CN104762302B - 镉强诱导启动子CdS2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物基因序列。本发明从日本晴水稻中分离克隆和鉴定了一个镉(Cd)强烈诱导的水稻特异基因的启动子Cd S2，并对获得的转基因水稻进行镉(Cd)处理，经过GUS化学染色发现，在处理后转基因植株在各个部位都有明显的染色。且通过RT‑qPCR鉴定处理前后的Gus基因表达量分析发现，镉(Cd)处理后，转基因植株中的Gus基因表达量是处理前的887.9倍，达到组成型启动子ACTIN活性的4倍。该启动子能够用于通过其在水稻中的表达量来反应土壤中镉污染的强度，其操作简单、检出限低、微量灵敏且准确度高的特性，对从研究环境关系到改善生态环境，在可持续发展中发挥重要意义，并且可以积极地对形成污染的原理进行分析，进一步为它们避免与可控转化提供宝贵经验。

Description

镉强诱导启动子CdS2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物镉强诱导表达启动子及其在水稻中的表达和应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中在镉诱导条件下驱动目标基因在植株中表达，并且可以用于测定土壤中的镉含量。

背景技术

随着现代工农业生产的飞速发展，工业“三废”、农业化肥用量、固体废弃物不断增加，导致土壤中重金属含量急剧增加。重金属污染问题日趋严峻，已成为世界范围的主要问题之一(邓湘雄等，2009)。镉(Cd)是毒性最强的重金属之一，与其它非必需元素相比，镉(Cd)具有更强的从土壤向植物迁移的能力，极易被植物吸收并积累，超过一定限度严重影响作物的产量和品质，进而严重威胁人类健康。

作物生长在有毒重金属污染的土壤上，由于过量吸收与积累有毒重金属，生长发育将受到严重抑制，在形态上主要表现为根、茎生长迟缓和叶片失绿、卷曲；生理生化方面多表现为光合作用和蒸腾作用受到抑制，引起氧化胁迫和膜的损伤等(Clemens,2006；Tudoreanu,2004)。对人类而言，镉对人体的健康危害主要是污染土壤中的镉可以通过食物链进入人体造成严重的危害。镉主要贮存于肾和肝中，贮存量约为体内总镉量的50％。镉被人体吸收后主要分布在肝与肾中，与低分子蛋白结合成金属蛋白，镉中毒主要表现为肾脏功能的损害和肺部的损伤，导致肾皮质坏死、肾小管损害、肺气肿、肺水肿，还可以引起心脏扩张和高血压，长期摄入镉将会导致骨质疏松、脆化、腰病和脊柱畸形等。

因此，镉是土壤环境检测的重要项目之一，目前关于土壤污染的检测手段主要有气相色谱法、高效液相色谱法和原子荧光光谱法等。其中，原子荧光光谱法的技术优势综合了原子吸收和原子发射光谱的特点，是一种优秀的痕量分析技术。国家标准分析方法是原子吸收法，该法虽然检出限较低，但由于土壤污染消解后，有众多的共存离子，对镉的测定有一定的干扰，并且干扰作用最大的就是金属离子。

目前，国内外已经高度重视土壤镉污染及其检测手段的问题，镉对土壤的污染对全世界的农业环境造成了威胁(Pilon-Smits 2005；Chen等，2007)。相应的，在农业上急需一种可以灵敏且稳定地检测土壤中镉浓度的方法来为我国环境检测提供重要参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在植株各部位表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物镉强诱导表达启动子，所述植物镉强诱导表达启动子提取自植物DNA。

优选地，所述启动子由序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列构成。序列表中SEQID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻镉强诱导表达启动子，本文中称为CdS2或启动子CdS2。

另一方面，本发明提供一种植物镉强诱导表达启动子，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少60％同源性；或者，所述植物镉强诱导表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或衍生物；或者所述植物镉强诱导表达启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物镉强诱导表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物中表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物镉强诱导表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物镉强诱导表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物镉强诱导表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Cd S2，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即CdS2或启动子CdS2构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-CdS2。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物镉强诱导表达启动子、上述表达盒或上述重组表达载体。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物镉强诱导表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物镉强诱导表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

