CN104988159A - 棉花耐旱基因GhEXP1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉花耐旱基因GhEXP1及其应用，属于生物技术领域。本发明涉及基因GhEXP1为棉花中首次报道的扩展蛋白基因。该基因是从棉花陆地棉耐旱品种奥3503中克隆，RT-PCR分析发现GhEXP1在干旱处理后上调表达。GhEXP1基因沉默株的耐旱性明显降低。GhEXP1转基因拟南芥植株经30天的干旱处理存活率为80%，而对照的野生型存活率为10%，表明GhEXP1可显著提高植株的耐旱性。GhEXP1基因有望在提高植物耐旱性中起到重要作用，具有较大的应用前景。

Description

棉花耐旱基因GhEXP1及其应用

一、技术领域

本发明提供了棉花耐旱基因GhEXP1及其应用，属于植物基因工程领域。涉及植物基因克隆以及功能分析，用于通过植物基因工程技术改善植物耐旱性和其他有益生产性状。

二、背景技术

干旱对植物造成的损失在所有非生物胁迫中占首位，仅次于生物胁迫中病虫害造成的损失。干旱可以造成植物细胞严重失水，正常的细胞膜结构受到破坏，导致气孔过度关闭，进而影响对CO₂的吸收，光合作用降低。棉花是中国乃至全世界最为重要的经济作物，其产区多为干旱和半干旱地区，水分供应不足成为棉花生产的主要障碍因素之一。王艳琴等(王延琴,杨伟华,许红霞.水分胁迫对棉花种子萌发的影响.棉花学报,2009，21(1):73－76)研究了水分胁迫对棉花种子萌发的影响，表明棉花种子在受到不同程度干旱胁迫时，随着水势的下降，其发芽率、发芽速度、发芽指数、苗高、根长、根茎比、幼苗干重、鲜重指标等均出现不同程度的降低。李秉柏等(李秉柏,陆景淮,吴金栋.旱涝灾害对江苏棉花生产影响初探.旱涝灾害对棉花生长的影响.中国农业气象,1995,16(3):23－26)通过研究干旱条件下江苏地区棉花的生长发育，发现在干旱条件下棉花生长首先受抑，株高、出叶速率明显减慢。俞希根等(俞希根，孙景生，肖俊夫，等.棉花适宜土壤水分下限和干旱指标研究.棉花学报，1999，11(1):35-38)研究发现，当棉花在不同生育阶段受到干旱胁迫时，其生长、发育和产量都有一定影响，影响从大到小依次为花铃期、蕾期、成熟期、苗期。研究表明，耐旱的种质材料主要通过加大气孔阻力和降低蒸腾强度来有效地减少体内水分丢失，从而保证光合作用的顺利进行。在干旱条件下，抗旱材料根系活力提高，体内脯氨酸积累明显增加。

干旱等逆境条件严重影响棉花的产量与品质，棉花耐旱育种一直沿用传统的育种方法，种质资源狭窄，筛选周期长，投入的人力物力大。挖掘抗旱种质，创制抗旱新材料，促进优良基因重组，采用常规育种技术结合现代分子生物学技术如分子标记辅助育种、生化辅助育种、转基因技术等，利用生态育种、轮回选择等方法，将优质、高产、抗旱、抗病虫等性状快速聚合在一起，培育优质、高产、抗旱的棉花新品种。耐旱棉花品种根系发达，茎秆硬，转基因抗性育种可加速育种进程(杨淑巧等，山西棉花耐旱育种研究进展，中国棉花,2012,39(10):1-3)。

目前，应用于棉花耐旱育种的基因十分有限，克隆的证明在棉花上具有耐旱效果的基因较少。AVP1是来源于拟南芥的基因，转化到棉花中后，转基因植株在干旱条件下可提高棉纤维产量20％(Zhang Hong et al,Creating drought-and salt-tolerant cotton by overexpressing a vacuolar pyrophosphatase gene,Plant Signal Behav.2011,6(6):861–863.)，具有一定的应用前景。拟南芥AtLOS5基因转化棉花后，同样可以提高棉花耐旱性，转基因植株具有更多内源的ABA和脯氨酸，在干旱条件下比对照的干重增加13％，也具有一定的应用价值(Yue Yuesen et al,Overexpression of the AtLOS5gene increased abscisic  acid level and drought tolerance in transgenic cotton.Journal of Experimental Botany,2012,63(10):3741-8.)。然而，这些基因均为拟南芥基因，棉花内源的耐旱基因尚未见报道。棉花比拟南芥更耐干旱，棉花中克隆的基因应用于耐旱育种具有更强的应用前景。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个能提高棉花耐旱性的新基因GhEXP1，该基因编码一个扩展蛋白(expansin protein)。该基因受干旱胁迫诱导后表达量增加。该基因沉默后植物耐旱水平显著下降，将该基因转化到拟南芥后，可显著提高植株的耐旱能力。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物耐旱性。

