CN105018493B - 水稻OsAHL1基因的启动子及包含其的重组载体、转化体以及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从水稻DNA片断中分离克隆的启动子OsAHL1‑p，该启动子驱动OsAHL1基因表达。启动子OsAHL1‑p能响应水分胁迫，与水稻抗非生物逆境相关，该启动子主要在水稻根组织，以及个器官维管束组织中特异驱动基因表达，具有一定的组织特异性，本发明的水稻启动子可驱动基因组织特异性表达及改变所启动基因在干旱胁迫下的表达量。

Description

水稻OsAHL1基因的启动子及包含其的重组载体、转化体以及 其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及水稻OsAHL1基因的启动子OsAHL1-p及包含其的重组载体、转化体以及其应用，利用此启动子OsAHL1-p可诱导基因组织特异性表达及改变所启动基因在环境胁迫下的表达量。

背景技术

水稻是农业生产中用水最多的作物，其节水抗旱性对我国的粮食、水和生态安全具有重要意义。利用基因工程这一分子育种技术，将抗旱基因转入当前广泛应用的优良水稻品种中，从而改良其抗旱性，培育即抗旱又高产优质的农作物新品种是抗旱育种的有效途径之一。

发掘抗旱基因是抗旱分子育种的基础。已发表的抗旱相关基因及其蛋白的研究越来越多。广义上的反式转录调节因子包括所有具有调节基因转录功能的蛋白分子，在植物生长和抗逆性方面都发挥了巨大的作用。

OsAHL1是水稻中干旱响应相关基因，其表达受到干旱、高盐以及低温等非生物胁迫的诱导，与非生物胁迫密切相关。关于OsAHL1基因启动子序列的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供OsAHL1基因的启动子OsAHL1-p。本发明的启动子OsAHL1-p克隆自水稻第11染色体。结合GFP观测及qRT-PCR结果可知，OsAHL1-p可驱动下游基因在水稻中表达，具有启动子活性。主要在水稻根组织以及维管束组织中驱动基因表达，具有一定的组织特异性，且对干旱等非生物逆境胁迫以及ABA等植物激素有响应。

发明人从水稻中分离克隆了OsAHL1基因起始密码子的上游调控区，获得1686bp序列，并命名为启动子OsAHL1-p。

对于从水稻中分离克隆的OsAHL1基因的上游调控区的启动子OsAHL1-p，通过Plant-CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析可知，该启动子中存在多个抗逆相关的顺式作用元件，如ABRE(脱落酸响应顺式作用元件，cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness)，MBS(干旱诱导的MYB结合位点，MYB binding site involved in drought-inducibility)，TCA-element(响应水杨酸反应的顺式作用元件，cis-acting element involved in salicylic acidresponsiveness)，TGACG-motif(茉莉酸甲酯响应顺式作用元件，cis-acting regulatoryelement involved in the MeJA-responsiveness)，这些保守序列的存在预示着该启动子与植物的抗逆性存在密切关系。

本发明采用的技术方案是，提供一种水稻OsAHL1基因的启动子OsAHL1-p，所述启动子OsAHL1-p序列表具有下列核苷酸序列之一：

SEQ ID NO:1中所示的DNA序列；

或与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列；

或功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

本发明还提供一种包含上述启动子OsAHL1-p的重组载体，构建所述重组载选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体，例如所述表达的载体可以为Ti质粒或植物病毒载体。

本发明还提供一种包含启动子OsAHL1-p的转化体，所述转化体的宿主可以为植物，例如所述植物可以为水稻。

本发明还提供上述启动子OsAHL1-p在水稻旱胁迫中的应用。其可以采用下述操作步骤：a)、将所述的启动子驱动目的基因导入水稻细胞、组织或器官；b)、再将转化后的水稻细胞、组织或器官培育成植株，得到驱动目的基因响应干旱胁迫的转基因植物，

本发明还提供权利要求1所述启动子OsAHL1-p在驱动水稻基因特异表达中的应用。其可以采用下述操作步骤：a)、将所述的启动子驱动目的基因导入水稻细胞、组织或器官；b)、再将转化后的水稻细胞、组织或器官培育成植株，得到驱动目的基因在特定的组织部位表达的转基因植株。

