CN116004622B - 一种棉花apr基因的启动子、获取方法及应用、融合载体、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种棉花APR基因的启动子、获取方法及应用、融合载体、制备方法及应用，属于基因工程，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明提供的棉花APR基因的启动子能够驱动棉花APR基因在植物表皮毛中高量表达。

Description

一种棉花APR基因的启动子、获取方法及应用、融合载体、制备 方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种棉花APR基因的启动子、获取方法及应用、融合载体、制备方法及应用。

背景技术

基因启动子(Promoters)是基因(gene)的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的位置、程度等。启动子就像"开关"，决定基因的活动的时空特性，由核苷酸组成。不同启动子具有不同的特性，可以控制基因的表达水平。也有一些启动子虽然(核苷酸)不是完全一致，但是其活性有相似的地方。植物表皮毛是植物表皮细胞特化形成的细胞组织。其在植物抗逆和有益化合物的生产方面具有重要作用。如棉花种子表皮毛(纤维)是棉花的主产品，具有重要经济价值。因此，鉴定和利用在植物表皮毛中特异和高量表达的启动子对细胞发育研究和提高作物的经济价值都有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种棉花APR基因的启动子、获取方法及应用、融合载体、制备方法及应用，本发明提供的棉花APR基因的启动子能够驱动棉花APR基因在植物表皮毛中高量表达。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种棉花APR基因的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明还提供了一种上述技术方案所述启动子的获取方法，包括以下步骤：

以棉花基因组DNA为模板，使用扩增引物进行扩增，得到启动子。

优选的，所述扩增引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述扩增引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述扩增的体系包括：KODone25μL、上下游引物各2μL、模板1μL和ddH₂O20μL。

优选的，所述扩增的程序包括：98℃1min；98℃10s，55℃5s，68℃30s，40个循环；68℃1min。

本发明还提供了上述技术方案所述的启动子在驱动棉花APR基因在植物表皮毛中高量表达中的应用。

本发明还提供了一种融合载体，将上述技术方案所述的启动子重组到过表达载体pBI121中，得到。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的融合载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将过表达载体pBI121进行酶切，得到酶切载体；

2)将上述技术方案所述的启动子重组到步骤1)得到的酶切载体中，得到融合载体。

优选的，所述步骤1)酶切使用的酶为限制性内切酶HindIII和BamHI。

本发明还提供了上述技术方案所述的融合载体在驱动棉花APR基因在植物表皮毛中高量表达中的应用。

本发明的有益效果为：

APR3基因的启动子在花、茎和果荚中均没有表达，在下胚轴和子叶中有少量表达，而在叶片表皮毛中有稳定和高量表达，观察到的所有表皮毛及分支中均发现显著的GUS信号。APR3启动子是一个在表皮毛中较特异表达的启动子。

附图说明

图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为过表达载体pBI121的结构图；

图3为pBI121::ProAPR3载体的PCR鉴定电泳图；

图4为部分T2代转基因拟南芥植株的PCR鉴定电泳图；

图5为转pBI121::ProAPR3拟南芥的GUS染色结果图，(A-B)莲座叶及其表皮毛；(C)幼苗；(D)下胚轴；(E)子叶；(F)根；(G)花；(H)茎；(I)果荚。

