)100mg，盐酸吡哆醇(Vitamin B₆)100mg。

预再生培养基MSpr：MS基本培养基添加NAA 1mg/L，BAP 2mg/L，头孢霉素500mg/L，Hyg 30mg/L，调整pH 5.8。

再生培养基MSr：MS基本培养基添加NAA 0.5mg/L，BAP 3mg/L，头孢霉素500mg/L，Hyg 30mg/L，调整pH 5.8。

1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2)（1000mL)：NaH₂PO₄ 38.9g、Na₂HPO₄258.12g；调pH值到7.2，ddH₂O定容至1000mL，121℃灭菌20min。

0.2mol/L NaH₂PO₄(pH7.0)(100mL)：3.12g NaH₂PO₄·2H₂O溶于灭菌ddH₂O中，定容至100mL。

0.2mol/L Na₂HPO₄(pH7.0)(100mL)：7.17g Na₂HPO₄·12H₂O溶于灭菌ddH₂O中，定容至100mL。

下述实施例中所涉及的生物材料：

农杆菌GV3101：刘福秀，赵芹，阮小蕾，何云蔚，李华平.水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子.科学通报，2008，53（1）：96-103；中国农业科学院作物科学研究所。

水稻（Kitaake，日本北海道早熟粳稻品种）：袁莉民，仇明，王朋，王志琴，杨建昌.C4转基因水稻秧苗叶片气孔和叶鞘维管束结构特征.中国农业科学，2006，39（5）：902-909；中国农业科学院作物科学研究所。

pCAMBIA-1391z载体：Enrico Scarpella,Erik J.Simons and Annemarie H.Meijer.Multiple Regulatory Elements Contribute to the Vascular-specific Expression of the RiceHD-Zip Gene Oshox1in Arabidopsis.Plant and Cell Physiology 2005 46(8):1400-1410；中国农业科学院作物科学研究所。

中国春小麦：陈锋，何中虎，陈东升，张春利，夏先春.中国春小麦籽粒硬度puroindoline基因等位变异检测.中国农业科学，2007，40（2）：217-224；中国农业科学院作物科学研究所。

实施例1、Pro-TaFRA1（TaFRA1的启动子）序列的发现

1、BAC混合池的筛选

（1）BAC混合池保存的菌种混匀后取5μL接种到LB培养基中，摇床转速220rpm、37℃培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA，根据TaFRA1基因开放阅读框设计引物进行扩增，对阳性混合池进行下一步的筛选。

（2）将阳性BAC混合池的保存菌液稀释之后，涂布在LB固体培养基表面，37℃过夜培养，然后挑取5倍于混合池中克隆数的单克隆接种于384孔板中，37℃培养过夜，培养基冷冻保存。

（3）用每块384孔板中的所有单克隆制备成混合池，接种于LB培养基中培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA，PCR检测。

（4）对上步中呈阳性克隆的混合池进行阳性单克隆筛选。将384孔板中16个横行（A-P）和24个纵列（1-24）中的克隆分别混合，共得到40个更小的克隆混合池。分别以其菌液为模板，用等位特异性PCR引物扩增，检测是否含有阳性克隆。含有阳性克隆的横行和纵列的交叉点就是可能的阳性单克隆；对384孔板中相应位置的单克隆用PCR引物加以验证。

2、BAC DNA的提取

Qiagen Large-Construct Kit提取BAC DNA。

3、测序

用BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）进行测序PCR反应，测序使用ABI3730 XL DNA Analyzer。