优选地，本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：

TTATGAAATTAGTTTTTTCATTCGTGTCCAAAAACTCCTTCCGACATCCGGTCAAACGTCCGATTTGACACCCAAAAATTTTCATTTCACAAACTAAACAAACCCTGAACAGTACAAATTCATGAACATGTACAGTGCTCGAGGTCATCGTGGCTGGCATTGTGGTTGGACGGCGAGGAGCAGGAGGGGCTTCTGAAGGAGACGAAGGAGAACCTGGCGCTTCTGGAGGCGCAGCTCCATGGGAAGAGGTTCTTTGCCGGTGACTCGGTCGGCTACCTCGACATTGTTGCCAGTGGACTGGCTCACTGGATCAGCGTGGTTGAGGAGGTGACCGGAGTGAGCTTGATGGGCGGCGCCGACGAGGATGACGAGTATCCTGCTCTACGCCGTTGGGCCAAGGAGTACACCACGGATGAGACCGTGATGCAGTGCCTGCCGAGCAGAGAGCACCTCGCTGCCTTCTTCGCTGCGAAGAAGGACAAGCTGAAGATGGTGGCTAAGGCGATGCTGCATCAGTGATTGTGAGTGTTGTGGGGGCCGACAGTGGGAGTGTATGTCTCAGGTGATGGTGCTTCTTAAATAAAATCGAATCAGAACATAATTAAACGATTATAAAGCCGAAAGTTCTACACGTACATCAGATTGTTCGTTTGTCACTCACTCGGCTCATTTTTATATGGCGTGATCTTGACTTTACACGTTTTGAATTGAACTTTGACTACTAATAAGTATATACTCCCTCCGGGTTGATAATACTTGTCGTTTTGGACAAGGGCACGGTCTCCAAAAATAATTTTGACCATTATTTTTCATTATAATATGTATAAAATTGTAAACAAATATATGATCTTATTAAAGTACTTTTTAAGACTAATCTATACATGTAGTCACTATATTTGAAAGATAAATATTTTAAAAATGATTCATAATAAAAAAAATCTAAATTTTGACTTCACCCTTATTTAGAACGATAAGTATTATCAGCCCGGAGGGAGTACTGATTAGCATGCAGGATAGGAACTGATCTGTACTTGTCGAAAGGGGATAGTGCAGAAGTTACCTGGTCATCTTATGGCTTGCGGGAGAAGCTTTGTAATTAGCAAATGATTTATTAAATATTAAGTATTACAAATTTAAAAATAGATTTGTTTGAATTCTTTTCAAAAACTTCTATATAGAATTTTTTTCTCAAAAATCACGCCGCTAGTTGAGATTAAATCTCAGTAAAATGTTCATAGATATTTTTTTTCTATGGACCATCTATCTAGGAATCTTTTCATTTTCTGGATTTTATCAATTCATCTGATTTGCCCTACCTTTGCGCTCCGGCTTGCTCTTCAAGAAATTTGATAGGATTAATCAATACAAAGTCTGAAAGCCATTATGGTGGCAGTAATTAAGCTATCTCTGGGAACTGCACATGTATATATATTATCTTTTGGTAAATTAAATCTCGCTGACAAAACCGATGACCTCTGCTATTTGGACCGAAGCAAAGAAAACCTGTGATTCCTCCCAAGCTTAATTAAACAAAACCGATGAGCTCCTGCTCTTTGGACCGAAGCAACTGAGAAGCAGATAGTCAAACTGATTGAAAAAAGAAAAGGAAAAATCACAGATAAGGGAGGTCGTCCTTCTTGGAGAAGAAGTAGCTAACACACCATTTGAAAATTACAAATTTGAGCCAAAAAGCAAACTTGACATGGCCCTATAAATAAATGTATGGTTTAGCCAAGAATACAGGAATAATAG。

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆上述的1796bp的DNA序列，并将其命名为CdS2(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行100μM的镉(Cd)处理，经过GUS化学染色发现，在处理后转基因植株在各个部位都有明显的染色。且通过RT-qPCR鉴定处理前后的Gus基因表达量分析发现，镉(Cd)处理后，转基因植株中的Gus基因表达量是处理前的887.9倍，达到组成型启动子ACTIN活性的4倍。从而证明该1796bp的序列，在镉(Cd)处理下具有强诱导活性，而且经镉(Cd)诱导后该启动子能驱动Gus基因在水稻各个部位进行表达。

