CN114717258B - 一种SsJMJ1基因在提高植物抗旱性中的应用 - Google Patents

一种SsJMJ1基因在提高植物抗旱性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种SsJMJ1基因在提高植物抗旱性中的应用,所述SsJMJ1基因为割手密的SsJMJ1基因;所述SsJMJ1基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示;所述SsJMJ1基因所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过分析具有较强抗旱特性的甘蔗野生种割手密发现,干旱胁迫下甘蔗多种组蛋白修饰发生显著变化,并且组蛋白去甲基化酶基因SsJMJ1在干旱胁迫下表达水平发生显著变化,通过体外和体内验证表明,提高SsJMJ1基因表达可增强植物耐旱性。由此可见,在具有较强抗旱性的甘蔗材料分离的SsJMJ1基因可作为提高植物抗旱的重要基因资源,具有作物抗旱育种应用潜力。

Description

一种SsJMJ1基因在提高植物抗旱性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种SsJMJ1基因在提高植物抗旱性中的应用。
背景技术
干旱严重影响作物生产和农业可持续发展。全世界每年因干旱造成的农业损失占各种气象灾害所造成损失总和的60%。据统计,世界上干旱及半干旱地区约占地球陆地面积的34.9%,中国的半干旱与干旱地区占国土面积的47%,占总耕地面积的51%,干旱缺水是目前中国农业乃至世界农业面临的最严重的问题之一。因此,探寻提高植物抗旱性的有效途径显得尤为重要。
经过漫长的自然环境适应性演化过程,植物自身也形成了一系列抵抗干旱胁迫的策略。研究发现,组蛋白去甲基化酶家族基因在植物逆境响应中扮演了重要角色。其中,一种编码JmjC结构域蛋白的组蛋白去甲基化酶家族基因,其编码的酶能特异地使甲基化H3K36去甲基化,并调节相应基因来抵御逆境胁迫。例如,干旱条件下,与基因沉默相关的H3K9me2修饰伴随着Asr2(Arsenic resistance protein 2)基因(干旱诱导上调表达)的上调表达呈下降趋势。据此,研究者将过表达的H3K9去甲基化酶JMJ27(Jumonji C domain-containing H3K9 demethylase 27)转化拟南芥,发现RD20和GolS2的H3K9me2修饰均发生下降,并且基因的表达水平上升、植株抗旱性提高。可见,组蛋白去甲基化酶基因可作为提升植物抗旱性的潜在基因资源。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点,而提出的一种SsJMJ1基因在提高植物抗旱性中的应用,可利用基因工程方法培育转基因植物,获得抗旱性提高的新种质资源,因而具有较好的遗传研究和育种应用潜力。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
一种SsJMJ1基因在提高植物抗旱性中的应用。
优选地,所述SsJMJ1基因为割手密的SsJMJ1基因。
优选地,所述SsJMJ1基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1:
5'-aaatcgactctagaaagcttatgctgtatattgggatgctctatgctgtatattgggatgctctttagtatgtttgcctggcatgtggaagatcattacttgtacagtattaactatcaccactgtggagcctcaaaaacatggtacggtattccaggaagtgctgcttctgattttgagaaagtggtacgtgagcatgtatatgatcacgaaattttatcaggtgaaggggaaagtgcagcctttgatgttcttttggggaagactacaatcttcccacctaatattttgctggatcatcatgttccagtctatagagctgtacagaaacctggagagtttgttgtaacatttccccgagcttatcattctggtttcagccatggtttcaattgtggtgaggcagtaaattttgctacaagcgaatggtttcctctaggagcagttgctagtcaacgttatgcgcttctgaagaggataccagtattaccttatgaggagcttctttgtaaagaaacaacattttttactaatgagttttccatgtctgatcacggagatgtaacattaactggagacacacatatacagagctatatgaaggccccctttgtgcagttgatgcggttccaacaccgtgttcgttggtcacttgcgaaaatgggtgctcgtgcacgctataaagcagacattgacgccacagttctctgtgggatatgcaaacgtgactgctatatagctcacattatgtgtaactgcagagccgatgcaatttgcctttgtcatgaggaagagattaggaagtgctcttgcaactgtgatcgtattgtttttgtgaggaaagacatctttgaattggaggaactatcaaagaagtttgaggaaattggaatattggatgaagtaggaaaacaaatgtctcaaagtgatggctcgagcacgcatccttatttgtccaatggcattgaccacaatgctaaatacttcccatattgcaagatcctaattgatacatcccctgaacttcataccttgtcagaggtagatgttcttggatatgatctgaataagccatatcctacattatcaacaataacttctgcacatggaccccaggagtatcctacacaaagtgatgagtgtactagttctaaccgaagaacattctctagctcatgtccagagaatggaatgattaatgtttatcctttatgcactgatcaagcattggctgctcaggatactgatgattctgactgtgaggtatttagagttaagagacgatctggcatagttctggagaaaagatgttctgaagatgtagcagtaaatttaactgagaatcaggctttaagacggttaaagaaagcctgctcagatgacagacaagagaagaacacaacagaagtatcctgtggtacaagaagtgtcaatctgggtgctgaatcgcattgtcttgactccatttctggaaatacagataacttcatcaatcgaagcaaacaaaaaatgaggatagatcagctaggtgcaaaaattgtgcaagacgaagttgctttcagccagaaatctatcggttgcagttacctatctccatctgtagatcttgagccaaaacgcttgaaaattcgtggcccatccttcccaagcactgtttctgaagtggaaatatcttataggttccaggaggacagtgacttggctccaggaggacagtgacttggctggtaccatggtgagca-3’
优选地,所述SsJMJ1基因所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID No.2:
MLYIGMLFSMFAWHVEDHYLYSINYHHCGASKTWYGIPGSAASDFEKVVREHVYDHEILSGEGESAAFDVLLGKTTIFPPNILLDHHVPVYRAVQKPGEFVVTFPRAYHSGFSHGFNCGEAVNFATSEWFPLGAVASQRYALLKRIPVLPYEELLCKETTFFTNEFSMSDHGDVTLTGDTHIQSYMKAPFVQLMRFQHRVRWSLAKMGARARYKADIDATVLCGICKRDCYIAHIMCNCRADAICLCHEEEIRKCSCNCDRIVFVRKDIFELEELSKKFEEIGILDEVGKQMSQSDGSSTHPYLSNGIDHNAKYFPYCKILIDTSPELHTLSEVDVLGYDLNKPYPTLSTITSAHGPQEYPTQSDECTSSNRRTFSSSCPENGMINVYPLCTDQALAAQDTDDSDCEVFRVKRRSGIVLEKRCSEDVAVNLTENQALRRLKKACSDDRQEKNTTEVSCGTRSVNLGAESHCLDSISGNTDNFINRSKQKMRIDQLGAKIVQDEVAFSQKSIGCSYLSPSVDLEPKRLKIRGPSFPSTVSEVEISYRFQEDSDLA
本发明还提供了一种提高植物抗旱能力的方法,使SsJMJ1基因在植物中高表达的方法是:将含有所述SsJMJ1基因的重组表达载体导入转基因材料中。
优选地,所述重组表达载体具体是:将SsJMJ1基因的cDNA序列插入pSUPER:eGFP的克隆位点得到的。
优选地,所述植物为甘蔗,转基因材料为拟南芥。
优选地,所述SsJMJ1基因为甘蔗SsJMJ1基因。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明只需要过表达单个基因,即甘蔗SSJMJ1基因,即可提高植物的抗旱性操作简便,便于筛选,可有效降低成本。
2、本发明可利用基因工程方法培育转基因植物,获得抗旱性提高的新种质资源,因而具有较好的遗传研究和育种应用潜力。
附图说明
