WO2011063706A1 - 一种棉花nac转录因子基因及其应用 - Google Patents

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WO2011063706A1
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cotton
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ghnac1
transcription factor
drought
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孙超
陈文华
王君丹
崔洪志
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创世纪转基因技术有限公司
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Definitions

  • the invention relates to the field of plant genetic engineering, in particular to a cotton NAC Transcription factor gene and its plant expression vector and its application in the development of drought tolerant transgenic plants.
  • Transcription factors also known as trans-acting factors, are a group of protein molecules that specifically bind to cis-acting elements in the promoter region of a eukaryotic gene, thereby ensuring that the gene of interest is expressed at a specific intensity and at a specific time and space.
  • RNA polymerase II Transcription of complexes, thereby initiating transcriptional expression of specific genes, and finally regulating responses to internal and external signals through the action of gene products.
  • the expression of many genes in plants is governed by the interaction of specific transcription factors with specific cis-acting elements.
  • a transcription factor directly regulates the expression of a target gene by binding to a cis-acting element of a downstream promoter region of its regulation, or forms a homologous, heterodimer, or interacts with other proteins to form an activated form and participates in JA.
  • Signal transduction pathways such as SA and ABA form a regulatory network for gene expression.
  • WRKY Class and AP2/EREBP Transcription factors are plant-specific transcription factors, but they are common to other transcription factors when regulating downstream gene expression, and they induce an anti-reverse response by binding to cis-acting elements.
  • introducing or modifying a transcription factor is a more effective method for improving crop stress resistance than introducing or modifying individual functional genes to enhance a certain resistance. And the way. By manipulating a transcription factor, it can promote multiple functional genes to achieve a comprehensive improvement of plant traits.
  • the NAC transcription factor is a plant-specific transcriptional regulator newly discovered in the last decade. In 1997, Aida et al first reported NAC. The domain was found to contain a conserved amino acid sequence at the N-terminus of the petunia NAM gene, Arabidopsis thaliana ATAF1/2 and CUC2 gene-encoding proteins, and the first three genes were named NAC. .
  • the first NAC transcription factor was cloned from Petunia by Souer in 1996 and subsequently found in Arabidopsis, rice, wheat, soybean, etc., and is currently found in Arabidopsis. 105 NAC members, while 75 were found in rice. Research shows that NAC Transcription factors play an important role in plant growth and development, organ construction, hormone regulation and defense against a variety of biotic and abiotic stresses.
  • NAC Transcription factors are induced by a variety of biotic and abiotic stresses and participate in plant stress responses.
  • Professor Xiong Lizhong from Huazhong Agricultural University has cloned a rice drought-tolerant salt-tolerant gene SNAC1, which is NAC.
  • SNAC1 a type of transcription factor, which is mainly induced in the protective cells of the stomatal, and promotes stomatal closure during drought stress, but does not affect the photosynthetic rate, so the drought resistance is greatly improved, and in the case of severe drought in the reproductive growth period, excessive expression
  • the fruit setting rate of SNAC1 transgenic plants increased by 22% to 34% compared with the control. In the vegetative growth phase, transgenic plants also showed strong drought resistance.
  • NAC transcription factors can be associated with The MYC-like element binds and the core sequence of this element (CATGTG) plays an important role in the Arabidopsis ERD1 response to drought-induced responses.
  • CAGTG the core sequence of this element
  • ANAC072(RD26) is involved in ABA-mediated stress signaling pathway, overexpressing RD26 It can significantly enhance the sensitivity of transgenic plants to ABA, and found that genes induced by ABA and stress factors are also up-regulated in transgenic plants, while inhibition of expression of RD26 is reversed.
  • Delessert et al found the Arabidopsis transcription factor ATAF2 Highly induced expression in the damaged part of the leaf, and responded to the induced phytohormone methyl jasmonic acid and salicylic acid, but not to abscisic acid; overexpression of ATAF2 The expression of some pathogen-related proteins was inhibited, and the resistance of plants to Fusarium oxysporum decreased, indicating that ATAF2 acts as a negative regulator of pathogen-associated proteins in defense responses. Hegedus A mixed cDNA library of rapeseed leaves subjected to mechanical damage, beetle inoculation and chilling injury was constructed, and 8 NAC transcription factors were screened from the library, among which 5 transcription factors were associated with Arabidopsis thaliana.
