CN103205427B - 一种花生种胚特异性启动子及其克隆和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，克隆获得了一个新的花生LEC1基因的启动子，其基因序列如Seq？ID？No:4所示，该启动子于种子特定发育阶段驱动基因在种胚或胚乳中特异表达。本发明构建了该启动子及6个其5′端系列缺失的启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。最终证实包括5′端非翻译区和其上游启动子驱动的GUS基因特异地在发育早期的种胚中表达，这一启动子的克隆和缺失分析对于研究植物种子发育和储藏物质积累，提高种子中储藏物质如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理论意义和实际应用价值。

Description

一种花生种胚特异性启动子及其克隆和应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的花生基因的特异性启动子的克隆。

背景技术

种子在农业生产和国民经济中占有举足轻重的地位。统计数据表明，人类粮食的80%直接取自植物的种子，稻、麦等种子中富含淀粉，是人类赖以生存的主粮；大豆、花生、油菜、芝麻等种子的含油量高，是食用油的主要来源。种子中储存物质的多少，直接影响作物的产量。因此，提高粮食作物和油料作物产量的根本在于提高其种子中储藏物质的积累量。尽管常规育种技术所培育的优良作物品种，为解决世界粮食安全问题做出了重大贡献。然而，近20年来许多作物产量呈现徘徊局面，新育成品种在产量潜力上没有大的突破，常规育种技术在继续提高作物产量方面的潜力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用转基因技术提高花生等作物产量及种子的含油量具有巨大的应用价值。

被子植物胚胎发育主要经历了3个相互交错的阶段：第一阶段为组织分化期，单细胞的受精卵经过多次分裂，并分化形成胚性组织和器官（即幼胚，从球形胚到心形胚期）；第二阶段为细胞伸长期（胚发育到鱼雷胚期），此时细胞分裂基本停止，以细胞膨大伸长和储藏物质积累为主要特征；第三阶段是成熟脱水期，种子开始脱水标志着胚胎发育成熟，种子经过脱水后代谢活动下降直至静止。对拟南芥种子发育表达谱研究的结果发现，大约289个种子特异性表达基因参与了胚胎发育，其中发现48个在不同发育阶段表达和定位在种子不同区域的转录因子基因对种子发育和储藏物质积累起重要的调控作用。对这些基因进行功能解析和表达调控研究具有重要意义。

花生作为重要的油料作物，不仅在国内农业经济中具有重要地位，而且在世界贸易中也具有举足轻重的作用。研究表明，不同植物种子储藏油脂的含量存在很大差异如主要油料作物油菜为28%-48%、大豆15%-22%、花生44%-54%、芝麻45%-57%，并且其主要脂肪酸组成也不同，油菜油中含有大量的芥酸（31-55%），其他含量较高的不饱和脂肪酸为油酸14-19%、亚油酸12-24%和亚麻酸1-10%；大豆油中含量最高的为亚油酸52-65%和油酸25-36%，并且棕榈酸（6-8%）、硬脂酸（3-5%）和亚麻酸（2-3%）也占有较大比例；花生种子脂肪酸组成主要是：棕榈酸，油酸和亚油酸，分别占总脂肪酸含量的10%、36-67%和15-43%，是除橄榄油外单不饱和脂肪酸油酸含量最高的。研究调控花生种子发育和储藏物质积累相关基因的表达对于通过基因工程改良其他作物具有一定指导意义。

目前在植物基因工程研究中，大多采用的是组成型启动子，如CaMV35S启动子、玉米Ubiquitin启动子等，这些启动子能够驱动外源基因在植物的所有组织和器官中高效表达，造成能量浪费，有些外源基因的表达还影响了植物的正常发育。为在确保植物正常生长的情况下，对目标性状进行转基因遗传改良，调控基因在一定发育时期和特定组织中表达非常重要。因此，寻找时空特异性表达启动子十分重要，也具有重要应用价值。

