CN106566825B - 筛选水稻组织特异表达顺式作用元件及其侧翼序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及筛选水稻组织特异表达顺式作用元件及其侧翼序列的方法。根据水稻全生育期表达谱芯片数据库中的信息，将所有组织特异表达基因按照表达模式分类。根据植物顺式作用元件数据库中的信息，对水稻不同组织特异表达基因的启动子区域进行顺式作用元件扫描及统计，选出在绿色组织特异表达基因的启动子区域中高频出现的顺式元件作为绿色组织特异表达相关的候选元件。对其中一个候选元件GEAT的侧翼序列做了生物信息学预测，并将该元件和侧翼序列的组合与‑46Minimal 35S启动子融合以驱动GUS基因表达进行功能鉴定。GUS分析显示，其与绿色组织特异表达相关。通过侧翼序列定点突变试验，找到了对维持GEAT的功能起关键作用的碱基。

Description

筛选水稻组织特异表达顺式作用元件及其侧翼序列的方法

技术领域

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及筛选水稻组织特异表达顺式作用元件及其侧翼序列的方法。

背景技术

启动子是一段调控基因转录的DNA序列，它是基因表达调控环节中最关键的因子，能够精确调控目的基因的表达模式及表达丰度(Cai,M.,Wei,J.,Li,X.,Xu,C.and Wang,S.A rice promoter containing both novel positive and negative cis-elementsfor regulation of green tissue-specific gene expression in transgenicplants.Plant Biotechnol.J.2007,5,664-674)。随着研究的深入，人们在基因组中发现了不同类型的天然启动子，如：组成型启动子、时空特异型启动子、诱导型启动子等。启动子的表达模式和表达强度主要由核心启动子上下游的顺式作用元件决定。顺式作用元件通过与特异的转录因子相结合来调控转录起始的效率、强度及基因表达的特异性，是启动子表达多样性的灵魂。因此，启动子研究中一个很重要的方面就是分析鉴定顺式作用元件的功能。研究启动子顺式作用元件功能的传统方法有缺失分析、凝胶阻滞试验(EMSA)、定点突变和酵母单杂交等。

随着合成生物学的发展(Baltes,N.J.and Voytas,D.F.Enabling plantsynthetic biology through genome engineering.Trends Biotechnol.2014,33,120-131)，人工合成启动子作为合成生物学的重要领域已逐渐成为研究的热点(Venter,M.Synthetic promoters:genetic control through cis engineering.Trends PlantSci.2007,12,118-124)。其中报道较多的是微生物合成启动子的研究，采用的主要策略是将大批量的不同顺式元件或者随机序列与核心启动子融合，筛选与试验设计相符合的合成启动子(Rytter,J.V.et al.Synthetic promoter libraries for Corynebacterium glutamicum.Appl.Microbiol.Biotechnol.2014,98,2617-2623；Sohoni,S.V.,Fazio,A.,Workman,C.T.,Mijakovic,I.and Lantz,A.E.Synthetic Promoter Library formodulation of actinorhodin production in Streptomyces coelicolor A3(2).PLoSOne,2014,9,e99701)。但是这种途径的筛选工作量大，不适合植物尤其是水稻这种生长周期较长的受体生物。