图1为本发明SsJMJ1响应干旱胁迫下基因表达情况图(RT-qPCR)。(A)SsJMJ1受不同程度干旱诱导表达。Control:未经干旱处理;Mild Drought:干旱三天;Severe Drought:干旱十天。(B)RT-qPCR检测SsJMJ1在受干旱胁迫的甘蔗栽培种中表达。eEF为内参基因,所有数据点均为平均值±SE(n=3),*的数目表示用T检验进行的单因素方差分析存在显著性差异(P<0.05)。
图2为本发明SSJMJ1基因在不同胁迫条件均显示迫诱导表达图。RT-qPCR检测200mM NaCl、100mM MeJA、4℃、38℃、100μM ABA、30%PEG6000和100mM甘露醇和处理后SES208植株中SsJMJ1基因的表达情况。
图3为本发明转基因拟南芥中SSJMJ1基因的克隆与基因模型图。该基因实际包含有5个外显子(黑色框)和6(黑色线条)个内含子。SsJMJ1编码的蛋白具有554个氨基酸。M为2000bp Marker,JmjC为组蛋白去甲基化位点。
图4为本发明SSJMJ1基因的亚细胞细胞定位及组织特异性表达图。(A)农杆菌侵染本氏烟草叶片48h后pSUPER:eGFP和pSUPER:SsJMJ1-eGFP的亚细胞定位。从左到右依次为pSUPER:SsJMJ1-eGFP绿色荧光、核定位信号、明场图片以及前三者的融合效果。标记的红色箭头、黄色箭头和蓝色箭头分别表示细胞膜、细胞核和细胞质。(B)使用anti-GFP检测本氏烟草、pSUPER:eGFP和pSUPER:SsJMJ1-eGFP的蛋白表达水平,H3组蛋白为内参蛋白。(C)甘蔗原生质体中pSUPER:eGFP和pSUPER:SsJMJ1-eGFP的亚细胞定位。从左到右依次为GFP荧光信号、细胞核定位标记物、明场以及混合图片。mCherry-ARF191V是一种具有RFP信号的细胞核定位标记物。图片标尺为10μm。(D)SsJMJ1的组织特异性表达。即SsJMJ1在叶、根、茎以及叶鞘中的表达,以叶的表达作为参考。eEF为内参基因。
图5为本发明SSJMJ1基因过表达植株的构建图。(A)pSUPER:SsJMJ1-eGFP过表达拟南芥T1代植株DNA检测。Marker:2000bp。(B)荧光定量检测拟南芥过表达株系中SsJMJ1基因表达。UBC为内参基因,所有数据点均为平均值±SE(n=3),*的数目表示用T检验进行的单因素方差分析存在显著性差异(P<0.05)。(C)使用anti-GFP检测Col-0、pSUPER:eGFP和过表达株系中的SsJMJ1的蛋白表达水平,红色箭头标示pSUPER:eGFP和过表达株系中的SsJMJ1蛋白,H3组蛋白为内参蛋白。(D)拟南芥过表达植株荧光信号检测。从左到右依次为野生型拟南芥(Col-0)、空载质粒拟南芥(pSUPER:eGFP)和SsJMJ1过表达的两个株系。标尺为10μm。
图6为本发明SSJMJ1基因过表达植株的抗旱性及离体叶片失水速率的检测图。对14天大小幼苗进行干旱处理,当pSUPEU:eGFP叶片完全萎蔫时复水,干旱复水三天后统计植物的存活率。数据代表均值±SE(n=6)。
具体实施方式
下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征,从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
pSUPER:eGFP在文献“Ce,YANG,and,Jian,ZHOU,&and,et al.(2007).Optimization of the construction of recombinant plasmids pparγ-psuper-egfpfor rna interference.Journal of Medical Colleges of Pla.”中公开过,公众可从福建农林大学海峡联合研究院获得。
割手密(Saccharum spontaneum L)在文献“Silva,Jorge,A.,G.,da,&Sorrells,et al.(1993).Rflp linkage map and genome analysis of saccharumspontaneum.Genome.”中公开过,公众可从福建农林大学海峡联合研究院获得。
本氏烟草野生型(N.benthamiana)在文献“Regner,F.,Machado,A.D.C.,Machado,M.L.D.C.,Steinkellner,H.,&Katinger,H..(1992).Coat protein mediated resistanceto plum pox virus in nicotiana clevelandii and n.benthamiana.Plant CellReports,11(1),30-3.”中公开过,公众可从福建农林大学海峡联合研究院获得。
