CN105695479B - 菊花对称性基因CmCYC2c及其应用 - Google Patents

菊花对称性基因CmCYC2c及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因，具体公开了一个新的菊花对称性基因CmCYC2c及其在调控菊花舌状花花瓣性状中，尤其是在增加舌状花花瓣数目和增长花瓣长度方面的新应用。所述菊花对称性基因CmCYC2c的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基于该基因及其上述应用，本发明进一步提供了采用转基因技术，将CmCYC2c基因整合到甘菊基因组中，初步定向改良花型，使其舌状花数目增多，花瓣长度增长，为利用基因工程技术初步选育菊花花型新品种提供了新颖实用的方法。

Description

菊花对称性基因CmCYC2c及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因，具体地说，涉及菊花对称性基因CmCYC2c及其在调控菊花舌状花花瓣性状中的应用。
背景技术
被子植物的花有辐射对称和左右对称两种形式，其中两侧对称的花是由辐射对称的花演变而来。两侧对称花的进化不仅丰富了花部的形态，也因提高了传粉效率从而促进了物种的生存能力(Endress，1998)。菊花(Chrysanthemum morifolium)为头状花序，每个花序由许多小花构成，其中舌状花为雌花，属于左右对称；中央管状花为两性花，属于辐射对称。菊花舌状花和管状花的构成和分布差异形成了千姿百态的品种类型。近年来，随着基因工程技术的迅速发展，通过遗传转化的技术在植物体内过量表达特定的内源基因以调控观赏植物的花部形态已成为现代育种的重要手段。对模式植物金鱼草(Antirrhinummajus)的研究揭示了CYC2基因(TCP基因家族)对花对称性的调控作用，研究表明cyc/dich双突变体的花由两侧对称变成了辐射对称，花的背部、侧部和腹部属性的差异消失，每个花瓣都成为两侧对称而且所有的花瓣都腹部化，花瓣数目比野生型多一个，即由5个变成6个(Luo et al.，1996；1999)。而在菊科的头状花序中，CYC2类基因对花朵对称性的影响方式具有新的特点。在非洲菊(Gerbera hybrida)中，GhCYC2基因的表达减缓了营养生长并抑制其向生殖生长的转变，导致部分不能正常开花；另外对花序的改变包括舌状花瓣的变短，管状花瓣的延长和雄蕊的畸形，增强了管状花的两侧对称性，从而影响了其头状花序形态(Chapman et al.，2008；Tahtiharju et al.，2012)。而在向日葵(Helianthus annuus)中，转座子在HaCYC2c不同位置的插入导致该基因的过表达或被沉默，结果使过表达植株的中心花盘出现更多舌状花，而被沉默植株的舌状花的形成受影响(Chapman et al，2012；Fambrini et al.，2014)。野生菊花均具有良好的生态适应性和抗逆性，比如菊属模式植物二倍体甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)广布于中国大江南北的各种生态环境中。但目前二倍体种均为单轮舌状花，这极大限制了其在生态园林中的观赏应用及新品种培育。如果能通过基因工程的技术引入重瓣基因逐步改善其舌状花瓣型，将极大促进其在生产中的应用。目前菊花CYC2类基因的功能研究尚未见报道，而通过利用其改善菊花花型的技术更是缺乏。另外菊花花型新品种培育的主要方法依然是传统的杂交育种，相对于分子育种，其不仅周期长且难以实现定向培育。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供菊花对称性基因CmCYC2c及其在调控菊花舌状花花瓣性状中的应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种菊花对称性基因CmCYC2c，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
第二方面，本发明提供了前述基因在调控菊花舌状花花瓣性状中的应用，所述菊花舌状花花瓣性状具体表现为舌状花花瓣数目或花瓣长度。
更为具体地，所述菊花对称性基因CmCYC2c在菊花中的表达可使菊花舌状花花瓣数目增加和/或花瓣长度增长。
进一步地，本发明还提供了前述基因在培育地被菊花型新品种中的应用，具体为将SEQ ID NO.1所示的基因序列构建到植物表达载体pCAMBIA1304质粒中，筛选阳性质粒，通过农杆菌介导将阳性质粒转化入菊花叶盘，获得转基因菊花，筛选阳性转基因株系。所述阳性转基因株系经正常培育可得到改良花型的甘菊，其舌状花数目增多，花瓣长度增长，为利用基因工程技术初步选育菊花花型新品种提供了新颖实用的方法。