植物合成启动子的研究相对较少，主要利用顺式元件融合核心启动子的方法。2012年，Koschmann等人根据PathoPlant数据库中的拟南芥芯片数据，挑选出受病原菌诱导上调表达的基因，利用BEST软件寻找这些基因启动子区的保守序列，然后与AthaMap，PLACE和AGRIS数据库中的顺式元件进行比对，挑选与已知顺式元件的相似度低或不相似的保守序列，通过合成启动子的方法进行验证(Koschmann,J.et al.Integration ofbioinformatics and synthetic promoters leads to the discovery of novelelicitor-responsive cis-regulatory sequences in Arabidopsis.PlantPhysiol.2012,160,178-191)。2013年，Liu等人将受病原菌和植物防御信号分子诱导的顺式元件与核心启动子融合并稳定转化烟草和拟南芥，对转基因植株进行病原菌、水杨酸、乙烯和茉莉酸甲酯处理，结果证实合成的诱导型启动子在转基因烟草和拟南芥中能够发挥预期功能(Liu,W.et al.Bacterial pathogen phytosensing in transgenic tobacco andArabidopsis plants.Plant Biotechnol.J.2013,11,43-52)。2014年，该研究小组根据大豆基因芯片数据，挑选出受大豆胞囊线虫(SCN)诱导的基因，综合七种生物信息学工具寻找这些基因启动子中可能受SCN诱导的顺式元件，并通过合成启动子的方法在转基因大豆毛状根中对候选的顺式元件进行验证(Liu,W.et al.Computational discovery of soybeanpromoter cis-regulatory elements for the construction of soybean cystnematode-inducible synthetic promoters.Plant Biotechnol.J.2014,12,1015-1026)。在植物中，很多研究工作都集中于诱导型合成启动子方面，组织特异型合成启动子的报道却非常少，在水稻中仍然没有相关的报道。其中重要的原因就是目前已鉴定且功能清晰的组织特异表达相关顺式元件的数量相对较少，同时，针对这一类顺式元件的高通量筛选方法仍没有相关报道。因此，寻找并鉴定更多组织特异表达的顺式元件、建立高通量的筛选方法，对于组织特异表达合成启动子的研究至关重要。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亦是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物。完备的基因组信息(Goff,S.A.et al.A draft sequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.japonica).Science,2002,296,92-100；Yu,J.et al.A draftsequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.indica).Science,2002,296,79-92)及较为清楚的基因表达信息(Wang,L.et al.A dynamic gene expression atlascovering the entire life cycle of rice.Plant J.2010,61,752-766)为组织特异表达顺式作用元件的高通量筛选带来了极大的便利。同时，借助合成启动子来研究诱导型顺式元件的策略也为本发明中组织特异表达顺式作用元件的功能鉴定提供了重要的启发。

发明内容

本发明的目的是在全基因组水平上筛选、鉴定组织特异表达顺式作用元件，并分析它的侧翼序列。本发明对水稻不同组织特异表达基因的启动子区域进行顺式元件扫描及统计，得到十个在绿色组织特异表达基因的启动子区域中高频出现的顺式元件。结合生物信息学分析及试验验证，最终分离克隆了一个可用于合成水稻绿色组织特异表达启动子的通用序列AAAATATTTAT(下划线的碱基为核心元件GEAT)。因为侧翼序列可能会影响核心元件的活性，所以本发明对GEAT的侧翼序列做了详细的功能分析。最终找到了对维持GEAT的功能起关键作用的碱基。本发明为水稻全基因组组织特异表达顺式作用元件的筛选、鉴定及其侧翼序列的分析提供了一个可借鉴的方法。

本发明的总体技术方案如下所述：

根据水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(Collection of Rice ExpressionProfiles)中的信息，将所有组织特异表达基因按照表达模式分为三类：在幼苗，叶片，叶鞘，颖壳，茎杆其中一个或多个组织特异表达的绿色组织特异表达基因、胚乳组织特异表达基因和剩余组织特异表达基因。所述的基因的上游2000bp序列被设定为所述基因的启动子，将所述的3类基因的启动子分别命名为绿色组织特异表达启动子(GSP)、胚乳特异表达启动子(ESP)和剩余组织特异表达启动子(RSP)；根据植物顺式作用元件数据库PLACE中的信息对启动子区进行顺式作用元件扫描分析，并选出在绿色组织特异表达基因的启动子区域中高频出现的顺式元件作为绿色组织特异表达相关的候选元件，共计十个，元件名称及功能注释见表1。对其中一个候选元件ROOTMOTIFTAPOX1(序列为：ATATT，申请人将该序列命名为：GEAT)的侧翼序列做了生物信息学预测，并将GEAT和侧翼序列的组合与-46Minimal35S启动子融合以驱动报告基因β-葡糖醛酸酶基因(以下简称GUS基因)表达进行功能鉴定。转基因水稻GUS分析结果显示，GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎这四个绿色组织中特异表达。最后，申请人通过侧翼序列定点突变试验找到了对维持GEAT的功能起关键作用的碱基：即AA ATATT A(下划线的碱基为GEAT，打点的碱基是维持GEAT功能所必须的)。本发明公开了筛选组织特异表达相关候选元件及预测其侧翼序列的生物信息学方法、合成启动子的构建、转化载体的构建、水稻遗传转化和转化植物的GUS组织化学染色等过程。

本发明的具体步骤是：

根据水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(Collection of Rice ExpressionProfiles)中的信息，将所有组织特异表达基因按照表达模式分为三类：在幼苗，叶片，叶鞘，颖壳，茎杆其中一个或多个组织特异表达的绿色组织特异表达基因、胚乳组织特异表达基因和剩余组织特异表达基因。所述的基因的上游2000bp序列被设定为所述基因的启动子，将所述的3类基因的启动子分别命名为绿色组织特异表达启动子(GSP)、胚乳特异表达启动子(ESP)和剩余组织特异表达启动子(RSP)，基于植物顺式作用元件数据库PLACE(Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)中的信息，对水稻不同组织特异表达基因的启动子区域进行顺式作用元件扫描及统计，淘汰在全部GSP中出现总数少于1000次的顺式作用元件，并选出在GSP中出现频率同时高于在ESP和RSP中出现频率的元件作为绿色组织特异表达相关的候选元件，共计十个，元件名称及功能注释见表1。为寻找新的绿色组织特异表达相关元件，本发明选取未被报道与绿色组织特异表达相关的候选元件ROOTMOTIFTAPOX1(序列为：ATATT，命名为：GEAT)进行功能鉴定。首先对GEAT的侧翼序列进行生物信息学预测(如图2)，然后将GEAT和侧翼序列的组合(GEATFLK，序列如SEQ ID NO：2所示)重复四次并在下游连接-46Minimal 35S启动子(命名为GEATFLK_MINI，结构如图3所示)。将组装好的合成启动子GEATFLK_MINI插入启动子功能分析载体pDX2181的多克隆位点(pDX2181载体图及多克隆位点等信息见图4)，得到重组的植物表达载体GEATFLK_MINI-pDX2181(如图5)。将植物表达载体GEATFLK_MINI-pDX2181转化农杆菌菌株EHA105。

将水稻品种中花11(来源于中国农业科学院作物科学研究所)的成熟种子消毒后诱导胚性愈伤组织。将含有表达载体GEATFLK_MINI-pDX2181的农杆菌菌株EHA105分别与胚性愈伤组织进行共培养后，在含有附加50mg/L潮霉素的筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选，经过两次筛选之后，挑取抗性愈伤转入分化培养基上进行分化，当分化的小苗长到2-3cm时，切掉原生根，转移至生根培养基上进行生根培养，当新根生长到2cm左右时，炼苗后移栽到温室。这些再生小苗即为T₀代转基因苗。同时以-46Minimal 35S启动子插入pDX2181形成的重组载体MINI-pDX2181作为阴性对照。

获得转基因植株后，通过GUS组织化学染色鉴定GEATFLK的功能。检测结果表明：GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎这四个绿色组织中特异表达(如图6)。证明该元件是一个绿色组织特异表达相关的顺式作用元件。

验证GEATFLK的功能后，在确定不产生已知能够促进表达的顺式作用元件的前提下，对其侧翼序列进行定点突变分析：GEATFLK_MUT1-1、GEATFLK_MUT1-2、GEATFLK_MUT1-3、GEATFLK_MUT1-4、GEATFLK_MUT1-5、GEATFLK_MUT1-6、GEATFLK_MUT1-7、GEATFLK_MUT2-1、GEATFLK_MUT2-2和GEATFLK_MUT4，序列分别如SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：12所示。将GEAT和不同突变侧翼序列的组合重复四次并分别在下游连接-46Minimal 35S启动子(分别命名为GEATFLK_MUT1-1_MINI、GEATFLK_MUT1-2_MINI、GEATFLK_MUT1-3_MINI、GEATFLK_MUT1-4_MINI、GEATFLK_MUT1-5_MINI、GEATFLK_MUT1-6_MINI、GEATFLK_MUT1-7_MINI、GEATFLK_MUT2-1_MINI、GEATFLK_MUT2-2_MINI和GEATFLK_MUT4_MINI，结构如图7所示)。将上述组装好的合成启动子分别插入启动子功能分析载体pDX2181的多克隆位点，得到不同的重组植物表达载体。将上述表达载体分别转化农杆菌菌株EHA105。并按照同样的方法转化水稻品种中花11。获得转基因植株后，通过GUS组织化学染色鉴定(如图8)找出了对维持GEAT的功能起关键作用的碱基：AA ATATT A(下划线的碱基为GEAT，打点的碱基是维持GEAT功能所必须的)。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次建立了在水稻全基因组范围内筛选、鉴定组织特异表达顺式作用元件及其侧翼序列功能分析的方法。

