CN116515889A

CN116515889A - 一种植物叶组织特异性表达dna调控元件及其应用

Info

Publication number: CN116515889A
Application number: CN202310540456.6A
Authority: CN
Inventors: 陆海; 国洪丽; 刘夏曈; 李慧; 刘迪
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2023-05-15
Filing date: 2023-05-15
Publication date: 2023-08-01

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物叶组织特异性表达DNA调控元件及其应用。其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。该DNA调控元件可实现实现基因的定位调控，对决定目的基因的叶片进行特异性表达。

Description

一种植物叶组织特异性表达DNA调控元件及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物叶组织特异性表达DNA调控元件及其应用。

背景技术

基因的差别表达是该基因的特异调节元件如启动子等来调控的。组织特异性基因的启动子对该基因的组织特异性表达起重要作用。启动子的结构分析在科学领域具有广泛的意义，启动子在结构上被表征后，可以获得仅包含与靶基因融合的感兴趣区域的基因构建，以进一步用于植物转化。启动子从各种来源(如细胞受体)接收信号并控制转录起始水平，外源蛋白的表达依赖于引入基因的转录诱导，而启动子允许转基因表达被调节、控制制和微调，对表型的表达方式提供更精确的控制，因此，确定调控元件即调控区域或启动子在一定意义上对植物生长发育是很重要的。常见的启动子区调控元件包括通常位于-70bp~-80bp附近的CAAT box （CCAAT）区和位于-80~-110bp附近的GC box（GGGCGG或GCCACACCC）区等。它们主要负责调节转录起始的频率，控制转录效率，但基本不参与起始位点的确定。

顺式作用元件是指与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。一般情况下顺式作用元件的长度很短，它们是简并的，核心结构只有3到4个bp。转录因子（TFs）作为基因表达的关键调控因子，通过识别启动子区域的特定顺式调控元件来调控靶基因的表达。

植物叶片是植物主要器官之一，叶一般由叶片、叶柄和托叶三部分组成。叶是绿色植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官，同时还具有定的吸收、繁殖和贮藏功能。因此实现关键基因的叶特异性表达对通过基因的定位调控实现基因工程定向调控植物生长发育意义重大。当前，植物叶特异性表达DNA调控元件的报道很少，仅有在编码质体核糖体蛋白的核RPL21基因启动子中发现了一个S2位点(ATACA)，被认为是一个叶片特异性的顺式元件，S2位点的叶片特异性激活是通过与叶片转录因子S2F相互作用实现的。然而，该位点驱动的目的基因在根中也有少量表达。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种植物特异性表达DNA调控元件，该调控元件可以实现基因的定位调控，对决定目的基因的叶片进行特异性表达。

为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种植物特异性表达DNA调控元件，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明另一方面提供一种用于植物特异性表达组合片段，包含上述的植物特异性表达DNA调控元件和启动子。

本发明再一方面提供一种用于植物特异性表达组合片段，上述启动子为35Smini。

本发明再一方面提供一种用于植物特异性表达重组表达载体，其包含上述的植物特异性表达DNA调控元件或上述的用于植物特异性表达组合片段。

本发明再一方面提供一种构建体，其包含上述的植物特异性表达DNA调控元件或上述的用于植物特异性表达组合片段或上述的用于植物特异性表达重组表达载体。

本发明再一方面提供一种工程菌或工程细胞，其包含上述的植物特异性表达DNA调控元件或上述的用于植物特异性表达组合片段或上述的用于植物特异性表达重组表达载体或上述的构建体。

本发明再一方面提供一种上述的植物特异性表达DNA调控元件或上述的用于植物特异性表达组合片段或上述的用于植物特异性表达重组表达载体或上述的构建体或上述的工程菌或工程细胞在培育植株中的应用。

本发明有益效果包括：本发明提供的植物特异性表达DNA调控元件可实现实现基因的定位调控，对决定目的基因的叶片进行特异性表达。

附图说明

图1为pBI121表达载体线性化；M：250bp marker；1：未双酶切空载体；2-11：双酶切载体；

图2为顺式作用元件-35Smini组合片段的PCR产物；M：2000bp marker；1-3：ABC-35Smini；4-6：AAA-35Smini；7-9：BBB-35Smini；10-12：CCC-35Smini；

