CN103740718A - 一种植物光诱导型基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种植物光诱导型基因启动子及其应用，本发明提供了一种植物光诱导型基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序列的由SEQ ID No.1衍生的核苷酸序列。本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，可以获得光诱导的特异表达的启动子；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得光诱导表达目的基因的转基因植株；这不仅可以实现目的基因在转基因植株中的定时、定点、定量三维调控，而且为植物转基因应用提供强有力的工具。

Description

一种植物光诱导型基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种植物光诱导型基因启动子及其应用。

背景技术

植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。高等植物基因表达调控主要发生在转录水平上，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互作用。启动子是一段位于基因5’端上游区的DNA序列，它包含有增强或阻遏基因表达的序列和对激素或外界胁迫有应答作用的序列，即顺式作用元件，转录调控是通过其与转录因子之间的相互作用来实现的。

植物启动子按其转录方式可以分为组成型、组织特异型和诱导型启动子，但不具有绝对性。组成型启动子广泛应用于植物转基因，如常用于转Bt基因抗虫水稻的CaMV35S启动子，ubiquitin启动子和actin启动子，它能高效、持续和非特异的启动外源基因表达，但外源蛋白在转基因植物中组成型表达也会带来很多负面影响。例如，持续合成外源基因产物会增加植物的代谢负担，并且这种高效表达经常是以大量的营养消耗为代价，从而直接影响了植株的生长发育，表现为植物生长延滞、植株矮小、产量降低等；另外，利用组成型启动子可能诱发基因沉默，影响转基因技术应用；并且，随着人们对于转基因植物食品安全问题的越来越多的关注，组成型启动子也越来越不能满足现代基因工程育种的要求。与组成型启动子相比，诱导型启动子只在某些物理或化学信号的刺激下或者植物发育到特定的阶段，才启动外源基因的转录。它不仅能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性，同时可避免由组成型启动子启动外源基因超表达引起的对植株发育的负面影响，也可以在一定程度上解决转基因应用中的基因沉默和食品安全性问题，是应用植物转基因技术进行基因工程育种的理想启动子。

光是影响植物生长发育最重要的因素之一，因为它不仅作为植物感知环境的信号来源，还作为光合作用的能量来源。因此，对光诱导型启动子的研究有助于了解植物基因光下的转录调控表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中使外源基因伴随植物生理状态适度表达，同时维持转基因植株的健康生长。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是解决目前分子育种过程中，因使用组成型启动子，使得外源基因持续大量表达，而破坏了植物的代谢平衡，阻碍植物正常生长发育的问题，提供一种新的植物光诱导型基因启动子序列及其应用。

为了实现本发明目的，本发明一种植物光诱导型基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长序列为1567bp；该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序列的由SEQ ID No.1衍生的核苷酸序列也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了上述光诱导型基因启动子的构建方法，具体步骤为：以玉米基因组DNA为模板，根据ZmRBCS-1基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增，获得上述光诱导型基因启动子。

优选地，所述玉米为B73系。

所述特异性引物的核苷酸序列为：

5’-CAAGCTT GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’；

5’-GGGATCC CATGGCTGCCTGGCTGC CTAG-3’。

其中，PCR扩增程序为95℃5min；94℃45sec，69℃45sec，72℃2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温保存。

本发明还提供了用于扩增植物光诱导型基因启动子的引物对，其核苷酸序列为：

5’-CAAGCTT GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’；

5’-GGGATCC CATGGCTGCCTGGCTGC CTAG-3’。

本发明还提供了含上述光诱导型启动子的植物表达载体，优选为p1-ZmRBCS-1:GUS。

本发明还提供上述启动子在植物基因工程中获得光诱导表达目的基因的转基因植株中的应用。

本发明还提供上述启动子在培育转基因玉米和水稻中的应用。

本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，可以获得光诱导的特异表达的启动子；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得光诱导表达目的基因的转基因植株；这不仅可以实现目的基因在转基因植株中的定时、定点、定量三维调控，而且为植物转基因应用提供强有力的工具。

附图说明

图1为本发明实施例1中玉米Zm-RBCS-1启动子p0片段和p1片段的克隆：A图中M为DNA maker，1为Zm-RBCS-1启动子p0片段；B图中M为DNA maker，1为Zm-RBCS-1启动子p1片段。

图2为本发明实施例1中含有Zm-RBCS-1启动子p0片段和p1片段的pBI121载体质粒，酶切位点为HindⅢ和BamHⅠ的酶切图。图中M为DNA maker，1为p0-ZmRBCS-1:GUS利用HindⅢ/BamHⅠ双酶切的图谱，2为p1-ZmRBCS-1:GUS利用HindⅢ/BamHⅠ双酶切的图谱

图3为本发明实施例2中转基因植株的PCR鉴定。A图中M为DNA maker，1为水稻中花11，2为p0-ZmRBCS-1:GUS转基因植株；B图中M为DNA maker，1为水稻中花11，2为p1-ZmRBCS-1:GUS转基因植株。

