CN116064593B - 一种毛白杨pgag基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种毛白杨PGAG基因及其应用,本发明属于基因工程技术领域。本发明提供的毛白杨PGAG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,编码的转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次发现了一个生长调节转录因子,并克隆了它的全长CDS序列PGAG,利用其构建的PGAG基因过表达毛白杨植株具有生长速度快、生物量积累快的优势。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种毛白杨PGAG基因及应用。
背景技术
生长调节因子家族是一个小型的植物特异性TF家族,虽然在最初的研究中,生长调节因子的功能仅在叶片和茎的发育中被确定。近年来的研究揭示了生长调节因子在植物生物学的其他方面的作用,如开花、种子和根的发育、逆境条件下生长的控制以及植物寿命的调控。
杨树(Populus L.)是一种杨柳目杨柳科植物具有适应性强、生长速度快、容易扩繁、树木笔直高大、用途广等特点,在全球都有广泛种植。杨树在我国的分布很广,从新疆到东部沿海,北起黑龙江、内蒙古到长江流域都有分布。不论营造防护林还是用材林,杨树都是主要的造林树种。我国杨树造林面积不断扩大,已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。提供优质木材和高产质优林果品等方面发挥着突出作用。
因此,如何克隆得到编码生长调节因子基因,并验证其相关功能,以改善杨树的生长特性,是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毛白杨生长调节因子,用于提升杨树生长速度及生物量积累。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种毛白杨PGAG基因,所述PGAG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种所述PGAG基因编码的转录因子,所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种表达载体,包括所述的PGAG基因。
本发明还提供了一种重组菌,包括所述的PGAG基因或所述的表达载体。
本发明还提供了一种所述的PGAG基因、所述的转录因子、所述的表达载体或所述的宿主在调控毛白杨生长特性中的应用。
优选的,所述调控毛白杨生长特性的方法为在毛白杨中过表达所述PGAG基因。
优选的,所述生长特性为促进毛白杨不定根伸长、叶片面积增加和生物量积累。
本发明首次发现了一个生长调节转录因子,并克隆了它的全长CDS序列PGAG,利用其构建的PGAG基因过表达毛白杨植株具有生长速度快、生物量积累快的优势。
附图说明
图1为实施例2中PGAG转基因鉴定结果;
图2为实施例3中毛白杨水培方式;
图3为实施例3中野生型和过表达株系叶片表型和面积统计;
图4为实施例3中野生型和过表达株系根部表型和根长统计;
图5为实施例3中野生型和过表达株系干重统计。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
获取毛白杨PGAG基因的CDS序列(如SEQ ID NO.1所示)
取毛白杨健康植株,使用BIOFIT试剂盒提取毛白杨RNA,然后使用翊圣生物科技有限公司反转录试剂盒反转录RNA获得cDNA,以cDNA为模板,使用过表达引物PCR扩增(程序:预变性98℃,30s;变性98℃,15s;退火55℃,5s;延伸72℃,20s;循环34次;72℃,1min)。
毛白杨PGAG基因过表达引物+载体连接引物F:ACTCGAGGGGGATCCCCAATACTTGTATGGATGGATTTTGGGGTTCAGG TGG(在过表达引物基础上加入Xcm I酶切位点以及载体上的重组同源片段)。
毛白杨PGAG基因过表达引物+载体连接引物R:TTCGCTAGTGGATCCCCAATACTTGTATGGTTACATGGCAGGCAATGAA GAAGAA(在过表达引物基础上加入Xcm I酶切位点以及载体上的重组同源片段)。
以cDNA为模板进行PCR扩增,回收产物。
本实验使用pCXSN载体,用XcmI限制性内切酶酶切,并回收载体骨架,与PCR回收的产物进行连接,转入DH5α大肠杆菌内,于抗性培养基(含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基)上进行筛选,构建含有PGAG全长CDS的过表达载体。
挑取阳性大肠杆菌菌落,提取质粒,验证序列是否正确。将提取的质粒转化农杆菌GV3101菌株,在抗性培养基(含有50mg/L卡那霉素,50mg/L利福平,50mg/L庆大霉素的LB固体培养基)上进行筛选。挑取阳性菌株扩大培养并保存。
将扩大培养的农杆菌菌株分装至50mL无菌离心管中,于离心机中以5000rpm的转速离心10min,弃去管中液体,保留菌体,向离心管中加入20mL事先配置好的WPM溶液备用。取子毛白杨第二节间的健康叶用于侵染。获得过表达株系。
实施例2
挑选正常对照组(WT)及转基因株系(PGAG-OE-L4、PGAG-OE-L8),进行RNA提取并反转录成cDNA,以毛白杨UBQ为内参引物,进行QPCR检测PGAG基因的表达量。
qPCR引物,以下所有引物序列方向均为5'-3':
表1qPCR引物
Q-PtoPGAG-F | ACTGTAAAGCCAGCCAATGGCA |
Q-PtoPGAG-R | ACCTACATTCTCTTTAGTAAGGA |
Q-PtoUBQ-F | CCAAGCCCAAGAAGATCAAGC |
Q-PtoUBQ-R | GCACCGCACTCAGCATTAGG |
结果如图1所示。从图1中可以看出,与正常对照组相比,过表达转基因株系中PGAG基因表达水平明显高于正常对照组。表明过表达转基因株系构建成功。
实施例3
将生根后长势一致的野生型(WT),过表达(PGAG-OE)株系移至霍格兰培养液中生长15天(如图2所示)。表型观察发现,过表达株系的第3片展开叶比野生型植株大(图3左图),叶面积统计数据分析显示,过表达株系的第3片展叶叶面积比野生型的大40%以上(图3右图);不定根的发育明显强于野生型,不定根长度增加30%以上(图4);取整株材料60℃烘干,测其干重发现过表达PGAG-OE株系干重明显高于野生型(图5)。以上结果证实了PGAG是促进杨树发育的关键基因。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种毛白杨PGAG基因、转录因子、表达载体或宿主在调控毛白杨生长特性中的应用,其特征在于,所述PGAG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述表达载体包含所述PGAG基因;
所述宿主包含所述PGAG基因或所述表达载体;
所述调控毛白杨生长特性的方法为在毛白杨植株中过表达所述PGAG基因;
所述生长特性为促进毛白杨不定根伸长和生物量积累。
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毛白杨真核细胞翻译起始因子5A基因(PtoeIF5A4)的克隆与表达分析;张利姣;张杰伟;陈亚娟;管阳;王宏芝;魏建华;;农业生物技术学报;20130825(08);949-956 * |
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