  • ATAF1 or ATAF2 Similar to ATAF1 or ATAF2, they are ectopically expressed in the model plant Arabidopsis, causing dysplasia, similar to Arabidopsis nam and cuc mutants; overexpression of BnNAC14
  • the lines showed increased leaf size, thick stems and luxuriant lateral roots, which are similar to the NAC1 gene function of Arabidopsis.
  • Oh et al. isolated a NAC transcription factor CaNAC1 from pepper. The transcription factor is induced by pathogenic bacteria, exogenous salicylic acid and ethylene. Thus, NAC transcription factors play an important role in a variety of stress-resistance pathways in plants.
  • the object of the present invention is to provide a cotton NAC transcription factor gene whose nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1 Shown.
  • a second object of the present invention is to provide a cDNA sequence of a cotton NAC transcription factor gene, the nucleotide sequence of which is SEQ ID NO : 2 is shown.
  • a third object of the present invention is to provide a cotton NAC transcription factor consisting of SEQ ID NO: 1
  • the nucleotide sequence shown is encoded and its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 3.
  • a fourth object of the present invention is to provide a plant expression vector containing the cotton NAC transcription factor gene.
  • a fifth object of the present invention is to provide a plant cell, tissue or plant transformed with the plant expression vector.
  • a sixth object of the present invention is the use of the cotton NAC transcription factor gene in drought tolerant plant species.
  • the technical route of the present invention is:
  • the NAC transcription factor gene was obtained by RACE method and named as: ghNAC1;
  • the invention clones a cotton NAC transcription factor gene ghNAC1 and constructs ghNAC1
  • the binary expression vector was transformed into cotton with Agrobacterium tumefaciens, and the cotton transformed with ghNAC1 was obtained.
  • the drought-simulated experiment was used to verify the transgenic cotton of ghNAC1 gene, due to ghNAC1 Over-expression and drought tolerance.
  • Figures 1A and 1B are Northern detection plots of ghNAC1 gene expression under drought-inducing conditions
  • Figure 2 is a schematic diagram of PCR amplification of the ghNAC1 gene
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the construction of the plant expression vector pBI121-ghNAC-1;
  • Figure 4 is an electrophoresis pattern of PCR detection of ghNAC1 gene transgenic ghNAC1 gene
  • Figures 5A, 5B and 5C are simulations of drought simulation of untransgenic cotton
  • Figures 6A, 6B and 6C are simulations of the drought simulation of the trans-shipped cotton
  • Figures 7A, 7B and 7C are simulations of the drought simulation of the transgenic ghNAC1 gene.
  • PCR amplification using cotton reverse transcribed cDNA as template PCR conditions: 94 ° C 5 min; 94 ° C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 35 cycles; 72°C 5min.
  • the PCR-derived fragment was cloned into the pGEM T-easy vector and sequenced to obtain the NAC gene expression sequence tag (EST The nucleotide sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 4.
  • GSP1 5'-GAAAGTTGCGGGGCATCATT-3'
  • GSP2 5'-TATCACAACAGAAGGCCGTAAA-3'
  • the PCR fragment was cloned into pGEMT-easy and sequenced, and the nucleotide sequence was SEQ ID NO: 5 Shown.
  • GSP1 GTTGTGAAGAACACGTTGATGATG
  • GSP2 GCTCTCTGCTTGAAACACTTGAC
  • GSP3 CAGTCCTAGAGACAGAAAATATCCG
  • the PCR fragment was cloned into pGEMT-easy and sequenced and sequenced with 3' RACE results to obtain sequences such as SEQ ID NO: 6 is shown.
