CN105602957B - 棉花纤维特异表达启动子tb7p1及其应用 - Google Patents

棉花纤维特异表达启动子tb7p1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棉花纤维特异性表达启动子TB7P1及其应用，启动子TB7P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用基因工程技术成功地分离了含2010bp片段的棉花纤维特异表达GhTUB7基因的TB7P1启动子。验证了TB7P1启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，能够指导报告基因在棉花纤维中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维特异性表达的启动子。本发明的TB7P1启动子与组成型启动子相比，具有较高的表达效率和纤维表达特异性；在改良纤维的基因工程中，能够很好地避免目的基因在其它组织器官表达带来的副作用；为进一步研究基因在纤维发育中的功能提供了新选择。

Description

棉花纤维特异表达启动子TB7P1及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体的说，涉及一种棉花纤维特异表达启动子TB7P1及其应用。
背景技术
我国是棉花生产和消费大国，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位。传统的育种方法曾在棉花品种改良上取得了较大的成功，但近20年来，世界棉花品种的产量已经达到平台期。因此，利用现有的遗传资源和传统育种手段难以再大幅度提高棉花产量。基因工程方法具有后代易于稳定，育种周期短等优点，可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移。利用基因工程改良棉花产量和纤维品质是解决这一难题的有效途径。但基因工程在作物改良中的作用发挥取决于三个方面的进展程度：目标基因的功能、调控目标性状的分子机理和控制目标基因在特定部位和特定时间表达的特异启动子。在棉花纤维品质和产量的基因工程改良中，常常需要在纤维细胞中超量或抑制一些基因的表达，来达到提高产量或改良品质的目的。在棉花纤维发育的分子机理研究中，也需要纤维细胞特异表达启动子来上调或下调目标基因的表达，进而分析其在纤维细胞中的功能。最大限度地减少目标基因对其他组织和器官的不良影响。但是，目前已报道的具有棉花纤维特异性的启动子非常有限。因此，棉花纤维特异启动子的克隆，对棉花纤维发育相关基因功能研究和棉花纤维的基因工程改良，具有十分重要的意义。
近年来，植物组织器官和发育特异性表达的研究成为植物分子生物学的一个重要研究领域，特别是在植物基因工程的实用化阶段中，为了使目的基因在特定的组织器官和特定的发育阶段优先表达，对组织特异性表达的研究更是成为热点。由于棉花纤维的发育直接影响纤维的品质和产量。因此，研究和筛选纤维特异表达的启动子不仅有助于解析基因表达调控的分子机制，并可为植物基因工程提供有用的调控元件，有着重要的理论意义和应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决现有技术对棉花纤维特异性表达启动子的研究和筛选不足的技术问题，提供了一种棉花纤维特异表达启动子TB7P1及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种棉花纤维特异性表达启动子TB7P1所述启动子TB7P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了一种含有上述启动子TB7P1的表达载体。
进一步的，所述表达载体为植物表达载体。
优选的，所述植物表达载体为pBI121-TB7P1::GUS。
本发明再公开了一种含有上述表达载体的宿主。
优选的，所述宿主为根癌农杆菌。
优选的，所述根癌农杆菌为农杆菌LBA4404。
本发明再公开了一种上述启动子TB7P1在制备转基因植物中的应用。
优选的，所述转基因植物为棉花。
本发明再公开了一种上述表达载体在制备转基因植物中的应用。
优选的，所述转基因植物为棉花。
本发明再公开了一种含有上述植物表达载体的宿主在制备转基因植物中的应用。
优选的，所述转基因植物为棉花。
本发明再公开一种利用启动子TB7P1制备转基因植物的方法，包括以下步骤：
(1)将所述启动子TB7P1插入到表达载体中，构建植物表达载体；
(2)将获得植物表达载体导入宿主，获得转化体；
(3)用所述转化体转化植物，培养转化后的植物，获得转基因植物。
进一步的，所述转基因植物为棉花，包括以下步骤：
(1)将所述启动子TB7P1可操作地插入到表达载体中，构建植物表达载体；
(2)将获得植物表达载体导入宿主，获得转化体：
(3)用所述转化体转化棉花愈伤再生组织，培养所述棉花愈伤再生组织，经筛选和诱导获得含棉花纤维特异性启动子TB7P1的棉花植株。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明提供了微管蛋白基因GhTUB7的启动子(TB7P1)及应用，该启动子是一个棉花纤维细胞特异表达启动子。
2)本发明利用基因工程技术成功地分离了棉花纤维特异表达的GhTUB7基因的启动子，所述TB7P1启动子含2010bp片段。
3)本发明还验证了TB7P1启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，能够指导报告基因在棉花纤维中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维特异性表达的启动子。
4)本发明的TB7P1启动子与组成型启动子(如CaMV35S启动子)相比，具有较高的表达效率(多数纤维特异性启动子表达效率极低)和纤维表达特异性；在改良纤维的基因工程中，能够很好地避免目的基因在其它组织器官表达带来的副作用。