技术方案

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花耐旱相关基因GhEXP1，属于植物基因工程领域，该基因来源于陆地棉品种奥3503(Gossypium hirsutum L.)，该品种具有较好的耐旱性。GhEXP1是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(15mM NaCl,1mM NaH₂PO₄,0.1mM EDTA)、0.1×SSC(15mM NaCl,1.5mM柠檬酸钠)、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO.1由599个碱基组成，自5’端第62位碱基为基因的编码区起始位点,记为+1，第455为基因的终止密码子，完整编码框长度为396个碱基。

该基因编码一个扩展蛋白(Expansin protein)。该基因受干旱胁迫处理后诱导上调表达。该基因沉默后棉花植株的耐旱性明显下降。转化拟南芥后，显著提高植株的耐旱性。本发明还提供了含有本发明基因的沉默载体、宿主菌、扩增该基因的引物、以及转基因载体。所述基因可以在植物耐旱改良中得到应用。所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

有益效果

1.本发明获得了一个全新的棉花耐旱相关基因GhEXP1。本发明获得的GhEXP1基因是一个全新的扩展蛋白类基因，BLAST搜索没有与其高度同源的相似基因。该基因受干旱胁迫诱导后上调表达。通过基因沉默后分析发现此基因的沉默可以显著降低植物的耐旱性。对沉默植株的耐旱性分析显示，在以18％PEG处理后24h，沉默植株萎蔫非常严重，而对照的为沉默植株萎蔫较轻。将该基因在拟南芥中过表达，获得的转基因植株在干旱处理30天后存活率80％，而未转基因的受体材料存活率仅为10％。表明GhEXP1具有较广阔的应用前景。

2.本发明有助于更好地了解耐旱基因的作用机制。GhEXP1的克隆为进一步了解植物抗逆信号传导通路奠定基础。例如可以利用GhEXP1分离互作的下游信号传递因子，从而获得耐旱信号传导通路，所以GhEXP1的分离以及功能鉴定为研究耐旱基因的作用机制奠定基础。

3.本发明可应用于耐旱育种。GhEXP1耐旱效果显著。沉默该基因后，植株即出现显著的萎蔫表型；将该基因转化拟南芥，可显著提高植株的耐旱性。该基因在育种中有较大的应用价值。

四、附图说明

图1 18％PEG模拟干旱处理陆地棉品种奥3503后GhEXP1的表达。

图2 PEG模拟干旱处理GhEXP1沉默植株。18％PEG模拟干旱处理24h后的萎蔫效果。

WT为野生型棉花植株，CLCrV为携带空载体农杆菌处理的棉花植株，GhEXP1为携带GhEXP1基因的农杆菌处理的棉花植株化植株。

图3转基因拟南芥植株在干旱处理30天后耐旱效果。

WT为野生型拟南芥植株(未转基因)，GhEXP1为转基因拟南芥植株。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成。本实验中基因来源于陆地棉品种奥3503(Gossypium hirsutum L.)(公知公用,刘小双等，棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析，中国农业科学2015,48(12):2306-2316)，该品种具有较强的耐旱性。

(一)棉花GhEXP1基因克隆以及序列分析

根据陆地棉转录组测序中一个受干旱诱导上调表达的基因序列设计克隆引物EXP1F:5’-ACCAACCTTTATATATTTGC-3’，EXP1R:5’-TTCCTTGTATCGGTGAAAG-3’，在陆地棉品种奥3503中的CDNA中扩增，将获得的片段构建到pMD19-T载体(Takara)进行测序，发现插入片段长度为599bp，含有一段396个核苷酸的开放阅读框，将该基因命名为GhEXP1，含该基因的T载体命名为T-EXP1。