(2)本发明鉴定了1个新的水稻绿色组织特异表达顺式作用元件，可用于绿色组织特异表达合成启动子的构建，也为基因工程和分子育种提供了新的顺式元件资源。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明中筛选出的水稻绿色组织特异表达顺式作用元件GEAT的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明中顺式作用元件GEAT维持功能所需的侧翼序列与顺式作用元件GEAT的组合——GEATFLK的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT1-1的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：4是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT1-2的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：5是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT1-3的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：6是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT1-4的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：7是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT1-5的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：8是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT1-6的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：9是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT1-7的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：10是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT2-1的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：11是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT2-2的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：12是本发明中GEATFLK侧翼序列定点突变元件GEATFLK_MUT4的核苷酸序列。

图1：本发明的技术路线图。

图2：顺式作用核心元件GEAT的侧翼序列(上下游各3个碱基)各位点出现的频率(％)。下划线的碱基为GEAT，打点的碱基表示被预测为核心元件GEAT维持功能所需的侧翼序列碱基。

图3：合成启动子GEATFLK_MINI的结构示意图。

图4：是pDX2181质粒图，本发明利用其骨架构建转化载体。

图5：是本发明构建的转化载体GEATFLK_MINI-pDX2181的结构示意图。该载体是在pDX2181的基础上改造而来，将GEATFLK_MINI插入质粒pDX2181的多克隆位点构建而成。图6：由GEATFLK_MINI驱动GUS基因的转化植株的不同组织的组织化学染色结果。图中标记说明：a：根；b：叶片；c：叶鞘；d：穗；e：茎杆；f：种子(含胚与胚乳)；NC：阴性对照。

图7：合成启动子GEATFLK_MUT1-1_MINI、GEATFLK_MUT1-2_MINI、GEATFLK_MUT1-3_MINI、GEATFLK_MUT1-4_MINI、GEATFLK_MUT1-5_MINI、GEATFLK_MUT1-6_MINI、GEATFLK_MUT1-7_MINI、GEATFLK_MUT2-1_MINI、GEATFLK_MUT2-2_MINI和GEATFLK_MUT4_MINI的结构示意图。下划线的碱基为GEAT，打点的碱基表示定点突变的碱基。

图8：由GEATFLK_MUT1-1_MINI、GEATFLK_MUT1-2_MINI、GEATFLK_MUT1-3_MINI、GEATFLK_MUT1-4_MINI、GEATFLK_MUT1-5_MINI、GEATFLK_MUT1-6_MINI、GEATFLK_MUT1-7_MINI、GEATFLK_MUT2-1_MINI、GEATFLK_MUT2-2_MINI和GEATFLK_MUT4_MINI分别驱动GUS基因的转化植株的不同组织的组织化学染色结果。图中标记说明：a：根；b：叶片；c：叶鞘；d：穗；e：茎杆；f：种子(含胚与胚乳)。

具体实施方式

实施例1：组织特异表达相关候选元件的筛选

水稻不同组织特异表达基因的信息由水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(Collection of Rice Expression Profiles,http://crep.ncpgr.cn)获得。根据表达模式将所有组织特异表达基因分为3类：绿色组织特异表达基因(在一个或多个绿色组织，如：幼苗，叶片，叶鞘，颖壳，茎杆中特异表达的基因)、胚乳组织特异表达基因和剩余组织特异表达基因。基因上游2000bp序列被设定为该基因启动子，这3类基因的启动子被分别命名为：绿色组织特异表达启动子(GSP)、胚乳特异表达启动子(ESP)和剩余组织特异表达启动子(RSP)。基于植物顺式作用元件数据库PLACE(Plant Cis-acting Regulatory DNAElements)中的信息对启动子区进行顺式作用元件扫描和统计。根据扫描结果，单个顺式元件在全部GSP中出现总数在1-6000不等。为降低随机事件的影响，去除在GSP中出现总数少于1000的顺式元件。余下的顺式作用元件中，在GSP中出现频率同时高于在ESP和RSP中出现频率的元件被视为可能与绿色组织特异表达相关的顺式作用元件，元件名称及功能注释见表1。

