CN114480415A - 一种提高棉花耐旱和耐盐碱能力的sgRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体公开了一种提高棉花耐旱和耐盐碱能力的sgRNA，该sgRNA的靶标序列由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了该sgRNA在提高棉花耐旱和耐盐碱能力的用途。本发明sgRNA依据陆地棉和海岛棉所有GI同源基因的保守区域设计的，可单独或者同时编辑不同的GI基因，其基因编辑效率高；其次，与野生型植株相比，利用本发明sgRNA对单个Gigantea(GI)基因进行编辑所得的棉花突变体植株的耐旱、耐盐碱能力均获得显著提高；此外，利用本发明sgRNA沉默GI基因的表达对于提高棉花产量和提高棉花纤维品质具有重要意义。

Description

一种提高棉花耐旱和耐盐碱能力的sgRNA及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高棉花耐旱和耐盐碱能力的sgRNA；还涉及该sgRNA在提高棉花耐旱和耐盐碱能力的用途。
背景技术
棉花是重要的纺织工业原料，随着我国棉花种植区域向新疆等西北地区转移，干旱和盐碱地危害成为限制当地棉花生产的主要因素。虽然棉花是较耐旱和耐盐碱的作物，但是土壤盐碱含量超过0.3％或在生长发育关键时期缺水都可能导致棉花减产90％以上。因此，研究棉花耐旱或耐盐机理、挖掘棉花耐旱或耐盐碱相关的功能基因，进而培育耐旱或耐盐碱的棉花新品种，是解决棉花品种耐旱或耐盐碱问题最经济有效的途径。
Gigantea(GI)是植物特有的蛋白质，该蛋白通过与其他蛋白形成复合物调控下游蛋白的表达，进而调控植物的生长发育和抵抗逆境胁迫。目前，已知GI在耐旱性、昼夜节律控制、miRNA加工、叶绿素积累、光信号、耐寒性、耐盐性、抗除草剂性、淀粉积累和开花时间调节中发挥作用(Tang等，2021；Neelofar等，2020；Fowler等，1999；Park等，1999)。
当植物面临干旱、盐碱等逆境胁迫时，通常表现为营养生长迟缓和开花延迟或停止(Dennis等，2007；de Montaigu等，2010)。而植物体感知和响应的分子机制，主要是通过GI蛋白作为中心模块，调控植物延迟开花同时提高胁迫耐受性来响应逆境胁迫条件。例如在正常条件下，GI:SOS2形成复合物，阻止了SOS2/SOS3/SOS1的复合物形成，植物细胞SOS1不发挥Na+逆向运输功能(Lin等，2009)，GI调控植物正常开花(Adams等，2011；Srikanth等，2011)。在盐胁迫条件下，GI蛋白发生降解，SOS2/SOS3/SOS1形成复合物，SOS1逆向运输Na+至细胞外(Li等，2020；Shi等，2000；Guo等，2004)，增强植物对盐胁迫的耐受性同时延迟开花。利用拟南芥GI基因过表达和突变体转基因材料，均证实了GI过度表达，植株表现为开花迅速并具备了更强的盐敏感性；而GI突变体植株表现出更强的耐盐性和延迟开花(Kim等，2013)。
CRISPR/Cas9技术是一种高效快捷的基因定点编辑技术，已广泛应用于动植物的基因功能研究中。sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用，其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等，甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此，设计合理有效的sgRNA是实现基因编辑的重要基础。陆地棉是异源四倍体植物，其基因组包含A和D两个基因组，多数基因为多拷贝，相互具有补偿功能，增加了采用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑的难度。
经检索，未发现通过对棉花GI基因进行基因编辑提高棉花耐旱和耐盐碱能力的报道。
发明内容
针对我国新疆等西北地区棉花栽培中面临的水资源短缺和盐碱地危害问题，本发明目的在于利用CRISPR/Cas9技术对棉花GI基因进行基因编辑，进而提高棉花的耐旱和耐盐碱能力，提高棉花产量和质量。
实现本发明的技术方案如下：
一种DNA分子，所述的DNA分子由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成；具体序列如下：5’-CACATCAGAACAATTCCCTG-3’(SEQ ID No.1)。
本发明另一目的在于提供上述DNA分子作为靶标序列在抑制作物GI基因表达上的应用。
本发明还提供上述DNA分子作为靶标序列在提高作物耐旱和/或耐盐碱能力上的应用。
所述的GI基因是指编码Gigantea(GI)蛋白的基因。