具体实施方式

本发明提供了一种棉花APR基因的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：

ctaccttcatcacccccacaccctactaaatcaccccactaactccatcacccaattaaaccatcccactaactccatcaccccacttgcctacaaaaagaaagggcaatcagttgtaaaagttggctataaaagccattcaaaaccattgtaaaaagggaagttcttttttggagattaatcaaatatcaaagcaaaagaggattttttttttgagatccggctgccgtgcacggtggcgccgacggcggcccgtgggggtccggtgaccggagcaaggccggaccaatggccggatttagaagggagagggagagtgttatttttaatattgttattattatatattattattattatatttattatattatacttattttattactgttactattattttgtatatatttattatcattattgatttattattattagaaacatatttttatttttattatttttatattattatttttattaatatattattattattgtcttctattttgttgttgttattattattttaatcgttattactatgtttatggttattgtagcattattctattattactattattatggttaattaattctacattttcattaccctatatatattttttatatttgttttatccctccatatgtatatatattatcgttttcacattattatttttatgtatagatcctttctttatctatgtatatatattatattttcatatatacaatttatttcttttgaagatcccgttttaaaactatactctgcctattttgactattttcttattattaatatgtgtattacaggaatcctttttcctattttcttctgttttatatatttatataattgtttttatttcttttgtttgtaccattattaacatgttaccactaccattttattatttgtcattaaatctttttttgccactatgttttattgttaatatgcatcgttcagcttattatggtaatattatttgcatgtgacataccattattttcgtttttttaaattttaattgtccaaattaatttattcacagatttattctcaattgtttttaaaataatagcaatgttcggtatttaaagaattcgaagaatcgtgccctaacgtactgggtttcgctttctttatttgttttgaatattcgaatatcctcttaaggctaaaacgcacttttaaaaggcaagctcacaattgagggtaaaaaatcttgtgtcctaacgtactggatgtaatgtttttaccttgaggtgagatggtctttaatacacatttgacttacctaaatgttttaaaagccaataaaaggaggatcgcgttttgaactctgtctaaatctctaattttcgacattaagacactaaataatcaatcaagtactaattttgggcgtgtcgaaggtgctagtccttcctcgtacgtaactgactcccgaaccggttttctattttcgcagaccaaaatcgtcgttttggaaaatttatttatttcttaaaaacgaccgtgttttgaggtgatccaatcacacactattaaaaacgattggtggcgactcccaacttttcattttcaaaagtcgattttctcttttcaaaaaaacggtttcgacagctatcatgcacctaagtatgctatctgaagttactttatatcattgttcatttcttttccgaaccaaccagtcattgtcaattgctaacataaataatttaagagtggaaacagaaggagaaacagaagagaatggaaaataaagaaaaaaaagttaaaagaacataaaagaaaaattttaaaatgctcaaaacgaaaaaaatatagggatcaattgtataatttaacctaaaatttttgtttaaaatgatgatttaacgtgccacgtcaactgactgttacaccgttaatgacaattaatagcttagtgactaaaatattgcaataatgtaatgtaagtgatgaaaatgtaacattttagacctaaatgattaaaacataatttgagttaaataaaagtaaatattttgagaatttaccaaaaataaaatataggatagtaaagaataaccagaaaaaaagggaaaagataaaagaaaaaaaaaagggaagaatctaagaaattaatgggaccgttttttcagcctccaaacacaaacttaaccttctccatattgaccacgtctctaaggtgctgtccacgtgacgcaagcgatgagaaaccttatattaagctccatccaaccaaaatcatccacgtaaacaatctcatgttatccagaaatgcgtctaggttcaatgaaccttgtacccctatctttaatcaggctattatttaacattttaaccctctgtgtttctctccccaccaccaacgctcaacatagagaaaactcagaaacacacaggaaacccaaagtctttctcctttttttccccctctttttttatacacaaaggtaataattttcgaaaatg。

在本发明中，所述棉花APR基因为GhAPR3基因，在CottonFGD中的登录号为：Gh_A05G1463。

本发明还提供了一种上述技术方案所述启动子的获取方法，包括以下步骤：以棉花基因组DNA为模板，使用扩增引物进行扩增，得到启动子。

在本发明中，所述扩增引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTttgtcttctattttgttgttgt-3’；

所述扩增引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

5’-GGACTGACCACCCGGGGATCCcattttcgaaaattattacc-3’。

在本发明中，所述扩增的体系优选包括：KODone25μL、上下游引物各2μL、模板1μL和ddH₂O20μL。在本发明中，所述扩增的程序优选包括：98℃1min；98℃10s，55℃5s，68℃30s，40个循环；68℃1min。

本发明还提供了上述技术方案所述的启动子在驱动棉花APR基因在植物表皮毛中高量表达中的应用。在本发明中，所述植物优选包括拟南芥。

本发明还提供了一种融合载体，将上述技术方案所述的启动子重组到过表达载体pBI121中，得到。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的融合载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将过表达载体pBI121进行酶切，得到酶切载体；

2)将上述技术方案所述的启动子重组到步骤1)得到的酶切载体中，得到融合载体。

本发明将过表达载体pBI121进行酶切，得到酶切载体。

在本发明中，所述酶切使用的酶优先为限制性内切酶HindIII和BamH I，本发明对酶切的条件没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。在本发明中，所述酶切去除过表达载体pBI121中的35S启动子。