更进一步地，培育地被菊花型新品种涉及构建转基因菊花的步骤。本发明针对甘菊提供一个具体的实施方式，转基因甘菊的构建主要包括如下步骤：
1)植物表达载体pCAMBIA1304-CmCYC2c的构建：
以SEQ ID NO.1所示的菊花CmCYC2c基因序列为模板，利用SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示的引物(CmCYC2c-F2和CmCYC2c-R2)经高保真酶进行PCR扩增，扩增产物经回收后用In-Fusion HD Cloning Kit法连接至经NcoI单酶切线性化的质粒载体pCAMBIA1304上，连接产物经转化涂板后，分别在CaMV35S和GFP上设计一对特异引物35S-F1和GFP-R1(序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示)对阳性克隆进行筛选，测序序列正确的菌落经扩大培养后，提取阳性质粒pCAMBIA1304-CmCYC2c。
2)农杆菌介导的叶盘法转化甘菊：
将步骤1)所得的阳性质粒转化农杆菌(菌株EHA105)感受态细胞，利用农杆菌侵染法侵染甘菊叶盘，获得转CmCYC2c基因甘菊。
3)筛选阳性转基因株系：
采用PCR法对转基因株系进行验证。提取抗潮霉素植株叶片基因组DNA，在CaMV35S启动子上设计上游引物35S-F2，序列如SEQ ID NO.12所示，在CmCYC2c序列上设计下游引物CmCYC2c-R3，序列如SEQ ID NO.13所示。以未转化植株为阴性对照，对转基因再生株系进行初步PCR检测，选取初步检测为阳性株系的花序提取RNA并反转录为cDNA，然后采用荧光定量RT-PCR计算各株系CmCYC2c的相对表达情况。以CnACTIN为内参设计一对引物ClACT-F1和ClACT-R1，序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，再设计一对CmCYC2c-ORF区的特异引物CmCYC2c-F4和CmCYC2c-R4，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，对CmCYC2c在不同株系花序中的表达量进行验证。经过PCR和荧光定量RT-PCR检测为阳性的为转基因阳性株系。
其中，质粒载体pCAMBIA1304为市售可得载体，如可购自生物风生物技术服务公司。CnACTIN为已知基因，NCBI登录号为KF305683.1。
本发明仅以甘菊为例，提供了具体的实施方式，但所述基因在菊花中的应用并不局限于甘菊品种。
第三方面，本发明提供了含有前述基因的载体及工程菌。
作为优选，所述载体以含有潮霉素抗性基因、CaMV35S启动子和GFP元件的pCAMBIA1304质粒为骨架，并通过酶切方式连接有前述基因序列。该载体由于含有潮霉素抗性基因、CaMV35S启动子和GFP元件，能够更好地在后期通过潮霉素筛选生根植株，并利于从分子水平上进行检测。
本发明的有益效果在于：
本发明发现了菊花对称性基因CmCYC2c在改善菊花舌状花瓣型，尤其是增加舌状花花瓣数目和增长花瓣长度方面的新应用。进而提供了采用转基因技术，将CmCYC2c基因整合到甘菊基因组中，初步定向改良花型，使其舌状花数目增多，花瓣长度增长，为利用基因工程技术初步选育菊花花型新品种提供了新颖实用的方法。
本发明所述的植物表达载体中，引入了潮霉素抗性基因、CaMV35S启动子和GFP，利于后期通过潮霉素筛选生根植株，利于从分子水平上进行检测，二者结合准确可靠。
附图说明
图1为本发明所述的植物表达载体pCAMBIA1304-CmCYC2c的载体图谱。
图2为本发明实施例1中CmCYC2c载体构建电泳图，其中，M:Mark2000；1：CmCYC2c3’RACE扩增；2：CmCYC2c第一轮5’RACE；3：CmCYC2c第二轮5’RACE末端序列扩增；4：CmCYC2c基因的ORF序列扩增；5：pCAMBIA1304-CmCYC2c重组质粒的PCR验证。
图3为本发明实施例1中转CmCYC2c基因菊花特异引物检测电泳图，其中，M:Mark2000；1：阳性质粒；2：未转基因对照植株；3～8：转CmCYC2c基因的菊花株系。