5)本发明为进一步研究基因在纤维发育中的功能提供了新选择，同时为改良棉花品种和纤维品质的分子设计提供了有效途径。
当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1中GhTUB7基因在棉花不同器官和组织中的表达特性；
图2为本发明实施例1中GhTUB7基因在棉花纤维和胚珠不同发育时期的表达特性；
图3为本发明实施例1中TB7P1启动子序列上具有的顺式调控元件；
图4为本发明实施例2中pBI121-TB7P1::GUS植物表达载体图谱；
图5为本发明实施例2中启动子分析植物表达载体的酶切验证电泳图；
图6为本发明实施例3中扩增验证转基因棉花中的GUS基因电泳图；
图7为本发明实施例3中TB7P1启动子在转基因棉花根、茎和叶中的表达情况图；
图8为本发明实施例3中TB7P1启动子在转基因棉花花器官中的表达情况图；
图9为本发明实施例3中TB7P1在转基因棉花纤维发育过程中的表达情况图。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
除非另有说明，本发明实施例中的试剂、药品、材料均为市售可得，方法均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。
在本发明的下述实施例中，所用的棉花实验材料为徐州142(Gossypium hirsutumL.cv徐州142)，来源于中国农业科学院棉花研究所。转基因受体为冀棉14，来源于河北农业大学。
实施例一
1、棉花RNA的提取
选取新鲜棉花材料(根、茎、叶、花、开花后0天的胚珠和纤维至开花后6天的胚珠和纤维、开花后6天的纤维至开花后20天的纤维、开花后6天的胚珠至开花后20天的胚珠)，利用北京艾德来(Aidlab，中国)生物科技公司的EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(货号：RN09)提取各个样品的总RNA，具体操作按说明书进行。
2、cDNA一链合成
利用宝生物工程有限公司(TakaRa，中国大连)的cDNA一链合成试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，货号：RR047A)和实验1提取的总RNA，合成cDNA一链。于-20℃冻存产物。
3、GhTUB7基因在棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期中的表达特性
运用实时定量PCR扩增分析GhTUB7的表达水平。采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行扩增，在20微升的反应体系中包括10微升扩增混合缓冲液(试剂盒提供)，5'-端和3'-端引物各1微升(5微摩/升)，cDNA一链1微升，用水补足至20微升。循环参数为94℃预变性3分钟；94℃，30秒，54℃，30秒，72℃，30秒，预设循环数为40。用棉花Histone3基因作内标，Histone3的5'-引物是GhHIS1(5'-ATGCCCAAGGACATCCAGTTG-3')(如SEQ ID NO.2所示)，3'-引物为GhHIS2(5'-CCTACCACTACCATCATGGCT-3')(如SEQ ID NO.3所示)。扩增GhTUB7基因的5'-引物序列为GhTUB7-1(5'-ACAGAAGCGGAAAGTAACA-3')(如SEQ ID NO.4所示)，3'-引物序列为GhTUB7-2(5'-AATAAACAAGCCAAAGTGA-3')(如SEQ ID NO.5所示)。
按上述实验1和2的方法获得棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期的总RNA进行实时定量RT-PCR分析。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带，每个样品重复3次。
结果如图1所示，GhTUB7基因在棉花根、茎、叶、花、雄蕊和雌蕊中都不表达，在开花后16天的胚珠中有微量表达，在开花后16天的纤维细胞中表达量极高。说明GhTUB7基因具有明显的纤维细胞表达特异性。图2中，0、2、4分别表示开花后0天的胚珠(含纤维)至开花后4天的胚珠(含纤维)；6-F～22F:分别表示开花后6天的纤维至开花后22天的纤维；6-O～20-O:分别表示开花后6天的胚珠至开花后20天的胚珠。在纤维发育过程中，GhTUB7基因在纤维细胞发育前期(开花后10天以前)基本不表达，在开花后12天的纤维细胞中，该基因的表达水平逐渐提高，在开花后20天达到表达峰值，随后稍有下降；同时，该基因在整个胚珠发育过程中基本不表达。由此说明GhTUB7基因在纤维中特异表达，而且在纤维细胞伸长后期和次生壁合成期表达水平较高。图1和2中误差棒表示3次生物学重复的标准差。
4、棉花基因组DNA的提取
取棉花幼叶，利用北京艾德来(Aidlab，中国)生物科技公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号：DN15)提取棉花的基因组DNA，-20℃保存备用。具体操作按说明书进行。
5、克隆GhTUB7基因的启动子TB7P1序列
