CN112501182A - 一种杨树erf转录因子基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因的技术领域，本发明提供了一种杨树ERF转录因子基因及其应用。本发明的杨树ERF转录因子基因为RAP2L15基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。本发明提供的杨树RAP2L15基因能够调控杨树生长发育，尤其是调控杨树生长速率和叶片形态，进而采用转基因技术，将RAP2L15基因整合到杨树基因组中，初步定向改变杨树生长速率和叶片形态特征。

Description

一种杨树ERF转录因子基因及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因的技术领域，尤其涉及一种杨树ERF转录因子基因及其应用。
背景技术
自然环境条件下，植物在生长发育过程中形成了一套复杂的信号转导系统以适应多变的环境条件。转录因子(transcription factor，TF)也称反式作用因子，是与真核生物基因启动子中的顺式作用元件发生特异性结合的一类蛋白质。转录因子对其下游基因具有开关的作用，可以通过与下游靶基因启动子中顺式作用元件结合，调控目的基因的表达，在调节植物生长发育中起着重要作用。随着多种植物全基因组测序的完成和生物信息学分析技术的发展，大量编码调控生长发育、干旱、高盐、低温、激素、病原反应等相关的转录因子被研究学者发现。其中，AP2/ERF转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，大约占已知植物转录因子总数的8％。AP2/ERF转录因子在调控植物生长发育或逆境胁迫过程中发挥着重要的作用，拟南芥ERF转录因子基因PUCHI能够促进植株侧根的生长及胚胎的形成；在水稻中过表达拟南芥HARDY基因能够促进分支和根系的生长，并且可以提高植株对干旱和盐碱胁迫的耐受性。在杨树中，PtaERF003转录因子在促进植株生长发育及根系生长过程中也发挥着积极的作用。因此，筛选并克隆重要ERF转录因子基因，利用ERF转录因子基因进行遗传转化，是改良植物新品种的重要途径之一。
杨树生长快、适应性强，是三北地区重要的经济树种和绿化树种。盐碱、干旱和低温等非生物环境因子是影响杨树生长、发育，限制杨树用材质量、产量的主要因素。2004年杨树全基因组测序的完成，使杨树成为研究木本植物生长发育和应答逆境胁迫分子机制的模式植物利用基因工程技术手段培育杨树新品种，提高杨树抗旱耐盐能力日益成为该领域的重要育种途径。而且，植物体内转录因子可以通过结合启动子序列中的顺式作用元件调控下游靶基因的表达，调节植物生长发育及对逆境胁迫的适应能力，进而解决杨树转基因育种中单一功能基因作用不明显的难题。目前对杨树ERF转录因子基因RAP2L15的研究尚未见报道，而通过利用其改良杨树新品种的技术更是缺乏。如果能通过基因工程的技术调控RAP2L15基因的表达，逐步改善杨树生长速率及叶片形态，将极大促进其在生产中的应用，对于林木分子育种研究及林业生态文明建设，具有非常重要的实践意义。
发明内容
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种杨树ERF转录因子基因，所述ERF转录因子基因为RAP2L15基因，所述RAP2L15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
本发明还提供了一种杨树ERF转录因子基因在调控杨树生长发育方面的应用。
优选的，所述杨树ERF转录因子基因在调控杨树生长速率和/或叶片形态方面的应用。
优选的，所述杨树ERF转录因子基因在杨树中过量表达可使杨树生长减慢和/或叶片减小；所述杨树ERF转录因子基因在杨树中抑制表达可使杨树生长速率加快和/或叶宽增加。
本发明还提供了一种转基因杨树的构建方法，包括如下步骤：
(1)过表达植物表达载体pART-CAM-RAP2L15的构建
以SEQ ID NO.1所示的杨树RAP2L15基因序列为模板，利用引物经高保真酶进行PCR扩增，扩增产物经回收后连接至经XhoI和XbaI双酶切线性化的质粒载体pART-CAM上，筛选得到阳性质粒pART-CAM-RAP2L15；
(2)抑制表达植物表达载体pART27-RAP2L15的构建
以SEQ ID NO.1所示的杨树RAP2L15基因序列为模板，分别利用正向片段克隆引物和反向片段克隆引物扩增正向片段和反向片段；
以pKANNIBAL为骨架载体，所述正向片段插入在酶切位点Xho I和Kpn I之间，所述反向片段插入在酶切位点Hind III和Xba I之间，筛选获得含有RAP2L15基因靶序列正向片段和反向片段的pKANNIBAL-RAP2L15重组质粒；最后用XhoI和XbaII双酶切重组质粒pKANNIBAL-RAP2L15和载体pART27，利用T4连接酶连接，筛选获得阳性质粒pART27-RAP2L15；
(3)采用农杆菌介导的叶盘法转化杨树
将步骤(1)和(2)所得阳性质粒pART-CAM-RAP2L15和阳性质粒pART27-RAP2L15分别转化农杆菌感受态，利用农杆菌侵染法侵染杨树叶盘，筛选阳性转基因株系，获得RAP2L15基因过量表达转基因杨树和RAP2L15基因抑制表达转基因杨树。