利用中国春BAC克隆测序，获得了小麦TaFRA1基因的启动子，命名为Pro-TaFRA1，全长3464bp（见序列表的序列1）。

实施例2、启动子的效果验证

一、启动子（Pro-TaFRA1）DNA的获得

设计一对引物如下：

根据全长Pro-TaFRA1的核苷酸序列（序列1）设计引物，并在引物两端分别加上酶切位点Sal I和EcoR I，引物序列如下：

Primer F：5’-GTCGACACCGGCTATGTTGAG-3’（下划线部分为酶切位点Sal I的识别序列，其后的序列为序列1的第470-484位）；

Primer R：5’-GAATTCGACAAGTAGAGACGGAA-3’（下划线部分为酶切位点EcoR I的识别序列，其后的序列为序列1的第2965-2981位的反向互补序列）。

提取中国春小麦的基因组DNA作为模板（也可以以人工合成的序列表中的序列1为模板），用以上引物对进行PCR扩增获得目的基因。

PCR反应体系如表1。

表1 PCR反应体系

反应程序：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，32个循环；72℃ 10min。

平末端加A反应体系如表2。

表2 加A反应体系

成分

体积（μL）

10×Buffer	2
		Mg²⁺	1.8
Taq(5U/μL)	0.16
		dNTP(25mM)	0.15
PCR产物	15
		总体积	20

反应程序：72℃ 30min。

PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后挖胶回收。用百泰克时代公司的凝胶回收试剂盒进行纯化。

将PCR纯化产物进行测序，测序结果表明PCR纯化产物的序列为“GTCGAC+序列1的第470-2981位+GAATTCA”。将该PCR纯化产物直接与pGEM-Teasy载体（Promega公司产品）相连，将得到的重组质粒命名为pGEM-Teasy-TaFRA1。

二、重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1的构建

用限制性内切酶Sal I和EcoR I酶切步骤一获得的重组质粒pGEM-Teasy-TaFRA1，将含有序列1的第470-2981位的目的片段（大小约为2512bp）与经过同样双酶切的pCAMBIA-1391z载体的骨架大片段相连，室温下连接2小时以上。连接体系为表3。

表3 连接体系

成分	体积
		T4 DNA连接酶	1μl
2×T4 DNA连接酶Buffer	2.5μl
		pCAMBIA-1391z载体的骨架大片段	1μl
目的片段	0.5μl
		总体积	5μl

连接产物热击法转化大肠杆菌（Trans-T1；货号：CD501；购自全式金生物公司北京全式金生物技术有限公司），得到重组大肠杆菌。从重组大肠杆菌单克隆中提取质粒，送样测序，将测序表明在pCAMBIA-1391z载体的酶切位点Sal I和EcoR I之间插入序列表中序列1的第470-2981位核苷酸的重组质粒命名为pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1。在重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1中，TaFRA1启动子（Pro-TaFRA1）位于GUS基因的上游，启动GUS基因的转录表达，在GUS基因下游连接有NOS转录终止子，终止GUS基因的转录表达。

三、转基因水稻的获得

1、感受态农杆菌的制备

（1）从划线平板上挑取农杆菌GV3101单克隆，接种到5mL YEB培养基中，28℃、250rpm培养过夜；

（2）按1:200的比例接种到500mL YEP液体培养基（含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平）中，培养至OD600为0.6-0.8左右；

（3）将菌液分装到预冷并灭菌的50mL离心管内，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体；

（4）弃上清，加入50mL10%（体积百分含量）甘油悬浮菌体（甘油用超纯水配制，并灭菌），4℃、4000rpm离心10min；

（5）弃上清，加入25mL10%（体积百分含量）甘油悬浮菌体，4℃、4000rpm离心10min；

（6）弃上清，加入5mL10%（体积百分含量）甘油悬浮菌体，4℃、4000rpm离心10min；

（7）弃上清，加入1mL10%（体积百分含量）甘油悬浮菌体，分装为20μL/管，液氮速冻后存于-70℃备用。

2、农杆菌的电击转化

在Gibico公司的cell Porter电击仪上进行。

（1）将步骤1制备的感受态农杆菌GV3101细胞、电击杯以及步骤二制备的重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1一起放到冰上直至感受态细胞融化；