实现上述技术方案采用的方法是，采用已克隆的OsAHL1-p启动子为探针，从基因组文库中筛选得到本发明的启动子片段或其同源序列。也可以采用PCR技术，从基因组中扩增得到本发明的OsAHL1-p启动子片段以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsAHL1-p启动子的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得在根、茎、叶等器官中特异表达且对逆境响应的转基因植株。

本发明的技术效果是：本发明的OsAHL1-p启动子主要在水稻根，以及根、茎、叶等器官的维管束组织中驱动基因表达，因此以本发明OsAHL1-p启动子与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可启动其下游基因主要在水稻根以及成熟的根、茎、叶等器官的维管束组织特异表达。

本发明的OsAHL1-p启动子可响应干旱高盐、低温等非生物逆境胁迫，以及ABA、H₂O₂、JA、SA等植物激素，驱动下游基因表达。因此以本发明OsAHL1-p启动子与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可使其下游基因在干旱、高盐、低温等非生物逆境胁迫以及ABA、H₂O₂、JA、SA等植物激素处理下的增强表达。

本发明采用的技术方案可以用于利用此序列遗传转化获得转基因植物，及提供该启动子序列差异对此基因表达的影响。

由于此启动子能诱导基因对非生物逆境胁迫响应，因此可应用于植物抗逆育种，达到提高植物的抗逆性的目的。

附图说明

图1水稻苗期OsAHL1-p启动子在自然干旱以及模拟渗透胁迫下对下游基因启动表达的分析；

图2为本发明水稻OsAHL1-p启动子对与逆境胁迫相关的植物激素的响应并调控下游基因表达的分析；

图3为本发明水稻的OsAHL1-p启动子驱动下游GFP报告基因表达情况的观测结果。

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1-OsAHL1启动子启动水稻内源OsAHL1基因响应逆境的分析

1.实验材料及处理

本实验以粳型旱稻品种IRAT109(Oryza sativa L.ssp.Japonica，国外引进的旱稻品种，上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存)为基因表达量分析的实验材料。挑选饱满的IRAT109水稻种子，1％次氯酸钠消毒后，4℃条件下清水浸泡24小时。然后转入35-38℃环境里破胸20小时，待露白后置25-28℃环境下催芽至半粒谷长，胚根为谷粒长。

(1)自然干旱处理。选择Wagner`s规格(1/5000a)大小的塑料小桶，采用穴播的方式，每个小桶种16株。正常条件下生长至五叶一心时进行旱处理，分别在旱处理前、旱处理后3d、5d、7d、9d、11d和复水后1h、3h、6h、12h、24h、48h取样。取样时，只选择倒数第二片叶片，用于总RNA的提取。

(2)模拟渗透胁迫：IRAT109种子催芽后，在发芽盒内水培生长。三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)，至幼苗长至30天开始处理。分别以4℃低温、聚乙二醇(PEG600)溶液(100mM，200mM，500mM)以及盐(NaCl)溶液(100mM，250mM，500mM)处理，模拟水分胁迫条件。每种处理设1h和2h两个时间梯度。同时设有正常水管理对照。处理结束后，快速吸干根表面水分并分别剪取叶片和根，投入液氮冷冻后-80℃保存用于RNA提取。

(3)苗期激素与化学试剂处理：IRAT109种子催芽后，在发芽盒内水培生长。三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)，至幼苗长至30天开始处理。分别以ABA(50uM，150uM)、JA(50uM，150uM)、SA(0.5mM，1.5mM)、H₂O₂(100mM，200mM)处理，每种处理设1h和2h两个时间梯度。同时设有正常水管理对照。处理结束后，快速吸干根表面水分并分别剪取叶片和根，投入液氮冷冻后-80℃保存用于RNA提取。

2.RNA提取与第一链cDNA合成

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mlTRNzol-A⁺试剂(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μl RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

反转录之前需用DNaseI消化所提取样品，反应体系如下：

试剂名称	使用量(μl)
		RNA	5(总量约1μg)
10×DNaseI Buffer	1
		DNaseI(5U/μl)	0.2

DEPC H2O

Up to 10μl

37℃反应15min后，加入0.25μl 0.1M EDTA(保证终浓度>2mM)，70℃温育10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：(1)DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μl的反应体系：