发明内容

基于上述的原因，本发明克隆获得了一个新的花生LEC1基因的启动子，该启动子于种子特定发育阶段驱动基因在种胚或胚乳中特异表达。本发明构建了该启动子及6个其5′端系列缺失的启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，包括5′端非翻译区和其上游2228bp启动子驱动的GUS基因特异地在发育早期的种胚中表达；而缺失5′端975bp-2009bp的1254bp、935bp、721bp、617bp启动子驱动的GUS基因在根、茎、叶、花和发育早期的种子中均有表达，表明-2228bp至-1255bp区段不仅含有种子特异性表达的正调控元件，还包括抑制在其他组织中表达的负调控元件。缺失5′端1875bp的354bp启动子驱动的GUS基因在叶和发育早期的种胚中表达，在根中有少量表达，而在茎和花中没有表达。进一步缺失5′端2124bp的105bp启动子驱动的GUS基因仅在叶缘处表达，其余组织和器官都未检测到表达。因此，这一启动子的克隆和缺失分析对于研究植物种子发育和储藏物质积累，提高种子中储藏物质如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理论意义和实际应用价值。

该启动子能驱动GUS基因在种子发育早期的种胚中特异表达。营养生长期的根、茎、叶中和进入生殖生长期的花中不表达。其基因序列如Seq ID No:4所示。

该启动子是在已得到的花生AhLEC1A基因的基因组序列（该基因其序列为：如Seq ID No:2所示）的基础上，通过染色体步移技术得到的2739bp AhLEC1A基因5′端上游序列，如Seq IDNo:1所示。经转录起始位点分析发现，AhLEC1A基因转录起始位点位于翻译起始密码ATG上游-82nt处，故2739bp5′端上游序列中包含该基因2625bp的启动子区，该区域的序列如Seq ID No:3所示。通过PlanCARE和PLACE软件对该启动子进行顺式调控元件分析，有2个胚乳特异性调控元件SKn-1 motif（GTCAT），分别处于-83～-87bp和-479～-483bp处；在-448～-454bp和-1603～-1609bp处分别有一个胚或胚乳特异性作用元件CANBANAPA（CNAACAC）；在-1244～-1253bp、-2078～--2087bp和-2271～-2280bp处分别有一个种子特异性表达转录因子基因AGL15结合位点CARGCW8GAT（CWWWWWWWWG）；此外，还有四个胚特异性的ABA作用相关的DPBFCOREDCDC3元件（ACACNNG）分布在-116～-120bp、-450～-456bp、-1326～-1332bp和-1329～-1335bp处。获得的2625bp启动子序列中还包括大量在叶肉细胞、根和花中特异表达的元件CACTFTPPCA1（YACT）、ROOTMOTIFTAPOX1（ATATT）和POLLEN1LELAT52（AGAAA），同时包含13个转录的负调控元件WBOXATNPR1（TTGAC）、WRKY71OS（TGAC）。这些负调控元件中5个位于启动子-1255～-2228bp区段（分别位于-1613～-1616bp、-1649～-1652bp、-1953～-1956bp、-2144～-2147bp、-2156～-2159bp），-2228～-2625bp还集中分布了4个WRKY71OS元件（-2275～-2278bp、-2281～-2284bp、-2445～-2448bp、-2472～-2475bp），-1～-1254bp区段仅含有4个WRKY71OS元件（位于-82～-85bp、-97～-100bp、-478～-481bp和-870～-873bp）。因此，该启动子驱动的GUS基因在种胚中特异表达受种子特异性表达调控元件和抑制在其他组织中表达的负调控元件的共同调控。存在的种子特异性表达调控元件和转录负调控元件的位置如说明书附图2所示。

为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以pCAMBIA3301为出发载体构建了含有AhLEC1A基因不同长度启动子片段的GUS基因植物表达载体，即用AhLEC1A基因不同长度启动子片段取代pCAMBIA3301中驱动GUS基因表达的35S启动子，获得的植物表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南芥繁殖开花时，配制浸染液，用农杆菌浸染将要开放的花序。