图4为本发明实施例1中转CmCYC2c甘菊的转化、再生及表型图，其中，a：预培养叶盘，b：叶盘再生转基因芽丛，c:再生的转基因小植株，d：转基因植株根系抗性筛选，e：对照(左)和转基因(右)幼嫩植株，f：对照(左)和转基因(右)植株开花，g：对照和转基因株系花序，h：转基因株系中出现的介于管状花和舌状花中间类型。
图5为本发明实施例1中CmCYC2c在对照和阳性株系花序中的相对表达量分析。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、地被菊‘国庆小六号’CmCYC2c基因的克隆
总RNA的提取材料为地被菊品种‘国庆小六号’的幼嫩花蕾，采用液氮研磨法，按照北京百泰克公司的通用植物总RNA提取试剂盒(离心柱型，RP3302)操作说明进行。总RNA质量采用NanoDrop-1000紫外分光光度计进行检测，只有当A260/280在1.8-2.1之间，A260/230大于2.0时才用于后续试验。3’RACE和5’RACE cDNA模板按照Clontech SMARTerTM RACEcDNA扩增试剂盒进行。根据已经在NCBI上登陆的非洲菊、向日葵和千里光(Seneciovulgaris)的CYC2类蛋白的保守结构域序列‘ASKTLDWL’对应的核苷酸序列设计3’RACE GSP正向引物CYC2-3’GSPF1(SEQ ID NO.3)，以上一步合成的3’RACE cDNA为模板，进行PCR扩增。50μL反应体系：3’RACE cDNA 2.5μL，10xUPM(0.4μM)5.0μL，3’GSP(10μM)1.0μL，10xAdvantage 2PCR Buffer 5.0μL，50xAdvantage 2Polymerase Mix 1.0μL，dNTP Mix(10mM)1.0μL，PCR-Grade Water 24.5μL；反应程序：94℃预变性3min，3cycles(94℃30sec，72℃2min)，3cycles(94℃30sec，70℃30sec，72℃2min)，3cycles(94℃30sec，68℃30sec，72℃2min)，25cycles(94℃30sec，65℃30sec，72℃2min)，72℃延伸6min。PCR反应结束后，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测产物如图2中1所示，对750bp处的条带进行切胶回收，回收按照北京Biomiga公司的琼脂糖凝胶DNA/PCR产物回收试剂盒(DC3511-01)进行。纯化的DNA产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，按照片段：载体摩尔比＝3:1-10:1连接至pMDTM18-T载体，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ。然后通过PCR鉴定挑选出转化的阳性克隆进行测序，即获得基因的3’末端。
根据上述3’末端序列设计5’RACE特异引物CYC2c-5’GSPR1(SEQ ID NO.4)和CYC2c-5’GSPR2(SEQ ID NO.5)做巢式PCR。第一轮PCR的反应体系为：5’RACE cDNA 2.5μL，10xUPM(0.4μM)5.0μL，CYC2c-5’GSPR1(10μM)1.0μL，10xAdvantage 2PCR Buffer 5.0μL，50xAdvantage 2Polymerase Mix 1.0μL，dNTP Mix(10mM)1.0μL，PCR-Grade Water 24.5μL；反应程序同上述3’RACE。在以第一轮PCR的产物为模板，用引物CYC2c-5’GSPR2进行第二轮PCR，反应体系为：5第一轮PCR产物1μL，10xNUPM(0.4μM)1μL，CYC2c-5’GSPR2(10μM)1.0μL，10xAdvantage 2PCR Buffer 5.0μL，50x Advantage 2Polymerase Mix 1.0μL，dNTP Mix(10mM)1.0μL，PCR-Grade Water 40μL；反应程序为：94℃预变性3min，25cycles(94℃30sec，66℃30sec，72℃1.5min)，72℃延伸6min，PCR产物凝胶电泳图结果如图2中2、3所示。