（2）打开电击仪的开关，并在电击槽内放入冰水混合物进行预冷；

（3）将1μL步骤二制备的重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1加入已融化的盛有感受态农杆菌GV3101的离心管内，轻弹管底混匀；

（4）将已混匀的质粒和感受态农杆菌GV3101一起转移至电击杯中，注意不要有气泡，并将电击杯放到电击槽内；

（5）将电击槽与电击仪连接好，将开关拧向CHARGE，按ΜP将电压升至390伏以上，将开关转向ARM，待电压降到390伏时，按trigger键（电击参数：电容为330μF；电击速度为fast）；

（6）取出转化液，加入500μL YEP液体培养基，28℃、220rpm复苏培养3h；

（7）取3μL培养液加入适量YEP液体培养基均匀涂布在含有卡那霉素（50mg/L）和利福平的YEP固体平板上，28℃倒置培养2天。

同时，参照如上电击转化的方法设置如下对照：转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFbox2的农杆菌的对照。

其中，重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFbox2为在pCAMBIA-1391z载体的酶切位点Sal I和EcoR I之间插入序列表中序列2所示启动子片段（参见如下专利：申请号为200910237908.3，发明名称为一种诱导型启动子，授权公告号为CN102071203B）后得到的重组质粒。

电击转化后，对重组农杆菌进行序列测定，将测序表明含有序列表中序列1的第470-2981位核苷酸所示DNA片段的重组农杆菌命名为GV3101/Pro-TaFRA1；将测序表明含有序列表中序列2所示DNA片段的重组农杆菌命名为GV3101/Pro-TaFbox2。

3、转化用重组农杆菌菌液的制备

取步骤2得到的两种重组农杆菌的菌液各5μL，分别接种于两份5mL/份的YEB液体培养基（含50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平）中，28℃、250rpm培养30h。菌液按1：400转接到300mLYEB液体培养基中，28℃、250rpm培养14h至OD600 1.5-3.0。7000rpm、4℃离心15min收集菌液，重悬菌体于2倍体积的转化渗透液（1/2MS+2%Sucrose，6-BA：0.01mg/L，VB1：10mg/L，VB6：1mg/L，Silwet L-77：0.02%）。

4、转基因水稻的获得

（1）成熟水稻(Kitaake)种子用70%（体积百分含量）乙醇进行表面消毒1min后，用20%（体积百分含量）次氯酸钠（滴加一滴Tween-20）消毒20min，无菌水冲洗4-5次，于滤纸上吸干，种子的胚朝上置于NB固体培养基上，26℃、16h/8h光周期下培养，诱导愈伤组织。

（2）10-15d后，剥下成熟胚盾片处长出的愈伤组织，转入新的NB固体培养基在相同的条件下继代培养。3-4cm大小的愈伤组织即可用于侵染转化。

（3）将步骤3所得的两种重组农杆菌菌液分别均匀涂在固体YEP平板（含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平）上28℃黑暗培养2-3d，用无菌药匙从平板上刮菌于液体共培养培养基AAM（含100μM乙酰丁香酮，简称AS）中，调整菌液浓度至OD600为0.2-0.5，得到两种重组农杆菌悬浮液。

（4）将步骤（2）的胚性愈伤组织放入步骤（3）的两种重组农杆菌悬浮液中浸没，不时轻轻摇动15min。倾除菌液，将水稻愈伤组织用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，置于NBco共培养基上，28℃、黑暗共培养2-3d。

（5）共培养2-3d的愈伤组织用无菌水洗两次，用含有500mg/L的头孢霉素（cef）的水清洗15min，再用水冲洗一次，将愈伤组织吹干水分，转到含潮霉素的预筛选培养基NBps上，26℃暗培养。

（6）培养7d后转入含潮霉素的筛选培养基NBs，诱导抗性愈伤组织2-3次。待抗性愈伤组织长到一定大小后，挑选色泽金黄、质地紧凑的抗性愈伤组织转入预再生培养基MSpr，将来源相同的抗性愈伤组织移至培养基的同一区域，作为同一株系，26℃光照培养。