(二)棉花GhEXP1的诱导表达分析

为探讨棉花GhEXP1基因是否响应干旱胁迫，将30d龄陆地棉奥3503进行18％的PEG模拟干旱胁迫处理。采用定量RT-PCR分析GhEXP1的表达量变化趋势(图1)，结果显示，在干旱胁迫处理后，GhEXP1基因在根中响应干旱胁迫诱导表达，24h和36h均上调达到3倍。

(三)棉花中抑制GhEXP1基因表达的耐旱效果

为了进一步研究GhEXP1在棉花中耐旱作用，利用VIGS(virus induced gene silencing)技术抑制陆地棉奥3503中GhEXP1基因的表达(Gu Zhouhang et al,Aversatile system for functional analysis ofgenes and microRNAs in cotton,Plant Biotechnology Journal,2014,12:638-599)。以18％PEG分别处理GhEXP1沉默植株与非沉默植株，处理24h时，与未沉默植株相比，沉默植株萎蔫较重，表型上差异显著(图2)。

(四)GhEXP1可显著提高拟南芥植株的耐旱性

以上述测序正确的克隆质粒T-EXP1为模板，经引物JAGN2113__EXP1F:

CGGGGTACCATGGCACTCTTGATCTTG和JAGN2114__EXP1R:

CGCGGATCCAATCTGTATATATTCTATATTG高保真酶(Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase,Vazyme)进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环。PCR产物按Axygen公司PCR纯化试剂盒说明书纯化后，用KpnI/BamHI酶切片段，连接到pBinGFP4载体(Tingli Liu et al,Unconventionally secreted effectors oftwo filamentous pathogens target plant salicylatebiosynthesis.Nature Communications,2014,5:4686)上，采用冻融法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，培养在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，37℃培养16h～20h，挑取单克隆菌落于含有卡那霉素(50mg/L)液体LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养14h，提取质粒，用载体引物JAGN2289_pBFP4F:CAAGCAATCAAGCATTCTAC和JAGN2290_pBFP4R:CGGACACGCTGAACTTGTGG进行PCR扩增，阳性克隆大小为600bp，获得阳性克隆命名为pBinGFP4-GhEXP1，用冻融法将pBinGFP4-GhEXP1转化农杆菌LBA4404，转化子经PCR验证后保存备用。

随机挑取合适的农杆菌转化子，进行PCR验证，吸取含有阳性克隆的菌液20μl加入到50ml的液体LB(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)培养基中，28℃、200r/min培养过夜至OD600为1-2左右，采用蘸花法(Steven J.Clough et al,Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998,16(6):735-43.)进行拟南芥转化，获得的T1代种子放于MS培养基上(1/2MS+cef500mg/L+30mg/L Kana)进行筛选，获得阳性植株。对所得T1代植株用PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达，对GhEXP1基因过量表达的拟南芥植株收获T2种子。T2种子在含有30mg/L Kana的1/2MS培养基上进行筛选培养，获得不分离的纯合植株。

将GhEXP1基因过量表达T2拟南芥以及野生型在温室中正常培育2周，停止浇水，1个月后观察干旱处理对植株的影响。如图3显示，转GhEXP1拟南芥植株在干旱处理一个月后，存活率为80％，转基因植株的可以正常结实，且植株仍保持绿色，而对照的野生型植株存活率仅为10％，大部分植株已经干枯，结实较少。表明GhEXP1显著提高了拟南芥的耐旱能力。

本发明棉花耐旱相关基因GhEXP1及其应用，该基因编码一个扩展蛋白，受PEG模拟干旱诱导后表达量增加。将GhEXP1构建到沉默载体CLCrV并利用基因沉默技术降低该基因表达量，结果该基因表达量降低可以显著降低植物对干旱的耐受性。将该基因在拟南芥中过表达，可显著提高拟南芥的耐旱性，转基因拟南芥在干旱处理30天后存活率80％，而未转基因的受体材料存活率仅为10％。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物耐旱性。GhEXP1的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，可应用于植物耐旱基因工程以及其他抗逆性的基因工程改良中。

SEQ ID NO.1:

