CN101875932B - 一种棉花生长点特异性启动子及其克隆和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，克隆了一个新的棉花MPK7基因的特异性启动子，该启动子在特定时期驱动基因在植物细胞分裂分化的关键部位尤其是生长点特异表达。本发明构建了该启动子和GUS报告基因的植物表达载体，并转拟南芥。实验表明在种子萌发阶段和幼苗期，该启动子驱动GUS基因在茎或根的生长点特异表达；而在繁殖期，所有器官和组织中均无表达。6BA、GA、IAA等激素是在植物种子萌发和生长过程中起重要作用的信号分子，用上述激素对子叶期幼苗进行诱导，GUS染色表明该启动子的表达受上述激素的诱导。因此这一特异性启动子的克隆对研究植物种子萌发及生长，提高种子发芽率，控制植株生长速度具有重要的实际意义和应用价值。

Description

一种棉花生长点特异性启动子及其克隆和应用

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体地说，本发明涉及一个新的棉花基因的特异性启动子的克隆。

背景技术

棉花是我国重要的纤维作物和主要的经济作物。以棉花为研究材料，利用转基因技术提高棉花产量、质量和育种效率具有重要的实际意义。生长点是植物细胞不断进行分裂增生的部位，位于根和茎的顶端。茎的生长点往往呈锥状，故又称“生长锥”。茎和根的生长点分别是由胚芽和胚根的生长点发育形成的。

健全的棉子，播种后如果条件适宜，就会吸水膨胀，通过内部一系列的酶促变化，逐渐恢复旺盛的生命活动，开始进行胚细胞的分裂、伸长及分化，从形态上看有胚根的生长及胚芽的伸长，这个过程叫萌发。一般要经历三个阶段：吸胀阶段、萌动阶段和发芽阶段。萌动阶段，胚不断吸收营养物质进行细胞分裂，胚根伸长，从珠孔突破种皮长出幼根；发芽阶段，细胞继续分裂增生，胚轴向上生长，形成幼茎。生长点是种子萌发过程中细胞分裂和增大的关键部位，细胞旺盛分裂的生长点有助于胚突破种皮，因此研究生长点基因的表达对种子萌发具有重要意义。

棉花的主茎是由胚芽发育而成的。胚芽顶端的分生组织不断地分裂分化形成主茎的节与节间，叶原基与腋芽原基。叶原基将来长成叶片，腋芽原基变成叶枝或果枝。因此，胚芽生长点是棉株地上部分各器官分化建成的总的发源地。棉花的主茎具有一个重要的特性，就是具有无限生长习性。只要环境适宜，主茎生长点就能不断地分裂分化增长枝叶，其中果枝的增加有助于棉花的产量增加。当然也不可以让主茎徒长而发生早衰、棉桃脱落，造成减产。因此通过控制某种影响茎生长点细胞分裂分化的基因的表达有望通过增加果枝的数量来提高棉花产量，具有重要的应用价值。

在植物转基因工程研究中，目前大多数采用的是组成型启动子，如CaMV35S启动子、玉米Ubiquitin启动子，但是这些启动子能够驱动外源基因在植物的所有组织和器官中表达，造成能量浪费，给植物的正常生长发育带来很大负担。为保证植物的健康生长，在转基因时，能够使所需基因在一定时期和一定的组织中表达非常重要。因此寻找时空特异性启动子具有重要意义。

发明内容

基于上述的原因，本发明克隆了一个新的棉花MPK7基因的特异性启动子，该启动子在特定时期驱动基因在植物细胞分裂分化的关键部位尤其是生长点特异表达。本发明构建了该启动子和GUS报告基因的的植物表达载体，并转拟南芥。实验表明在种子萌发阶段和幼苗期，该启动子驱动GUS基因在茎或根的生长点特异表达；而在繁殖期，所有器官和组织中均无表达。6BA、GA、IAA等激素是在植物种子萌发和生长过程中起重要作用的的信号分子，用上述激素对子叶期幼苗进行诱导，GUS染色表明该启动子的表达受上述激素的诱导。因此这一特异性启动子的克隆对研究植物种子萌发及生长，提高种子发芽率，控制植株生长速度具有重要的实际意义和应用价值。