图3为顺式作用元件-35Smini组合片段融合表达载体示意图；

图4为顺式作用元件-35Smini组合片段重组载体大肠杆菌菌液PCR；1-3：ABC-35Smini；4-6：AAA-35Smini；7-9：BBB-35Smini；10-12：CC-35Smini；

图5为顺式作用元件-35Smini组合片段重组载体双酶切鉴定；M：250bp marker；1：ABC-35Smini重组载体；2：ABC-35Smini重组载体双酶切；3：AAA-35Smini重组载体；4：AAA-35Smini重组载体双酶切；5：BBB-35Smini重组载体；6：BBB-35Smini重组载体双酶切；7：CCC-35Smini重组载体；8：CCC-35Smini重组载体双酶切

图6为顺式作用元件-35Smini组合片段重组载体双酶切鉴定；M：250bpmarker；1-2：ABC-35Smini；3-4：AAA-35Smini；5-6：BBB-35Smini；7-8：CCC-35Smini；

图7为顺式作用元件-35Smini重组载体瞬时侵染来自同一时期的不同植株烟草叶片组织GUS染色；

图8为顺式作用元件-35Smini重组载体瞬时侵染同一时期的同一植株烟草叶片组织GUS染色；

图9为pBI121表达载体线性化；M：250bp marker；1：未双酶切空载体；2-11：双酶切载体；

图10为定点突变顺式作用元件结合35Smini的PCR产物；M：2000bp marker；1-3：（A）BC-35Smini；4-6：A（B）C-35Smini；7-9：AB（C）-35Smini；

图11为定点突变顺式作用元件-35Smini组合片段融合表达载体示意图；

图12为定点突变顺式作用元件-35Smini组合片段重组载体大肠杆菌菌液PCR；M：2000bp marker；1-3：（A）BC-35Smini；4-6：A（B）C-35Smini；7-9：AB（C）-35Smini；

图13为定点突变顺式作用元件-35Smini组合片段重组载体双酶切鉴定；M：250bpmarker；1：（A）BC-35Smini重组载体；2：（A）BC-35Smini重组载体双酶切；3：A（B）C-35Smini重组载体；4：A（B）C-35Smini重组载体双酶切；5：AB（C）-35Smini重组载体；6：AB（C）-35Smini重组载体双酶切；

图14为定点突变顺式作用元件结合35Smini重组载体农杆菌菌液PCR；M：2000bpmarker；1-3：（A）BC-35Smini；4-6：A（B）C-35Smini；7-9：AB（C）-35Smini；

图15为定点突变顺式作用元件-35Smini组合片段重组载体瞬时侵染同一时期的不同植株烟草叶片组织GUS染色；

图16为定点突变顺式作用元件-35Smini组合片段重组载体瞬时侵染同一时期的同一植株烟草叶片组织GUS染色。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

本发明实施例提供一种植物特异性表达DNA调控元件，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

需要说明的是，植物叶特异性表达DNA调控元件的报道很少,仅有在编码质体核糖体蛋白的核RPL21基因启动子中发现了一个S2位点(ATACA)，被认为是一个叶片特异性的顺式元件，S2位点的叶片特异性激活是通过与叶片转录因子S2F相互作用实现的。然而，该位点驱动的目的基因在根中也有少量表达。本发明发现一个全新的叶特异性表达DNA调控元件CCGTTACGTCA（SEQ ID NO：1），可以决定目的基因的叶片特异性表达。

本发明另一实施例提供一种用于植物特异性表达组合片段，包含上述的植物特异性表达DNA调控元件和启动子。

本发明再一实施例提供一种用于植物特异性表达组合片段，上述启动子为35Smini。

本发明再一实施例提供一种用于植物特异性表达重组表达载体，其包含上述的植物特异性表达DNA调控元件或上述的用于植物特异性表达组合片段。

本发明再一实施例提供一种构建体，其包含上述的植物特异性表达DNA调控元件或上述的用于植物特异性表达组合片段或上述的用于植物特异性表达重组表达载体。

本发明再一实施例提供一种工程菌或工程细胞，其包含上述的植物特异性表达DNA调控元件或上述的用于植物特异性表达组合片段或上述的用于植物特异性表达重组表达载体或上述的构建体。