  • the amplification primer sequences are as follows:
  • ghNAC5' 5'-GAAGATCTGGGTGAATCATGGGAGTGCC-3'
  • ghNAC3' 5'-CGGCTAGCCTGAAATTCCTTTCCTGGTCC-3'
  • the ghNAC1 gene cDNA sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the gDNA sequence of the ghNAC1 gene is shown in SEQ ID NO: 1, wherein 192bp-289bp and 558bp-638bp is an intron part.
  • amino acid sequence of the protein encoded by ghNAC1 is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Example 3 Agrobacterium-mediated transformation was used to obtain transgenic ghNAC1 cotton.
  • the cotton ghNAC1 gene was transformed by Agrobacterium-mediated transformation of cotton.
  • Suspension cultures pass through 30 mesh, 10 mesh sieves, and stay below 30 mesh. 10 Suspended solids, transferred to somatic embryo germination medium (KNO3 doubling, NH4NO3 halved MSB plus KT0.1, Km100, in mg/L ), cultured until the somatic embryos sprouted into seedlings.
  • somatic embryo germination medium KNO3 doubling, NH4NO3 halved MSB plus KT0.1, Km100, in mg/L
  • the leaves of the transgenic plants were taken and the total DNA of the plants was extracted by the kit method. PCR identification, amplification with synthetic ghNAC1 gene-specific primers;
  • the amplification primer sequences are as follows:
  • ghNAC5' 5'-GGGTGAATCATGGGAGTGCC-3'
  • ghNAC3' 5'-CCTGAAATTCCTTTCCTGGTCC-3'
  • PCR conditions 94 ° C for 10 min; 94 ° C for 45 s, 56 ° C for 45 s, 72 ° C for 1 min, 5 cycles; 94°C 45s, 60°C 45s, 72°C 1min, 25 cycles; 72°C 7min.
  • Figure 5A-5C for the results of drought simulation experiments on non-GM cotton.
  • Figure 5A shows the results of the second day after water saturation
  • Figure 5B As a result of a week of drought after water saturation
  • Figure 5C shows the results of drought for two weeks after water saturation.
  • Figure 6A-6C for the results of the drought simulation experiment of the empty carrier cotton
  • Figure 6A shows the results of the second day after water saturation
  • Figure 6B As a result of a week of drought after water saturation