表1可能与绿色组织特异表达相关的顺式作用元件

实施例2：顺式作用元件侧翼序列的预测

根据顺式作用元件在绿色组织特异表达启动子(GSP)和胚乳特异表达启动子(ESP)中的扫描结果确定它维持功能所需的侧翼序列。顺式作用元件的侧翼序列包括上下游各3个碱基。本发明中，侧翼序列碱基的挑选原则基于：在GSP中出现的频率高于在ESP中同一位点出现的频率，同时在GSP中出现的频率高于25％的碱基。侧翼序列预测结果如图2所示。

实施例3：植物表达载体的构建

如无特别说明，本发明的参考方法及相应分子生物学常规操作参考：J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》(中译本)，科学出版社1996版。

本发明首先对GEAT的侧翼序列做了生物信息学预测。将GEAT和侧翼序列的组合(GEATFLK，序列如SEQ ID NO：2所示)重复四次并在下游连接-46Minimal 35S启动子(命名为GEATFLK_MINI，结构如图3所示)，并送交南京金斯瑞生物科技有限公司合成。然后将GEATFLK_MINI通过Hind III和BamH I内切酶位点分别连入启动子功能分析载体pDX2181(载体图及多克隆位点等信息见图4)，得到重组的植物表达载体GEATFLK_MINI-pDX2181(见图5)。将上述重组的植物表达载体转化农杆菌菌株EHA105，将转化后的农杆菌菌株EHA105菌株于-70℃下保存待用。

实施例4：农杆菌介导的遗传转化

农杆菌介导的遗传转化方法主要参照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，2002)。转化受体为水稻品种中花11(为常规品种，来源于中国农业科学院作物科学研究所)的成熟种子所诱导产生的胚性愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛选得到具有潮霉素抗性的愈伤，再经过分化、生根、练苗和移栽，得到转基因植株。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)愈伤诱导

a.将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

b.用灭菌水洗种子4-5次；

c.将种子放在诱导培养基上；

d.将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4)农杆菌培养

a.在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司商业化的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

b.将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

5)农杆菌侵染

a.将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

b.调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

c.将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

d.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

6)愈伤洗涤和选择培养

a.灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

b.浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

c.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

d.转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

7)分化

将生长旺盛的抗性愈伤转入分化培养基中，放置于光照培养室中进行光照培养至分化出再生小苗。

8)生根

待再生小苗的芽长至2-3cm高时即可进行生根。用剪刀和镊子将再生植株在分化培养基上长出的根清除干净，将再生植株芽的下部插入生根培养基中，放置于光照培养室培养直至长出白色的新根。

9)炼苗及移栽

当新根生长到2cm左右时，可进行炼苗：将生根培养基的封口膜揭掉，加入适量自来水，在光照培养室继续培养3天。移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

(2)主要溶液配方

1)N₆培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制：

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

3)铁盐(Fe_2-EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)：

将3.73g乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)：

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(按照10X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(按照100X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

称取2,4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液配制：

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250ul AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250ul AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。使用前加入1ml无菌葡萄糖贮存液和100ul AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250ul HN(50mg/ml)和400ul CN(250mg/ml)分装倒入培养皿中(25ml/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400mg/l，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250mg/l)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250ul HN(50mg/ml)250ul CN(250mg/ml)，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法灭菌。

实施例5：PCR法检测转基因阳性植株

转化苗移入温室后，待其返青，然后分单株取1-2cm幼嫩叶片，抽提其基因组DNA为模板，用PCR法检测阳性植株。扩增片段为报告基因gus的部分片段，大小为699bp。引物序列为GUS-F:GGGCGAACAGTTCCTGATTA，GUS-R:AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR反应条件：94℃5min，94℃50sec，57℃40sec，72℃50sec，30个循环，72℃7min。PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳检测。对所有T₀代植株进行PCR检测，根据检测结果剔除假阳性的转化植株。

小量叶片基因组DNA的提取方法:取适量幼嫩叶片，加800μl 1.5×CTAB(1.5×CTAB配方：1.5％CTAB、75mM Tris-HCl、15mM EDTA及1.05M NaCl)研磨，转入1.5ml离心管中；65℃水浴30min；加入600μL氯仿/异戊醇(体积比为24:1)上下颠倒数次(约15min)，下层液相呈深绿色为止；室温下12000r/min离心10min；取500μL上清于一新1.5ml离心管，加入预冷的95％乙醇1mL，混匀后置-20℃，30min；室温下12000r/min离心10min，去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100μL ddH₂O溶解，备用。