(2)将上反应体系于42℃温育15min；

(3)然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；

(4)4℃或冰上放置5min。

制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。

3.定量PCR分析

基因表达的定量分析使用Takara公司的 Premix Ex Taq^TM(Perfect RealTime)试剂盒，和美国ABI 7000定量PCR仪进行。根据osa-miR171a前体序列设计定量引物。以水稻持家基因actin2为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。所用基因定量引物为qAHL1-1:5’-CTGGTGGGCTCAGTGTATCG-3’和

qAHL1-2:5’-GCCATAGGCGGTGGTAGTG-3’，内参基因定量引物为

Actin2F:5’-TTCCTCATGCCATCCTGCGTCTG-3’和

Actin2R:5’-GTCCCTTACAATTTCCCGTTCAGC-3’。

20μl反应体系的配制：

试剂名称	使用量(μl)
		SYBR Premix Ex TaqTM(2x)	10
qAHL1-1(10μM)	0.5
		qAHL1-2(10μM)	0.5
cDNA	0.5

Rox	0.4
		ddH2O	8.1

反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设DissociationStage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^-ΔΔCT法进行结果分析，做出目的基因的相对表达量柱状图。

在各种激素、盐、渗透胁迫和低温(4℃)处理的样品中，OsAHL基因在根、叶中都有表达。不同浓度的ABA、H₂O₂、NaCl、SA、JA、甘露醇处理以及低温(4℃)均提高了OsAHL基因在水稻叶片中的表达。

OsAHL基因在根中对各种处理的响应表达情况不一，在不同浓度的ABA、H₂O₂、NaCl、甘露醇和低温(4℃)等处理下，OsAHL基因在根中的表达被诱导升高，其促进作用随浓度升高与处理时间延长而加强。

图1为水稻IRAT109苗期在不同逆境胁迫处理下OsAHL相对表达量变化，其是以三叶期的水稻IRAT109为实验材料，分别在(A)4℃冷处理，(B)不同浓度的甘露醇，以及(C)不同浓度的NaCl等逆境下，OsAHL相对表达量明显提高。误差线表示3次生物学重复的标准误。

图2为水稻IRAT109苗期在不同激素处理下OsAHL相对表达量变化，其是以三叶期的水稻IRAT109为实验材料，分别使用浓度的激素，处理不同的时间。具体激素为：(A)ABA；(B)H₂O₂；(C)JA；(D)SA。误差线表示3次生物重复的标准误。

定量分析结果显示，该启动子响应非生物逆境胁迫，在干旱、低温、及高盐胁迫下(图1)，操控基因上调表达。在水稻苗期、分蘖期和幼穗分化期均对干旱胁迫有响应，高效调控下游基因的表达。图1为模拟渗透胁迫及不同生育期自然干旱条件下AHL-p诱导下游基因表达量变化，其是以水稻品种IRAT109为实验材料，同时期正常水分下植株为对照(n＝3)。误差线表示3次生物重复的标准误。

同样该启动子响应脱落酸(ABA)、过氧化氢(H₂O₂)、茉莉酸(JA)以及水杨酸(SA)等多种激素而调控下游基因增强表达(图2)。图2为水稻IRAT109苗期在不同激素处理下OsAHL相对表达量变化，其是以三叶期的水稻IRAT109为实验材料，分别使用浓度的激素，处理不同的时间。具体激素为：(A)ABA；(B)H2O2；(C)JA；(D)SA。误差线表示3次生物重复的标准误。

实施例2-OsAHL-p序列顺式元件分析。

利用已有数据库分析OsAHL-p启动子，即基因组DNA中基因翻译起始位点(ATG)上游约1500bp长的序列，在植物启动子顺式原件数据库(Plant Cis-acting Regulatory DNAElements,PLACE；http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)搜索其包含的顺式元件，结果见表1。由表1中可以看出，AHL-p包含19个基本的启动子核心顺式元件，可以起到基本的启动下游基因转录的功能。另含有54个非生物逆境胁迫相关元件和74个其它顺式元件构成，则与响应水稻内外环有关。其中包括，ABA、生长素、GA等激素响应因子，以及脱水、光照等环境因素响应因子。更重要的是，这些顺式元件中包含了14个Dof蛋白以及17个叶肉细胞发育相关蛋白结合元件，由此可以初步推测，可能影响到AHL-p下游基因表达的环境因素包括，干旱及盐胁迫等水分胁迫，ABA、生长素及赤霉素刺激，光照及光合色素变化等。