该启动子能驱动GUS基因在植物种子萌发和生长时期在茎或根的生长点特异表达，繁殖期无表达，其基因序列如Seq ID No：1所示。

该启动子是在已得到的棉花GhMPK7基因的基因组序列(该基因其序列为：如Seq ID No：2所示)的基础上，通过反向PCR的方法，得到的1298bp的启动子序列，如Seq ID No：1所示。通过PlantCARE软件和查阅资料对该启动子进行顺式作用元件分析，有三个与细胞分裂素(6-BA)作用相关的CPBCSPOR元件(Naoki Fusada，2005，Plant Molecular Biology，59：631-645)，分别处于-878--864bp、-860--866bp、-702--706bp处；在-569--575bp和-405--412bp处分别有一个与赤霉素(GA)作用相关的元件，分别是TATCCAOSAMY和GARE1OSREP1(Keita Sutoh and Daisuke Yamauchi，2003，The Plant Journal，34：635-645)；有三种与生长素(IAA)诱导相关的元件分别是ARFAT、NtBBF1和TGA-element(Jennifer L.Nemhauser，2004，PLoS Biology，9：1460-1471)，ARFAT在-1072--1078bp处，在-316--322bp(-)，-354--360bp(-)，-417--423bp(-)各有一个NtBBF1元件，TGA-element处于-148--154bp(-)；此外，增强转录水平的元件CAAT-box、G-box(未标注)，胚乳表达所需的控制元件Skn-1-motif也是与信号转导途径密切相关的顺式作用元件，元件的位置如附图2。

为了完成该启动子的初步功能分析，本发明采用了花粉管通道法进行转基因，构建了一种该启动子的植物真核表达载体，即用棉花GhMPK7基因的启动子序列取代pBI121中的35S启动子，构建GUS融合基因，转化农杆菌，将该表达载体转拟南芥，具体方法是进行花序侵染，即待拟南芥繁殖期开花时，配制侵染液，用农杆菌侵染花序。

本发明在经过上述转基因后的拟南芥的不同发育时期检测了GUS活性，并用不同的条件进行诱导，研究该启动子驱动基因的表达情况，具体如下：

本发明分别取种子发芽时期、幼苗生长时期、繁殖期的转基因拟南芥，通过现有的方法检测GUS基因的表达情况。本发明发现，在种子发芽时期，在茎和根的生长点有GUS基因的表达(图4A、B)；在幼苗生长时期，在茎生长点检测到有GUS基因活性(图4C、D)；在繁殖期，所有组织器官中均无GUS基因的表达。由此可见，本发明克隆所得的棉花GhMPK7基因的启动子具有不同生长发育时期的表达特异性，即时间表达特异性。

同时发明人发现该启动子具有生长点特异性，并且根据对启动子顺式作用元件的分析，发现该启动子具有ABA、GA、6BA、IAA等激素的响应元件，而上述的激素是几种与植物细胞分裂、分化及凋亡相关的激素，因此我们选用上述激素对转基因拟南芥幼苗诱导，分析本发明克隆的启动子的功能。无诱导条件下，GUS基因只在茎的生长点有表达(图5A、B)。在转基因拟南芥子叶期对其进行诱导，具体结果如下：ABA诱导后，进行GUS组织化学染色，发现GUS基因在茎和叶脉中表达，并且在茎中的表达量很高；不同的赤霉素(GA)生物活性不同，GA3的活性最高，用GA3诱导后，在子叶和茎的生长点检测到GUS活性(图5C、D)；6BA诱导，GUS基因只在茎的生长点高效表达(图5G、H)；IAA诱导，发现GUS基因仍在茎的生长点高效表达，在茎中其它部位也有表达(图5E、F)。因此本发明指出该启动子驱动基因的表达具有组织特异性，并且是一种激素诱导型启动子。

通过上述的实验，发明人证实了，通过本发明克隆所得的特异性启动子，在生长点特异表达，又由于ABA、GA、6BA、IAA这些激素对植物种子的萌发、芽的生长和茎的伸长有重要作用，因此该启动子影响着棉花种子的发芽、芽和子叶的生长及茎的生长速度。因此，本发明所克隆的启动子在植物生长点的特异表达，有望在提高种子发芽率中应用；构建该启动子和相关基因的表达载体，调控植株茎的生长速度，可能会影响棉花及其它作物的结实率；该启动子是一个时空特异性表达和诱导型的启动子，因此该启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研究也具有重要意义。