  • Figure 6C shows the results of drought for two weeks after water saturation.

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Description

一种棉花 NAC 转录因子基因及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种棉花 NAC 转录因子基因以及其构建的植物表达载体及其在耐旱转基因植物研制方面的应用。
背景技术
转录因子又称反式作用因子，是一群能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。当植物感受外界干旱、高盐、激素、病害时，通过一系列信号传递，激发转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件结合后，激活 RNA 聚合酶 II 转录复合物，从而启动特定基因的转录表达，最后通过基因产物的作用对内、外界信号做出的调节反应。植物许多基因的表达都是由特定的转录因子与特定的顺式作用元件相互作用调控的。
转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中扮演着非常重要的角色。近几年来在植物转录因子的基因克隆和功能研究方面取得了很大进展，同时也鉴定出多种与转录因子相结合的顺式作用元件，例如： G 盒、 W 盒、 CRT/DRE 、 MYC-like 。转录因子通过与其调控的下游基因启动子区的顺式作用元件结合而直接调控靶基因的表达，或形成同源、异源二聚体，或与其他蛋白互作成为某种活化形式而参与 JA 、 SA 、 ABA 等信号传导途径，形成基因表达的调控网络。根据对 MYB 类、 bZIP 类、 WRKY 类、 AP2/EREBP 类和 NAC 类植物转录因子家族成员的研究，结果表明它们调控了相关生理反应基因表达的蛋白在植物防卫反应和逆境信号转导中发挥作用，从而使植物适应外界不良环境。其中， WRKY 类和 AP2/EREBP 类转录因子是植物所特有的转录因子，不过在调控下游基因表达时与其他转录因子是有共性的，都是通过与顺式作用元件结合来诱导抗逆反应应答。
转录因子在提高作物对环境胁迫抗性的分子育种中，与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的方法相比，导入或改良一个转录因子是提高作物抗逆性更为有效的方法和途径。操纵一个转录因子就可通过它促使多个功能基因发挥作用，从而达到使植株性状获得综合改良的效果。
NAC 转录因子是近十年来新发现的植物特有的转录调控因子。 1997 年 Aida 等首先报道了 NAC 结构域，发现在矮牵牛 NAM 基因、拟南芥 ATAF1/2 和 CUC2 基因编码蛋白的 N 端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为 NAC 。第一个 NAC 转录因子是由 Souer 等于 1996 年从矮牵牛中克隆得到的，随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中相继发现，目前在拟南芥中共发现了 105 个 NAC 成员，而水稻中则发现了 75 个。研究表明， NAC 转录因子在植物的生长发育、器官建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。
NAC 转录因子受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达，参与植物的胁迫应答。华中农业大学熊立仲教授研究小组克隆了一个水稻抗旱耐盐基因 SNAC1 ，该基因是 NAC 类型的转录因子，其主要在气孔的保卫细胞中被诱导表达，干旱胁迫时促进气孔关闭，但是并不影响光合速率，因而抗旱性大为提高，在生殖生长期严重干旱的情况下，超量表达 SNAC1 的转基因植株坐果率较对照提高 22% ～ 34% ，在营养生长期，转基因植株也表现出很强的抗旱性。中国农业大学王学臣教授研究小组在拟南芥中克隆了一个干旱诱导基因 ATAF1 ，该基因也是 NAC 类型的转录因子。 ATAF1 的表达受干旱和 ABA 处理的诱导，在浇水情况下又受到抑制。敲除 ATAF1 基因的突变体 ataf1 ，在干旱胁迫后的浇水反应测试中恢复率是正常对照的 7 倍，而且 6 个已知干旱诱导基因 (RD17 、 ERD10 、 KIN1 、 RD22 、 COR78 和 LT178) 表达水平提高，说明 ATAF1 基因作为负调控子，通过调节渗透胁迫反应基因的表达在抗旱反应中起作用。有的 NAC 转录因子可与 MYC-like 元件结合，该元件的核心序列 (CATGTG) 在拟南芥 ERD1 干旱诱导反应应答过程中起重要作用。 Tran 等采用酵母单杂交技术从拟南芥中分离到 3 个不同的 NAC 基因 (ANAC019 、 ANAC055 和 ANAC072) ，它们的表达受干旱、高盐和 ABA 的诱导，超量表达能显著增强转基因植株的耐旱能力。而 ANAC072(RD26) 参与 ABA 介导的逆境信号传导途径，超量表达 RD26 能显著增强转基因植株对 ABA 的敏感性，同时发现 ABA 和逆境因子诱导的基因在转基因植株中也被上调表达，抑制表达 RD26 则相反。