利用GhTUB7基因的cDNA序列，搜索已公布的棉花D-亚基因组序列(http://www.phytozome.net)。获得GhTUB7基因的5'-上游调控序列，进而在ATG上游大约2.0Kb处设计特异引物TB7P1-up(5'-GGATTCCAACAAGTAACCATT-3')(如SEQ ID NO.6所示)和在近ATG位点处设计特异引物TB7P1-down(5'-GGCAAAGAAGTGATGATATAC-3')(如SEQ ID NO.7所示)，以徐州142基因组DNA为模板进行扩增，20微升的反应体系包含约20纳克棉花DNA，10微升2XTaq Master Mix(上海近岸科技有限公司，novoprotein，货号：E005-02)，5微摩/升的上下游引物各1微升，用水补足至20微升。扩增程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，52℃，30秒，72℃，2.5分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。扩增产物经过电泳回收、将其连接在克隆载体pMD19(TaKaRa，中国大连)上，形成pMD19-TB7P1载体，该载体经过转化大肠杆菌、验证和测序，结果表明扩增片段长度为2010bp，命名为TB7P1，如SEQ ID NO.1所示。序列分析在PlantCare数据库进行(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，分析结果见图3，序列中除具有一般启动子所具有的大量TATA框和CAAT框外，还具有许多特异性响应元件，如厌氧反应元件(TTTGGT)，光反应元件(ATTAAT、TTTCAAA、AAACTTT、CCACCCAACT、TCTTAC)，乙烯反应元件(ATTTCAAA)，光反应MYB结合位点(AACCTAA)，胚乳表达元件(TACTG)，防御与胁迫反应元件(CACTTCGTTTA)，水杨酸反应元件(TTTTT)，未知功能(CTCC)，昼夜节律调控元件(CAATTCTATC)。
实施例二
TB7P1启动子分析植物表达载体pBI121-TB7P1::GUS的构建
用HindⅢ和XbaⅠ内切酶从pMD19-TB7P1载体上切下TB7P1片段，连接到用HindⅢ和XbaⅠ双酶切的pBI121载体片段上，从而使TB7P1片段置换了pBI121载体中的CaMV35S启动子。通过酶切验证(见图5)，构建成植物表达载体pBI121-TB7P1::GUS(见图4)。
如图4所示，植物表达载体pBI121-TB7P1::GUS中，LB为T-DNA区段左边界；RB为T-DNA区段右边界；Kanr为卡那霉素抗性基因；GUS为β-葡萄糖酸苷酶基因(报告基因)；Nos-T为冠瘿碱合成酶基因终止子。
图5中，M15为DNA Marker 15(MBI)；1和2为没有接入TB7P1片段的质粒；3～6表示已经接入TB7P1片段的pBI121-TB7P1::GUS质粒。样品1和2中没有酶切出2000bp左右的片段，样品3-6中酶切出2000bp左右的片段，说明样品1和2中没有TB7P1片段，而样品3-6的图谱表明样品中已经含有TB7P1片段，启动子TB7P1已经成功插入pBI121载体，植物表达载体pBI121-TB7P1::GUS构建成功。
实施例三
1、棉花的遗传转化
用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转化。
参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404菌株。
上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如下：
冀棉14(河北农业大学提供)种子剥去外壳，用0.1％的升汞(HgCl2)灭菌10分钟，用大量无菌水冲洗8次。在125毫升三角瓶中加入约35毫升无菌水震荡过夜，次日换一次无菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28℃，黑暗条件下萌发2～3天，此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。
转化用的含pBI121-TB7P1::GUS植物表达载体的农杆菌菌株在含50毫克/升卡那霉素(Kan)和125毫克/升链霉素(Sm)的YEB固体培养基上活化。挑取其单菌落，接种于5毫升含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200转/分钟震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1︰20的比例转接到25毫升含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值约为0.6～0.8，10000转/分钟、1分钟离心收集菌体，菌体用等体积的液体共培养基重悬备用。
转化时，将棉花下胚轴切成1.5～2.0厘米的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆菌菌液侵染，条件为28℃摇床120转/分钟，侵染30分钟。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共培养基上，28℃暗培养2-3天。
共培养后，下胚轴段转入到下胚段筛选培养基，28℃光照培养，约20天继代一次，直到出现大量愈伤组织。愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28℃、120转/分钟摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0毫升枪头吸取细沙状的体胚平铺于体胚伸长培养基，20-30天后出现大量的绿色小体胚。挑取生长状态良好的体胚继代培养，待体胚伸长到1-2厘米时，将其转移到成苗培养基生根出苗。幼苗生长到3-5厘米高时，通过嫁接或者移栽的方式转移到温室花钵中生长。其中，本实验例中所用的培养基如表1所示。
表1根癌农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化所用培养基
注:MS(基础盐混合物)：Murashige&Skoog,1962；B5:Gamborg,1986.
