CN104357449B - 一种获取植物雄蕊表达启动子sta3的方法及相应启动子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种获取植物雄蕊表达启动子STA3的方法，所述方法包括如下步骤：制备正、反向引物；以水稻品种日本晴的DNA序列为模板，利用所述正向引物和所述反向引物，对日本晴的DNA序列中的一目的片段进行PCR扩增；对所述目的片段进行加A并连接PGEM‑T‑Easy载体；将目的片段转入到激活的感受态细胞中；挑取单克隆摇菌液提质粒；回收所述目的片段。本发明的分离方法能够从日本晴水稻中有效地分离出能够驱动雄蕊中的外源基因表达的启动子。本发明的方法简单易行，能够为人们提供现有技术中尚未发现的STA3启动子。该启动子STA3能够调控外源基因在植株的雄蕊中集中表达，具有显著的研究和商业价值。

Description

一种获取植物雄蕊表达启动子STA3的方法及相应启动子

技术领域

本发明涉及一种从植物中分离的启动子，尤其涉及从水稻中分离的雄蕊特异表达启动子，本发明还涉及含有该雄蕊特异表达启动子的重组表达载体、宿主细胞以及在改良植物性状、培育植物新品种等方面的应用，属于植物组织或器官特异性表达启动子的分离及其应用领域。

背景技术

植物生长过程中，基因表达的开启、关闭、表达模式、表达丰度的高低往往会受到精细细胞的调控。基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制，也是在多阶段水平来实现的。尽管基因表达在高等生物中是多级调控系统，但是转录水平上的调控是最关键的环节。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，是众多转录因子及RNA聚合酶的最终作用靶标，因此，深入研究启动子的结构、功能和作用模式等具有重大意义(Xu et al.,2011；yamamoto et al.,2011)。

通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景(林拥军，2001)。但是在其广泛运用的过程中也逐渐暴露了一些问题，由于组成型启动子会使驱动的目的基因在受体植物各组织中持续而恒定的表达，所以有时会带来一些负面效应，如增加代谢负担以及一些食品安全性方面的担忧等等(Conner et al.,2003；Kuiper et al.,2001)。为此，随着植物基因工程的发展，人们寻找更为有效的组织、器官特异性表达启动子来代替组成型表达启动子，以更好地调控目的基因的表达。在组织特异型启动子调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官或组织部位，并常常表现出发育调节的特性。目前，组织器官特异启动子的研究已经取得了很大的进展。

雄蕊是高等植物生殖器官的重要组成部分，雄蕊的形成是一个十分复杂的过程，在这个过程中，大量基因的协同表达受到不同启动子的调节和控制，其中花药特异表达启动子和花粉特异表达启动子起到了十分重要的作用。Orys1是一个水稻来源的花粉过敏原基因，Azria等分离克隆了其启动子，然后在澳大利亚本地的水稻栽培种中做了功能验证，证实其启动子具有花粉中特异表达的特性(Azria and Bhalla,2011)。Zhou等分离克隆了一个来源于马铃薯的花粉特异表达基因SBgLR的启动子，研究发现一个18bp长的回文对称序列在控制花粉特异表达过程中起非常重要的作用(Zhou et al.,2010)。END1是从豌豆中分离得到的一个花药特异表达基因，GUS组织化学分析表明END1启动子可以驱动GUS基因在烟草、拟南芥、番茄等植物的花药中特异表达。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亦是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物(Zhang,2007)，启动子是精确调控基因表达的“开关”。在过去的几年里，尽管克隆了一些组织特异表达启动子，但是这些组织特异表达的调控机理仍然很不清楚，用于作物遗传改良的高丰度表达特异启动子仍然较少。因此对水稻组织器官尤其是雄蕊特异表达启动子的分离、克隆及深入研究，可以指导转基因育种，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类的生产生活服务。

但是目前现有的获取启动子的方法都或多或少存在其自身的问题。而且，从目前的现有相关报道来看，现有方式所获得的启动子还不能够很好地满足人们对雄蕊特异表达启动子的需求，尤其是水稻雄蕊特异性表达启动子的需求。因此，科研人员还是希望能够获得更好地分离雄蕊启动子的方法，也希望得到更好地雄蕊启动子。