附图说明

图1：扩增的棉花GhMPK7基因启动子的电泳图(A为目的片段，B为2kb的Marker)；

由图中可知，扩增得到的序列为1298bp，包括1223bp的启动子序列和部分5’非编码区序列。

图2：棉花GhMPK7基因特异性启动子区域可能的顺式作用元件及扩增转基因序列所用的引物；

图3：棉花GhMPK7基因启动子序列与GUS基因的融合表达载体的构建流程图；

图4：转基因拟南芥不同生长发育时期的GUS活性检测图；

图中可见，在种子发芽时期，在茎和根的生长点有GUS基因的表达(图4A、B)；在幼苗生长时期，在茎生长点检测到有GUS基因活性(图4C、D)；

图5：不同诱导条件下，转基因拟南芥中GUS活性检测图；

图5中可见无诱导条件下，GUS基因只在茎的生长点有表达(图5A、B)；在转基因拟南芥子叶期对其进行诱导，具体结果如下：ABA诱导后，进行GUS组织化学染色，发现GUS基因在茎和叶脉中表达，并且在茎中的表达量很高；不同的赤霉素(GA)生物活性不同，GA3的活性最高，用GA3诱导后，在子叶和茎的生长点检测到GUS活性(图5C、D)；6BA诱导，GUS基因只在茎的生长点高效表达(图5G、H)；IAA诱导，发现GUS基因仍在茎的生长点高效表达，在茎中其它部位也有表达(图5E、F)。

具体实施方式

本发明的实施步骤是根据棉花GhMPK7基因的DNA序列用反向PCR的方法克隆得到该基因的启动子序列→启动子顺式作用元件分析及功能预测→设计带有酶切位点HindIII和BamH I的引物从DNA上扩增得到目的启动子序列→用同样的酶HindIII和BamH I酶切pBI121→连接目的片段和酶切的pBI121→转拟南芥→GUS组织化学染色检测GUS活性，分析启动子功能。本实施例中的其他技术均采用已有技术。实施例1棉花GhMPK7基因启动子的克隆

1.1基因组DNA的提取

1、5ml提取buffer(100mM Tris，500mM NaCl，50mM EDTA，高压灭菌后4℃用)中加入40μl β-巯基乙醇，冰浴；

2、称取1g幼嫩叶片，在液氮中研磨，快速转移到提取buffer中，涡旋混匀；

3、加入2ml 10％SDS，65℃水浴10min；

4、加入5ml 5M KAC，混匀，冰水浴20min；

5、4℃，11000rpm离心20min；

6、上清用无菌纱布过滤，加入10ml异丙醇充分混匀，-20℃放置30min；

7、4℃，11000rpm离心15min，弃上清；

8、沉淀用700μl溶解buffer(50mM Tris，10mM EDTA，高压灭菌后4℃保存)悬浮；

9、移入1.5ml eppendorf管，加入5μl RNase A，37℃温育30min；

10、加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，4℃，12000rpm离心10min；

11、取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后4℃，12000rpm离心5min；

12、取上清，加入1/10体积的3M NaAC和1ml异丙醇，-20℃放置2h；

13、4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；

14、70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥；

15、60μl TE溶解沉淀，测OD260，-20℃保存。

1.2棉花GhMAPK7基因启动子的克隆

该启动子的克隆是采用反向PCR(I-PCR)的方法。分别用六种核酸内切酶酶切棉花总DNA，这六种酶分别是EcoR I，KpnI，Sca I，Xba I，Xho I，Bgl II，Pst I，Vsp I，用大连宝生物公司生产T₄连接酶将酶切后的产物连接成环，以连接好的产物为模板扩增棉花GhMPK7基因的启动子序列。酶切体系为80μl∶15μl的DNA，3μl酶，8μlBuffer(根据每种酶说明书上有相应的各种Buffer)，54μl ddH₂O；十二小时之后补酶1μl。连接体系为20μl∶2μl的酶切的DNA，4μl的5×T₄Buffer，2μlT₄连接酶，12μl ddH₂O；常温连接10分钟。

用酶Sca I酶切连接的模板扩增出了一段GhMPK7基因启动子序列，第一轮PCR所用的一对外侧引物是Sup1和Ssca1，第二轮PCR用的一对内侧引物是Sup2和Ssca2，得到980bp的启动子序列。利用得到的这段启动子序列设计引物，所用模板是内切酶Vsp I所酶切连接的环状DNA，第一轮PCR所用的一对外侧引物是Sup3和Svsp1，第二轮PCR用的一对内侧引物是Sup4和Svsp2，得到另外318bp的启动子序列；因此共得到1298bp的启动子序列。