Delessert 等发现拟南芥转录因子 ATAF2 在叶片损伤部位高度诱导表达，并对涉及损伤的植物激素甲基茉莉酮酸和水杨酸诱导反应作出响应，但对脱落酸没有反应；超量表达 ATAF2 抑制了一些病原相关蛋白的表达，植株对土生镰刀霉菌的抵抗力下降，说明 ATAF2 作为病原相关蛋白的负调控子在防御反应中起作用。 Hegedus 等构建了油菜叶片受机械损伤、甲虫噬啮和冷害处理的混合 cDNA 文库，并从该文库中筛选出 8 个 NAC 类转录因子，其中 5 个转录因子与拟南芥的 ATAF1 或 ATAF2 相似，将它们异位表达于模式植物拟南芥，造成发育异常，类似于拟南芥 nam 和 cuc 突变体；过量表达 BnNAC14 的株系表现出叶片增大，茎干变粗和侧根繁茂等特征，这与拟南芥的 NAC1 基因功能相似。 Oh 等从辣椒中分离到一种 NAC 类转录因子 CaNAC1 ，该转录因子受病原菌、外源水杨酸和乙烯的诱导。由此可见， NAC 转录因子在植物的多种抗逆信号途径之中起重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种棉花 NAC 转录因子基因 ，其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
本发明的第二个目的在于提供棉花 NAC 转录因子基因的 cDNA 序列，其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。
本发明的第三个目的在于提供一种 棉花 NAC 转录因子，由 SEQ ID NO ： 1 所示核苷酸序列编码，其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示。
本发明的第四个目的在于提供含有所述棉花 NAC 转录因子基因的植物表达载体。
本发明的第五个目的在于提供用所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。
本发明的第六个目的在于所述棉花 NAC 转录因子基因在耐旱植物品种中的应用。
本发明的技术路线为：
1 ）干旱处理棉花幼苗；
2 ）从经干旱处理的的棉花幼苗上取叶片，并从叶片提取总 RNA ；
3 ）用总 RNA 进行逆转录反应，得到 cDNA ；
4 ）依据 Genebank 上发布的已知 NAC 基因序列保守区设计简并引物，以棉花逆转录 cDNA 作为模板进行 PCR 扩增，获得棉花 NAC 转录因子基因的 EST;
5 ）以 EST 为探针，未诱导棉花总 RNA 为对照，对所获 EST 进行干旱胁迫下的 Northern 表达分析，筛选干旱诱导增强表达的 EST ；
6 ）根据 EST ，用 RACE 方法获得 NAC 转录因子基因，命名为： ghNAC1 ；
7 ）构建 ghNAC1 双元表达载体，用根癌农杆菌转化棉花，获得转 ghNAC1 基因棉花，采用干旱模拟实验验证转 ghNAC1 基因棉花，因 ghNAC1 的过表达而具有耐旱能力。
本发明克隆了一种棉花 NAC 转录因子基因 ghNAC1 ，构建 ghNAC1 双元表达载体，用根癌农杆菌转化棉花，获得转 ghNAC1 基因棉花，采用干旱模拟实验验证转 ghNAC1 基因棉花，因 ghNAC1 的过表达而具有耐旱能力。
附图说明
图 1A 和 1B 是干旱诱导条件下 ghNAC1 基因表达的 Northern 检测图；
图 2 是 ghNAC1 基因的 PCR 扩增示意图；
图 3 是植物表达载体 pBI121-ghNAC-1 构建示意图；
图 4 是转 ghNAC1 基因棉花 ghNAC1 基因 PCR 检测电泳图；
图 5A 、 5B 和 5C 是未转基因棉花干旱模拟实验图；
图 6A 、 6B 和 6C 是转空载体棉花干旱模拟实验图；
图 7A 、 7B 和 7C 是转 ghNAC1 基因棉花干旱模拟实验图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
实施例 1 棉花干旱诱导增强表达 ghNAC1 基因的克隆