此外，本发明还提供了一种检测土壤中镉的含量的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

1)获取镉诱导启动子；

2)将所述镉诱导启动子转入到植物双元表达载体pCAMBIA1391中，连接到Gus基因上游，获得重组表达载体；

3)利用所述重组表达载体转化根癌农杆菌菌株EHA105；

4)利用农杆菌介导法以及转化后的重组表达载体进行水稻的转化，得到转基因水稻植株；

5)将获得的转基因水稻种植在含镉的待测土壤中，以便对其进行镉(Cd)诱导处理；

6)对经诱导处理的转基因水稻进行GUS化学染色；

7)通过RT-qPCR鉴定处理前后的Gus基因表达量分析；

8)根据Gus基因的表达量推算土壤中的镉含量。

优选地，所述方法还包括建立Gus基因与土壤中土壤镉含量的对应表，并且利用Gus表达量与土壤镉含量的对应表来推算被测土壤中的镉含量，优选地，所述启动子为上述的镉强诱导启动子。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，可驱动靶标基因在镉诱导条件下在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。此外，本发明提供的检测土壤中镉含量的方法能够方便地检测出土壤中的镉含量，并且本发明的方法可以在进行转基因品种培育的过程中进行镉检测，检测灵敏度高。本发明是通过鉴定一个镉(Cd)强烈诱导的水稻特异基因的启动子，通过其在水稻中的表达量来反应土壤中镉(Cd)的含量，其操作简单、检出限低、微量灵敏且准确度高的特性，对从研究环境关系到改善生态环境，在可持续发展中发挥重要意义，并且可以积极地对形成污染的原理进行分析，进一步为它们避免与可控转化提供宝贵经验。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子CdS2能够调控基因在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，并通过其在水稻中的表达量来反应土壤中镉(Cd)的含量，对从研究环境关系到改善生态环境，在可持续发展中发挥重要意义，并且可以积极地对形成污染的原理进行分析，进一步为它们避免与可控转化提供宝贵经验。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将CdS2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图A为pCAMBIA1391示意图，图B为pCAMBIA1391-CdS2示意图，其中示出了利用CdS2启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为对获得的CdS2：：gus转基因水稻植株，进行100μM镉(Cd)处理前后的各部位Gus染色结果示意图。即图中上面部分表示的是镉(Cd)诱导前各组织染色结果，下面表示镉(Cd)诱导后各组织染色结果。从左向右分别表示根、茎、叶组织(标尺＝0.5cm)。

图4为对获得的CdS2：：gus转基因水稻植株，进行100μM镉(Cd)处理前后Gus基因表达量的qRT-PCR检测结果。如图所示，以未用镉(Cd)处理的CdS2启动子转基因植株整株中的Gus基因表达量为1，镉处理后CdS2启动子驱动的Gus基因表达量是处理前的887.9倍。水稻强启动子——肌动蛋白启动子(ACTIN)与CdS2启动子相比，在镉未处理的情况下，ACTIN启动子驱动的Gus基因表达量是CdS2启动子的220倍，而在镉处理后，ACTIN启动子驱动的Gus基因表达量没有明显的变化。结果说明，CdS2是一个受镉强诱导表达的启动子，经镉诱导后，启动子的活性是诱导前的887.9倍，约为水稻强启动子ACTIN活性的4倍。

图5为将4天大小的Cd-S2启动子的转基因幼苗，分别移栽在含有0.2、0.5、5mg/LCdCl₂的1/2MS培养基上生长15天，在同等生长条件下，以1/2MS培养基上生长的转基因植株为对照。提取这些植株的RNA，并测定Gus基因的转录水平的表达量。结果显示，不同浓度的CdCl₂均能诱导CdS2启动子活性的表达，特别是浓度较低(0.2mg/L CdCl₂)时，Gus基因表达量达到最高，是对照的23.2倍，随着Cd²⁺浓度的升高，Gus基因表达量降低，但仍是对照的2～3倍。结果说明，在Cd²⁺的长时间处理下，仍能诱导CdS2启动子的活性。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的Cd-S2启动子的获得

1、植物材料

日本晴成熟种子，由安徽省农科院水稻所生技室保存。

2、菌株及质粒

本研究所用大肠杆菌菌株为XL1-blue；根瘤农杆菌为EHA105，安徽省农科院水稻所生物技术室保存；植物表达载体pCAMBIA1391购自澳大利亚CAMBIA公司。