ACCAACCTTTATATATTTGCTGTAGATAAAAATAGTTTATGTTATTCTCCAGTTGAGGGTAATGGCACTCTTGATCTTGGCAATTCTGATTACTGCAGTTATAAGCAAAG AAGCATACTTTGTCCATGGTGACATTGGCACTGCATCGTATTATAACCCACCATATATACCAACTAAATGTGATGGTAATAGAGAAGAACAGTTTCCACCTGGGAACTTGTTTGTTGCAGTTAGCGAGGGATTATGGGACAATGGTGCCGCTTGTGGGAGGCGTTACCGATTAAGATGCCTGAGCGGACCTAAGCGACCATGTAAGCGGAGAACCATTGATGTCAAAGTGGTGGATTTCTGCCCTTTCACTCCATGCCCCTCTACCATCATGCTGTCCAGGGATGCTTTTGCTGCTATTGCACATAAACATGGAAGGAAAATCAATATAGAATATATACAGATTTGAAGAAGAAGCTACTATTAATACAATCATATCGAAGTACCAGTTTCAGCCTGTGTAAGAAAGAAAAATACATGCAAGGAAGACACTAGAAATGTGATCAAGATGTTAATACCAAGTTTGTAAATTCTTTCACCGATACAAGGAA。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  棉花耐旱基因GhEXP1及其应用

 

 

<130>  0

 

 

<160>  7    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  599

<212>  DNA

<213>  陆地棉品种奥3503 (Gossypium  hirsutum L.)

 

 

<220>

<221>  上游引物HoBi-F

<222>  (1)..(21)

<223> 

 

 

 

<400>  1

accaaccttt atatatttgc tgtagataaa aatagtttat gttattctcc agttgagggt     60

 

aatggcactc ttgatcttgg caattctgat tactgcagtt ataagcaaag aagcatactt    120

 

tgtccatggt gacattggca ctgcatcgta ttataaccca ccatatatac caactaaatg    180

 

tgatggtaat agagaagaac agtttccacc tgggaacttg tttgttgcag ttagcgaggg    240

 

attatgggac aatggtgccg cttgtgggag gcgttaccga ttaagatgcc tgagcggacc    300

 

taagcgacca tgtaagcgga gaaccattga tgtcaaagtg gtggatttct gccctttcac    360

 

tccatgcccc tctaccatca tgctgtccag ggatgctttt gctgctattg cacataaaca    420

 

tggaaggaaa atcaatatag aatatataca gatttgaaga agaagctact attaatacaa    480

 

tcatatcgaa gtaccagttt cagcctgtgt aagaaagaaa aatacatgca aggaagacac    540

 

tagaaatgtg atcaagatgt taataccaag tttgtaaatt ctttcaccga tacaaggaa     599

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  EXP1F

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  2

accaaccttt atatatttgc                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  w

 

 

<220>

<221>  EXP1R

<222>  (1)..(19)

<223> 

 

 

 

<400>  3

ttccttgtat cggtgaaag                                                  19

 

 

<210>  4

<211>  27

<212>  DNA

<213>  

 

 

<220>

<221>  JAGN2113__EXP1F

<222>  (1)..(27)

<223> 

 

 

 

<400>  4

cggggtacca tggcactctt gatcttg                                         27

 

 

<210>  5

<211>  31

<212>  DNA

<213>  

 

 

<220>

<221>  JAGN2114__EXP1R

<222>  (1)..(31)

<223> 

 

 

 

<400>  5

cgcggatcca atctgtatat attctatatt g                                    31

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  

 

 

<220>

<221>  JAGN2289_pBFP4F

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  6

caagcaatca agcattctac                                                 20

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  

 

 

<220>

<221>  JAGN2290_pBFP4R

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  7

cggacacgct gaacttgtgg                                                 20

 

 

Claims (9)

1.棉花耐旱基因GhEXP1，是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

2）可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的条件为0.1×SSPE或 0.1×SSC、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下洗膜。

3.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因编码一个扩展蛋白（Expansin protein）。

4.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因受干旱胁迫处理后诱导上调表达。

5.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因沉默后棉花植株的耐旱性明显下降。

6.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因转化拟南芥后，显著提高转基因植株的耐旱性。

7.含有权利要求1～6之一所述基因的表达载体。

8.权利要求1～6之一所述基因在植物耐旱改良中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。