所述的作物是指棉花、油菜、水稻、玉米或高粱等。
本发明还提供一种提高作物耐旱和耐盐碱能力的sgRNA，所述的sgRNA的靶标序列由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。
本发明还提供了上述sgRNA在抑制作物GI基因表达上的应用。
本发明还提供了上述sgRNA在提高作物耐旱和/或耐盐碱能力上的应用。
所述的作物是指棉花、油菜、水稻、玉米或高粱等。
所述的棉花是指陆地棉(Gossypium hirsutum)或海岛棉(Gossypiumbarbadense)；如棉花品种R15、WC或SU12等。
所述的GI基因可以是棉花GI基因；所述的棉花GI基因的核苷序列可参见如下基因登录号：D02染色体基因XM_016838310.2，XM_041088410.1；D05染色体基因XM_041094387.1，XM_041094386.1，XM_041094385.1，XM_041094384.1，XM_041094383.1，XM_041094382.1；A02染色体基因XM_041090781.1，XM_016886709.2，XM_016886708.2；A05染色体基因XM_016842825.2，XM_041112076.1，XM_016842823.2，XM_016842822.2，XM_041112077.1。
本发明还提供了含有上述sgRNA的靶标序列的表达盒，所述的表达盒的启动子为NtU6启动子，靶标序列下游为42bp与CRISPR系统Cas9酶结合的发卡结构序列以及40bp终止子序列；所述的靶标序列由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。
本发明还提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑表达载体；该表达载体由GFP和Cas9融合基因表达盒与上述含有sgRNA的靶标序列的表达盒同时插入植物表达载体pBI121构建而成；其中所述的含有sgRNA的表达盒由烟草NtU6启动子和40bp终止子调控表达；所述的GFP和Cas9融合基因的表达盒是由35S启动子和35S终止子调控表达，GFP和Cas9融合基因是按照密码子读码框将两个基因连接到一起融合而成；在融合基因两端各加了一个核定位信号(NLS)序列。
本发明还提供了一种提高棉花耐旱和/或耐盐碱能力的方法，包括抑制棉花GI基因的表达。
上述方法中所述抑制GI基因的表达是通过对棉花GI基因进行基因编辑实现的。
上述方法中所述的基因编辑是通过CRISPR/Cas9基因编辑系统实现的。
上述方法中所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统中的靶标序列由SEQ ID No.1所示的核酸序列组成：
一种利用上述sgRNA培育耐旱和/或耐盐碱能力强的棉花品种的方法，包括如下步骤：
(1)按照SEQ ID No.1所示人工合成sgRNA的靶标序列；
(2)在sgRNA的靶标序列的正向序列的5’端添加4个碱基GATT，获得单链DNA，命名为sgRNA1；在sgRNA的靶标序列的反向互补序列的5’端添加4个碱基ACAC，获得单链DNA，命名为sgRNA2；
sgRNA1：5’-GATTCACATCAGAACAATTCCCTG-3’；
sgRNA2：5’-ACACCAGGGAATTGTTCTGATGTG-3’；
(3)人工合成sgRNA1和sgRNA2；然后在将sgRNA1和sgRNA2置于水浴锅中退火形成双链DNA片段；再将双链DNA片段连接于sgRNA克隆载体上，获得sgRNA表达盒；其中sgRNA克隆载体已经包含了NtU6启动子、Cas9酶结合的42bp发卡结构序列以及40bp终止子序列，在NtU6启动子与42bp发卡结构序列之间有两个Bsa I酶切位点，且双切之后5’和3’端分别形成GATT和ACAC末端；
(4)将Cas9基因和eGFP基因融合，并在两端添加一个核定位信号(NLS)序列，之后将融合基因片段连接于BamH I和Xho I双酶切pBI121表达载体上，获得的Cas9-eGFP融合表达载体；
(5)利用Kpn I和Apa I双酶切将步骤(3)所得的sgRNA表达盒，并连接于步骤(4)所获得的Cas9-eGFP融合表达载体，构建成CRISPR/Cas9基因编辑表达载体，命名为pGBI-Cas9-GI-KO；
(6)将步骤(5)所得的表达载体导入农杆菌，然后利用农杆菌介导的棉花遗传转化方法将表达载体导入棉花，获得含有Cas9-eGFP融合基因和sgRNA表达盒的转基因棉花；对转基因棉花进行分子鉴定，筛选出Gigantea(GI)基因突变而沉默表达的GI基因敲除突变体材料，即获得耐旱和/或耐盐碱的棉花品种。