（7）7d后转入再生培养基MSr，直到出绿、分化出芽。长出的小苗到3-4cm后，移至生根培养基1/2MS的试管中，生根培养。生根培养2+3周，待小苗长出粗壮的根系后可移至温室培养。培养一段时间后即可移栽大田收获种子，得到T1代种子。

5、转基因水稻的鉴定

将步骤4得到的T1代转基因水稻（转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1、转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFbox2）进行PCR鉴定和Southern鉴定。

（1）PCR鉴定

以步骤4得到的T1代转基因水稻的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。对于转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1的T1代转基因水稻，采用引物Pro-TaFRA1 F和Pro-TaFRA1 R进行PCR扩增；对于转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFbox2的T1代转基因水稻，采用引物Pro-TaFbox2 F和Pro-TaFbox2 R进行PCR扩增。

Pro-TaFRA1 F：5’-GTCGACACCGGCTATGTTGAG-3’（下划线部分为酶切位点Sal I的识别序列，其后的序列为序列1的第470-484位）；

Pro-TaFRA1 R：5’-GAATTCGACAAGTAGAGACGGAA-3’（下划线部分为酶切位点EcoR I的识别序列，其后的序列为序列1的第2965-2981位的反向互补序列）。

Pro-TaFbox2 F：5’-GTCGACGACTGCGAGTTGCTG-3’（下划线部分为酶切位点Sal I的识别序列，其后的序列为序列2的第1-15位）；

Pro-TaFbox2 R：5’-GAATTCGACAAGTTGAGAAGGAA-3’（下划线部分为酶切位点EcoR I的识别序列，其后的序列为序列2的第3060-3076位的反向互补序列）。

转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1的T1代转基因水稻的PCR检测结果见图1中A，图中扩增得到大小约为2512bp目的条带的植株为鉴定阳性的植株。转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFbox2的T1代转基因水稻的PCR检测结果见图1中B，图中扩增得到大小约为3076bp目的条带的植株为鉴定阳性的植株。

（2）Southern鉴定

以步骤4得到的两种T1代转基因水稻（转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFRA1、转入重组表达载体pCAMBIA-1391z/Pro-TaFbox2），以及野生型水稻Kitaake（阴性对照）为实验材料，进行Southern鉴定，具体操作如下：

第一步：DNA提取

1）采集5g鲜嫩的转基因水稻的不同株系和野生型水稻（阴性对照）幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。

2）将研磨好的样品转移到预冷的50mL离心管中，加入20mL预热的S buffer，颠倒混匀。

其中，S Buffer成分如下：100mM Tris·Cl（pH8.5）、100mM NaCl、50mM EDTA（pH8.0）、2％（2g/100mL）SDS，各浓度为相应组分在溶液中的终浓度。

3）于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。

4）加入20mL（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状。

5）用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20min。

6）加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。

7）转移上清到1个灭菌的50mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，2000rpm离心1min沉淀DNA。