实施例6：利用GUS组织化学染色法鉴定顺式作用元件的功能

取GEATFLK_MINI::GUS的阳性转化植株(参考实施例5)的不同组织(包括：根、叶片、叶鞘、茎杆、穗及种子)切成约0.5CM长度的适当大小，浸入约200μl的GUS染液，于37℃过夜，然后用75％酒精脱色，观察是否有蓝色出现。染色液的配方参照Jefferson等报道的方法(Jefferson,R.A.,Kavanagh,T.A.and Bevan,M.W.GUS fusions:β-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.1987,6,3901-3907)。检测结果表明：GUS基因在转化植株的叶片、叶鞘、穗和茎这四个绿色组织中特异表达(如图6)。证明该顺式作用元件是一个绿色组织特异表达相关的顺式作用元件。

验证GEATFLK的功能后，在确定不产生已知能够促进表达的顺式作用元件的前提下，对其侧翼序列进行定点突变分析。GEATFLK侧翼序列定点突变元件的功能鉴定过程中使用的载体构建、遗传转化和GUS组织化学染色的方法均与上述实施例相同。获得转基因植株后，通过GUS组织化学染色鉴定(如图8)找出了对维持GEAT的功能起关键作用的碱基：AA ATATT A(下划线的碱基为GEAT，打点的碱基是维持GEAT功能所必须的)。

本发明筛选并鉴定出一个可用于合成水稻绿色组织特异表达启动子的通用序列，并对其侧翼序列做了详细的功能分析。本发明也为水稻全基因组组织特异表达顺式作用元件的筛选、鉴定及其侧翼序列的分析提供了一个可借鉴的方法。

Claims (3)

1.一种筛选水稻组织特异表达顺式作用元件及其侧翼序列的方法，其特征包括下列步骤：

(1)从水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP中获得水稻不同组织特异表达基因信息；

(2)根据组织特异表达基因的表达模式将所述的组织特异表达基因分为3类：即在幼苗，叶片，叶鞘，颖壳，茎杆其中一个或多个组织特异表达的绿色组织特异表达基因、胚乳组织特异表达基因和剩余组织特异表达基因；

(3)将步骤(2)所述的基因的上游2000bp序列设定为所述基因的启动子，将所述的3类基因的启动子分别命名为绿色组织特异表达启动子(GSP)、胚乳特异表达启动子(ESP)和剩余组织特异表达启动子(RSP)；根据植物顺式作用元件数据库PLACE中的信息对启动子区进行顺式作用元件扫描分析；

(4)淘汰在全部GSP中出现总数少于1000次的顺式作用元件；

(5)在余下的顺式作用元件中，在GSP中出现频率同时高于在ESP和RSP中出现频率的元件被定为与绿色组织特异表达相关的顺式作用元件；

(6)挑选未被报道的与绿色组织特异表达相关的顺式作用元件进行功能鉴定，选出序列为ATATT的元件ROOTMOTIFTAPOX1进行鉴定，将其命名为GEAT；根据GEAT在GSP和ESP扫描的结果确定GEAT的侧翼序列；所述的侧翼序列包括顺式作用元件的上下游各3个碱基，即，根据在GSP中出现的频率高于在ESP中同一位点出现的频率，同时在GSP中出现的频率高于25％的碱基挑选为侧翼序列；将所述的侧翼序列与GEAT进行组合得到如SEQ ID NO：2所示的序列GEATFLK；

(7)将步骤(6)得到的序列GEATFLK进行4次重复，并置于-46Minimal 35S的上游，同时以-46Minimal 35S为对照，导入启动子功能分析载体pDX2181，转化水稻受体中花11，鉴定序列GEATFLK的功能；

(8)在确定不产生已知能够促进表达的顺式作用元件的前提下，对GEAT的侧翼序列分别进行定点突变；

(9)将GEAT与突变侧翼序列的组合分别进行4次重复并置于-46Minimal 35S上游，导入载体pDX2181，转化水稻中花11验证侧翼序列不同碱基在维持GEAT功能中的作用，所述的GEAT与突变侧翼序列的组合的核苷酸序列如SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：12所示。

2.一种顺式作用元件GEAT在绿色组织中特异表达所必需的侧翼序列与GEAT的组合，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求2所述的序列在水稻遗传改良中的应用。