上述方法中所述的棉花是指陆地棉(Gossypium hirsutum)或海岛棉(Gossypiumbarbadense)；如棉花品种R15、WC或SU12等。
所述的棉花GI基因可参见登录号为:D02染色体基因XM_016838310.2，XM_041088410.1；D05染色体基因XM_041094387.1，XM_041094386.1，XM_041094385.1，XM_041094384.1，XM_041094383.1，XM_041094382.1；A02染色体基因XM_041090781.1，XM_016886709.2，XM_016886708.2；A05染色体基因XM_016842825.2，XM_041112076.1，XM_016842823.2，XM_016842822.2，XM_041112077.1。
本发明还提供一种耐旱和耐盐碱棉花品种的育种方法，以上述方法获得的耐旱和/或耐盐碱的GI基因敲除棉花突变体为亲本之一，通过杂交或者回交的方法，在后代中选择耐旱、耐盐碱能力强的植株，连续选择4～5代，即可育成新的抗旱和/或耐盐碱棉花品种。
与现有技术相比，本发明具有的优点和有益技术效果：本发明sgRNA是依据陆地棉和海岛棉四倍体棉花染色体上Gigantea(GI)的所有同源基因的保守区域设计的，可以单独或者同时编辑不同的GI基因，因而可产生不同GI基因突变组合的突变体，其基因编辑效率高。其次，与野生型植株相比，利用本发明sgRNA对单个Gigantea(GI)基因进行编辑获得的棉花突变体植株的耐旱抗旱、耐盐碱能力均获得显著提高。此外，利用本发明sgRNA沉默GI基因的表达对于提高棉花产量和提高棉花纤维品质具有重要意义。
附图说明
图1.pGBI-Cas9-GI-KO基因编辑表达载体示意图。
图2.本发明棉花GI基因敲除突变体的PCR鉴定电泳图谱；其中M为DNA标准分子量；“-”为阴性对照；“+”为阳性对照；1～14为突变体材料；其中箭头指示Cas9基因扩增产物。
图3.本发明棉花GI基因敲除突变体抗旱能力对比鉴定照片；其中1～3分别为gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3突变体植株；4～6为野生型植株。
图4.本发明棉花GI基因敲除突变体耐盐碱能力对比鉴定照片；其中1～3分别为gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3突变体植株；4～6为野生型植株。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的解释和说明，但不对本发明的范围构成限制。如无特殊说明，以下实施例中的实验方法均为常规方法，以下实施例中所用试剂均为常规生化试剂。
实施例1棉花Gigantea(GI)基因靶标序列的设计
(1)GI基因序列获得
利用棉花FGD数据库(https://cottonfgd.org/)查找棉花Gigantea(简称GI)基因，共发现4个GI同源基因，它们分别位于D02、D05、A02、A05染色体上。将4个GI同源基因在NCBI在线数据库进行比对查找，共发现16个登录号，其中D02染色体基因XM_016838310.2，XM_041088410.1；D05染色体基因XM_041094387.1，XM_041094386.1，XM_041094385.1，XM_041094384.1，XM_041094383.1，XM_041094382.1；A02染色体基因XM_041090781.1，XM_016886709.2，XM_016886708.2；A05染色体基因XM_016842825.2，XM_041112076.1，XM_016842823.2，XM_016842822.2，XM_041112077.1。
(2)GI基因靶位点设计规则
利用步骤(1)中获得的GI基因ID号，下载所有GI基因的核苷酸序列，并进行比对分析，获取其保守区域。参考Wagner JC等(Nature Methods，2014，11(8)：915-918)所述sgRNA设计方法以及棉花等多倍体植物基因组特征设计基因编辑靶标位点。
基因编辑靶标位点设计规则为：(a)为了保证靶标基因表达被完全抑制，靶标位点必须位于第一或第二个外显子；(b)大多数基因在棉花等多倍体植物基因组存在较多的同源基因，这些基因相互之间存在功能冗余关系，往往突变一个基因对表型没有影响，因此多倍体植物基因编辑靶位点最适区域位于保守序列；(c)靶标位点序列长度为20bp，3’端与一个由“NGG”三个碱基组成的“前间区序列邻近基序(PAM)”相邻；(d)为了提高靶位点编辑效率，20bp全长靶位点序列GC含量应≥45％，靠近PAM端的10bp靶位点序列GC含量应≥50％。