发明内容

基于目前人们对启动子的研究现状，本发明的目的是提供一种获取植物雄蕊表达启动子STA3的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤(1)制备正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；

步骤(2)制备反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

步骤(3)以水稻品种日本晴的DNA序列为模板，利用所述正向引物和所述反向引物，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶对日本晴的DNA序列中的一目的片段进行PCR扩增，该目的片段的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；

步骤(4)对所述目的片段进行加A并连接PGEM-T-Easy载体；

步骤(5)，利用该载体转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中；

步骤(6)挑取单克隆摇菌液提质粒，用所述正向引物和所述反向引物进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆进行测序，验证正确的克隆即为所要获得的目的片段——启动子STA3，其核酸序列如SEQ ID No:1所示；

步骤(7)，回收所述目的片段。

优选地，所述扩增程序包括：步骤(3-1)在95℃下进行预变性5min；步骤(3-2)95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，(3-3)重复步骤(3-1)和步骤(3-2)35-40个循环，步骤(3-4)72℃延伸10min。

另一方面，本发明提供一种植物雄蕊表达启动子STA3，其特征在于，所述植物雄蕊表达启动子STA3包含SEQ ID No:1所示的DNA序列或其变体、同源物或衍生物。

另一方面，本发明提供一种表达盒、重组表达载体或转化子，其特征在于，所述表达盒、重组表达载体或转化子所述植物雄蕊表达启动子STA3。

另一方面，本发明提供一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含所述植物雄蕊表达启动子STA3。

另一方面，本发明提供一种所述植物雄蕊表达启动子STA3的应用，其特征在于，所述植物雄蕊表达启动子STA3用于驱动外源基因在植物雄蕊部位表达。

本发明所提供的方法以及相应启动子特别适合用于单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，尤其适合用于水稻。

该启动子分离自日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)，本文中称为STA3或启动子STA3。

在所述重组表达载体中，所述植物雄蕊特异表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为雄性不育基因。

优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

优选地，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

本发明的启动子的应用包括将本发明提供的上述植物雄蕊特异表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

SEQ ID No1中的启动子中，序列开头“TTTCCTCAAGATTCCTAGCCTC”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾“CCGCGCCAAGAACTCGATCCTC”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列，是该序列的核心部分。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，发明人采用本发明的分离方法从日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)中分离克隆STA3基因上游包括转录起始位点在内的2140bp的DNA序列，并将其命名为STA3(序列表中的SEQ ID No:1)。本发明的分离方法可以用于从植物中提取指定的目的片段，用于后续的研究应用。本发明所提取出的雄蕊启动子经连接表达载体后，可以转入到植物细胞中，得到转基因植株。

技术效果

本发明的分离方法能够从日本晴水稻中有效地分离出能够驱动雄蕊中的外源基因表达的启动子。本发明的方法简单易行，能够为人们提供现有技术中尚未发现的STA3启动子。该启动子STA3能够调控外源基因在植株的雄蕊中集中表达，只要将该启动子连接到外源基因的上游并转入水稻植株中即可。通过该启动子对农作物雄蕊的生长特性进行改造，可以提高和改善水稻的生长特性和机制，从而培育出具有希望的繁殖特性的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的获取方法的简化流程示意图；

图2为对本发明所获得的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为利用STA3启动子驱动Gus基因表达后对水稻植株进行Gus染色，在水稻植株花的部位所得到的的染色结果。

图4为对水稻植株进行Gus染色，在水稻植株茎的部位所得到的的染色结果。

图5为对水稻植株进行Gus染色，在水稻植株叶子部位所得到的的染色结果。

图6为对水稻植株进行Gus染色，在水稻植株叶鞘部位所得到的的染色结果。

图7为对水稻植株进行Gus染色，在水稻植株根部位所得到的的染色结果。

具体实施方式

以下参照具体实施例来说明本发明。

1、植物材料

日本晴成熟种子，由安徽省农科院水稻所生技室保存。

2、菌株及质粒

本研究所用大肠杆菌菌株为XL1-blue；根瘤农杆菌为EHA105，安徽省农科院水稻所生物技术室保存；植物表达载体pCAMBIA1391购自澳大利亚CAMBIA公司。