应用DNAMAN软件对CmCYC2c基因的3’端序列及5’端序列进行拼接，根据拼接结果，从序列的两端分别设计1对引物：CmCYC2c-F1(SEQ ID NO.6)和CmCYC2c-R1(SEQ ID NO.7)。然后以‘国庆小6号’的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO43μL，引物(10μM each)1.5μL，cDNA模板1μL，KOD-Plus-Neo酶1μL，distilled water 32μL；反应程序为：94℃预变性2min，30cycles(98℃10sec，58℃30sec，68℃40sec)，68℃延伸2min，PCR产物用凝胶电泳检测如图2中4，片段大小为900bp。PCR产物经回收、连接、T-A克隆、转化、阳性克隆筛选、测序后，得到菊花CmCYC2c基因ORF序列。CmCYC2c基因的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2、植物表达载体pCAMBIA1304-CmCYC2c的构建
设计一对引物CmCYC2c-F2和CmCYC2c-R2，序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，在CmCYC2c基因的上下游引入NcoI酶切位点，PCR体系为(50μL)：10×PCR Buffer forKOD-Plus-Neo 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，引物(10μM each)1.5μL，CmCYC2cORF质粒1μL，KOD-Plus-Neo酶1μL，distilled water 32μL；PCR程序同上。PCR产物经回收后用In-Fusion HD Cloning Kit法连接至经NcoI单酶切线性化的质粒载体pCAMBIA1304上。单酶切体系为(50μL)：pCAMBIA1304 15μL，NEBuffer 3.1 5μL，NcoI 2μL，ddH2O 28μL；37℃反应3h。连接体系为(10μL)：In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，线性化的pCAMBIA1304质粒2μL，纯化的NcoI-CmCYC2c-NcoI片段6μL；50℃反应15min。连接产物转化DH5ɑ感受态细胞，涂板后挑取阳性克隆进行PCR检测，分别在CaMV35S和GFP上设计一对特异引物35S-F1(SEQ IDNO.10)和GFP-R1(SEQ ID NO.11)，电泳检测结果如图2中5所示，片段大小980bp。对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒，植物表达载体pCAMBIA1304-CmCYC2c构建成功，过程如图1所示。
3、农杆菌EHA105介导的叶盘法转化甘菊
从超低温冰箱中取出农杆菌感受态100μL放至碎冰上融化，向其中加入5μLpCAMBIA1304-CmCYC2c表达载体质粒，轻弹混匀；冰上放置30min；液氮速冻1min，37℃热激5min，冰浴2min。向其中加入500μL不含抗生素的液体LB培养基，150rpm 28℃培养4-5h。取200μL菌液用玻璃涂布器均匀涂布于含卡那霉素(Kan，50mg/L)和利福平(Rif，50mg/L)的平板上，于28℃黑暗条件下倒置培养48h。挑取单菌落进行菌落PCR，将PCR结果为阳性的菌落接种于含卡那霉素和利福平的液体培养基上28℃摇菌约16小时。将活化好的菌液离心，将沉淀用液体MS培养基重悬。分光光度计600nm波长光测定菌液浓度为0.6-0.8时，即可用于侵染转化。
以幼嫩甘菊无菌苗的叶片为试验材料，剪取顶端完全伸展开的叶片，切成小于0.5cm2大小的方形小块(图4a)，再沿垂直于主叶脉的方向划几个浅伤口，背面朝下接种于MS培养基上预备养48h。将预培养好的叶盘接于备好的农杆菌中在摇床上130rpm/min摇约10min，使叶盘与农杆菌菌液充分接触。然后取出叶盘，用无菌的滤纸吸去叶盘表面的菌液。将叶盘转移到共培养基MS+1mg/L 6BA+0.5mg/L NAA上，24±2℃黑暗条件下共培养72h。将共培养后的叶盘用无菌蒸馏水清洗4-5次，期间要不断地摇动。倒干洗液，将叶盘置于灭菌滤纸上吸干，在超净台内风干，接入筛选培养基MS+1mg/L6BA+0.5mg/LNAA+400mg/l Carb+8mg/l Hyg，每15天继代一次，直至叶盘上分化出愈伤组织，长出不定芽并发育成小植株(图4b和图4c)。挑取筛选培养基上的小植株转入生根培养基1/2MS+0.1mg/L NAA+250mg/lCarb+10mg/l Hyg，能在培养基中长出大量白色须根的即为转基因再生苗(图4d)。当再生苗长出5-6片真叶时，将PCR检测确认为阳性植株的移入混合基质中在温室常规培养直至开花(图4e和图4f)。
4、转基因株系的检测