(3)棉花GI基因靶位点选择
根据上述靶标位点设计规则和所有棉花GI同源基因的核苷酸序列，在棉花GI基因第二个外显子保守区域找到一个最佳靶标位点，设计靶标序列；再从所设计的靶标序列中进行筛选，获得一个最佳的sgRNA的靶标序列，命名为GI-KO。所述靶标序列为：
GI-KO：5’-CACATCAGAACAATTCCCTG-3’(SEQ ID No.1)。
实施例2CRISPR/Cas9基因编辑表达载体的构建
按照如下方法进行：
(1)、pGBI-Cas9表达载体构建：将Cas9基因和eGFP基因融合，并在融合基因的5’和3’端添加一个核定位信号(NLS)序列，得Cas9-eGFP融合基因；然后将融合基因片段连接于BamH I和Xho I双酶切的pBI121表达载体上，获得植物表达载体，命名为：pGBI-Cas9，该表达载体由35S启动子和35S终止子调控Cas9-eGFP融合基因表达。其反应体系为：融合基因1μL(10ng)，pBI121载体2μL(20ng)，T4 DNA连接酶(NEB)1μL，T4 DNA连接酶Buffer1μL，ddH2O5μL。16℃连接过夜，得连接产产物；然后将连接产物转化大肠杆菌，通过测序筛选，获得正确Cas9-eGFP融合基因序列的植物表达载体pGBI-Cas9。
(2)、PUC-sgRNA-GI构建：PUC-sgRNA载体为含有U6启动子和终止子的克隆载体，专为构建sgRNA表达盒设计。U6启动子和终止子之间含有两个Bsa I酶切位点，同时切开之后可以形成两个不同粘性末端，便于靶标序列连接构建表达盒。具体操作如下：
(a)依据克隆载体PUC-sgRNA双酶切之后形成的粘性末端序列，在靶标序列GI-KO的正向序列的5’端添加4个碱基GATT，获得单链DNA，命名为sgRNA1；在靶标序列GI-KO的反向互补序列的5’端添加4个碱基ACAC，获得单链DNA，命名为sgRNA2。具体序列如下：
sgRNA1：5’-GATTCACATCAGAACAATTCCCTG-3’；
sgRNA2：5’-ACACCAGGGAATTGTTCTGATGTG-3’。
(b)人工合成sgRNA1和sgRNA2(人工合成由生物工程(上海)股份有限公司完成)。分别将sgRNA1和sgRNA2单链DNA加超纯水溶解至10μM，各取10μL放置于一个1.5mL离心管内充分混匀，随即放入98℃水浴锅内自然冷却至室温，最后获得含有粘性末端的GI-KO双链DNA片段。
(c)将GI-KO双链DNA片段连接于Bsa I酶切的PUC-sgRNA克隆载体，获得含有GI-KO表达盒的PUC-sgRNA-GI-KO。其反应体系为：GI-KO双链DNA片段1μL(5ng)，PUC-sgRNA克隆载体1μL(10ng)，T4 DNA连接酶(NEB)1μL，T4 DNA连接酶Buffer1μL，ddH2O 6μL。16℃连接过夜，然后将连接产物转化大肠杆菌，通过测序筛选含有sgRNA1和sgRNA2的sgRNA的克隆载体，命名为PUC-sgRNA-GI-KO。
(3)基因编辑表达载体pGBI-Cas9-GI-KO构建：利用Kpn I和Apa I双酶切步骤(2)所得的PUC-sgRNA-GI-KO，获得sgRNA表达盒；将sgRNA表达盒连接于Kpn I和Apa I双酶切的pGBI-Cas9表达载体上，获得基因编辑表达载体(示意图见图1)，命名为：pGBI-Cas9-GI-KO。其中所述连接的反应体系为：sgRNA表达盒1μL(10ng)，pGBI-Cas9表达载体2μL(20ng)，T4DNA连接酶(NEB)1μL，T4 DNA连接酶Buffer 1μL，ddH2O 5μL。16℃连接过夜，得连接产物；然后将连接产物转化大肠杆菌，通过测序，筛选含有sgRNA1和sgRNA2的表达载体，最终获得CRISPR/Cas9基因编辑表达载体pGBI-Cas9-GI-KO。
实施例3棉花GI基因敲除突变体材料的获得
(1)基因编辑表达载体pGBI-Cas9-GI-KO转化农杆菌
将农杆菌GV3101感受态细胞100μL与实施例2中所得的基因编辑表达载体pGBI-Cas9-GI-KO 2～5μg混匀，获得悬浮混合液，置于冰上5min。将悬浮混合液加入2mm电击杯(加时要尽量避免产生气泡)，2500V电击；电击后迅速加入LB液体培养基800μL并转移至1.5mL离心管内，在28℃、180rpm条件下活化培养5h，获得含有pGBI-Cas9-GI-KO表达载体的农杆菌悬浮菌液。取出200μL菌液涂布于含有壮观霉素和利福平(浓度均为50μg/mL)的LB固体培养基平板上，在28℃培养48h。由于pGBI-Cas9-GI-KO表达载体含有壮观霉素抗性基因，结合农杆菌具有抗利福平的特征，固体培养基上培养48h，生长出来的细菌斑点即为含有pGBI-Cas9-GI-KO表达载体的候选克隆子。随机挑取5个含有pGBI-Cas9-GI-KO表达载体的候选克隆子，送交生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，选取含有正确GI-KO序列表达载体的农杆菌克隆子，保存备用。