表1.启动子AHL-p(下有基因转录起始起始密码子始至上游1500bp序列)分析。

^a该顺式元件的诱导因子或表达特性。

实施例3-水稻OsAHL1基因启动子OsAHL1-p分离及克隆

1.幼苗培育

将水稻IRAT109的种子置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA。

2.水稻OsAHL1基因启动子OsAHL1-p序列的克隆

首先，在GRAMENE网站中(http://www.gramene.org/)下载得到OsAHL1基因转录起始密码子上游2000bp以及下游200bp的序列，根据预测信息设计上下游引物：P1：(ACCGTTCTATCTTCTTCC)和P2(5’-TTGCTTGGAGCTCAAAC-3’)，从IRAT109基因组DNA中扩增获得1686bp的片段，将此片段连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI 3730测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。测序结果经BLAST比对确认。具体操作步骤如下：

(1)用IRAT109的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系(50μl)及条件如下：

10×Buffer	5μl
		dNTP(2mM)	4μl
Ex Taq(5u/μl)	0.4μl
		DNA模板	1μl
P1(10mM)	1μl
		P2(10mM)	1μl

ddH2O

Up to 50μl

反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35cycles；72℃5min；4℃HOLD。

(2)回收(TianGen普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)

a.柱的平衡：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

b.将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管；

c.向胶块中加入500μl溶胶液PN，50℃水浴至胶块完全溶解；

d.将溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

e.向吸附柱CA2中加入500μl漂洗液PW，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

f.重复步骤5；

g.12,000r/min离心2min，尽量除去漂洗液，打开吸附柱CA2的盖子，室温放置几分钟，使漂洗液中的酒精挥发干；

h.将吸附柱CA2放到干净的离心管中，向吸附膜中间悬空滴加40μl洗脱缓冲液EB或是ddH₂O，室温放置2min，12,000r/min离心30s，把溶液吸回吸附柱，再12,000r/min离心2min收集DNA溶液；

i.回收的DNA溶液-20℃保存备用。

(3)连接

混匀后16℃连接过夜，取5μl进行转化。

(4)转化

a.取预备好的100μl感受态细胞，加入5μl连接液，混匀，冰浴30min；

b.42℃热激，90s，迅速置冰上3-5min；

c.加800μl LB液体培养液(无抗生素)，混匀，37℃，80-120r/min培养1h复苏；

d.5000r/min离心5min，倒掉多余上清，保留100μl，重悬菌体；

e.把菌液在加了相应抗生素的LB固体培养基平板上涂板，37℃倒置培养过夜(12-16h)。

实施例4-水稻OsAHL1基因启动子OsAHL1-p驱动GFP报告基因植物表达载体的构建

以实施例3中已获得的阳性克隆为模板，用加了HindIII酶切位点的引物5’-aagcttACCGTTCTATCTTCTTCC-3’和加了BamHI酶切位点的引物5’-cctaggTTGCTTGGAGCTCAAAC-3’再进行一轮PCR扩增，回收纯化目的片段后，导入大肠杆菌，然后挑取阳性克隆扩繁，并提取质粒，经酶切后连入载体pCAMBIA1300G(由pCAMBIA1300载体多克隆位点后插入GFP蛋白编码序列而来)，构建出能够在植物中由OsAHL1基因启动子启动表达GFP蛋白的转化载体。具体操作步骤如下：

1.PCR、回收、转化同实施例3。

2.测序正确的单克隆提取质粒(TianGen普通质粒小提试剂盒)。

(1)柱的平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12,000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(2)把过夜培养的菌液12,000r/min离心5min，倒掉上清；

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，悬浮菌体；

(4)向离心管加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解(不要太剧烈，以免打断基因组DNA，而使质粒不纯，时间不应超过5min)，此时菌液变得清亮粘稠；

(5)向离心管加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次使菌体充分混匀，此时会出现白色沉淀；

(6)12,000r/min离心5min，把上清转到吸附柱CP3，尽量不要吸出沉淀，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(7)向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液PW，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(8)重复步骤7；

(9)12,000r/min离心2min，尽量除去漂洗液，打开吸附柱CP3的盖子，室温放置几分钟，使漂洗液中的酒精挥发干；

(10)将吸附柱CP3放到干净的离心管中，向吸附膜中间悬空滴加50μl洗脱缓冲液EB或是ddH2O，室温放置2min，12,000r/min离心30s，把溶液吸回吸附柱，再12,000r/min离心2min收集质粒溶液；