优选的，步骤(1)中所述引物为引物RAP2L15-F2和引物RAP2L15-R2，所述引物RAP2L15-F2的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物RAP2L15-R2的序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，步骤(2)中所述正向片段克隆引物为RAP2L15-I-F1和RAP2L15-I-R1，所述反向片段克隆引物为RAP2L15-I-F2和RAP2L15-I-R2；所述正向片段克隆引物RAP2L15-I-F1的序列如SEQ ID NO.4所示，所述正向片段克隆引物RAP2L15-I-R1的序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向片段克隆引物RAP2L15-I-F2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述反向片段克隆引物RAP2L15-I-R2的序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明提供了杨树ERF转录因子基因RAP2L15在调控杨树生长发育，尤其是调控杨树生长速率和叶片形态方面的新应用。进而采用转基因技术，将RAP2L15基因整合到杨树基因组中，初步定向改变杨树生长速率和叶片形态特征。RAP2L15基因过量表达使杨树生长减慢，叶片减小，叶面积减小；而RAP2L15基因抑制表达能够适当促进植株生长，使株高增加，叶宽增加，为利用基因工程技术初步选育杨树新品种提供了新颖实用的方法。
附图说明
图1为实施例1构建的RAP2L15过表达载体电泳图；(a)M:Mark 2000；1～2：RAP2L15基因的ORF序列扩增；(b)M:Mark 2000；1～4：pART-CAM-RAP2L15重组质粒的PCR验证；
图2为实施例1构建的过表达植物表达载体pART-CAM-RAP2L15的载体图谱；
图3为实施例1构建的RAP2L15抑制表达载体电泳图；(a)M:Mark 2000；1～2：RAP2L15基因靶序列正向片段扩增；3～4：RAP2L15基因靶序列反向片段扩增；(b)M:Mark2000；1～2：pKANNIBAL连接正向片段的重组质粒的PCR验证；(c)M:Mark 2000；1～2：pKANNIBAL-RAP2L15正反向片段重组质粒的PCR验证；(d)M:Mark 2000；1～4：pART27-RAP2L15重组质粒的PCR验证；
图4为实施例1构建的抑制表达植物表达载体pART27-RAP2L15的载体图谱；
图5为实施例1中转RAP2L15基因杨树的转化、再生及表型图；其中，a：叶盘再生转基因芽丛及再生的抗性转基因小植株；b：对照(WT)、过表达(OX-1，OX-2，OX-3)和抑制表达(RNAi-1，RNAi-2，RNAi-3)转基因幼嫩植株继代扦插4天；c：对照(WT)、过表达(OX-1，OX-2，OX-3)和抑制表达(RNAi-1，RNAi-2，RNAi-3)转基因幼嫩植株继代扦插30天；d：对照(WT)、过表达(OX-1，OX-2，OX-3)和抑制表达(RNAi-1，RNAi-2，RNAi-3)转基因植株叶片(第四片)；e：对照(WT)、过表达(OX-1，OX-2，OX-3)和抑制表达(RNAi-1，RNAi-2，RNAi-3)转基因植株土壤培养3个月；
图6为实施例1中转RAP2L15基因杨树特异引物检测电泳图；(a)1～18：RAP2L15过表达杨树转基因株系；M：Mark 2000；阴：阴性对照；H2O：空白对照；阳：阳性对照；(b)1～44：RAP2L15抑制表达杨树转基因株系；M：Mark 2000；阴：阴性对照；H2O：空白对照；阳：阳性对照；
图7为实施例1中RAP2L15在对照(WT)、过表达(OX)和抑制表达(RNAi)阳性株系叶片中的相对表达量分析；(a)过表达转基因株系；(b)抑制表达转基因株系；
图8为实施例1中对照(WT)、过表达(OX)和抑制表达(RNAi)阳性株系30天幼苗表型统计分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1.获取RAP2L15基因
总RNA的提取材料为717杨的幼嫩叶片，采用液氮研磨法，按照北京百泰克公司的通用植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，RP3302)操作说明进行。总RNA质量采用NanoDrop-1000紫外分光光度计进行检测，只有当A260/280在1.8～2.1之间，A260/230大于2.0时才用于后续试验。cDNA的合成按照天根(北京)生化科技有限公司cDNA反转录试剂盒进行。根据Phytozome数据库毛果杨基因组获取杨树RAP2L15基因核苷酸序列，利用Primer 6.0设计引物RAP2L15-F2(序列如SEQ ID NO.2所示)和RAP2L15-R2(序列如SEQ ID NO.3所示)，以上一步合成的cDNA为模板，使用
Figure BDA0002821001610000051