(2)农杆菌介导棉花遗传转化以及转基因植株的获得
(a)无菌苗准备：
将R15棉花种子(从Coker312选育获得，由山西省农业科学院棉花研究所提供)在70％乙醇中消毒30s，再用30％H2O2浸泡消毒2h，然后用无菌蒸馏水冲洗3次，去掉种子表面残留的H2O2。将消毒后的种子在无菌水中28℃浸泡过夜，待种子萌动露白后去除种皮，播种于1/2MS(Murashige&Skoog)培养基上。播种后的种子在28℃、16小时光照/8小时黑暗培养1周左右，切下幼苗下胚轴并分割为0.5cm长度，用于愈伤组织诱导的外植体。
(b)遗传转化及再生植株获得：
将步骤(1)中所得的农杆菌克隆子接种于100mL含有50mg/L的壮观霉素和利福平的LB液体培养基中，在28℃、250rpm条件下培养8～10h；4000rpm转速离心10min，收集培养好的农杆菌细胞；利用MS液体培养基重悬农杆菌细胞至OD600为0.4。将步骤(a)中所得的外植体在重悬农杆菌细胞液中浸泡30分钟。随后，感染的外植体在无菌滤纸上干燥，并转移到共培养培养基(含有0.05mg/L KT、2.5mg/L 2,4-D的MSB5固体培养基)上，在24℃、避光条件下培养2天。将侵染后的外植体转移至CIM愈伤诱导培养基(含有100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素、0.05mg/L KT、2.5mg/L 2,4-D的MSB5固体培养基)上，在28℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养2～3个月，诱导愈伤细胞。选择生长活跃的愈伤细胞，转移到EIM胚胎诱导培养基(含有100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的MSB5固体培养基)上，在28℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养培养2～3月，获得具有分化成为胚胎的愈伤组织。将绿色健康愈伤组织转移到不含卡那霉素的EIM培养基上，诱导胚胎发育形成幼芽。挑选外观发育正常的幼芽，转移至含有200mg/L IAA的MS培养基中，在28℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养诱导生根，最终发育成为再生植株。通过对再生植株进行炼苗、移栽至营养钵成活，共获得了14株再生棉花植株。
实施例4本发明棉花GI基因敲除突变体材料鉴定和筛选
按照如下方法进行：
(1)转基因阳性植株筛选
提取实施例3中获得的14株棉花再生株的叶片基因组DNA，以Cas9基因特异引物Cas9-FP和Cas9-RP为引物进行PCR扩增，所得PCR产物大小为706bp(见图2)。通过对PCR产物进行测序验证，测序获得序列与Cas9基因一致即为转基因植株。所述的Cas9基因特异引物如下：
Cas9-FP：5’-GTACTCCATTGGGCTCGATATCGGC-3’；
Cas9-RP：5’-ACCAAACAGGCCGTTCTTCTTCTC-3’。
其中所述PCR的反应体系(50μL)：dNTP 3μL，Buffer 5μL，Cas9-FP2μL，Cas9-RP 2μL，DNA模板2μL，Tag酶1μL，ddH2O 35μL。所述PCR的反应程序：94℃5min；94℃5min，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。
(2)基因编辑突变植株获得
根据本发明sgRNA靶标位点的上下游序列，设计特异引物gi-FP和gi-RP，PCR检测阳性再生植株靶标位点附近的序列，GI基因未发生编辑的R15野生型植株的PCR产物大小为528bp，GI基因发生编辑之后导致基因组片段缺失或者插入，PCR产物会小于或者大于528bp。通过对PCR产物进行测序分析确定靶标位点的编辑类型。其中所述的鉴定引物gi-FP和gi-FP序列如下：
gi-FP：5’-GGCTTTATGGTTGGAAGAGGTTGAGGAC-3’；
gi-RP：5’-CTATTACAAGAACAAGCAAATTTTGTTAG-3’。
其中所述PCR的反应体系(50μL)：dNTP 3μL，Buffer 5μL，gi-FP 2μL，gi-RP 2μL，DNA模板2μL，Tag酶1μL，ddH2O 35μL。所述PCR的反应程序：94℃5min；94℃5min，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。