(11)回收的质粒溶液-20℃保存备用。

3.用HindIII/BamHI分别双酶切上一步回收的质粒及载体pCAMBIA1300G质粒，酶切体系如下：

混匀后37℃酶切3-6个小时，进行琼脂糖电泳检测，回收目的片段；载体酶切后高温变性，不需要回收。

4.酶切后的目的片段与载体pCAMBIA1300G连接，并转入E.coli DH5α挑菌落，通过PCR鉴定阳性，取阳性菌液扩繁并提取质粒(同实施例3)。

实施例5-农杆菌转化

1.根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600＝0.5时，4℃离心收集菌体，用500ul、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30min后离心，去上清，用100ul，0.1mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

2.农杆菌转化(冻融法)：

(1)向感受态农杆菌(100ul)中加入5ul植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；

(2)取出，加入400～800ul YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200r/min振荡培养3-5h；

(3)室温离心(5000r/min，5min)，保留100ul上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落。

(4)挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

实施例6-水稻OsAHL1基因启动子OsAHL1-p驱动GFP报告基因转基因水稻植株的获 得

1.愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表2的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

2.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表2的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

3.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在1ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表2的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成100ml溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50ml)，高温高压灭菌。使用之前加入1ml 50％的葡萄糖和100μl AS(100mM)。

共培养培养基：采用表2的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20ml 50％的葡萄糖和1ml AS(100mM)。

4.筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表3的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2,4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1ml Hn和1ml Cn(100ppm)。

5.分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表3的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

6.生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表3的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH值至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

7.转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表2基本培养基成分1

表3基本培养基成分2

实施例7-转基因水稻中OsAHL1-p操控下GFP荧光观测

据实施例3-6中所述，取得由OsAHL1-p操控GFP表达的转基因水稻用于观测GFP荧光观测，确定OsAHL1-p序列在水稻中启动下游基因的能力。

取分蘖盛期转基因水稻，分别取根系、叶片、叶鞘、节及节间部位，利用冰冻切片机横切成薄片，置荧光显微镜下，由紫外波段光激发，观测GFP荧光情况。结果显示(图3)，在水稻中SEQ ID NO:1所示DNA片段即OsAHL-p能够驱动下游GFP基因的表达，具有启动子活性。

GFP绿色荧光检测显示主要在以及叶片(图3A，B)、叶鞘(图3C，D)、节(图3E，F)及节间(图3G，H)部位的维管束中，以及水稻根(图3I，J)组织中表达。这表明，OsAHL1-p序列能在水稻中有效驱动下游基因表达，具有显著的启动子活性；另，其驱动表达具有组织特异性，主要在根系组织，以及叶片、叶鞘、节及节间部位的维管束中发挥作用。图3为OsAHL1-p诱导GFP基因在水稻中的表达情况观测。其中A、C、E、G、I为自然光下观测结果，B、D、F、H、J为在紫外光下激发GFP荧光的观测结果。

Claims (9)

1.水稻OsAHL1基因的启动子OsAHL1-p，其特征在于，所述启动子如

SEQ ID NO:1中所示的DNA序列所示；

所述启动子OsAHL1-p序列的克隆包括获得OsAHL1基因转录起始密码子上游2000bp以及下游200bp的序列，根据预测信息设计上下游引物：P1：ACCGTTCTATCTTCTTCC和P2：5’-TTGCTTGGAGCTCAAAC-3’，从IRAT109基因组DNA中扩增获得1686bp的片段；

所述启动子OsAHL1-p与任何感兴趣的基因构建的植物表达载体，可启动其下游基因主要在水稻根以及成熟的根、茎、叶等器官的维管束组织特异表达。

2.一种包含权利要求1所述启动子OsAHL1-p的重组载体。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，构建所述重组载选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于构建重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

5.一种包含权利要求1所述启动子OsAHL1-p的转化体。

6.根据权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主为植物。

7.根据权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述植物为水稻。

8.权利要求1所述启动子OsAHL1-p在水稻环境胁迫或驱动水稻基因特异表达中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的操作步骤：

a)、将所述的启动子驱动目的基因导入水稻细胞、组织或器官，

b)、再将转化后的水稻细胞、组织或器官培育成植株，得到驱动目的基因响应环境胁迫或驱动目的基因在特定的组织部位表达的转基因植物。