CN103045599A

CN103045599A - 块根特异启动子SpoA-p

Info

Publication number: CN103045599A
Application number: CN201310026289XA
Authority: CN
Inventors: 张聪; 郑雪莲; 蒲志刚; 张婷; 屈会娟; 李明; 吴洁; 谭文芳; 杨松涛; 王大一; 阎文昭
Original assignee: SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2013-01-24
Publication date: 2013-04-17

Abstract

本发明公开了一个块根特异启动子SpoA-p，其具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。此启动子克服了组成型启动子启动外源基因在受体植物中非特异性持续、高效表达所造成浪费的特点,从而避免了在需要该基因大量表达的特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果。红薯是属于块根作物，此特异启动子能使根部外源基因得到表达，用于红薯高淀粉等性状的定向育种。

Description

块根特异启动子SpoA-p

技术领域

本发明涉及基因工程技术，尤其涉及的是一个块根特异启动子SpoA-p，此类启动子克服了组成型启动子启动外源基因在受体植物中非特异性持续、高效表达所造成浪费的特点,从而避免了在需要该基因大量表达的特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果。红薯是属于块根作物，此特异启动子能使根部外源基因得到表达，用于红薯高淀粉等性状的定向育种。

背景技术

启动子是指RNA聚合酶及一些反式作用因子识别并与之结合从而正确有效地起始转录的一段特异性的DNA序列。不同的启动子使基因具有不同的表达特性。能够使基因在大多数的细胞类型中表达的启动子称为组成型启动子,使基因表达能够对特异条件产生响应的启动子为特异性启动子。

植物基因工程技术在解决人类所面临的粮食、能源和环境危机等方面发挥了很大的作用并显示了良好的前景,在植物育种上，他能导入新的基因引入新的性状，弥补传统育种的缺陷。转基因植物中使用较多的是组成型表达启动子,它们是植物基因工程中应用最早、最广泛的一类启动子。

具有持续性,表达量基本恒定。然而,在其发展过程中也不可避免地遇到一些问题,例如外源基因在受体植物内往往会出现表达效率低、表达产物不稳定甚至基因失活或沉默等现象,导致转基因植物无法投入投入实际应用。也正由于这种特点使得外源基因产物可能对植物的生长发育产生不利影响,甚至导致死亡。此外,重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。而使用组织特异启动子可以解决这些缺点。

甘薯储藏蛋白(Sporamin)是一类块根特殊蛋白质，于1985年由Maeshima发现，存在于甘薯块根中而其他器官中则无(Maeshima etal.,1985)，占块根可溶性蛋白的60%-80%，在植物块根中以单体的形式出现，与马铃薯中的Patatin蛋白以及薯蓣中的Discorin蛋白同属变态根茎器官中的特异贮藏蛋白。储藏蛋白分为A、B两个亚族：Sporamin A和Sporamin B(Hattori et al.,1989;Murakami et al.,1986)，每个亚基因家族都包含6个以上的成员(Wettstein and Chua,1987)。

Sporamin的表达具有块根特异性，与块根形态器官的发生有着密切的关系(Hattori and Nakamura,1988;Hattori et al.,1991;Ohto et al.,1992;Takeda et al.,1995)，同时受到植株发育阶段和光合产物的调控。Sporamin是甘薯块根特异贮藏蛋白，其启动子也应具有块根特异性，克隆到该启动子，就可以构建外源基因在甘薯块根中表达的载体，从而实现甘薯块根特异表达外源基因的目的。为此，本研究根据已知Sporamin A基因序列设计引物，通过PCR扩增获得了启动子片段，用克隆的启动子表达GUS基因并分析了该启动子在烟草和甘薯植株的表达特异性。

Sporamin的表达具有块根特异性，与块根形态器官的发生有着密切的关系(Hattori and Nakamura,1988;Hattori et al.,1991;Ohto et al.,1992;Takeda et al.,1995)，同时受到植株发育阶段和光合产物的调控。Sporamin是甘薯块根特异贮藏蛋白，其启动子也应具有块根特异性，克隆到该启动子，就可以构建外源基因在甘薯块根中表达的载体，从而实现甘薯块根特异表达外源基因的目的。