PCR一步定向克隆试剂盒克隆目的基因。20μL反应体系：2×fast pfu master mix 10μL，Primer RAP2L15-F2 1μL，Primer RAP2L15-R2 1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL；反应程序：94℃预变性3min，33cycles(94℃30sec，58℃1min，72℃30s)，72℃延伸10min；4℃保存。PCR反应结束后，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测产物如图1(a)所示，对500bp处的条带进行切胶回收，回收按照北京Biomiga公司的琼脂糖凝胶DNA/PCR产物回收试剂盒(DC3511-01)进行。获得杨树RAP2L15基因ORF序列。RAP2L15基因的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
2.过表达植物表达载体pART-CAM-RAP2L15的构建
用XhoI和XbaI双酶切质粒pART-CAM。双酶切体系为(20μL)：10×Tango buffer 4μL，XhoI 1μL，XbaI 1μL，pART-CAM 1μg，ddH2O up to 20μL；37℃反应2.5h。回收线性化的质粒载体pART-CAM。将上一步纯化的RAP2L15基因片段，按照片段：载体摩尔比＝3:1～10:1将RAP2L15基因片段连接至pART-CAM线性化载体，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ。涂板后挑取阳性克隆进行PCR检测，分别在CaMV35S和RAP2L15上设计一对特异引物35S-F1(序列如SEQ ID NO.8所示)和RAP2L15-R1(序列如SEQ ID NO.9所示)，电泳检测结果如图1(b)所示，片段大小613bp。对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒，过表达植物表达载体pART-CAM-RAP2L15构建成功，如图2所示。
3.抑制表达植物表达载体pART27-RAP2L15的构建
设计RAP2L15基因序列正向片段克隆引物RAP2L15-I-F1(序列如SEQ ID NO.4所示)和RAP2L15-I-R1(序列如SEQ ID NO.5所示)、反向片段克隆引物RAP2L15-I-F2(序列如SEQ ID NO.6所示)和RAP2L15-I-R2(序列如SEQ ID NO.7所示)。以SEQ ID NO.1所示的杨树RAP2L15基因为模板，使用
Figure BDA0002821001610000061
PCR一步定向克隆试剂盒克隆目的基因。正向片段克隆的20μL反应体系：2×fast pfu master mix 10μL，Primer RAP2L15-I-F1 1μL，PrimerRAP2L15-I-R1 1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL；反向片段克隆的20μL反应体系：2×fast pfumaster mix 10μL，Primer RAP2L15-I-F2 1μL，Primer RAP2L15-I-R2 1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL；反应程序：94℃预变性3min，33cycles(94℃30sec，58℃1min，72℃30s)，72℃延伸10min；4℃保存。PCR反应结束后，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测产物如图3(a)所示，分别对500bp处的正向和反向目的条带进行切胶回收，回收按照北京Biomiga公司的琼脂糖凝胶DNA/PCR产物回收试剂盒(DC3511-01)进行，得到纯化的正向目的片段和反向目的片段。
用XhoI和KpnI双酶切质粒pKANNIBAL。双酶切体系为(20μL)：10×Tango buffer 4μL，XhoI 1μL，KpnI 1μL，pKANNIBAL 1μg，ddH2O up to 20μL；37℃反应2.5h。回收线性化的质粒载体pKANNIBAL。将纯化的正向目的片段，按照片段：载体摩尔比＝3:1～10:1连接至pKANNIBAL载体，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ。然后通过PCR鉴定挑选出转化的阳性克隆进行测序，获得pKANNIBAL连接正向片段的重组质粒，如图3(b)所示。
用XbaI和HindIII双酶切pKANNIBAL连接正向片段的重组质粒。双酶切体系为(20μL)：10×Tango buffer 2μL，XbaI 1μL，HindIII 2μL，pKANNIBAL连接正向片段的重组质粒1μg，ddH2O up to 20μL；37℃反应2.5h。回收线性化的质粒载体。将纯化的反向目的片段，按照片段：载体摩尔比＝3:1～10:1连接至线性化的质粒载体上，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ。然后通过PCR鉴定挑选出转化的阳性克隆进行测序，获得含有RAP2L15基因正向和反向序列的pKANNIBAL-RAP2L15重组质粒，如图3(c)所示。