3、试剂与药品

次氯酸钠(NaClO，有效氯浓度4％)，Tween20购自Sigma公司。潮霉素B购自Roche公司；PEASY-T simple和DNA marker-Trans2K购自Transgen公司；限制性内切酶购自NEB公司；KOD高保真聚合酶和定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa宝生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；DNA片段回收试剂盒购自TIANGEN公司；质粒DNA提取采用Axygen质粒小提试剂盒。引物合成和测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

缓冲液、试剂、细菌培养基配方、大肠杆菌感受态制备参见《分子克隆实验指南》(第三版)。

4、基因克隆

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)CdS2基因序列设计引物，以cDNA为模板，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。回收片段大小和目的基因片段长度大小相近的片段，进行凝胶回收加polyA尾并连接T载体，转化大肠杆菌XL1-blue，放在37℃恒温培养箱培养16-18h，挑选菌落进行Taq-PCR并酶切验证，挑选正确的克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序分析，测序后产物与NCBI上序列进一步比对验证。验证正确的克隆提质粒备用以构建表达载体。

5、转化

(1)准备LB(不含抗生素)和X-gal固体培养基。(每板涂浓度为20mg/mL的X-gal 40μl，24mg/mL的IPTG 160μl，室温下放置2-3h)；

(2)从-80℃冰柜中取出感受态细胞，冰浴中融化。在无菌的1.5mLEppendorf中加入2μl所克隆基因与载体的连接产物，其中一管加入2μlH₂O作为对照。取50μl感受态细胞与连接产物轻轻混匀，冰浴中放置20min；

(3)42℃热击90s，然后立即冰浴2min。加入950μl LB液体培养(不含抗生素)，37℃摇床振荡培养1h(120r/min)；

(4)12000r/min，离心1min，沉淀用100μl LB重悬。取适量涂于固体培养基上，37℃倒置培养16-20h，有的菌落为白色，有的变为蓝色，选取白色的菌落进行PCR鉴定。

6、质粒小量提取的方法

用AXYGEN质粒DNA小量试剂盒提取相应的质粒，具体操作方法如下：第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseA全部加入到Buffer S1中，混匀，4℃贮存。

(1)取约4mL过夜培养的菌液(菌液过浓时体积应减半或更少)，12,000×g离心30s，弃尽上清。

(2)加250μl Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小菌块。

(3)加250μl Buffer S2，缓慢地上下翻转4-6次，混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。

(4)加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min。

(5)吸取步骤4中的上清并转移到吸附柱(置于2mL离心管中)，室温静止2min，12,000×g离心1min，弃滤液。

(6)将吸附柱放回离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

(7)将吸附柱放回离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液；以同样的方法再用500μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。

(8)将吸附柱置回2mL离心管中，12,000×g离心2min。

(9)将吸附柱移入新的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在吸附柱膜中央加60μl去离子水(65℃预热)，室温静置2min。12,000×g离心1min。将洗脱下来的溶液重新加到吸附膜的中央，复洗一次，获得所提取质粒。

7、AXYGEN胶回收试剂盒

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。计算凝胶重量(提前记录1.5mL离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，期间不断晃动(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。

(3)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。

(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，DNA制备管置于2mL(试剂盒内提供)离心管中，12,000×g离心1min。弃滤液。

(5)将制备管重新置回2mL离心管中，加入500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

(6)将制备管置回2mL离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μl Buffer W2洗涤一次，12,000×g离心1min。

(7)将制备管置回2mL离心管中，12,000×g离心2min。

(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl Eluent或去离子水(65℃预热的更好)，室温静置2min。12,000×g离心1min洗脱DNA片段。

8、对克隆载体的酶切鉴定

质粒DNA用限制性内切酶消化。电泳观察酶切片段的位置和大小，以判断所鉴定的质粒是否有外源片段插入以及插入片段的大小。酶切反应体系为20μl，组分如下：

上述各组分混匀后，置37℃反应2-4h。电泳观察酶切结果，如图2。

9、表达载体的构建

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中日本晴基因CdS2的CDS序列序列设计扩增引物，构建表达载体的引物如下：