8）用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在2mL1×TE中。

9）待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。

10）DNA样品可以放在4℃保存备用。

第二步：基因组DNA的酶切

1）取DNA的量在5μg左右，用Hind III（NEB）进行酶切。

反应混合液（20μL）：DNA 5μg，10×Buffer 2μL，Hind III 3μL）

2）37℃酶切过夜酶切。

3）酶切完成后，加入上样缓冲液中止反应（5μL loading buffer/30μL reaction mix）。

4）短暂离心后上样电泳。

第三步：琼脂糖凝胶电泳

1）配制0.8%的琼脂糖凝胶。

2）加入样品，在室温下以25V电压（稳压）电泳过夜。

3）当跑在最前端的溴酚兰指示剂移动到15cm时，终止电泳。

4）将凝胶转移到加有EB的浅盘中，染色10-15min。

5）用蒸馏水漂洗1-2次。

6）用凝胶成像系统中检测电泳和酶切结果（图2中A和B的左图）。

第四步：转膜

1）根据检测结果对凝胶进行修整，用刀片切去点样孔和泳道周围的空白区域。

2）将凝胶转移到盛有0.25N HC1溶液的浅盘中，在水平摇床上轻轻震荡15min。

3）倒掉HCl，用清水清洗一次，然后加入少量0.4N NaOH以中和过量的HCl。

4）将3张3MM Whatman滤纸（18×27cm）叠在一起作盐桥，另剪3张3MM滤纸（与尼龙膜大小一致）备用。

5）向一个水平放置的浅盘中加入适量0.4N NaOH，然后在浅盘上架一块玻璃板，用浅盘中0.4N NaOH将盐桥浸湿，再将其平铺在玻璃板上（盐桥两端浸在NaOH溶液中），用玻璃棒赶出盐桥（滤纸）下的气泡。

6）将凝胶倒扣在盐桥上（正面向下），用玻璃棒赶出凝胶下的气泡。

7）用0.4M NaOH将Hybond-N+尼龙膜（Amersham）浸湿，然后平铺在凝胶上，赶出尼龙膜下的气泡。

8）先将1张用0.4M NaOH浸湿的3MM滤纸(与尼龙膜大小一致)平铺在尼龙膜上，接着再放上2张同样大小的滤纸。

9）在滤纸上放上纸塔（吸水纸），再在纸塔上放置一个petri-dish，最后在petri-dish上压一个重约500g重物压，转膜过夜。

10）移去纸塔和尼龙膜上滤纸，将尼龙膜放在2×SSC中漂洗2-3min，以中和膜上的NaOH，用滤纸将尼龙膜吸干，用铅笔做上标记，最后用保鲜膜将转好的膜包好，放在冰箱中保存备用。

第五步：探针的制备

1）以GUS基因为探针，利用引物（HPT-F：5’-AGGGCGAAGAATCTCGTGCT-3’；HPT-R：5’-AACCCGCTCGTCTGGCTAAG-3’）进行扩增，PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后将片段挖胶经回收试剂盒（天根生物公司）进行纯化备用。

2）将25ng上述回收的GUS探针及10ng marker DNA。

3）实验前20min将同位素从冰箱中取出放在室温下解冻。

4）向0.5mL离心管中加入25ng探针，用水补足到15μL，在沸腾的水浴锅中煮沸7min，取出后迅速放在冰上，待完全冷却后短暂离心。

5）向1.5mL Eppendorf管中加入5μL OLB（Oligolabelling buffer），2μL BSA（Bovineserum albumin）。