用XhoI和XbaII双酶切质粒pKANNIBAL-RAP2L15和载体pART27。利用T4连接酶连接，转化至DH5α感受态细胞。然后通过PCR鉴定挑选出转化的阳性克隆进行测序，获得pART27-RAP2L15重组质粒，如图3(d)所示。对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒，抑制表达植物表达载体pART27-RAP2L15构建成功，如图4所示。
4.农杆菌GV3101介导的叶盘法转化717杨
从超低温冰箱中取出农杆菌感受态100μL放至碎冰上融化，向其中分别加入5μL过表达载体质粒pART-CAM-RAP2L15和抑制表达载体质粒pART27-RAP2L15，轻弹混匀；冰上放置30min；液氮速冻1min，37℃热激5min，冰浴2min。向其中加入500μL不含抗生素的液体LB培养基，150rpm28℃培养4～5h。取200μL上述菌液用玻璃涂布器均匀涂布于含卡那霉素(Kan，50mg/L)和利福平(Rif，50mg/L)的平板上，于28℃黑暗条件下倒置培养48h。挑取单菌落进行菌落PCR，将PCR结果为阳性的菌落接种于含卡那霉素和利福平的液体培养基上28℃摇菌16h。将活化好的菌液离心，得到沉淀，将沉淀用液体MS培养基重悬，得到农杆菌菌液。分光光度计600nm波长光测定菌液浓度为0.6～0.8时，即可用于侵染转化。
以幼嫩717杨无菌苗的叶片为试验材料，剪取完全伸展开的叶片，沿垂直于主叶脉的方向划几个浅伤口(图5a)，背面朝下接种于1/2MS培养基上预培养48h。将预培养好的叶盘接于备好的农杆菌菌液中在摇床上130rpm/min摇约10min，使叶盘与农杆菌菌液充分接触。然后取出叶盘，用无菌的滤纸吸去叶盘表面的菌液。将叶盘转移到共培养基1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA上，25℃黑暗条件下共培养2～4d。将共培养后的叶盘用无菌蒸馏水洗液清洗4-5次，期间要不断地摇动。倒干洗液，将叶盘置于灭菌滤纸上吸干，在超净台内风干，接入筛选培养基1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+50mg/L卡那霉素+300mg/LTimentin，每15天继代一次，直至叶盘上分化出愈伤组织，长出不定芽并发育成小植株(图5a)。挑取筛选培养基上的小植株转入生根培养基1/2MS+0.05mg/L IBA+0.02mg/L NAA+50mg/L卡那霉素+300mg/L Timentin，直至诱导出不定根。
5.转基因株系的检测
采用PCR法对转基因株系进行验证。待不定芽形成完整小植株时，切取部分叶片，使用TransDirect Plant Tissue PCR Kit试剂盒提取基因组DNA(模板)，用基因特异引物检测阳性植株。分别在CaMV35S和RAP2L15上设计一对特异引物35S-F1(序列如SEQ ID NO.8所示)和RAP2L15-R1(序列如SEQ ID NO.9所示)，以未转化植株为阴性对照(野生型植株)，对转基因再生株系进行初步PCR检测，PCR体系为(50μL)：Premix Taq 25μL，35S-F1和RAP2L15-R1引物各1μL，DNA模板2μL，ddH2O 21μL；PCR程序为94℃预变性2min，30cycles(98℃10sec，58℃30sec，72℃50sec)，72℃延伸5min。PCR产物用凝胶电泳检测如图6所示，阳性转基因株系(过表达株系14个，抑制表达株系27个)均可扩增出约600bp大小的条带，而野生型植株没有扩增出条带。
选取初步检测为阳性株系的叶片提取RNA并反转录为cDNA，然后采用荧光定量RT-PCR计算各株系RAP2L15的相对表达情况。以Actin为内参设计一对引物ACT-F1(序列如SEQID NO.10所示)和ACT-R1(序列如SEQ ID NO.11所示)，再设计一对RAP2L15-ORF区的特异引物RAP2L15-F3(序列如SEQ ID NO.12所示)和RAP2L15-R3(序列如SEQ ID NO.13所示)。按照荧光定量试剂盒(
Figure BDA0002821001610000081
Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)，RR820A)建立扩增体系，扩增条件：95℃1min，40cycles(95℃10sec，58℃20sec，72℃45sec)。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，计算各转基因株系及野生型的RAP2L15相对表达情况。检测结果如图7所示，与野生型(WT)相比，RAP2L15过表达转基因株系表达量均有所提高，尤其在株系OX-10、OX-13和OX-15中RAP2L15的表达量升高了1000倍以上。抑制表达转RAP2L15基因株系表达量均降低，尤其在株系RNAi-17、RNAi-25和RNAi-40中RAP2L15的表达受到显著抑制。证实内源基因RAP2L15已经转入717杨基因组中并得到过量或抑制表达的结果。
6.转基因株系表型的测量记录统计
对转基因阳性株系的生长过程的观察显示，相对于对照(WT)植株，过表达植株生长受到抑制，茎第3-4节间减小，叶面积减小，比叶重增加，叶长宽比增加，叶片宽度减小；抑制表达植株高生长增加，叶片长宽比减小，叶片宽度增加(图8)。
本发明中所用引物的序列如表1所示：
表1引物
序列名称 名称 序列
SEQ ID NO.2 RAP2L15-F2 GGAGAGGACACGCTCGAGATGGTGAGAGAAAGAAGGGAGC