2、转基因棉花的分子验证
取棉花抗性苗幼叶，利用北京艾德来(Aidlab，中国)生物科技公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号：DN15)提取棉花的基因组DNA，-20℃保存备用。具体操作按说明书进行。以TB7P1-up(5'-GGATTCCAACAAGTAACCATT-3')(如SEQ ID NO.6所示)和GUS基因的3'引物GUS-down(5'-GGGGACTCTAGAGGATCCC-3')(如SEQ ID NO.8所示)扩增抗性棉花基因组DNA，预计扩增片段大约3.8kb。20微升的反应体系包含约20纳克棉花DNA，10微升2XPrimeSTAR Max Premix(宝生物工程有限公司，TaKaRa,中国大连，货号：R045)，5微摩/升的上下游引物各1微升，加水补足至20微升。扩增程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，52℃，30秒，72℃，20秒，35个循环；72℃延伸30秒。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
如图6所示，M15为DNA Marker 15(MBI)；“+”为阳性对照(煮沸过的pBI121-TB7P1::GUS农杆菌液)；H2O为以水为模板的扩增产物；“C”为阴性对照(未转基因的棉花)；1-5为转基因后再生的卡那霉素(Kan)抗性苗，表示T-DNA区段已经整合到转基因棉花基因组中。从图6中可以看出，从5株抗性棉花植株中扩增出了约3.8kb的GUS基因(β-葡萄糖苷酸酶基因)特异带，说明外源片段已经整合到转基因棉花植株的基因组中。
3、转基因棉花中GUS活性的检测
随机选取5株PCR阳性的转基因棉花植株进行全面的β-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性检测，GUS的表达特性基本一致。检测了根、茎、叶、花的表达情况，检测结果如图7和图8所示，图中WT是野生型棉花；TB7P1是pBI121-TB7P1::GUS载体转基因棉花；35S为pBI121载体转基因棉花。在检测样品中都没有检测到阳性信号，说明TB7P1启动子在棉花的根、茎、叶、叶柄和花器官中均不表达。
进而检测了纤维不同发育时期的GUS表达情况，如图9所示，图中WT是野生型棉花不同发育时期的纤维；TB7P1是pBI121-TB7P1::GUS载体转基因棉花不同发育时期的纤维；35S是pBI121载体转基因棉花不同发育时期的纤维；5天～30天分别表示开花后5天至开花后30天的纤维。在开花后5天的纤维细胞上几乎没有GUS信号，在开花后10天的纤维中有一定的GUS信号，在开花后15天到开花后30天纤维中有明显的GUS信号，而且其强度与组成型启动子CaMV35S的强度相似。说明TB7P1启动子是一个纤维细胞特异表达启动子，在纤维伸长后期和次生壁合成期高量表达，这时期的表达效率与组成型启动子CaMV35S的表达效率相似。
本发明提供了一个微管蛋白基因GhTUB7的启动子(TB7P1)及应用，该启动子是一个棉花纤维细胞特异表达启动子；本发明利用基因工程技术成功地分离了棉花纤维特异表达的GhTUB7基因的启动子，所述TB7P1启动子含2010bp片段；本发明还验证了所述TB7P1启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，能够指导报告基因在棉花纤维中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维特异性表达的启动子序列。
本发明的TB7P1启动子与组成型启动子(如CaMV35S启动子)相比，具有较高的表达效率(多数纤维特异性启动子表达效率极低)和纤维表达特异性；在改良纤维的基因工程中，能够很好地避免目的基因在其它组织器官表达带来的副作用。为进一步研究基因在纤维发育中的功能提供了新选择，同时为改良棉花品种和纤维品质的分子设计提供了有效途径。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.棉花纤维特异性表达启动子TB7P1，其特征在于，所述启动子TB7P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有如权利要求1所述启动子TB7P1的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体，所述植物表达载体为pBI121-TB7P1::GUS。
4.含有权利要求2或权利要求3任一项所述的表达载体的宿主，其特征在于，所述宿主为根癌农杆菌。
5.如权利要求1所述的启动子TB7P1在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述转基因植物为棉花。
6.如权利要求2或3任一项所述的表达载体在制备转基因植物中的应用，其特征在于，所述转基因植物为棉花。
7.利用权利要求1所述的启动子TB7P1制备转基因棉花的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述启动子TB7P1插入到表达载体中，构建植物表达载体；
(2)将获得植物表达载体转化宿主，获得转化体；
(3)用所述转化体转化棉花，培养转化后的棉花，获得转基因棉花。
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