本发明分别取营养生长期的转基因拟南芥幼苗的根、茎和叶以及繁殖期的转基因拟南芥的花、授粉后10天和20天的种子，通过现有的方法检测GUS基因的表达情况。本发明发现，本发明所提供的启动子区域中，2228bp的启动子，其基因其序列如Seq ID No:4所示，即可驱动的GUS基因仅在授粉后10天的种胚中表达，在营养生长期的根、茎、叶和生殖期的花中均不表达，在授粉20天的种子中也没检测到GUS基因的表达。由此可见，本发明克隆的花生AhLEC1A基因的启动子具有早期发育种胚表达特异性，即表达的时空特异性。

通过上述实验，发明人证实了，在本发明提供的2625bp的启动子区内缺失了5′端396bp片段的2228bp具有早期发育种胚表达特异性，通过克隆出的2228bp特异性启动子，其基因其序列如Seq ID No:4所示，即可在早期发育的胚中特异表达，同时利用这种特异性表达在早期发育胚中特异表达，可以应用在提高种子储藏物质含量中；构建该启动子和相关基因的表达载体，调控淀粉、油脂或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量；该启动子是一个时空特异性表达的启动子，因此，该启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研究也具有重要意义。

附图说明

图1：扩增的花生AhLEC1A基因2739bp5′端上游序列扩增的电泳图，

图中M为Trans5K DNA Marker，LD、LE、LP和LS为不同基因组文库扩增结果，LP泳道箭头所指为扩增的目的启动子片段；

由图中结合实施例可知，扩增得到的序列为2739bp，包括2625bp的启动子序列、82bp 5′非编码区序列和32bp包括扩增引物序列在内的ORF区序列；

图2：花生AhLEC1A基因启动子区域可能的顺式作用元件；

图3：花生AhLEC1A基因启动子序列与GUS基因的融合表达载体的构建流程图；

图4：PCR检测具不同长度启动子驱动的GUS基因表达结构部分转基因拟南芥；

图中编号36为启动子大小105bp，37为354bp，38为617bp，39为721bp，40为935bp，41为1254bp，42为2228bp；M均为DL2000DNA Marker，其条带分子量大小自上而下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；

图5：本发明所提供的2228bp启动子驱动的GUS基因表达结构转基因拟南芥种子GUS活性组织化学检测图；

由图可见授粉后10天的种子（上面8个）在胚胎发育的位置染为蓝色（箭头所示），而授粉后20天的种子（下面8个）在任何部位均未检测到GUS染色；

图6为图5的彩色示意图；

图7：本发明所提供的2228bp启动子驱动的GUS基因表达结构转基因拟南芥根、茎、叶和花GUS活性组织化学检测图；

图中42-9为转入2228bp启动子的基因株系号，CK-P为转基因阳性对照，CK-N为未转基因阴性对照；

由图可见，无论根、茎、叶还是花仅有CK-P检测到GUS染色，42-9株系和CK-N不同材料的所有样品均未检测到蓝色染色信号；

图8为图7的彩色示意图。

具体实施方式

本发明的实施步骤是根据花生AhLEC1A基因的基因组DNA序列用染色体步移的方法克隆得到该基因的启动子序列→启动子顺式作用元件分析及功能预测→涉及带有酶切位点HindⅢ和Nco Ⅰ的引物从启动子DNA上扩增得到不同长度的目的启动子序列→用同样的酶HindⅢ和Nco Ⅰ酶切载体pCAMBIA3301→目的片段连接到酶切的pCAMBIA3301载体上→含植物表达载体的农杆菌转化拟南芥→转基因拟南芥鉴定和筛选纯合体转基因株系→GUS组织化学染色检测GUS表达部位及强度，分析启动子功能。本实施例中的其他技术均采用已有技术。