SEQ ID NO.3 RAP2L15-R2 TTAAAGCAGGACTCTAGATCATTAAACTGTCCACACACCAGG
SEQ ID NO.4 RAP2L15-I-F1 GGAGAGGACACGCTCGAGGTGAGAGAAAGAAGGGAGCGAGG
SEQ ID NO.5 RAP2L15-I-R1 TTTCCTTACCAATTGGGGTACCAACTGTCCACACACCAGGTGT
SEQ ID NO.6 RAP2L15-I-F2 TTCGAAATCGATAAGCTTAACTGTCCACACACCAGGTGT
SEQ ID NO.7 RAP2L15-I-R2 TTAAAGCAGGACTCTAGAGTGAGAGAAAGAAGGGAGCGAGG
SEQ ID NO.8 35S-F1 TGACGCACAATCCCACTATC
SEQ ID NO.9 RAP2L15-R1 TCATTAAACTGTCCACACACCAGG
SEQ ID NO.10 ACT-F1 ACCCTCCAATCCAGACACTG
SEQ ID NO.11 ACT-R1 TTGCTGACCGTATGAGCAAG
SEQ ID NO.12 RAP2L15-F3 CAAGGGAGTGAGGATGAGAAAG
SEQ ID NO.13 RAP2L15-R3 CGTTGGAAAATGAAACGTCGCC
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种杨树ERF转录因子基因及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagaaagt ggggaaaatg ggtagcagaa ataaggcaac caaacagtag aaatagaata 60
tggttaggtt cgtataatac cgcagaggaa gcagcaagag catatgatgc tgctgtttta 120
tgtttacgtg ggccttcggc gacgtttaat tttccatcga atgtaccgga aattcctgca 180
acgacagaga tgttgcctcc cgcgcagatt agggaggttg cttttaggca tgcaagaaag 240
gggagtactt tggaagctgc agagaggatt gtggaatctg ggttgtttga agggccgtct 300
gggatgagtg gagaggtgta tttgggtggc gaaggcggtg gggcggaaaa tttagaggga 360
gtttcgagtg gggtatgtta tcaaacatct ggtgtgtgga cagtttaa 408
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagaggaca cgctcgagat ggtgagagaa agaagggagc 40
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaaagcagg actctagatc attaaactgt ccacacacca gg 42
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagaggaca cgctcgaggt gagagaaaga agggagcgag g 41
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttccttacc aattggggta ccaactgtcc acacaccagg tgt 43
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcgaaatcg ataagcttaa ctgtccacac accaggtgt 39
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttaaagcagg actctagagt gagagaaaga agggagcgag g 41
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgacgcacaa tcccactatc 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcattaaact gtccacacac cagg 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accctccaat ccagacactg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgctgaccg tatgagcaag 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagggagtg aggatgagaa ag 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgttggaaaa tgaaacgtcg cc 22
<210> 14