图4为本发明实施例3中转基因水稻的叶片、叶鞘在不同光线处理后GUS染色分析结果。A图是p0-ZmRBCS-1:GUS转基因植株，P0-Zm-RBCS-1:GUS的叶片、叶鞘GUS染色后没有变蓝；B图是p1-ZmRBCS-1:GUS转基因植株，P0-Zm-RBCS-1:GUS的叶片、叶鞘GUS染色后都变蓝，随着光照时间的延长，蓝色越来越深。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1玉米Zm-RBCS-1启动子p0和p1片段的克隆及序列分析(1)启动子克隆

生物信息学分析显示，Zm-RBCS-1基因的启动子中含有多个光应答的顺式作用元件，说明该基因有可能受到光诱导表达。本发明将Zm-RBCS-1基因的序列登录号ZM04G24740在Plaza网站上进行比对分析，得到包含此基因上游约2227bp(p0)和1567bp(p1)的序列。根据二者序列分别设计引物用于扩增Zm-RBCS-1的启动子p0和p1片段。设计用于扩增Zm-RBCS-1启动子p0片段引物为：正向引物5'-CAAGCTTCTGCAGCGCGCATGGCATCGTG-3'（SEQ ID No.4），5'端引入HindIII酶切位点；反向引物5'-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3'（SEQ ID No.3），3'端引入BamHI酶切位点。设计用于扩增Zm-RBCS-1启动子p1片段引物为：正向引物5'-CAAGCTTGGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3'（SEQ ID No.2），5'端引入HindIII酶切位点；反向引物为5'-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3'(SEQ ID No.3)，3'端引入BamHI酶切位点。利用PCR技术从玉米B73的基因组DNA上分别扩增Zm-RBCS-1启动子的p0和p1片段，得到2227bp和1567bp的PCR产物（图1），p1片段的序列如SEQ ID No.1所示，p0片段的序列如SEQ ID No.5所示。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

将扩增得到的PCR产物连接到Promega公司生产的pGEM-Teasy vector载体上，并利用此载体上的T7和SP6引物对基因进行测序，测序结果显示克隆正确。

(2)载体连接

Zm-RBCS-1启动子p0和p1序列5'端含有HindIII酶切位点，3'端含有BamHI酶切位点。将含有p0和p1片段的T载体用HindIII和BamHI进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，分别回收2227bp和1567bp的片段。同样用HindIII和BamHI酶切pBI121载体，电泳并回收约13kb片段。将回收的p0、p1片段和pBI121载体片段分别用T4DNA连接酶连接，获得含Zm-RBCS-1启动子p0或p1片段的载体，分别命名为p0-ZmRBCS-1:GUS和p1-ZmRBCS-1:GUS。

实施例2转基因水稻的获得

(1)种子消毒

取水稻中花11成熟种子，剥去颖壳，在无菌条件下，70%乙醇浸洗30-60秒，倒掉乙醇转入25%次氯酸钠溶液中表面消毒20-30分钟，倒掉废液用无菌水冲洗5-6遍，置于灭菌滤纸上阴干。

(2)愈伤诱导

将盾片向上置于愈伤组织诱导培养基(NB0)，25℃暗培养10天后，在胚的部位长出致密的细胞团-胚性愈伤组织。10-14天以后，愈伤组织可以长到3-5mm大小，此时的愈伤组织为淡黄色，质地致密，呈颗粒状。

(3)愈伤继代

种胚经10-14天培养，其愈伤组织就可以进行继代培养。选择淡黄色、致密的愈伤组织，将其夹碎1-2mm大小，在NB0培养基上，25℃条件下暗培养4天，准备转化。

(4)农杆菌转化：

取200μl农杆菌GV3101感受态细胞，加入1μg实施例1构建的各个质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入lml YEB培养基，28℃慢速振荡培养4小时；1000rpm离心30秒，弃上清，加入0.lmL YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL利福平、40μg/mL庆大霉素和卡那霉素的YEB平板上，28℃培养约48小时。挑取平板上长出的单克隆，接种于YEB液体培养液中，28℃振荡培养过夜，小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。

将鉴定正确的农杆菌单克隆转接到5mL液体YEP中，250rpm,28℃至OD595=0.5后，取上述菌液取1mL转接至100mL AB培养基至OD595=08-1.0。4000rpm10min离心收集菌，等体积AAM重悬4000rpm10min离心。AAM重悬菌体，至OD595=0.4。将愈伤组织浸入菌液中浸染30min，偶尔震荡一下，倒掉菌液。无菌滤纸吸干愈伤组织上多余的菌液，将愈伤组织置于N6-AS培养基上，25℃暗培养2-3天。