本发明将上述技术方案所述的启动子重组到得到的酶切载体中，得到融合载体。本发明优选使用重组试剂盒按照说明书进行重组，如诺唯赞公司销售的重组试剂盒。

本发明还提供了上述技术方案所述的融合载体在驱动棉花APR基因在植物表皮毛中高量表达中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

ProAPR3启动子克隆和测序

1、以中棉24(ZM24)的基因组DNA为模板，采用ProAPR3-HindIII-F和ProAPR3-BamHI-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2500bp。扩增的体系：KODone25μL、上下游引物各2μL、模板1μL和ddH₂O20μL；扩增的程序包括：98℃1min；98℃10s，55℃5s，68℃30s，40个循环；68℃1min。引物序列如下：

ProAPR3-HindIII-F(SEQ ID No.2):

5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTttgtcttctattttgttgttgt-3’；

ProAPR3-BamHI-R(SEQ ID No.3):

5’-GGACTGACCACCCGGGGATCCcattttcgaaaattattacc-3’。

2、对步骤1获得的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，按照说明进行目的条带回收并对其进行纯化。

3、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1(泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp；泳道1、2为PCR扩增产物，大小约为2500bp)，产物序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2

pBI121::ProAPR3载体构建

1、使用限制性内切酶HindIII与BamHI酶切过表达载体pBI121(该载体的结构如图2所示)，得到切去35S启动子的线性载体序列。

酶切体系：

酶切条件：

37℃，2h；65℃，20min。

2、将扩增纯化后的实施例1的启动子序列和酶切后的pBI121载体使用重组试剂盒(诺唯赞公司)进行重组。再将重组产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。将其涂布于含卡那霉素的LB抗性平板上，在37℃下培养12h，筛选阳性克隆并测序。用引物ProAPR3-F(SEQ ID No.4)(5’-TTGTCTTCTATTTTGTTGTTGT-3’)和GUS-R(SEQ ID No.5)(5’-GCGAACTGATCGTTAAAACTGC-3’)进行菌落PCR检测和测序。经鉴定结果表明：PCR扩增得到大小约为2500bp的条带的载体为正确连接的pBI121::ProAPR3载体(图3)。

实施例3

转基因拟南芥的获得

将实施例2构建好的pBI121::ProAPR3载体导入到农杆菌GV3101感受态细胞，采用Floral-dip方法得到转基因拟南芥。

转基因植株鉴定

提取经过抗性筛选后的T2代转基因拟南芥植株的叶片的基因组DNA，用ProAPR3-F和GUS-R引物对T2代转基因拟南芥植株的基因组DNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转pBI121::ProAPR3拟南芥植株。部分T2代转基因拟南芥植株的PCR鉴定电泳图见图4。

转pBI121::ProAPR3拟南芥的GUS染色

取经过PCR鉴定为阳性的T2代转pBI121::ProAPR3拟南芥植株的成熟花器官、叶片和根进行GUS染色分析。GUS染色分析的具体步骤如下：将植株的花、叶片和根在GUS染色液中37℃浸泡12小时，然后用75％的乙醇溶液脱色2-3次，然后在体式显微镜下观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点(图5)。该结果表明APR3基因的启动子在花、茎和果荚中均没有表达，在下胚轴和子叶中有少量表达，而在叶片表皮毛中有稳定和高量表达，观察到的所有表皮毛及分支中均发现显著的GUS信号。APR3启动子是一个在表皮毛中较特异表达的启动子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种棉花APR基因的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述启动子的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

以棉花基因组DNA为模板，使用扩增引物进行扩增，得到启动子；所述棉花的品种为中棉24；

所述扩增引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述扩增引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述扩增的体系包括：KOD one 25μL、上下游引物各2μL、模板1μL和ddH₂O 20μL。

4.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述扩增的程序包括：98℃1min；98℃10s，55℃5s，68℃30s，40个循环；68℃1min。

5.权利要求1所述的启动子在驱动棉花APR基因在植物表皮毛中高量表达中的应用。

6.一种融合载体，其特征在于，所述融合载体是将权利要求1所述的启动子重组到过表达载体pBI121中得到的。

7.一种权利要求6所述的融合载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将过表达载体pBI121进行酶切，得到酶切载体；

2)将权利要求1所述的启动子重组到步骤1)得到的酶切载体中，得到融合载体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)酶切使用的酶为限制性内切酶Hind III和BamH I。

9.权利要求6所述的融合载体在驱动棉花APR基因在植物表皮毛中高量表达中的应用。