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Arg Lys Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Gln Pro Asn Ser
1 5 10 15
Arg Asn Arg Ile Trp Leu Gly Ser Tyr Asn Thr Ala Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Arg Ala Tyr Asp Ala Ala Val Leu Cys Leu Arg Gly Pro Ser Ala Thr
35 40 45
Phe Asn Phe Pro Ser Asn Val Pro Glu Ile Pro Ala Thr Thr Glu Met
50 55 60
Leu Pro Pro Ala Gln Ile Arg Glu Val Ala Phe Arg His Ala Arg Lys
65 70 75 80
Gly Ser Thr Leu Glu Ala Ala Glu Arg Ile Val Glu Ser Gly Leu Phe
85 90 95
Glu Gly Pro Ser Gly Met Ser Gly Glu Val Tyr Leu Gly Gly Glu Gly
100 105 110
Gly Gly Ala Glu Asn Leu Glu Gly Val Ser Ser Gly Val Cys Tyr Gln
115 120 125
Thr Ser Gly Val Trp Thr Val
130 135

Claims (7)

1.一种杨树ERF转录因子基因，其特征在于，所述ERF转录因子基因为RAP2L15基因，所述RAP2L15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
2.一种权利要求1所述的杨树ERF转录因子基因在调控杨树生长发育方面的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述杨树ERF转录因子基因在调控杨树生长速率和/或叶片形态方面的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述杨树ERF转录因子基因在杨树中过量表达可使杨树生长减慢和/或叶片减小；所述杨树ERF转录因子基因在杨树中抑制表达可使杨树生长加快和/或叶宽增加。
5.一种转基因杨树的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)过表达植物表达载体pART-CAM-RAP2L15的构建
以SEQ ID NO.1所示的杨树RAP2L15基因序列为模板，利用引物经高保真酶进行PCR扩增，扩增产物经回收后连接至经XhoI和XbaI双酶切线性化的质粒载体pART-CAM上，筛选得到阳性质粒pART-CAM-RAP2L15；
(2)抑制表达植物表达载体pART27-RAP2L15的构建
以SEQ ID NO.1所示的杨树RAP2L15基因序列为模板，分别利用正向片段克隆引物和反向片段克隆引物扩增正向片段和反向片段；以pKANNIBAL为骨架载体，所述正向片段插入在酶切位点Xho I和Kpn I之间，所述反向片段插入在酶切位点Hind III和Xba I之间，筛选获得含有RAP2L15基因靶序列正向片段和反向片段的pKANNIBAL-RAP2L15重组质粒；最后用XhoI和XbaII双酶切重组质粒pKANNIBAL-RAP2L15和载体pART27，利用T4连接酶连接，筛选获得阳性质粒pART27-RAP2L15；
(3)采用农杆菌介导的叶盘法转化杨树
将步骤(1)和(2)所得阳性质粒pART-CAM-RAP2L15和阳性质粒pART27-RAP2L15分别转化农杆菌感受态，利用农杆菌侵染法侵染杨树叶盘，筛选阳性转基因株系，获得RAP2L15基因过量表达转基因杨树和RAP2L15基因抑制表达转基因杨树。
6.如权利要求5所述的转基因杨树的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述引物为引物RAP2L15-F2和引物RAP2L15-R2，所述引物RAP2L15-F2的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物RAP2L15-R2的序列如SEQ ID NO.3所示。
7.如权利要求5所述的转基因杨树的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述正向片段克隆引物为RAP2L15-I-F1和RAP2L15-I-R1，所述反向片段克隆引物为RAP2L15-I-F2和RAP2L15-I-R2；所述正向片段克隆引物RAP2L15-I-F1的序列如SEQ ID NO.4所示，所述正向片段克隆引物RAP2L15-I-R1的序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向片段克隆引物RAP2L15-I-F2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述反向片段克隆引物RAP2L15-I-R2的序列如SEQ IDNO.7所示。
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