发明内容

本发明提供了一个块根特异启动子SpoA-p，此启动子克服了组成型启动子启动外源基因在受体植物中非特异性持续、高效表达所造成浪费的特点,从而避免了在需要该基因大量表达的特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果。红薯是属于块根作物，此特异启动子能使根部外源基因得到表达，用于红薯高淀粉等性状的定向育种。。

本发明的技术方案如下：

块根特异启动子SpoA-p，其具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

组织特异启动子能使基因定时定位的表达，减少过量表达产物的堆积，SpoAp是一个可诱导性的块根特异启动子，该启动子可以为植物块根特异表达系统研究提供帮助。有研究表明sporamin含量与甘薯块根中淀粉含量呈正相关，通过此启动子的研究能使淀粉合成相关基因在块根中得到特异表达，提高淀粉含量，探索块根淀粉、储藏蛋白的合成机理中的相互关系，为选育获得高淀粉新品种奠定基础。

附图说明

图1为SpoA-p的克隆；M:markerⅤ;1-4：1100bp的SpoA-p；

图2为双酶切鉴定pBI121-SpoA-p:gus；

图3为转基因烟草的获得；其中左图为叶片侵染后共培养；中间图为筛选培养上生成愈伤后出苗；右图为完整烟草再生植株；

图4为转基因甘薯的阳性植株，其中左图为茎段在筛选培养基上长成愈伤；中间图为叶片在筛选培养上生成愈伤；右图为甘薯完整再生植株；

图5为再生植株PCR鉴定；左图：烟草；M:500bp marker；1-7,8-10:阳性植株；7、11：阴性植株；12：阴性对照;13:阳性对照；右图：甘薯；M:markerⅤ；1：阴性对照；2：阳性对照；3-10：阳性植株；11：阴性植株；

图6为烟草转基因植株的GUS染色；烟草根部GUS染色成蓝色；

图7为烟草对照与转基因植株蔗糖诱导前后GUS染色情况；A:烟草对照(左)；阳性再生植株(中)；5%蔗糖诱导抗性再生植株(右);B:b脱去背景色;C:c脱去背景色；D、E、F:分别为C图中的染色根、叶、茎;G、H:显微镜下观察抗性再生植株根染色；

图8为甘薯转基因诱导前后GUS染色，A：转基因植株GUS染色;B,C:5%蔗糖诱导后GUS染色；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1、启动子克隆与分析

川薯34为实验材料提取总DNA，经电泳检测及紫外分光光度计分析。

设计引物：

SpoA-p F：AAGCTTTGCCAAACAGAGCCTAAATCCATC，

SpoA-p R：GGATCCTCATGGTGG CAGATGAGATGACAA，

下划线的序列分别为引入的限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ的识别位点。PCR扩增片段,扩增条件为：94℃5min，94℃1min,56℃1min20s，72℃1min，30个循环。电泳检测PCR产物,回收片段与克隆载体PMD19-T连接，亚克隆测序，得到了1144bp的SpoA-p片段(如图1)。

PLACE数据库(A database of plant cis-acting regulatory DNAelements)在线分析表明：此启动子具有核心启动子元件CAATBOX1，豌豆豆球蛋白基因中此共有序列能控制组织特异性启动子的活性；元件SREATMSD跟蔗糖表达相关；959(-)CANBNNAPA含序列CNAACAC，是油菜储藏蛋白启动子核心组件，胚及胚乳中napin蛋白转录必须的调控因子，具有特异性；300(-)ELEMENT在大麦醇溶蛋白及小麦麦谷蛋白基因启动子的上游元件中也存在；959(-)2SSEEDPR OTBANAPA在很多储藏蛋白启动子中存在，与储藏蛋白基因Nap4启动子的高活性有重要的关联；ACGTATERD1，ABRELATERD1是干旱条件下黄化感应表达所必须的元件，转录调控因子ARR1AT曾在水稻非共生的血红蛋白启动子中发现；CACTFTPPCA1是C4植物叶片基因特异表达的顺式调控元件；359(-)WBOXNTERF3在转录抑制ERF3基因的启动子区发现存在，跟受创伤时激活此基因有关；265(-)CIACADIAN LELHC是西红柿生理节奏表达基因DE启动子的必须区域；950(-)DOFCOREZM是玉米Dof蛋白所需的核心位点，此蛋白质只含有1个锌指结构，是植物所特有的一类转录因子，其N末端保守的单锌指Dof结构域是既与DNA又和蛋白相互作用的双重功能域；同时还包含其他的功能组件(表1)。