结果获得3株靶标位点发生DNA片段缺失的植株，分别命名为gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3。其中gi-18-1基因组靶位点缺失47bp(见SEQ ID No.2)，gi-18-2基因组靶位点缺失60bp(见SEQ ID No.3)，gi-18-3基因组靶位点缺失32bp(见SEQ ID No.4)。
实施例5本发明棉花GI基因敲除突变体材料耐旱能力对比鉴定试验
按照如下方法进行：
(1)将实施例4中所得的gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3转基因植株种子分别用70％乙醇浸泡消毒30s，然后用30％H2O2浸泡消毒2h；再用无菌蒸馏水冲洗3次，去掉种子表面残留的H2O2。
(2)将消毒后的种子在无菌水中28℃浸泡过夜，待种子萌动露白后去除种皮，分别播种于含有200mmol/L甘露醇的MS培养基上进行胁迫处理。播种后的种子在28℃、16小时光照/8小时黑暗培养1周左右。以R15野生型植株为对照。观察分析植株在甘露醇胁迫培养基上的生长情况，检测GI基因敲除突变体的耐旱能力。
结果从图3可以看出，在干旱胁迫条件下，本发明棉花GI基因敲除突变体gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3的平均植株高度大于4cM，而对照植株平均高度小于2cM。同时，GI基因敲除突变体植株的根系总面积是对照材料的3倍以上，说明本发明GI基因敲除突变体植株gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3的株高和长势显著优于对照材料，即利用本发明sgRNA进行基因编辑获得的棉花GI基因敲除突变体材料的耐旱性显著高于野生型植株，其耐旱性获得显著提高。
实施例6本发明棉花GI基因敲除突变体材料耐盐能力对比鉴定试验
按照如下方法进行：
(1)将实施例4中所得的棉花GI基因敲除突变体gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3的种子分别用70％乙醇浸泡消毒30s，然后用30％H2O2浸泡消毒2h；再用无菌蒸馏水冲洗3次，去掉种子表面残留的H2O2。
(2)将消毒后的种子在无菌水中28℃浸泡过夜，待种子萌动露白后去除种皮，分别播种于200mmol/L NaCl的MS培养基上进行胁迫处理。播种后的种子在28℃、16小时光照/8小时黑暗培养1周左右。以R15野生型为对照。观察分析植株在NaCl胁迫培养基上的生长情况，检测GI基因敲除突变体植株的耐盐碱能力。
结果从图4可以看出，在NaCl胁迫条件下，本发明棉花GI基因敲除突变体gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3的平均植株高度大于5cM，而作为对照的R15野生型植株平均高度小于2cM。同时，GI基因敲除突变体材料的根系总面积是对照材料的2倍以上，说明其具有较强的耐盐碱能力。上述结果说明利用本发明sgRNA进行基因编辑获得的GI基因敲除突变体gi-18-1、gi-18-2和gi-18-3的株高和长势显著优于对照材料；与R15野生型相比，本发明GI基因敲除突变体植株的耐盐碱能力获得显著提高。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种提高棉花耐旱和耐盐碱能力的sgRNA及其应用
<141> 2021-12-31
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 1
cacatcagaa caattccctg 20
<210> 8
<211> 150
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 8
gctaatataa attcttatgc tttattatgt ttccccttgt ttaggttcaa attactgcat 60
attgctgagg tatgtttgtt ttgtgcaacc ttttcacagt ttccaactat gaaggaaaag 120
atacttaacg aatttgttta ttatcaatgt 150
<210> 9
<211> 137
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 9
gctaatataa attcttatgc tttattatgt ttccccttgt ttaggatatt gctgaggtat 60