实施例1花生AhLEC1A基因启动子的克隆

1.1花生基因组DNA的提取

用植物DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司产品）提供的方法提取花生幼叶的DNA，溶解于适量TE（pH8.0）缓冲液中。

1.2花生AhLEC1A基因启动子的克隆

分别取2.5μg花生基因组DNA经DraI、EcoRV、PvuII、StuI内切酶酶切、苯酚抽提纯化后，溶解于20μl TE(pH7.5)缓冲液中。分别取4μl酶切完全的DNA，按照BD Genome WalkerUniversal Kit的要求连接上Adaptor（序列：5′GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3′，如Seq ID No:5所示），构建4个花生基因组DNA文库（LD、LE、LP、LS）。根据已获得的花生AhLEC1A基因的基因组序列，设计该基因的2个嵌套的3′端特异性引物LEC1AGSP1-3（5′TGGGGATGGATAGAGAAACCAACGAGA 3′，如Seq ID No:6所示）和LEC1AGSP2-2（5′TGATAACCGTGAAAGCCTCCTCCAGT 3′，如Seq ID No:7所示）。以AP1（5′端接头引物：5′GTAATACGACTCACTATAGGGC3′，如Seq ID No:8所示）和LEC1AGSP1-3为引物进行第一轮扩增，扩增体系为25μl，模板量为1μl，扩增条件为：94℃25sec，72℃3min，7个循环；94℃25sec，67℃3min，32个循环；最后67℃继续延伸7min。第二轮巢式PCR模板为1μl第一轮PCR产物10倍稀释液，引物为5′端巢式接头引物AP2（5′ACTATAGGGCACGCGTGGT 3′如Seq ID No:9所示）和LEC1AGSP2-2，扩增体系与第一轮PCR相同，扩增条件94℃25sec，72℃3min，5个循环；94℃25sec，67℃3min，20个循环；最后67℃继续延伸7min。1%琼脂糖电泳检测PCR结果。

挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。

1.3RNA提取和转录起始位点确定

用CTAB法提取不同发育时期种子的总RNA，经琼脂糖电泳检测RNA质量和分光光度计定量后，等量混合储存于–80℃冰箱备用。为防止RNA酶污染,研钵、研锤、药匙均以180℃烘烤6h,所用塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡,于室温下过夜后,高温灭菌处理。

用Invitrogen公司GeneRacer^TM Kit提供的方法和试剂，取5μg混合好的LH14种子总RNA，按照说明书要求用碱性磷酸酶（CIP）将截断的mRNA或其他非mRNA5′端去磷酸化，然后将抽提纯化并沉淀的全长mRNA脱去帽子结构，并连接上RNA接头（GeneRacer RNA Oligo：5′CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA 3′，如Seq ID No:10所示）；以此RNA为模板，用试剂盒提供的随机引物和SurperScript^TM Ⅲ RT酶反转录合成cDNA；最终将合成的cDNA克隆至载体pCR4-TOPO中，获得LH14不同发育时期种子全长cDNA文库，用于随后转录起始位点扩增。根据已获得的花生AhLEC1A基因的cDNA序列，设计2个该基因的3′端特异性引物，引物序列为：TSS GSP1-15′TCTTTTGCGTCGTCGGAGATTTTAGC 3′，如Seq ID No:11所示，TSS GSP2与LEC1AGSP2-2相同。以构建的cDNA文库为模板，分别以TSS GSP1-1引物与GeneRacer^TM 5′Primer（5′CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3′，如Seq ID No:12所示）进行第一轮PCR扩增，PCR体系参照BD Advantage^TM2 PCR Kit要求，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃ 30 sec，72℃30sec，5个循环；94℃ 30 sec，70℃ 30sec，5个循环；94℃ 30 sec，63℃ 30sec，68℃ 30sec，20-25个循环；最后68℃继续延伸10min。第一轮PCR产物经电泳检测后，用缓冲液稀释50倍，用于第二轮巢式PCR。取1μl第一轮PCR产物，以TSS GSP2和GeneRacer^TM5′Nested Primer（5′GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA 3′，如Seq ID No:13所示）进行第二轮PCR，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃ 30 sec，65℃ 30 sec，68℃ 10 sec，35个循环；最后68℃继续延伸10min。1.5%琼脂糖电泳检测PCR结果。

挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到pEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。

1.4启动子序列分析

应用在线植物转录元件分析工具PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）、PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对花生AhLEC1B启动子序列进行分析。

1.5不同长度花生AhLEC1A基因启动子片段的扩增

设计克隆不同长度AhLEC1A基因启动子所需的引物，引物P1为3′端下游引物位于5′UTR区，序列如Seq ID No:14所示；引物P2-P8为5′端上游引物，序列如Seq ID No:15-21所示。引物P1中下划线部分CCATGG为Nco Ⅰ酶切位点，其余部分为5′UTR序列；引物P2-P8中下划线部分AAGCTT为HindⅢ酶切位点，其余部分为启动子序列。利用引物P1分别和P2-P8，以已克隆的含有AhLEC1A基因2265bp启动子的重组质粒为模板，扩增不同长度的启动子片段，扩增片段长度分别为2228bp、1254bp、935bp、721bp、617bp、354bp和105bp。

PCR扩增体系为20μl：包括10×PCR buffer 2μl，dNTP mixure（各2.5mM）1μl，上、下游引物各1μl，模板DNA1μl，Taq酶0.25μl，加ddH₂O补足20μl。反应程序为：预变性94℃ 2min；变性94℃ 30 sec，退火55℃ 30 sec，延伸72℃ 30 sec-2min（根据扩增片段长度调整），30个循环；最后72℃继续延伸10min。

扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，并测序验证序列正确。

表1.AhLEC1A基因启动子缺失分析引物

实施例2 植物表达载体的构建与转化

2.1花生AhLEC1A基因启动子序列与GUS报告基因的融合

选择pCAMBIA3301作为植物表达载体，将PCR扩增得到的目的片段酶切，电泳并胶回收。同时用限制性内切酶HindⅢ和NcoⅠ酶切表达载体，并回收载体片段。连接启动子片段与载体片段，经质粒酶切图谱鉴定筛选含不同长度启动子的pCAMBIA3301-AhLEC1A启动子重组载体。具体过程可参考附图3：

1.用带有酶切位点的引物P1分别和带不同酶切位点的P2-P8扩增花生AhLEC1A基因的不同长度启动子序列，并凝胶电泳分离和回收目的片段。

2.用HindⅢ和NcoⅠ双酶切回收目的片段和植物表达载体pCAMBIA3301。

3.回收：进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有AhLEC1A启动子序列的DNA片段和pCAMBIA3301载体片段。

4.连接，连接体系如下：

混匀后16℃连接过夜。

5.转化：取5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素的固体培养基平板上。

6.重组子的筛选：对长出的菌落进行重组质粒酶切图谱鉴定。

2.2农杆菌感受态细胞的制备

1.挑取单菌落LBA4404，接种于5ml加有50mg利福平（Rifampicin）的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜培养。

2.取2ml培养物至100ml液体LB培养基中，继续培养至OD600为0.8左右。将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min。

3.弃上清。用10ml0.1mol/L冷的NaCl悬浮菌体；4℃，5000rpm，离心5min。

4.弃上清。用1ml 20mmol/L冷的CaCl₂悬浮菌体，分装成50μl/管，液氮中速冻后，-80℃保存。

2.3冻融法转化农杆菌

1.冰上融化农杆菌LBA4404感受态细胞，加入1μl带有目的片段的pCAMBIA3301质粒，冰冻30min，液氮中冷冻1min，然后在37℃水浴5min。

2.加入1ml无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3h。

3.10,000rpm离心1min收集菌体，用100μlYEP液体培养基重悬菌体。

4.将重悬的菌体涂布于附加50mg/L卡那霉素（Kanamycin sulfate）和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃下培养2-3天。