表1SpoA-p启动子序列分析

SpoA-p启动子序列为：

AACGACGTTGTAAAACGCATACGGYCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGA

TTAAGCTTTGCCAA

ACAGAGCCTAAATCCAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAACATTATTTTGGTTGAGCTC

GTTGCACAAGATCT

TTTTTGTGCGAGTGGTAAATACTTTGGTTTTATGCAAGAAGTTCCTTAATTACTTTGT

TTATATCTTTAGGT

GCATATATTGTTTAGTTGAAGACAATTGTGTGTTTTTGAGGCATTTTGGATGCATTTG

GAGTCAATGAGAGC

CAAATATGAAGCTAAGGAGATGGATGCAACACTCCCATGAGAGTCTAAGAGTGGTGTT

TTCAATGGTCTTGG

TCATTTGGACAAACCAAAACGTACAAAAGAGAAGCAAAAGAACAAAGGCATTACAATT

CTCGCACTGCACGT

CGACGTCTTAGTATTTAGACCATATCTAAACCTAGGAATATCCAAATGAAGTGATTTA

TGCGCCATTAGAAA

GAAGACTCGAAGGGCTACAACTTTAGCGTAATTCTGAAGACAAAAGGTTCAAAATCAG

CCTACAAAAAAAGT

TTTGTTGCAGAGAGGCTCTCGATGCGTCGAGAATTGGCAGAAAGCTCCCATATGTGTT

CTGGAAATGCTCGA

CGCGTCGAGCCTCCCAGATCTACAAATTTCCAGCTCGTCCCTACTCCTATTTAACATT

TTTTTCACTCATTT

CTTCATGGTTCTGACCCATTTTAGAGCCCTAGCTAGCTTCTCTCTTTCATTTTCTTTA

ATATTTTTAGGTTA

GATTAGGCTTATATTTAGGTTCCTAAACATTTTGGAAGTTTGGATTGAAGCATTTAAT

CTTGGATTTCAAGG

ATTTCATATCAATTTTCAATAGATAAGTTTTTCTTCTCTTTATTTCATTCCTTTGCAA

TTTACTTTCTTGCT

TTATTGCTTTGATCTTTATCTTGTGTTTGCTATTTTTATTATGGTTATGTGTGATTAG

TTCTCCTTGGGGGG

AGGTAGGGATTTAGGCTCTGTTTGGCAAAGCTTAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACC

GAGCTCGAAWTCCG

TAATMATGGTCCATGTAGCTCGTTTTCCTGTGTGAAATTGTTTATCCGCCTCCCCAAT

TTCCCA

实施例2、SpoA-p启动子功能验证

1、载体构建

用SpoA-p替代表达载体PBI121中的CaMV35s,启动GUS基因表达。用HindⅢ及BamHⅠ同时双酶切含有SpoA-p的PMD19-T及植物表达载体PBI121的质粒DNA，回收SpoA-p与PBI121大片段，T4酶连接，转入感受态细胞JM109中。挑取阳性克隆，提取质粒DNA，利用HindⅢ及BamHⅠ双酶切验证pBI-SpoA-p::GUS，得到1144bp的SpoA-p片段，证明构建成功(图2)。采用根癌农杆菌EHA105构建工程菌株EHA105：pBI-SpoA-p::GUS。

2、遗传转化

A烟草：取健壮烟草无菌苗的幼嫩叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm²的小块。用农杆菌(EHA105：pBI-SpoA-p::GUS)感染后共培养3d；经3d共培养转入筛选培养基后叶片变成愈伤，愈伤经分化逐渐长出小苗，后移至含选择压卡那霉素(Kana,购自北京天根生化科技有限公司)的分化培养基上分化出芽；在MS培养基上生根再生出完整植株(图3)。