SalI FP:GTCGACCGTCTCACGGTTTTCAGGCAAG

SmaI RP:CCCGGGGTTTGCTTTAGAGTGTTTTTGG

分别以上面克隆正确的质粒为模板用带酶切位点的引物进行PCR扩增，扩增的体系和程序同用cDNA基因克隆，加A连T转化大肠杆菌，选取正确的T载体阳性克隆提取质粒。用限制性内切酶SalI和SmaI对含目的片段的质粒和pCAMBIA1391质粒进行双酶切，分别回收目的片段和1391质粒的大片段进行连接。用Progema T4连接酶连接目的片段和1391载体大片段(10×T4ligase buffer 1μl，T4ligase 1μl，目的片段2μl，1391质粒大片段6μl)，4℃冰箱过夜连接16-18h，将连接产物转化大肠杆菌。经过菌落PCR筛选重组子和双酶切验证正确的，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序并将测序所的序列与NCBI中该基因序列比对。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Cd S2，其核酸序列如SEQ ID No:1所示，并提取其质粒用于转化农杆菌。

10、农杆菌感受态细胞的制备

(1)从-80℃超低温冰箱取出甘油冻存的农杆菌EHA105菌株，在含10μg/mL Rif的YEP培养基划线，28℃培养2～3d至长出单菌落。

(2)挑取单菌落接种于10mL含10μg/mL Rif的YEP培养基，28℃，210r/min过夜培养。

(3)将菌液全部转移至250mL含10μg/mL Rif的YEP培养基(1L三角瓶)中于28℃、210r/min继续培养4h左右，中间每隔一段时间测量一次OD值，培养OD600至0.5-0.7。

(4)将菌液均分于6支50mL(预冷的聚乙烯管)离心管，冰上静置30min，然后于4℃、4000r/min离心5min。

(5)弃上清，将离心管倒扣于无菌滤纸上，为除净剩余菌液。

(6)加入3mL预冷的100mM CaCl₂重悬菌体(可用移液枪轻轻吹打重悬)。

(7)将重悬菌液集中于2支离心管，配平，4℃4000r/min，离心5min。

(8)弃上清，将离心管倒扣于无菌滤纸上，以除净剩余菌液；

(9)加入5mL预冷的100mM CaCl₂重悬菌体(可用移液枪轻轻吹打重悬)。

(10)加入5mL预冷的50％甘油，混匀。

(11)冰浴10min，每管100μl分装于无菌Eppendorf管，液氮冷冻后，存于超低温冰箱，备用(枪头和Eppendorf管需4℃预冷)。

11、超表达载体转化根癌农杆菌EHA105

(1)从-80℃超低温冰箱取出农杆菌感受态细胞，小心地用手心暖化，加入2μg表达载体质粒DNA混匀后，冰浴30min；

(2)迅速转入液氮速冻1min；

(3)从液氮中取出后再加入30℃预热的1mL YEP培养基(不含抗生素)，于30℃摇床120r/min培养4h；

(4)4000r/min离心1min，弃上清；

(5)加入150μl YEP培养基(不含抗生素)重悬，将菌液均匀涂布与含50μg/mL Kan和10μg/mL Rif的YEP固体平板培养基上；

(6)28℃恒温培养箱培养2～3d至长出单菌落，进行菌落PCR鉴定。

(7)挑取阳性的菌落摇菌，并用甘油保存菌液备用。

利用启动子CdS2驱动报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)愈伤组织诱导消毒后的种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性塑料培养皿，内含50mL诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。

(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管中，加入超表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干。后将愈伤组织均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d。

(4)恢复将共培养的愈伤组织转移至恢复培养基上(愈伤之间尽量避免重叠)。23℃黑暗培养3～5d。

(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。

(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的所有愈伤组织)挑选三个独立的胚性愈伤组织到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。

步骤2、GUS组织化学染色

GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性的研究GUS的表达水平和表达模式。

(1)GUS染色底物的配制

50ml 0.5M磷酸缓冲液(pH7.0)，50μl 100mM铁氰化钾K₃Fe(CN)₆(将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml，4℃保存)，50μl 100mM亚铁氰化钾K4〔Fe(CN)₆〕·3H₂O(将4.2239g亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml，4℃保存)，1ml 0.5M EDTA，250μl 1mg/ml X-Gluc(用二甲基甲酰胺溶解，-20℃避光保存)。

(2)染色步骤

①染色：将待测样品浸到GUS染液中，37℃保温箱中放置24h-36h。

②脱色：加入100％乙醇浸泡直至完全脱色。可用含有30％甘油和70％乙醇的溶液保存。

③在显微镜下拍照记录。

按上述方法进行Gus染色，结果如图3所示，为对获得的CdS2：：gus转基因水稻植株，进行100μM镉(Cd)处理前后的各部位Gus染色结果示意图。即图中上面部分表示的是镉(Cd)诱导前各组织染色结果，下面表示的是镉(Cd)诱导后各组织染色结果。从左向右分别表示根、茎、叶组织的Gus染色结果,结果表明，镉(Cd)诱导前植株没有明显染色，而镉(Cd)诱导后均呈现出较强的Gus染色(标尺＝0.5cm)。