gtttgttttg tgcaaccttt tcacagtttc caactatgaa ggaaaagata cttaacgaat 120
ttgtttatta tcaatgt 137
<210> 10
<211> 164
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 10
gctaatataa attcttatgc tttattatgt ttccccttgt ttaggttcaa attactgcat 60
agtcgagtga ggatattgct gaggtatgtt tgttttgtgc aaccttttca cagtttccaa 120
ctatgaagga aaagatactt aacgaatttg tttattatca atgt 164

Claims (10)

1.一种DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。
2.权利要求1所述的DNA分子作为靶标序列在抑制作物GI基因表达上的应用。
3.一种提高作物耐旱和耐盐碱能力的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA的靶标序列由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。
4.权利要求3所述的sgRNA在抑制作物GI基因表达上的应用。
5.权利要求3所述的sgRNA在提高作物耐旱和/或耐盐碱能力上的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的作物是指棉花、油菜、水稻、玉米或高粱等。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的棉花是指陆地棉(Gossypiumhirsutum)或海岛棉(Gossypium barbadense)。
8.一种提高棉花耐旱和/或耐盐碱能力的方法，其特征在于，包括抑制棉花GI基因的表达；所述的抑制GI基因的表达是通过对棉花GI基因进行基因编辑实现的；所述的基因编辑是通过CRISPR/Cas9基因编辑系统实现的；所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统中的靶标序列由SEQ ID No.1所示的核酸序列组成。
9.一种利用权利要求3所述的sgRNA培育耐旱和/或耐盐碱能力强的棉花品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照SEQ ID No.1所示人工合成sgRNA的靶标序列；
(2)在sgRNA的靶标序列的正向序列的5’端添加4个碱基GATT，获得单链DNA，命名为sgRNA1；在sgRNA的靶标序列的反向互补序列的5’端添加4个碱基ACAC，获得单链DNA，命名为sgRNA2；
sgRNA1：5’-GATTCACATCAGAACAATTCCCTG-3’；
sgRNA2：5’-ACACCAGGGAATTGTTCTGATGTG-3’；
(3)人工合成sgRNA1和sgRNA2；然后在将sgRNA1和sgRNA2置于水浴锅中退火形成双链DNA片段；再将双链DNA片段连接于sgRNA克隆载体上，获得sgRNA表达盒；其中sgRNA克隆载体已经包含了NtU6启动子、Cas9酶结合的42bp发卡结构序列以及40bp终止子序列，在NtU6启动子与42bp发卡结构序列之间有两个Bsa I酶切位点，且双切之后5’和3’端分别形成GATT和ACAC末端；
(4)将Cas9基因和eGFP基因融合，并在两端添加一个核定位信号(NLS)序列，之后将融合基因片段连接于BamH I和Xho I双酶切pBI121表达载体上，获得的Cas9-eGFP融合表达载体；
(5)利用Kpn I和Apa I双酶切将步骤(3)所得的sgRNA表达盒，并连接于步骤(4)所获得的Cas9-eGFP融合表达载体，构建成CRISPR/Cas9基因编辑表达载体，命名为pGBI-Cas9-GI-KO；
(6)将步骤(5)所得的表达载体导入农杆菌，然后利用农杆菌介导的棉花遗传转化方法将表达载体导入棉花，获得含有Cas9-eGFP融合基因和sgRNA表达盒的转基因棉花；对转基因棉花进行分子鉴定，筛选出Gigantea(GI)基因突变而沉默表达的GI基因敲除突变体材料，即获得耐旱和/或耐盐碱棉花品种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的棉花是指陆地棉(Gossypiumhirsutum)或海岛棉(Gossypium barbadense)。
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