1 、棉花材料的处理
鄂杂棉 11 号 F1 代种子萌发 15 天后，进行干旱处理 4 小时后，冻存于 -70℃ 冰箱保存。
2 、棉花总 RNA 的提取
A. 取 0.1g 棉花叶片液氮研磨后，加 0.5ml 植物 RNA 提取液（购自 invitrogen ），振荡至彻底混匀。
B. 室温放置 5 分钟。
C.4℃ 12,000rpm 离心 1 分钟，上清转入新的无 RNase 离心管。
D. 加入 0.1ml 5M NaCl ，温和混匀。
E. 加入 0.3ml 氯仿，上下颠倒混匀。
F.4℃ 12,000rpm 离心 10 分钟，取上层水相转入新的无 RNase 离心管。
G. 加与所得水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置 10 分钟。
H.4℃ 12,000rpm 离心 10 分钟。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。加 1ml 75% 乙醇。
I.4℃ 5,000rpm 离心 3 分钟。倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温晾干 2-3 分钟。
J. 加 50μl 无 RNase 水，反复吹打、混匀，充分溶解 RNA 。
3 、 RNA 样品中 DNA 污染的去除
A ．在 RNase-free 的 Eppendorf 管中依次加入 16 m l 总 RNA 、 2 m l10×Buffer 、 1 m l RnaseOUT 、 1 m l RNase-free DNaseI （ 2U/ m l ）；
B ．室温放置 15min ；
C ．加入 2 m l 25mM EDTA ， 65℃ 保温 15min 。
4 、逆转录
A ．在 0.2ml tube 中，加入下列成分：
总 RNA(0.1μg/μl) 2.0μl
Oligo(dT12-18)(2μM) 2.0μl
B ． 70℃ 水浴 10 分钟。立即放置在冰浴中；
C ．加入下列成分：
2.0μl 10×RT buffer ；
2.0μl 250μM dNTP mix ；
2.0μl 100mM DTT ；
9.8μl DEPC H2O ；
0.2μl 200Uμ/l SuperScriptIII ；
D ．进行下列反应： 42℃ 90 分钟； 70℃ 15 分钟； -20℃ 保存。
5 、简并引物的设计和棉花 ghNAC1 EST 的获得
依据 Genebank 上发布的已知 NAC 基因序列保守区设计简并引物：
NF80 ： 5'-AYCCSACIGAYGAIGAGCT-3'
NR510 ： 5'-TTGTAIAKYCGRCAYARMACCCA-3'
以棉花逆转录 cDNA 作为模板进行 PCR 扩增， PCR 条件： 94℃ 5min ； 94℃ 30s ， 52℃ 30s ， 72℃ 30s ， 35 个循环； 72℃ 5min 。
PCR 得到的片段克隆至 pGEM T-easy 载体上，测序获得 NAC 基因的表达序列标签（ EST ），其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示。
6 、棉花 ghNAC1 片段的 3'RACE
3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒购 invitrogen 公司，实验步骤按试剂盒说明书操作。引物设计如下：
GSP1 ： 5'-GAAAGTTGCGGGGCATCATT-3'
GSP2 ： 5'-TATCACAACAGAAGGCCGTAAA-3'
将 PCR 片段克隆至 pGEMT-easy 上并测序，核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示。
7 、干旱诱导条件下 ghNAC1 基因表达的 Northern 检测
将鄂杂棉 11F1 代棉花苗提前一天进行水饱和，第二天早上，进行干旱诱导 1 小时， 2 小时， 4 小时， 6 小时， 8 小时后，并取未诱导的作对照，分别取叶片冻存 -70℃ ，提取 RNA ，进行 Northern 检测，结果参见图 1A 和 1B ，图中 1 、 2 、 3 、 4 、 5 分别为干旱诱导 2 、 4 、 6 、 8 、 10 个小时。可见随干旱诱导时间的增加，此 NAC 家族基因表达水平也逐渐增强。
8 、棉花 ghNAC1 片段的 5'RACE
5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒购 invitrogen 公司，实验步骤按试剂盒说明书操作。引物设计如下：