6）将变性后的探针加入到1.5mL管中，然后加入2μL Klenow酶（DNA PolymeraseI）（1U/μL），离心混匀；

7）加入2μL 3000Ci/mmole 32P-dCTP，吹打混匀，最好短暂离心混匀。

8）室温下放在铅瓶中反应5h，或在37℃的杂交炉中反应1-2h。

第六步：预杂交

1）用2×SSC将尼龙膜浸湿。

2）将尼龙膜放在塑料盒中或杂交管中。

3）配制预杂交缓冲液：H₂O 7mL，5×HSB 2mL，Denhart’s III 10mL

将预杂交液放在65℃预热使之变清澈，然后加入刚刚煮沸变性的carrier DNA（封阻DNA）混匀（100μL/10mL预杂交液）。

4）倒掉多余的SSC，将配好的杂交缓冲液倒入杂交管或杂交盒中。

5）将盒子或杂交管放在65℃杂交炉中温育，预杂交至少保证2h。

第七步：杂交

1）用1×TE将标记好的探针稀释到50μL，加入5μL（1/10终体积）3M NaOH，离心混匀，变性5min。

2）将变性的探针加入到杂交盒中，重新盖好。

3）放在65℃的杂交炉中杂交过夜。

第八步：洗膜

1）将杂交膜转移到塑料盒中，用少量冷洗液I漂洗一次，以除去过量的杂交液。

2）在65℃的杂交炉中用65℃的洗液I清洗2次，每次15min。

3）如果膜上的杂交信号很强，可用洗液II清洗，每次漂洗时要调换膜的顺序，以使每张膜漂洗得一致。

4）用滤纸将杂交膜上的洗液吸干，然后用保鲜膜包好（尽可能除去保鲜膜内的空气）。

第九步：杂交结果检测（用磷屏仪，Bio-Rad）

1）将杂交膜放在磷屏夹中，然后压上磷屏。

2）根据信号的强弱，选择适当的时间，按磷屏仪操作步骤扫屏（图2中A和B的右图）。

第十步：结果分析

图中有条带的为获得的阳性株系（条带的多少为插入基因的拷贝数，后续分析选择单拷贝插入的转基因株系），没有条带的为阴性植株。

附录：

1）20×SSC

5L：将877g NaCl，441g柠檬酸三钠溶解在4L蒸馏水中，补足体积到5L。

SSC SDS

洗液I 2× 0.5%

洗液II 0.2× 0.5%

洗液III 0.1× 0.5%

2）4M NaOH

5L：将800g NaOH慢慢加入到在4L蒸馏水中，待溶解后，补足体积到5L。

3）2.5M HC1

2L：将430mL浓HC1(d=1.18)加入到1L H₂O中，补足体积到2L。

4）100×TE

将121.1g Tris，37.2g Na₂-EDTA·2H₂O加入到800mL H₂O中，用浓HC1调到需要的pH，补足体积到1L，高压灭菌。

5）0.5M EDTA pH8.

将186.1g Na₂-EDTA·2H₂O溶解在800mL H₂O中，用固体NaOH将pH调到8.0，补足体积到1L，高压灭菌。

6）1M Tris·C1

1L：将121.1g Tris加入到800mL H₂O中，用浓HC1将pH调到8.0，补足体积到1L，高压灭菌。

7）20%SDS

2L：慢慢地将400g SDS加入到2L热水中，待其溶解后保存在较温暖的地方。

8）50×TAE

将242g Tris溶解在500mL H₂O中，加入100mL 0.5M EDTA（pH8.0），57.1mL乙酸，补足体积到。

9）Loading Buffer

40mL：将0.1g溴酚兰，10g Ficoll-400，8mL 0.5M EDTA，2mL20%SDS和30mL H₂O混合。

10）5M NaC1

在750mL H₂O中加入292.2g NaCl，溶解后补足体积到1L，高压灭菌。

13）Denhardt′s III

100mL：将2g gelatin(BDH 44045)，2g FicoU-400(SIGMA F-4375)，2g PVP-360(SIGMA PVP-360)，10g SDS和5g焦磷酸钠（Na₄P₂O·10H₂O），加入到100mL H₂O中，于65℃溶解，保存在较温暖的地方。

14）5×HSB

1L：将175.3g NaCl，30.3g PIPES（SIGMA P-6757）和7.45g Na₂.EDTA·2H₂O溶解在800mL H₂O中，用4M的NaOH将pH调到6.8，补足体积到1L，高压灭菌。

15）Carrier DNA（封阻DNA）

将5g鲑精DNA（Sigma）溶解在50mL水中，高压灭菌，然后分装在1.5mL的离心管中，冷冻保存。

16）3M Sodium acetate pH 5.2

1L：向600mL H₂O中加入408.24g乙酸钠（NaAC·3H₂O），待其溶解后，用乙酸将pH调到5.2，补足体积到1L，高压灭菌。

17）1M MgCl₂

100mL：向60mL H₂O加入20.3MgCl₂·6H₂O，待溶解后补足体积到100mL，过滤灭菌。

18）Solution O：1.25Tris·Cl(pH8.0)，0.125M MgCl₂

19）Solution A

Solution O 1mL

β巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）18μL

dATP(100mM，Promega)5μL，

dGTP(100mM，Promega)5μL，

dTTP(100mM，Promega)5μL。

20）Solution B

2M HEPES(pH6.6,Amresco)