3、试剂与药品

次氯酸钠(NaClO，有效氯浓度4％)，Tween20购自Sigma公司。潮霉素B购自Roche公司；PEASY-Tsimple和DNA marker-Trans2K购自Transgen公司；限制性内切酶购自NEB公司；KOD高保真聚合酶和定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa宝生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；DNA片段回收试剂盒购自TIANGEN公司；质粒DNA提取采用Axygen质粒小提试剂盒。引物合成和测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。缓冲液、试剂、细菌培养基配方、大肠杆菌感受态制备参见《分子克隆实验指南》(第三版)。

4、引物的设计

为了获取本发明所需要的启动子，首先要针对性的设计引物。根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻STA3基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

FP：GTCGACTTCTCCACCCCTTGTAAGTAGC SalI

RP：GAATTCCAGAATCTCCCTGCAAGCAAGC EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

5、启动子STA3的获得

接下来，需要以水稻品种日本晴DNA为模板，利用上面获得的正向引物、反向引物扩增启动子STA3。按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2140bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌。经过菌落PCR筛选重组子和双酶切验证，测序正确的重组子，提取其质粒用于转化农杆菌。农杆菌感受态细胞的制备方法如下：

(1)从-80℃超低温冰箱取出甘油冻存的农杆菌EHA105菌株，在含10μg/mL Rif的YEP培养基划线，28℃培养2～3d至长出单菌落。

(2)挑取单菌落接种于10mL含10μg/mL Rif的YEP培养基，28℃，210r/min过夜培养。

(3)将菌液全部转移至250mL含10μg/mL Rif的YEP培养基(1L三角瓶)中于28℃、210r/min继续培养4h左右，中间每隔一段时间测量一次OD值，培养OD600至0.5-0.7。

(4)将菌液均分于6支50mL(预冷的聚乙烯管)离心管，冰上静置30min，然后于4℃、4000r/min离心5min。

(5)弃上清，将离心管倒扣于无菌滤纸上，为除净剩余菌液。

(6)加入3mL预冷的100mM CaCl2重悬菌体(可用移液枪轻轻吹打重悬)。

(7)将重悬菌液集中于2支离心管，配平，4℃4000r/min，离心5min。

(8)弃上清，将离心管倒扣于无菌滤纸上，以除净剩余菌液；

(9)加入5mL预冷的100mM CaCl2重悬菌体(可用移液枪轻轻吹打重悬)。

(10)加入5mL预冷的50％甘油，混匀。

(11)冰浴10min，每管100μl分装于无菌Eppendorf管，液氮冷冻后，存于超低温冰箱，备用(枪头和Eppendorf管需4℃预冷)。

质粒提取方法如下：

用AXYGEN质粒DNA小量试剂盒提取相应的质粒，具体操作方法如下：第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseA全部加入到Buffer S1中，混匀，4℃贮存。

(1)取约4mL过夜培养的菌液(菌液过浓时体积应减半或更少)，12,000×g离心30s，弃尽上清。

(2)加250μl Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小菌块。

(3)加250μl Buffer S2，缓慢地上下翻转4-6次，混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。

(4)加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min。

(5)吸取步骤4中的上清并转移到吸附柱(置于2mL离心管中)，室温静止2min，12,000×g离心1min，弃滤液。

(6)将吸附柱放回离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

(7)将吸附柱放回离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液；以同样的方法再用500μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。

(8)将吸附柱置回2mL离心管中，12,000×g离心2min。

(9)将吸附柱移入新的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在吸附柱膜中央加60μl去离子水(65℃预热)，室温静置2min。12,000×g离心1min。将洗脱下来的溶液重新加到吸附膜的中央，复洗一次。

提取质粒后再用SalI和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子STA3，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