启动子的克隆所需的引物如下表：

1.3棉花GhMPK7基因启动子序列的扩增

设计克隆GhMPK7基因启动子所需引物：

引物Sz1(上游序列)：序列如Seq ID No：11所示，AAGCTTAATAAATTACGTCCGCGAC；

引物Szx1(下游序列)：序列如Seq ID No：12所示，GGATCCACTTTGAGATCATTCCACCAC；

引物Sz1中的AAGCTT为HindIII的酶切位点，引物Szx1中的GGATCC是BamHI的酶切位点，下划线的部分是启动子序列。利用引物Sz1和引物Szx1，以棉花DNA为模板将该启动子从棉花基因组中扩增出来，扩增片段为1298bp，序列如序列表中SED ID NO.1。

体系如下：

反应程序为：预变性94℃，5min；变性94℃，40s，退火52℃，40s，延伸72℃，1min20s，35个循环；后延伸72℃，10min。

反应结束后，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，如图1。实施例2植物表达载体的构建与转化

2.1棉花GhMPK7基因启动子序列与GUS报告基因的融合

选择pBI121作为植物表达载体，将PCR扩增得到目的片段酶切，电泳并胶回收。同时用限制性内切酶HindIII和BamHI酶切表达载体，并回收载体片段。连接基因片段与载体片段，利用菌落PCR及质粒酶切方法筛选pBI121-GhMPK7启动子。具体过程可参考附图3

1、用带有酶切位点的引物Sz1和Szx1扩增棉花GhMPK7基因的启动子序列，并凝胶电泳分离和回收目的片段。

2、用HindIII和BamH I双酶切回收目的片段和植物表达载体pBI121。

3、回收：进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有GhMPK7启动子序列的DNA片段和pBI121载体片段。

4、连接，连接体系如下：

混匀后16℃连接过夜。

5、转化：取5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素的固体培养基平板上；

6、重组子的筛选：对长出的菌落进行PCR及质粒的HindIII和BamH I双酶切鉴定。

2.2农杆菌感受态细胞的制备

1、挑取单菌落LBA4404，接种于5ml加有50mg利福平(Rifampicin)的液体LB培养基中，28℃，200rpm，过夜培养。

2、取2ml培养物至液体LB培养基中，继续培养至OD800为0.5左右。将培养物冰浴30min，4℃，5,000rpm，离心5min。

3、弃上清。用10ml 0.1mol/L冷的NaCl悬浮菌体；4℃，5,000rpm，离心5min。

4、弃上清，1ml 20mmol/L冷的CaCl₂悬浮，分装成50μl/管，液氮中速冻后，-80℃保存。

2.3冻融法转化农杆菌

1、冰上融化农杆菌LBA4404感受态细胞，加入3μl带有目的片段的pBI121质粒，冰冻30min，液氮中冷冻1min，然后在37℃水浴5min。

2、加入1ml无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3h。

3、10,000rpm离心1min以浓缩菌液，用100μl YEP回溶菌体。

4、将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素(Kanamycin sulfate)和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃下培养2-3d。

5、酶切及PCR鉴定阳性菌落。

2.4农杆菌介导转化拟南芥

农杆菌的培养：从-80℃冰箱中取出所要的菌种，在冰浴中融化。分别取30μl的农杆菌接种于5ml的YEP培养基(100mg/L利福平，100mg/L卡那霉素)，28℃，200rpm过夜培养。然后在附加50mg/L卡那霉素和100mg/L的固体YEP培养基上划板，以便将来挑单菌落所用。

侵染液的配制：配制15ml侵染液，需加入0.81g蔗糖，加3.6μl sliwet。

花序侵染：挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡培养约48h，至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀释10倍，待用。将拟南芥种子播种于MS基本培养基中，待种子萌发长出子叶后，移入蛭石中，浇营养液，等待拟南芥开花。将摇好的菌液放入80ml大离心管中，5,500rpm离心7min；去上清，用侵染液5ml将沉淀重悬，稍震荡。将所有花序侵入约5S，时间过长花序容易死掉，过短则侵染不上。

2.5转基因植株的鉴定

待花序侵染的拟南芥接种后，将拟南芥种子播种于加有卡那霉素的MS培养基中筛取转基因的拟南芥种子，能在加有卡那霉素的MS培养基中萌发生长的拟南芥种子，可初步确定为转基因的拟南芥。种子萌发长出子叶后，移入蛭石中，浇营养液。为进一步鉴定所得到的植株为转基因的植株，取每个植株的的一片小叶分别用微量法提取DNA，通过PCR的方法进行转基因鉴定。所用引物和程序如扩增启动子时所用引物和程序，得到目的片段，连接转化后，取阳性克隆，经测序证明所得植株中确实转入了该发明所克隆的启动子。