21）Solution C

将6碱基随机引物溶解在1×TE中，终浓度为3mg/mL。

22）5×OLB

Solution A：Solution B：Solution C=100：250：150（体积比）

四、Pro-TaFRA1启动子诱导表达活性分析

将经以上步骤三5鉴定阳性的两种T1代转基因水稻的种子（同时设置未转基因的水稻Kitaake作为野生型对照）浸泡过夜，然后转入铺有滤纸的培养皿中，待幼苗长至5cm时，转入盛有Hoagland营养液的塑料盒中培养。当幼苗长至两叶一心时，分别进行盐胁迫处理、干旱胁迫处理和低温胁迫处理，处理时间为0h、0.5h、3h、6h、12h、24h、48h。然后提取所取材料的RNA采用Real-time方法进行Pro-TaFRA1启动子诱导表达活性分析。

盐胁迫处理：将幼苗根部浸在含有250mM NaCl的水溶液中，25℃培养。

干旱胁迫处理：将幼苗根部浸在含有16%（质量百分含量）PEG6000的水溶液中，25℃培养。

低温胁迫处理：将幼苗放置在4℃人工气候箱中培养。

ABA胁迫处理：将幼苗放置在浓度为100μmol/L的ABA水溶液中培养。

1、总RNA的提取

（1）RNA的提取采用Trizol法进行，提取过程中所用的移液器吸头及离心管等使用前需用0.1%DEPC水浸泡过夜，然后高压蒸汽灭菌45min，烘干备用。具体程序如下：取0.1g左右水稻材料（幼苗根部），在处理过的研钵中用液氮浸没材料并充分研磨，转入1.5mL离心管，加入1mL Trizol（用前摇匀），迅速充分混匀；

（2）将样品在室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离，4℃12,000×g离心10min；

（3）将上清液转入一新离心管，加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min，4℃12,000×g离心10min；

（4）将上清移至一新离心管中，加入0.7×体积的异丙醇（提取种子RNA时用2×体积的75%乙醇），混匀后室温静置10min，4℃ 12,000×g离心10min；

（5）倒掉液相，加入1mL用DEPC水配制的75%乙醇，4℃ 7,500×g离心3min，弃上清；

（6）重复步骤（5），干燥后，加入适量DEPC水溶解；

（7）经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用Bio-Rad公司的紫外分光计测定RNA的浓度；

（8）RNA放置于-80℃超低温冰箱保存。

2、实时荧光定量PCR检测GUS基因在转基因水稻中的相对表达量

（1）引物设计

由于实时荧光定量PCR具有灵敏度高的特点，为了结果可靠性其对引物设计有特殊的要求。产物长度在150～250bp之间，而且引物之间不能出现引物二聚体，以避免非特异性扩增对结果真实性的干扰。根据GeneBank中注册的pCAMBIA-1391z载体序列（GeneBank中登录号AF234312.1）和内参基因Actin（GeneBank中登录号X16280）序列，按照实时荧光定量PCR对引物设计的特殊要求，利用Primer primer 5.0软件设计引物。GUS基因的正向引物为5′-ACGCTCACACCGATACCAT-3′，反向引物为5′-ATACCTGTTCACCGACGACG-3′，预期产物长度为297bp；Actin的正向引物为5′-TCAACCCAAGGCCAATC-3′，反向引物为5′-CACCATCACCAGAGTCCAACA-3′，预期产物长度为196bp。