采用PCR法对转基因株系进行验证。提取抗潮霉素筛出植株叶片基因组DNA，在CmCYC2c序列上设计上游引物CmCYC2c-F3(SEQ ID NO.12)，在GFP上设计下游引物GFP-R2(SEQ ID NO.13)，以未转化植株为阴性对照，对转基因再生株系进行初步PCR检测，PCR体系为(50μL)：Premix Taq 25μL，35SF1和CmCYC2c-R3引物各1μL，cDNA模板2μL，ddH2O 21μL；PCR程序为94℃预变性2min，30cycles(98℃10sec，58℃30sec，72℃50sec)，72℃延伸5min。PCR产物用凝胶电泳检测如图3所示，转基因株系均可扩增出259bp大小的条带，而野生型植株没有扩增出条带。选取初步检测为阳性株系的花序提取RNA并反转录为cDNA，然后采用荧光定量RT-PCR计算各株系CmCYC2c的相对表达情况。以CnACTIN为内参设计一对引物ClACT-F1(SEQ ID NO.14)和ClACT-R1(SEQ ID NO.15)，再设计一对CmCYC2c-ORF区的特异引物CmCYC2c-F4(SEQ ID NO.16)和CmCYC2c-R4(SEQ ID NO.17)。按照荧光定量试剂盒(
Figure BDA0000938883230000091
Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)，RR820A)建立扩增体系，扩增条件：95℃1min，40cycles(95℃10sec，58℃20sec，72℃45sec)。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，计算各转基因株系及野生型的CmCYC2c相对表达情况。检测结果如图5所示，与野生型(WT)相比，转CmCYC2c基因株系表达量均有所提高，尤其在株系TR1、TR2和TR3中CmCYC2c的表达量升高了8-24倍。证实内源基因CmCYC2c已经转入甘菊基因组中并得到过表达。
5、转基因株系表型的测量记录统计
对转基因阳性株系的生长过程的观察显示，相对于对照植株，其早期的营养生长和侧芽生长受抑制(图4e)，但并未影响后期的花芽分化和花序生长。对花序的观察测量统计表明，转基因株系的舌状花花瓣长度增长且舌状花数目增加，花瓣呈现出重叠生长的现象(4g)，部分株系舌状花畸形，出现介于舌状花和管状花之间的类型(4h)。在对照植株中，一个花序中舌状花的平均数目为13.75，舌状花花瓣的平均长度为4.89mm。而在转基因株系中，舌状花数目增加了16％～31％(16-18片)，花瓣长度增加了25％～44％(6-7mm)，结果如表1所示。
表1
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000938883320000011
Figure IDA0000938883320000021
Figure IDA0000938883320000031
Figure IDA0000938883320000061
Figure IDA0000938883320000071

Claims (3)

1.SEQ ID NO.1所示的菊花对称性基因CmCYC2c在调控菊花舌状花花瓣性状方面的应用；
基因调控菊花舌状花花瓣性状是在菊花中的表达使菊花舌状花花瓣数目增加和/或花瓣长度增长。
2.SEQ ID NO.1所示的菊花对称性基因CmCYC2c在培育地被菊花型新品种中的应用，其特征在于，将所述基因构建到植物表达载体pCAMBIA1304质粒中，筛选阳性质粒，通过农杆菌介导将阳性质粒转化入菊花叶盘，获得转基因菊花，筛选阳性转基因株系，获得花瓣数目增加和/或花瓣长度增长的新花型菊花。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）植物表达载体pCAMBIA1304-CmCYC2c的构建：
以SEQ ID NO.1所示的菊花CmCYC2c基因序列为模板，利用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物经高保真酶进行PCR扩增，扩增产物经回收后连接至经NcoI单酶切线性化的质粒载体pCAMBIA1304上，筛选得到阳性质粒pCAMBIA1304-CmCYC2c；
2）农杆菌介导的叶盘法转化甘菊：
将步骤1）所得的阳性质粒转化农杆菌感受态细胞，利用农杆菌侵染法侵染甘菊叶盘，获得转CmCYC2c基因甘菊；
3）筛选阳性转基因株系，获得花瓣数目增加和/或花瓣长度增长的新花型菊花。
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