本发明再一实施例提供一种上述的植物特异性表达DNA调控元件或上述的用于植物特异性表达组合片段或上述的用于植物特异性表达重组表达载体或上述的构建体或上述的工程菌或工程细胞在培育植株中的应用。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，实验材料包括：实验室前期保存的经过改造的植物双元表达空载体pBI121；大肠杆菌感受态菌株DH5α、农杆菌感受态菌株GV3101购于上海维地生物技术有限公司；本氏烟草（Nicotianatabacum）植株（土培）种植于实验室的组培间，培养条件为：光照14h/黑暗10h，温度25℃。

以下实施例中，主要实验试剂包括：天根生化科技（北京）有限公司：质粒小提试剂盒，增强型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；南京诺唯赞生物科技有限公司：高保真DNA聚合酶，DNALoadingBuffer；北京擎科生物科技有限公司：DNAmarker、琼脂糖和无缝克隆试剂盒（SoSoCloningKit）；北京百瑞极生物科技有限公司：GoldenView；爱博泰克生物技术公司：PCRMix；NEB（北京）有限公司：限制性内切酶及Buffer；拜尔迪生物技术有限公司：乙酰丁香酮（AS）；TAE缓冲液、GUS染色缓冲液、LB固体/液体培养基、YEB固体/液体培养基、硫酸卡那霉素、利福平等。

以下实施例中，主要实验仪器包括：高压灭菌锅、小型电泳仪、超净工作台、-80℃超低温冰箱、紫外可见分光光度计、紫外仪、恒温摇床、人工气候箱、NANODROP 2000超微量分光光度计、循环水式多用真空泵、水浴锅、离心机、解剖镜等。

实施例1叶特异性表达DNA调控元件驱动基因特异性表达分析

本发明实施例中，将三个候选元件（MYB、TGACG、MYC）顺式元件串联以及将单个元件三个一组串联后分别与35S最小启动子（35Smini）连接，形成4个组合片段。为了便于叙述，以下将MYB、TGACG、MYC这三个元件分别简称为A、B、C元件（ABC-35Smini、AAA-35Smini、BBB-35Smini、CCC-35Smini）。再通过无缝克隆方法分别将组合片段融合到含有GUS报告基因的pBI121载体上，构建顺式作用元件-35Smini-GUS-pBI121融合表达载体。瞬时侵染烟草，通过GUS组织化学染色观察不同顺式元件下驱动GUS活性的差异。

（1）pBI121表达载体质粒的获得与线性化

使用质粒小提试剂盒从大肠杆菌中提取pBI121质粒，对提取的质粒采用Hind III和BamH I进行双酶切，从而将表达载体上的CaMV35S组成型启动子切去，最终使其成为具有粘性末端的线性化表达载体。双酶切结果见图1。

（2）顺式作用元件与35Smini的连接

以提取的pBI121载体质粒作为模板，利用PCR基因扩增的方法将35Smini序列从载体上扩增下来。为了使不同组合方式的顺式作用元件能够和35Smini结合，以及后续与表达载体pBI121的构建，在各个上游引物中引入了表达载体上游的一段同源臂序列（包括Hind III酶切位点）以及不同组合方式的顺式作用元件序列；在下游引物中引入表达载体下游的一段同源臂序列（包括BamH I酶切位点）。其中上游引物分别命名为ABC F、AAA F、BBB F、CCC F，下游通用引物命名为ABC R（见表1）。

表1顺式作用元件与35Smini结合的PCR扩增引物

注：黑色下划线部分为酶切为位点。Hind III：AAGCTT；BamH I：GGATCC；加粗大字体：MYB（CCGTTA）；加粗斜体：TGACGmotif（CGTCA）；加粗大字体斜体：MYC（CATGTG）。

胶回收pBI121线性化载体和顺式作用元件-35Smini组合片段的产物，最终获得4种不同组合方式顺式作用元件-35Smini结合的片段（见图2），分别命名为ABC-35Smini、AAA-35Smini、BBB-35Smini、CCC-35Smini。

（3）顺式作用元件-35Smini组合片段与pBI121重组载体的构建、转化及阳性鉴定

将切除了CaMV35S的线性化表达载体pBI121和顺式作用元件-35Smini组合片段均进行胶回收纯化，然后利用特定的无缝克隆连接酶对线性化载体和目的片段进行同源重组连接，从而构建如图3所示的重组载体。