5.酶切及PCR鉴定阳性克隆。

2.4农杆菌介导转化拟南芥

1.农杆菌的培养：从-80℃冰箱中取出所要的菌种，在冰浴中融化。分别取30μl的农杆菌接种于5ml的YEP培养基（含100mg/L利福平，50mg/L卡那霉素），28℃，200rpm，振荡培养过夜。然后在附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上划板培养，已挑选单菌落。

2.花序浸染液的配制：配制50ml浸染液，需加入2.5g蔗糖（终浓度5%）和15μl Sliwet L-77（终浓度0.03%）。

3.花序浸染：将拟南芥种子表面消毒后播种于MS固体培养基平板上，待种子萌发长出子叶后，移入蛭石中培养至拟南芥开花，期间浇营养液维持幼苗健壮生长。浸染前，提前准备菌液。挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于含100mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至对数生长期（约48h）；将菌液用MS液体培养基稀释10倍备用。将摇好的菌液转入离心管中5000rpm离心10min；去上清，用适量浸染液重悬菌体，轻微振荡混匀。去掉开过的花，将整个花序浸入菌液中30s，然后用保鲜膜包裹花序，至黑暗中平放2天后，转至光下培养。

2.5转基因植株的鉴定

待浸染后的拟南芥接种后，将种子在4℃春化10天，然后播种于含80mg/L卡那霉素的MS培养基中筛选，能在含卡那霉素培养基中萌发生长的拟南芥，可初步确定为转基因的拟南芥。种子萌发长出子叶后，移入蛭石中生长。为进一步鉴定抗卡那霉素植株为转入目的启动子片段的转基因植株，取每个植株的一片小叶提取基因组DNA，通过PCR的方法进行目的片段鉴定（如图4所示）。所用引物和程序如扩增启动子时所用的引物和程序。得到目的片段，经测序证明所得植株中确实转入了该发明所克隆的不同长度的启动子片段。

实施例3 对转基因植株不同组织和不同发育时期的种子进行GUS活性组织化学染色

3.1GUS活性组织化学染色的方法：

1.样品放入冰水混合物冰浴2min；

2.样品用滤纸吸干后放入离心管中，加入90%丙酮浸泡样品10min；

3.用GUS染色buffer迅速清洗一遍样品后，加入GUS染色液浸染5min，倒掉染液；

4.加入适量染液浸没样品，抽气2次，每次5min；

5.37℃恒温保存过夜；

6.加入无水乙醇脱色，然后转移至水中。肉眼或解剖镜下观察、照相。

3.2GUS染色buffer配方：

100ml buffer

ddH₂O定容至100ml。

3.3GUS染色液配方

用800μl DMSO溶解100mg X-Gluc，加入GUS染色buffer定容至100ml。

3.4对转基因植株不同组织和不同发育时期的种子进行GUS活性组织化学染色

分别取各转基因株系营养生长期的根、叶（4片莲座叶）和茎，以及繁殖期刚刚开放的花和授粉后10天、20天的种子进行GUS活性组织化学染色，如图5和7所示，发现2228bp启动子驱动的GUS基因仅在授粉后10天的种胚中表达，在营养生长期的根、茎、叶和生殖期的花中均不表达，在授粉20天的种子中也没检测到GUS基因的表达。

Claims (3)

1.一种花生LEC1基因特异性启动子，其特征在于：其核苷酸序列如Seq IDNo.:4所示。 

2.根据权利要求1所述的特异性启动子，其特征在于：该启动子能驱动GUS基因在拟南芥发育早期的种胚中特异表达。 

3.如权利要求1所述花生LEC1基因特异性启动子在研究拟南芥种子发育和储藏物质积累上的应用。