（2）总RNA中DNA的处理

实验步骤参照Fermentas公司提供的DNA消化试剂盒说明书进行，操作如下：

①在微量离心管中配置表4中反应液；

②37℃反应30min；

③加入1μL 50mM的EDTA，65℃处理10min。

表4 DNA酶消化反应混合液

成分	体积
		总RNA	1μg
10×reaction Buffer with MgCl₂	1μL
		DNaseI，RNase-free	1μL
总体积	10μL

（3）cDNA第一链的合成

以经过DNA酶处理过的总RNA为模板，采用Invitrogen公司的M-MLV ReverseTranscriptase合成cDNA第一链的操作步骤进行cDNA第一链的合成。反应总体积为20μL，具体操作方法如下：

①将表5中所列试剂加入无RNA酶离心管中，65℃恒温5min后，迅速置于冰上；

表5 cDNA合成反应混合液1

成分	体积
		Oligo(dT)18(500ng/μL)	1μL
总RNA	1～5μg
		10mM dNTP Mix	1μL
总体积	12μL

②将上述混合液离心（充分混合并防止沾到管壁上，瞬时离心即可）后，每管加入如下溶液（表6），轻轻混匀，37℃恒温2min；

表6 cDNA合成反应混合液2

成分	体积
		5×first strand Buffer	4μL
0.1M DTT	2μL
		RNaseOUT^TM	1μL
总体积	7μL

③加入1μL M-MLV反转录酶（200U/μL），用枪头反复吹吸混匀，37℃恒温50min；

④70℃15min终止反应。

（4）Real-time PCR

按照Takara公司的实时荧光定量PCR试剂盒中提供的方法，以经过反转录的cDNA样品为模板，用GUS基因引物和Actin内参基因引物进行实时荧光定量PCR反应。反应在ABI7300 Real-time PCR仪上进行，每一个反应设置3次重复。按照表7配置各PCR混合液。

反应程序为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃复性31sec，40个循环；每个循环中60℃处收集荧光信号，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物溶解曲线分析。为了排除RNA中可能残留的DNA对结果可信度的影响，用RNA和水空白同时当做阴性对照。

表7 实时荧光定量PCR反应体系（20μL）

数据处理：按照Livak et al.（2001）对实时荧光定量PCR数据处理方法的探究，采取2^-△△Ct法计算目标基因的相对表达量。Ct值是通过7000System SDS Version 1.3.2软件在PCR的荧光阈值通过手工设定为0.2时产生的，并将3-15个循环设置为本底，将数据输出到Excel软件进行分析。△△Ct=(C_t,Target-C_t,actin)_timex-(C_t,Target-C_t,actin)_time0。其中公式中的Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Time x代表不同的处理时间，Time0代表处理的零点。

结果如图3所示：在非生物胁迫条件下，两个启动子（Pro-TaFRA1和Pro-TaFbox2）均具有诱导反应，但Pro-TaFRA1驱动的GUS基因表达量比Pro-TaFbox2整体反应水平较高，而且表现为早期表达启动子。另外，未转基因的野生型对照水稻Kitaake，无GUS基因的表达。

Claims

1.DNA分子，为如下1)或2)：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的第470-2981位所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。

3.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。

4.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。

5.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pCAMBIA-1391z载体的Sal I和EcoR I之间插入序列表中序列1的第470-2981位所示的DNA分子后得到的重组质粒。

6.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

7.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因在单子叶植物中表达中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述启动目的基因在单子叶植物中表达，为在逆境胁迫条件下启动目的基因在单子叶植物中表达；

所述逆境胁迫为如下中的至少一种：盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫、ABA胁迫。

9.利用权利要求1所述的DNA分子培育转基因单子叶植物的方法，包括如下步骤：

1)构建目的基因重组表达载体：将目的基因插入权利要求2或5所述重组载体，使权利要求1所述的DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；

2)将步骤1)构建的目的基因重组表达载体导入目的单子叶植物中，得到表达所述目的基因的转基因单子叶植物。