吸取5μL重组产物转化到50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据热激的方法进行同源重组产物的转化；加入600μL的无抗液体LB到感受态细胞活化1h，活化结束后转化产物涂布到含有Kan抗性的LB固体培养基平板上，37℃恒温倒置培养12h；待平板上长出单菌落后，挑取若干单菌落以进行初步菌液PCR鉴定（图4）。

对PCR鉴定条带正确的菌液，随机选取与其对应的一个，提质粒后进行双酶切验证（图5）。若菌液PCR和双酶切结果均正确，则将相应的菌液送与测序公司测序，检测序列是否正确无突变等。菌液PCR和双酶切结果以及测序均无误的菌液提质粒，转化农杆菌，即吸取5μL质粒产物转化到50μL GV3101农杆菌感受态细胞。

加入600μL的无抗液体YEB到感受态细胞活化3h，活化结束后转化产物涂布到含有Kan和Rif抗性的YEB固体培养基平板上，28℃恒温倒置培养48h。待平板上长出单菌落后，挑取若干单菌落进行农杆菌菌液PCR鉴定（图6），将条带大小正确的相应菌液视为阳性重组质粒，将其分别命名为ABC-35Smini、AAA-35Smini、BBB-35Smini、CCC-35Smini，随后在无菌操作台内进行保菌，以备后用，其中50%甘油和菌液比例为1:1。

（4）重组载体瞬时侵染烟草观察驱动GUS活性的差异

将含有候选顺式作用元件-35Smini组合片段的重组载体的农杆菌菌液瞬时侵染烟草叶片，2d后进行GUS组织化学染色，染色后37℃孵育14h，随后进行乙醇梯度脱色处理，根据GUS染色颜色深浅的情况，观察与35Smini结合后的不同顺式作用元件驱动GUS活性的差异。结果显示（见图7和图8），ABC-35Smini可以驱动GUS的转录；AAA-35Smini、BBB-35Smini、CCC-35Smini均不能正常驱动GUS转录。换言之，当三个候选元件同时存在时基因可以正常表达，而每个单独的元件均不能使基因正常表达。这个结果表明关键区段内应至少两个元件同时存在时，二者相互协调，共同决定叶片特异性表达，A、B或C元件不决定叶片特异性表达。

实施例2叶特异性表达的元件核心结构的验证

本发明实施例中，为了进一步确定启动子中发挥重要作用的候选关键元件的核心结构，将三个候选元件分别进行定点突变，并将点突变后的元件分别与35Smini连接形成定点突变元件-35Smini的组合片段，从而构建含定点突变元件-35Smini组合片段的pBI121重组表达载体。后续通过重组载体瞬时侵染烟草叶片以及GUS化学染色观察各顺式作用元定点突变后驱动GUS活性的差异。

（1） pBI121表达载体质粒的获得与线性化

使用质粒小提试剂盒从大肠杆菌中提取pBI121质粒，对提取的质粒采用Hind III和BamH I进行双酶切，从而将表达载体上的CaMV35S组成型启动子切去（图9），最终使其成为具有粘性末端的线性化表达载体。

（2）定点突变顺式作用元件与35Smini的连接

以提取的pBI121载体质粒作为模板，利用PCR的方法将35Smini序列从载体上扩增下来。为了使定点突变顺式作用元件能够和35Smini连接，以及后续与表达载体pBI121的构建，在各个上游引物中引入了表达载体上游的一段同源臂序列（包括Hind III酶切位点）以及点突变的顺式作用元件序列；在下游引物中引入表达载体下游的一段同源臂序列（包括BamH I酶切位点）。以获得3种不同点突变顺式作用元件与35Smini组合的片段。其中上游引物分别命名为（A）BC F、A（B）C F、AB（C） F，下游通用引物命名为ABC R（表2）。

表2点突变顺式作用元件与35Smini结合的PCR扩增引物

注：黑色下划线部分为酶切为位点。Hind III：AAGCTT；BamH I：GGATCC；加粗大字体：MYB（CTAGGA、CCGTTA和CCGTTA）；加粗斜体：TGACGmotif（CGTCA、CAGCA和CGTCA）；加粗大字斜体：MYC（CATGTG、CATGTG和CCGAGG）；（）：定点突变元件。