步骤3、Gus基因表达量鉴定

选取不带病斑、胚发育良好的CdS2：：gus或ACTIN：：gus转基因水稻种子去颖壳，70％乙醇浸泡并剧烈摇晃1min后，倒掉乙醇，加入50％的次氯酸钠(有效氯4％)和少许几滴Tween20浸泡20min(150r/min，30℃)进行表面消毒。种子接种于含有25mg/l潮霉素的1/2MS培养基，于30℃、16h光照/8h黑暗条件下培养21d。在胁迫处理时，先清洗根部培养基并用吸水纸吸干水分，将幼苗浸泡在含100μM CdCl₂的1/2MS溶液中进行胁迫处理，于72h取样。未处理的幼苗作为对照。幼苗经液氮速冻后存于-80℃超低温冰箱用于提取RNA。

RT-PCR采用天根公司(北京)的SuperReal荧光定量预混液试剂盒(TIANGEN，SYBRGreen，FP205)。以水稻ACTIN基因作为内参基因对所用RNA模板量进行定量。采用2^–ΔΔCT(ΔCT＝CT目标基因–CT内参基因；ΔΔCT＝ΔCT处理后–ΔCT对照)对获得的信号和数据进行处理。每个基因做3次重复。本实验中用到的基因的定量引物为：

Actin-FP 5’-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’；

Actin-RP，5’-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’

用于ACTIN的扩增；

Gus-FP，5’-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’

Gus-RP，5’-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’

用于GUS的扩增。

如图4所示为定量鉴定的结果。图中以镉(Cd)处理前CdS2启动子转基因植株整株中的Gus基因表达量为1，结果显示，镉(Cd)处理后CdS2启动子驱动的Gus基因表达量是处理前的887.9倍，是水稻组成型启动子ACTIN的强度的4倍，结果证明，CdS2是一个受镉强诱导表达的启动子。

如图5所示为将4天大小的CdS2启动子驱动GUS的转基因幼苗，分别移栽在含有0.2、0.5、5mg/L CdCl₂的土壤中生长15天，在同等生长条件下，以Cd离子浓度低于检出线土壤中生长的转基因植株为对照。提取这些植株的RNA，并测定Gus基因的转录水平的表达量。结果显示，不同浓度的CdCl₂均能诱导CdS2启动子活性的表达，在浓度较低(0.2mg/L CdCl₂)时，Gus基因表达量是对照的23.2倍，随着Cd²⁺浓度的升高，Gus基因表达量逐渐上升。结果说明，在一定浓度范围内，CdS2启动子强度与土壤中镉污染程度正相关。因此，本发明建立该启动子驱动的报告基因的转基因植株可作为生物检测器快速、无损监测土壤的镉含量。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (1)

1.一种植物镉强诱导表达启动子CdS2在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述植物镉强诱导表达启动子CdS2由SEQ ID No:1所示的DNA序列构成，所述应用包括：

将消毒后的水稻种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上，每皿均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤组织；

从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d；

将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管中，加入超表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干，后将愈伤组织均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d；

将共培养的愈伤组织转移至恢复培养基上，愈伤组织之间尽量避免重叠，23℃黑暗培养3～5d；

从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤组织；

每一转化事件挑选三个独立的胚性愈伤组织到分化培养基某一区域，30℃光照培养室条件下培养3～4周，待幼苗长出；

每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期，16h光照/8h黑暗，培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间；

对所培养出的水稻种子，进行镉处理，经镉处理后，Gus基因表达量是处理前的887.9倍；

其中，超表达载体如下构建：

根据所述植物镉强诱导表达启动子CdS2的序列设计扩增引物，以日本晴水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增，加A连T载体转化大肠杆菌，选取正确的T载体阳性克隆提取质粒，用限制性内切酶SalI和SmaI对含目的片段的质粒和pCAMBIA1391质粒进行双酶切，分别回收目的片段和pCAMBIA1391质粒的大片段进行连接，用Progema T4连接酶连接目的片段和pCAMBIA1391载体大片段，4℃冰箱过夜连接16-18h，该连接产物即为超表达载体。