6、植物表达载体的构建

从上面“启动子STA3的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子STA3片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的STA3片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子STA3与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-STA3，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用SalI和EcoRI进行酶切验证，即质粒DNA用限制性内切酶消化。电泳观察酶切片段的位置和大小，以判断所鉴定的质粒是否有外源片段插入以及插入片段的大小。酶切反应体系为20μl，组分如下：

上述各组分混匀后，置37℃反应2-4h，电泳观察酶切结果。对获得的转基因水稻进行GUS表达定量检测发现，转基因植株在雄蕊部位上的Gus基因表达水平提高，从而证明该2140bp的序列具有驱动基因在雄蕊部位表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻雄蕊部位特异表达。

7、农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)愈伤组织诱导消毒后的种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性塑料培养皿，内含50mL诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。

(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管中，加入超表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干。后将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d。

(4)恢复将共培养的愈伤转移至恢复培养基上(愈伤之间尽量避免重叠)。23℃黑暗培养3～5d。

(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。

(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的所有愈伤组织)挑选三个独立的胚性愈伤到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室(光周期16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。

8、GUS组织化学染色的鉴定

GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性的研究GUS的表达水平和表达模式。因此，本发明收集上面步骤7中所获得的转基因植株，并分别针对转基因植株的不同部位进行Gus染色。

(1)GUS染色底物的配制

50ml 0.5M磷酸缓冲液(pH7.0)，50ul100mM铁氰化钾K₃Fe(CN)₆(将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml，4℃保存)，50ul100mM亚铁氰化钾K₄〔Fe(CN)₆〕.3H₂O(将4.2239亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml，4℃保存)。1ml0.5MEDTA，250ul1mmg/mlX-Gluc(用二甲基甲酰胺溶解，-20℃避光保存，呈紫红色)。

(2)染色步骤

①染色：将待测样品浸到GUS染液中，37℃保温箱中放置24h-36h。

②脱色：加入100％乙醇浸泡直至完全脱色。可用含有30％甘油和70％乙醇的溶液保存。

③在显微镜下拍照记录。

按上述方法进行Gus染色，染色结果如图3-7所示。图3-7分别示出了STA3：：gus转基因水稻植株各部位Gus染色结果，图3示出了花的染色结果；图4示出了茎的染色结果；图5示出了叶的染色结果；图6示出了叶鞘的染色结果；图7示出了根的染色结果。通过对各个图中的GUS染色结构进行比较和观察可以发现，Gus仅在转基因植株的雄蕊部位染色明显，也就是说启动子驱动雄蕊部分的Gus基因明显表达，而不驱动其他部位的Gus基因表达。(标尺＝1cm)。

实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

本领域技术人员能够理解，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，仅用于说明本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (5)

1.一种获取植物雄蕊表达启动子STA3的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤(1)制备正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤(2)制备反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤(3)以水稻品种日本晴的DNA序列为模板，利用所述正向引物和所述反向引物，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶对日本晴的DNA序列中的一目的片段进行PCR扩增，该目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤(4)对所述目的片段进行加A并连接PGEM-T-Easy载体；

步骤(5)利用该载体转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中；

步骤(6)挑取单克隆摇菌液提质粒，进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆进行测序，验证正确的克隆即为所要获得的目的片段——启动子STA3，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

步骤(7)回收所述目的片段。

2.根据权利要求1所述的获取植物雄蕊表达启动子STA3的方法，其特征在于，所述扩增的程序包括：步骤(3-1)在95℃下进行预变性5min；步骤(3-2)95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，(3-3)重复步骤(3-1)和步骤(3-2)35-40个循环，步骤(3-4)72℃延伸10min。

3.一种植物雄蕊表达启动子STA3，其特征在于，所述植物雄蕊表达启动子STA3由SEQID NO.1所示的DNA序列构成，所述植物雄蕊表达启动子STA3能够驱动目标基因在水稻雄蕊处特异性表达。

4.一种表达盒或重组表达载体，其特征在于，所述表达盒或重组表达载体包含权利要求3中所述的植物雄蕊表达启动子STA3。

5.一种权利要求3所述的植物雄蕊表达启动子STA3的应用，其特征在于，所述植物雄蕊表达启动子STA3用于驱动外源基因在水稻雄蕊部位表达。