实施例3对不同时期的转基因植株进行GUS活性组织化学染色

3.1GUS活性组织化学染色的方法：

1、样品放入冰水混合物冰浴两分钟；

2、将样品用滤纸吸干水，放入染色瓶中，加入90％丙酮浸过样品10min；

3、用buffer迅速清洗一遍倒掉；

4、加入GUS染色液冲洗两遍，每遍5min，轻摇；

5、抽气2次10min；

6、37℃恒温保存过夜。用显微镜观察。

3.2GUS染色Buffer配方

100mlbuffer：

ddH₂O定容至100ml。

3.3GUS染色液配方

用800μlDMSO溶解100mg的X-GluC，加入GUS染色buffer定容至100ml。

3.4对不同时期的转基因植株进行GUS活性组织化学染色

分别在转基因拟南芥的种子萌发阶段、幼苗期及繁殖期进行GUS活性组织化学染色，发现在种子萌发阶段和幼苗期，该启动子驱动GUS基因在茎或根的生长点特异表达(如图4)；而在繁殖期，所有器官和组织中均无表达，可见其为时间表达特异性启动子。

实施例4对转基因拟南芥诱导的方法

通过喷洒的方法将ABA、GA、6BA、IAA等激素喷洒到子叶期转基因拟南芥叶片上，6个小时后取样，进行GUS活性组织化学染色；其具体结果如图5所示，由图中内容可见本发明所得的启动子驱动基因的表达具有组织特异性，并且是一种激素诱导型启动子。

<110>山东农业大学

<120>一种棉花生长点特异性启动子及其克隆和应用

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caattcatga cagagtatgt tgtcacccgc tggtaccgtg cacctgagct cctactctgt    2100

tgtgataatt atgggacctc cattgatgtt tggtcggtag gatgcatctt tgcggagatt    2160

cttggtcgga aaccaatctt tcctggaacg gaatgcctca accagcttaa gctgattatc    2220

aatgttctcg gaagtcaaca agaggccaac attcagttta ttgataatcc caaagctcga    2280

cggtacatca agtcacttcc gtactctagg ggcacccact tttccctttt atacccacaa    2340

gccgatccat tagccataga tttgttgcaa aggatgcttg ttttcgaccc atcaaagaga    2400

atcaccgtca cagaagcact cctacatcca tacctgttag ggctgtatga tccaaggtgc    2460

aatccacctg ctcaagtccc aattgatctt gagatagatg agaacatggg agaatcgatg    2520

atcagggaga tgatgtggag tgaaatgctt cactatcacc cagaggctgt atctgccaat    2580

gcttaggtaa cattgttttc gctgctttgt tgtaatgtat tttcggaact gatatttatc    2640

gattgaactc aatgaacaat gttgagaatt ctggtggtac ccagattttg ttttactttt    2700

aacattcttg tttattagtt tatgatttgg ttgtagcg                            2738

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gattatcaag tctcctcagc cgc    23

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tggctccaca agcgtcgcc         19

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cattgtaggg taggtatctg gtg    23

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cacaactttg agatcattcc accac   25

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

aaggccgcaa gaaggtggtt         20

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gctgctaata gaaattcctg cacc    24

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ttagaggact tggctggtgg         20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccacagtcac tcttcgacag         20

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

aagcttaata aattacgtcc gcgac      25

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ggatccactt tgagatcatt ccaccac    27

Claims (6)

1.一种棉花生长点特异性启动子，其特征在于：该启动子的基因序列如Seq ID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的棉花生长点特异性启动子，其特征在于：该启动子是在棉花GhMPK7基因的基因组序列的基础上，通过反向PCR的方法获得的，所述的GhMPK7基因其序列如Seq ID No：2所示。

3.根据权利要求1或2所述的棉花生长点特异性启动子，其特征在于：该启动子是激素诱导型启动子，具有ABA、GA、6BA、IAA中各种激素的响应元件。

4.根据权利要求1或2所述的棉花生长点特异性启动子，其特征在于：该启动子具有时间表达特异性。

5.如权利要求1所述的启动子，其应用于利用该启动子构建的各种基因的植物表达载体。

6.如权利要求1所述的启动子，其应用于利用该启动子序列与其他启动子组合构建其他基因的植物表达载体。

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