GSP1: GTTGTGAAGAACACGTTGATGATG
GSP2: GCTCTCTGCTTGAAACACTTGAC
GSP3: CAGTCCTAGAGACAGAAAATATCCG
将 PCR 片段克隆至 pGEMT-easy 上测序并和 3'RACE 结果进行序列拼接，获得序列如 SEQ ID NO ： 6 所示。
9 、棉花 ghNAC1 片段的基因全长的获得和克隆
根据拼接序列重新设计引物，并以 cDNA 和基因组 DNA 作为模板，扩增得到 cDNA 和基因组 DNA 全长并克隆测序。并将获得的基因命名为 ghNAC1 。
扩增引物序列如下：
ghNAC5' ： 5'-GAAGATCTGGGTGAATCATGGGAGTGCC-3'
ghNAC3' ： 5'-CGGCTAGCCTGAAATTCCTTTCCTGGTCC-3'
PCR 条件： 94℃ 10min 、 94℃ 45s 、 56℃ 45s 、 72℃ 1min ， 5 个循环； 94℃ 45s 、 60℃ 45s 、 72℃ 1min ， 25 个循环； 72℃ 7min 。电泳结果参见图 2 。
ghNAC1 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。
ghNAC1 基因 gDNA 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示，其中 192bp-289bp 和 558bp-638bp 为内含子部分。
ghNAC1 编码的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示。
实施例 2 ghNAC1 双元表达载体的构建
请参阅图 3 ，将 PCR 扩增得到的 ghNAC1 基因 cDNA （ ghNAC-1 ）用 T4 连接酶连接至 pGEM-TEasy 上得到质粒 pGEM-ghNAC-1 ，用 BamH1 和 SacI 同时双酶切 pGEM-ghNAC-1 和 pBI121 ，分别获得 ghNAC-1 片段和线性 pBI121 载体，用 T4DNA 连接酶将 ghNAC-1 片段和线性 pBI121 载体连接，得到 ghNAC1 双元表达载体 pBI121-ghNAC-1 。
实施例 3 利用农杆菌介导的转化法获得转 ghNAC1 基因棉花
1 、根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备
1 ）挑取新鲜的 LBA4404 单菌落接种于含适量抗生素的 LB 液体培养基中， 28℃ 培养至对数生长期；
2 ） 4℃ ， 8000 rpm 离心 5 分钟，收集菌体于小离心管中；
3 ）用 600 μl 冰预冷的 500 mM CaCl2 重悬洗涤细胞；
4 ） 4℃ ， 8000 rpm 离心 5 分钟，细胞沉淀中加入 100 μl 冰预冷的 500mM CaCl2 ，混匀后备用（ 24-48 小时后使用效果最佳）。
2 、根癌农杆菌 LBA4404 的转化
1 ）加入 1μl 植物表达载体质粒 DNA 至农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，于液氮中速冻 5 分钟， 37℃ 温浴 5 分钟；
2 ）加入 600μl LB 液体培养基， 28℃ 轻摇 4-6 小时，室温， 6000rpm 离心 3 分钟，富集菌体；
3 ）保留 50-200 μl 菌液，混匀，均匀涂布于含适量抗生素的 LB 选择平板上， 28℃ 倒置培养两天。
4 ）挑取新鲜菌落，进行 PCR 鉴定，筛选阳性克隆。
3 、棉花的遗传转化及植株再生
采用农杆菌介导法转化冀棉 14 ，获得转 ghNAC1 基因棉花。
1 ）接种农杆菌单菌落于含有适量抗生素的液体 LB 培养基中， 28℃ 摇床暗培养至生长对数期。以菌液：培养基 1:50 ～ 1:100 的比例用 LB 液体培养基稀释菌液， 28℃ 摇床暗培养至 OD600 值 0.8 ～ 1.0 ；
2 ）取暗培养 3 ～ 4 天的冀棉 14 无菌苗下胚轴，用解剖刀切成 0.6 ～ 0.8cm 的切段，用培养好的菌液浸泡 10 ～ 15min ，其间轻摇几次；
3 ）用无菌滤纸吸去多余菌液，于 MS 培养基上 22 ～ 25℃ 共培养 2 天；
4 ）把材料转入棉花诱愈筛选培养基（ MSB 附加 KT0.1 、 2,4-D0.1 、 Km100 、 Cef500 ，单位为 mg/L ）上，于 25 ～ 30℃ 培养 2 ～ 3 个月，每 20 ～ 30 天继代一次；
5 ）待愈伤长至直径约 2cm 时，转入胚性愈伤诱导培养基（ KNO3 加倍、 NH4NO3 减半的 MSB 附加 Km100 、 Cef 500 ，单位为 mg/L ）上，于 25 ～ 30℃ 培养，直至长出大量胚性愈伤；