(5)筛选和分化

将N6-AS培养基上的愈伤组织夹入100mL的三角瓶中，将愈伤组织用2倍体积的无菌水摇洗5-6次，滤纸吸干表面水分。将愈伤组织放入含500mg/L cef和200mg/L Amp的无菌水中120rpm,25℃2h。无菌滤纸吸干愈伤组织表面水分，将其放入筛选培养基（NB1）上25℃暗培养3-4星期。进行愈伤组抗性筛选与脱菌培养，一般筛选14天，继代一次。取新长出的抗性愈伤组织，对于部分褐色的愈伤，挑取黄色部分，弃掉完全黑化或褐化的愈伤组织。转到预分化培养基（NB2）25℃暗培养3星期。

(6)抗性愈伤组织分化与抗性植株的再生

经过分化处理7-14天后，愈伤组织质地致密、颗粒状明显，转入分化培养基上（NB3）培养25℃14h光照。8-10天后开始出现绿点，14-21天后出现芽、根分化，得到抗性苗。当根长0.5-1.0cm，叶子长3cm时，将其转入生根培养基，促进根系发育。当植株根长至3-4cm，叶子长至7-8cm时，将其转入1/2MS培养液中，5-8天开口与外界环境接触，并及时换水。

(7)温室或大田移栽种植

当幼苗长至15cm左右时移栽温室。

(8)PCR鉴定转基因植株

分别提取水稻中花11(负对照)、p0-ZmRBCS-1:GUS植株和p1-ZmRBCS-1:GUS植株幼苗的叶片DNA，利用PCR技术鉴定其是否为转基因植株。图3-A显示：利用p0的正向引物和反向引物SEQID No.3进行PCR扩增后电泳图谱显示水稻中花11中没有检测到p0片段，而在p0-ZmRBCS-1:GUS植株能检测到p0片段；图3-B显示:利用p1的正向引物SEQ ID No.2和反向引物SEQ ID No.3进行PCR扩增后电泳图谱显示水稻中花11中没有检测到p1片段，而在p1-ZmRBCS-1:GUS植株中能检测到p1片段。以上的实验结果表明获得的p0-ZmRBCS-1:GUS植株和p1-ZmRBCS-1:GUS植株的确都是转入目的片段的转基因植株。

实施例3转基因水稻的GUS活性分析

(1)取材：

p0-ZmRBCS-1:GUS转基因水稻和p1-ZmRBCS-1:GUS转基因水稻的叶片、叶鞘。

(2)洗涤

将材料转入预冷的不含X-gluc的染色缓冲液（0.2%Triton X-100，2mM亚铁氰化钾，2mM铁氰化钾，50μM磷酸钠缓冲液，pH7.2）中洗涤。

(3)染色：

去除洗涤染色缓冲液，加入含X-gluc的染色缓冲液（0.2%TritonX-100，2mM亚铁氰化钾，2mM铁氰化钾，2mM X-gluc，50μM磷酸钠缓冲液，PH7.2）并将样品放到冰上真空抽滤15-20min，直至所有材料都浸没在溶液中。将材料转移到37℃染色数小时至过夜。

(4)脱色：当组织出现蓝色时，去除染色液，用75%乙醇脱色。

(5)直接在显微镜下观察材料并照相。

(6)染色结果表明：p0-ZmRBCS-1:GUS转基因水稻的叶片、叶鞘无论是黑暗处理，还是黑暗处理转入白光，或者是持续白光下生长，都无法检测到GUS活性，P0-Zm-RBCS-1:GUS的叶片、叶鞘GUS染色后没有变蓝；但是p1-ZmRBCS-1:GUS转基因水稻的叶片、叶鞘GUS染色后都能够变蓝，在黑暗处理36小时后，GUS染色程度较弱；转入白光后，随着处理时间的延长，GUS染色程度越来越强；持续白光下生长的叶片和叶鞘，GUS染色程度最强，随着光照时间的延长，GUS蛋白的表达量也越来越多。以上结果表明ZmRBCS-1启动子的p0段不能受到光的诱导，而p1段能够受到光的诱导，这说明在p0与p1之间有可能存在抑制光诱导反应的顺式作用元件。本发明的实验结果证明ZmRBCS-1启动子的p1段具有光诱导的特异性，表明本发明得到了能够受到光诱导的ZmRBCS-1的特异启动子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种植物光诱导型基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序列的由SEQ ID No.1衍生的核苷酸序列。

2.一种植物光诱导型基因启动子的构建方法，具体步骤为：以玉米基因组DNA为模板，根据ZmRBCS-1基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增，获得上述光诱导型基因启动子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述玉米为B73。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述特异性引物的核苷酸序列为：

5’-CAAGCTTGGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’；

5’-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3’。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为95℃5min；94℃45sec，69℃45sec，72℃2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温保存。

6.用于扩增植物光诱导型启动子的引物，其核苷酸序列为：

5’-CAAGCTTGGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’；

5’-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3’。

7.含权利要求1所述启动子的植物表达载体。

8.如权利要求7所述的表达载体，其为p1-ZmRBCS-1:GUS。

9.权利要求1所述启动子在植物基因工程中获得光诱导表达目的基因的转基因植株中的应用。

10.权利要求1所述启动子在培育转基因玉米、水稻中的应用。

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