胶回收纯化pBI121线性化载体和定点突变顺式作用元件-35Smini组合片段的产物，最终获得4种不同定点突变顺式作用元件与35Smini连接的组合片段（图10），分别命名为（A）BC-35Smini、A（B）C-35Smini、AB（C）-35Smini。

（3）定点突变顺式作用元件-35Smini组合片段与pBI121载体的构建、转化及阳性鉴定

将切除了CaMV35S的线性化表达载体PBI121和定点突变元件-35Smini启动子的组合片段均进行胶回收纯化，然后利用特定的无缝克隆酶对线性化载体和目的组合片段进行同源重组连接，从而构建如图10所示的重组载体。

吸取5μL重组产物转化到50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据热激的方法进行同源重组产物的转化。加入600μL的无抗液体LB到感受态细胞活化1h，活化结束后转化产物涂布到含有Kan抗性的LB固体培养基平板上，37℃恒温倒置培养12h。待平板上长出单菌落后，挑取若干单菌落以进行初步菌液PCR鉴定（图12）。

对PCR鉴定条带正确的菌液，随机选取与其对应的一个，提质粒后进行双酶切验证（图13）。若菌液PCR和双酶切结果均正确，则将相应的菌液送与测序公司测序，检测序列是否正确无突变等。菌液PCR和双酶切结果以及测序均无误的菌液提质粒，转化农杆菌，即吸取5μL质粒产物转化到50μL GV3101农杆菌感受态细胞。

加入600μL的无抗液体YEB到感受态细胞活化3h，活化结束后转化产物涂布到含有Kan和Rif抗性的YEB固体培养基平板上，28℃恒温倒置培养48h。待平板上长出单菌落后，挑取若干单菌落进行农杆菌菌液PCR鉴定（图14），将条带大小正确的相应菌液视为阳性重组质粒，将其分别命名为（A）BC-35Smini、A（B）C-35Smini、AB（C）-35Smini，随后在无菌操作台内进行保菌，以备后用，其中50%甘油和菌液比例为1:1。

（4）重组载体瞬时侵染烟草观察驱动GUS活性的差异

将含有PtoCP1启动子定点突变顺式作用元件结合35Smini组合片段的重组载体的农杆菌菌液瞬时侵染烟草叶片，2d后进行GUS组织化学染色，染色后37℃孵育14h，随后进行乙醇梯度脱色处理，根据GUS染色颜色深浅的情况，观察与35Smini连接后的不同点突变顺式作用元件下驱动GUS活性的差异。结果显示（图15和图16），（A）BC-35Smini和A（B）C-35Smini均消除了GUS的活性，而AB（C）-35Smini不影响GUS活性，也就是说当A元件和B元件中的任何一个发生突变，均不能正常驱动叶片中GUS的转录，而当C元件发生突变时并不影响下游GUS的表达，这个结果表明A和B元件共同存在决定基因特异性表达，而C元件并不影响基因的特异性表达。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims

1.一种植物特异性表达DNA调控元件，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于植物特异性表达组合片段，其特征在于，包含权利要求1所述的植物特异性表达DNA调控元件和启动子。

3.根据权利要求2所述的用于植物特异性表达组合片段，其特征在于，启动子为35Smini。

4.一种用于植物特异性表达重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的植物特异性表达DNA调控元件或权利要求2至3任一项权利要求所述的用于植物特异性表达组合片段。

5.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的植物特异性表达DNA调控元件或权利要求2至3任一项权利要求所述的用于植物特异性表达组合片段或权利要求4所述的用于植物特异性表达重组表达载体。

6.一种工程菌或工程细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的植物特异性表达DNA调控元件或权利要求2至3任一项权利要求所述的用于植物特异性表达组合片段或权利要求4所述的用于植物特异性表达重组表达载体或权利要求5所述的构建体。

7.权利要求1所述的植物特异性表达DNA调控元件或权利要求2至3任一项权利要求所述的用于植物特异性表达组合片段或权利要求4所述的用于植物特异性表达重组表达载体或权利要求5所述的构建体或权利要求6所述的工程菌或工程细胞在培育植株中的应用。