6 ）将诱导出的胚性愈伤转入液体培养基（ KNO3 加倍、 NH4NO3 减半的 MSB 附加 Km 100mg/L ）中，培养 15 ～ 25 天，至细小体胚出现 ;
7 ）悬浮培养物依次过 30 目、 10 目筛，留 30 目以下 10 目以上悬浮物，转接至体胚萌发培养基（ KNO3 加倍、 NH4NO3 减半的 MSB 附加 KT0.1 、 Km100 ，单位为 mg/L ）上，培养至体胚萌发成苗。
8 ）待苗长至 3 ～ 5 片真叶，用劈接法嫁接至抗性强、生长旺的砧木上，确认成活后移栽大田。
4 、转基因棉花植株的鉴定及检测
试剂盒法提取棉花总 DNA
（ 1 ）取新鲜叶片 0.1g 。装入 2ml 离心管，液氮冷冻后研磨仪充分研磨；
（ 2 ）加入 404µlPG1 ， 65℃ 水浴后加入 100µlPG2 ，冰浴 5min ；
（ 3 ） 12000rpm 离心 4min ，取上清，加入上清 1.5 倍体积的 PG2 ，上柱；
（ 4 ） 12000rpm 离心 1min ，弃废液，加入 500µlPG4 （ PG4 与无水乙醇按 1 ： 1.4 配制，现配现用）；
（ 5 ） 12000rpm 离心 1min ，弃废液，加入 500µlPG5 （ PG5 与无水乙醇按 1 ： 4 配制，现配现用）；
（ 6 ） 12000rpm 离心 30Sec ，弃废液，加入 500µlPG5 （ PG5 与无水乙醇按 1 ： 4 配制，现配现用）；
（ 7 ） 12000rpm 离心 30Sec ，弃废液；
（ 8 ） 12000rpm 离心 2min ，加入 50 ～ 100µl TE 洗脱液（ 65℃ 水浴预热），静置 1min ；
（ 9 ） 12000rpm 离心 1min ， -20℃ 冰箱中保存备用。
转基因棉花的 PCR 鉴定
得到抗生素筛选阳性的转基因植株后，在生长初期，取转基因植株叶片，用试剂盒法提取植株总 DNA 进行 PCR 鉴定，以合成的 ghNAC1 基因特异性引物进行扩增；
扩增引物序列如下：
ghNAC5' ： 5'-GGGTGAATCATGGGAGTGCC-3'
ghNAC3' ： 5'-CCTGAAATTCCTTTCCTGGTCC-3'
PCR 条件： 94℃ 10min ； 94℃ 45s ， 56℃ 45s ， 72℃ 1min ， 5 个循环； 94℃ 45s ， 60℃ 45s ， 72℃ 1min ， 25 个循环； 72℃ 7min 。
经 PCR 扩增，可以得到约 1Kb 的条带，说明 ghNAC1 基因已整合至棉花基因组，电泳结果如图 4 所示。
5 、过表达 ghNAC1 转基因棉花的耐旱模拟实验及功能鉴定
未转基因棉花干旱模拟实验结果参见图 5A-5C ，其中图 5A 为水饱和后第二天结果，图 5B 为水饱和后干旱一周结果，图 5C 为水饱和后干旱两周结果。
转空载体棉花干旱模拟实验结果参见图 6A-6C ，其中图 6A 为水饱和后第二天结果，图 6B 为水饱和后干旱一周结果，图 6C 为水饱和后干旱两周结果。
转 ghNAC1 基因基因棉花干旱模拟实验结果参见图 7A-7C ，其中图 7A 为水饱和后第二天结果，图 7B 为水饱和后干旱一周结果，图 7C 为水饱和后干旱两周结果。
通过转 ghNAC1 基因和对照组的干旱耐受实验证明，干旱胁迫两周后，转空载体和未转基因棉花萎蔫程度明显高于转 ghNAC1 基因组，并且转基因组棉花生长状况依然良好，这说明我们克隆的棉花 ghNAC1 基因作为植物逆境胁迫下的转录因子，通过调节渗透反应基因的表达在干旱反应中起作用。

Claims (1)

  1. 1 、一种棉花 NAC 转录因子基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。
    2 、根据权利要求 1 所述的一种棉花 NAC 转录因子基因，其特征在于：所述棉花转录因子基因的 cDNA 序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。
    3 、权利要求 2 所述的棉花 NAC 转录因子基因编码的蛋白质，具有 SEQ ID NO ： 3 所示的氨基酸序列。
    4 、含有权利要求 1 或 2 所述棉花 NAC 转录因子基因的植物表达载体。
    5 、用权利要求 4 所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。
    6 、权利要求 1 或 2 所述棉花 NAC 转录因子基因在耐旱植物品种中的应用。
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