B甘薯：将甘薯叶片在含20um/L的MS培养基上28℃预培养过夜，农杆菌工程菌株培养至OD值为0.3-0.5，侵染甘薯叶片30min；无菌滤纸吸干多余菌液，接种至含有20g/L Glucose、0.5g/L MES及200μm Acetosyingone共培养基上28℃暗培养3d；后转入含有0.2mg/L2,4-D、0.2mg/L Zeatin和50mg/L kana的筛选培养基上培养60-90d；再移至Gibberellic acid 0.05mg/L的分化培养基上进行再生植株的培养，获得kana抗性的甘薯植株。待幼苗长至5cm左右移栽入土(图4)。

3、转基因植株的分子检测

提取植株总DNA为模板，使用上海生工有限公司合成扩增长度为1000bp的GUS基因特异引物，F:5’-TCTGGTATCAGCGCGAAGTCT-3’,R:5’-TGTCACGCGCTATCA GCTCT-3’。PCR方法扩增检测GUS基因，以质粒DNA为阳性对照，未转化的同一基因型植株总DNA为阴性对照。PCR采用25μL反应体系：约50ngDNA模板，2.5μL10×PCR buffer，2μL2.5mmol/L dNTPs，1.5μL25mmol/L MgCl₂，5μmol/L的上下游引物各1μL，1U Taq DNA聚合酶。PCR特异扩增程序为：94℃5min，94℃1min，56℃2min，72℃1min，30个循环。将阴性、阳性对照及样品DNA进行PCR扩增后，电泳检测有15株烟草跟阳性对照扩出同为1000bp的条带，阴性对照及另5株抗性植株未见条带，由此确定15株烟草被成功导入了SpoA-p；同样有10株甘薯被确定为阳性植株，见(图5)。

4、转基因植株的GUS染色

X-Gluc(5-bromo-4chloro-3-indolyl-b-D-glucuronic acid)购自北京天根生化科技有限公司，配制方法参考《现代植物生理学实验指南》。100mg Gluc，先溶于1mL的DMF，取80mL50mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，加入1mL50mmol/L铁氰化钾、1mL50mmol/L亚铁氰化钾和2mL0.5mol/L EDTA(PH8.0)，再加入已溶解的Gluc，后加20mL的甲醇，混匀后分装保存。分别取分子检测为阳性的烟草及甘薯转基因植株的根、茎、叶放入GUS染液内；同时以未转烟草及甘薯植株作为阴性对照同样放入GUS染液中，37℃过夜，将GUS染液内37℃浸泡过夜的阴性对照、甘薯及烟草的根、茎、叶分用95%乙醇脱色至阴性对照完全为白色，观察并照相。染色结果表明分子检测为阳性的烟草根染出了蓝色，茎、叶及对照的根、茎、叶均未发现蓝色出现(见图6)；而甘薯转基因植株及对照的各个部位都未染出蓝色。推测此启动子可能在甘薯块根储藏蛋白合成时期才能启动基因表达，具有时间表达特异性，GUS染色所检测的是再生试管苗，此阶段SpoA₁不具活性。在储藏蛋白被合成时期，叶片中大量合成的糖份，是储藏蛋白合成的上游碳源，故用5%蔗糖溶液对转基因植株进行了诱导。

5、蔗糖诱导

对得到的转基因烟草植株放置于含5%蔗糖的培养基上诱导培养24h后，取各部位的外植体染色，37℃过夜后发现GUS活性表达较高，整个染色液变成了蓝色，其茎、叶片及叶柄均全部被染色，(图7A)为阴性对照(左)及未脱背景色的阳性植株诱导前(中)后(右)的对比情况，可见对照(未转基因植株)毫无GUS表达。将A中左、右用酒精脱去背景色后即为图7B、7C两图，转入启动子后植株根变成了蓝色，茎、叶无变化,而经过5%蔗糖诱导后根、茎、叶全部变蓝,见图7中D、E、F。将诱导前后的染色根在显微镜下观察，诱导后根GUS表达更高，蓝色较深,见图7中G、H。

对甘薯阳性植株进行GUS染色，根、茎、叶未染出任何颜色，经5%蔗糖诱导后根出现了蓝色，叶、茎未见蓝色出现。烟草及甘薯的蔗糖处理实验证明此启动子受蔗糖的诱导，为诱导型根特异表达启动子。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.块根特异启动子SpoA-p，其具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。