拟南芥Col-0生态型(Arabidopsis thaliana,Columbia ecotype)在文献“Wang,L.,Hua,D.,He,J.,Duan,Y.,Chen,Z.,Hong,X.,and Gong,Z.(2011).Auxin ResponseFactor2(ARF2)and its regulated homeodomain gene HB33 mediate abscisic acidresponse in Arabidopsis.PLoS genetics 7,e1002172.”中公开过,公众可从福建农林大学海峡联合研究院获得。
EZ-Flex Seamless Assembly and Cloning Kit品牌为GenStar,产品货号为T195-20。
实施例1、SSJMJ1基因在干旱及非生物胁迫下的诱导表达
一、引物的设计和合成
根据SSJMJ1基因的CDS序列设计实时定量荧光PCR引物,引物序列为:
正向引物:
5'-TATGAAGGCCCCCTTTGTGC-3'
反向引物:
5'-GTGCACGAGCACCCATTTTC-3'
二、SES208植株非生物胁迫处理
取生长于田间的割手密SES208以及栽培种的四个品种,剪成约6-8cm的带一个节间与芽的茎,将其清洗干净以后置于大的容器中,加多菌灵侵泡过夜,将多菌灵洗净,置于加水的玻璃瓶中,每个玻璃瓶放两到三个茎,置于30℃春化箱中培养十天左右,待其芽长至约15cm。
不同程度干旱材料处理。选取长势一致的幼苗移至直径为26cm的花盆中,用相同重量的营养土培养,置于温室中。待幼苗长至十天左右,选取长势一致的幼苗进行干旱处理,一组作为对照正常浇水,另外两组组进行干旱处理,分别三天和十天后取样。
水分胁迫材料。选取三株长势一致的割手密SES208放置于盛有总体积为80mL配比溶液组织培养的玻璃瓶中,进行100μM ABA、4℃、38℃、100mM MeJA、100mM甘露醇、200mMNaCl和30%PEG6000胁迫处理。除冷胁迫和热胁迫置于培养箱以外,其余胁迫置于30℃春化箱中培养,每组制备三个生物学重复的样品,其中Mannitol(甘露醇)取样时间为12h、24h、48h,其余胁迫的取样时间为3h、6h、12h。取没经过胁迫处理甘蔗叶片作为对照组。
提取上述材料的总RNA,通过反转录得到cDNA,以上述所示的DNA分子为引物,进行实时定量荧光PCR,结果如图1、图2所示。
图1结果表明不同干旱条件均能诱导SsJMJ1的表达。不同程度干旱胁迫下,SsJMJ1则随着干旱程度变重而表达量变高,在重度干旱时SsJMJ1的表达量为对照组的10.2倍(图1A);由文献已知栽培种的抗旱能力为:中蔗9号>中蔗6号>中蔗1号>ROC22。RT-qPCR结果表明,当四个甘蔗栽培种受干旱胁迫时,SsJMJ1的表达量为中蔗1号>ROC22>中蔗6号>中蔗9号,与四个品种的抗旱性成大致相反的结果(图1B)。
图2结果表明在ABA胁迫下SsJMJ1的转录受到抑制。4℃、38℃、100mM MeJA、100mM甘露醇、200mM NaCl和30%PEG6000均能诱导SsJMJ1的表达。其中在热胁迫3h时达到最高值,为对照值的1.4倍;在NaCl与PEG6000胁迫的第六个小时达到最高值,分别为对照组的1.3倍和2.7倍;在受到4℃、100mM MeJA与100mM Mannitol的胁迫时随着受胁迫时间变长而表达量变高,其中受甘露醇胁迫48h后表达量大幅增加,达到了对照组的7.3倍,而冷胁迫也在12h时表达量为对照组4.1倍。
实施例2、SSJMJ1基因的cDNA基因克隆
一、引物的设计和合成
根据SSJMJ1基因的CDS序列设计带有Gateway接头的引物,引物序列为:
正向引物:
5'-aaatcgactctagaaagcttATGCTGTATATTGGGATGCTCT-3'
反向引物:
5'-tgctcaccatggtaccAGCCAAGTCACTGTCCTCCTGG-3'
二、提取割手密SES208的总RNA,通过反转录得到cDNA,以cDNA为模板,以上述所示的DNA分子为引物,进行PCR扩增,得到PCR扩增产物(如SEQ ID No.1所示),SSJMJ1基因的cDNA序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第43位至第1704位核苷酸所示,SSJMJ1蛋白序列如SEQ ID No.2所示。
三、鉴定阳性克隆后再利用Gateway克隆表达试剂盒(EZ-Flex SeamlessAssembly and Cloning Kit)与pSUPER:eGFP载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为pSUPER-SSJMJ1-eGFP,将pSUPER-SSJMJ1-eGFP送测序,结果正确(图3)。
实施例3、SSJMJ1基因的亚细胞定位及组织特异性表达
一、SsJMJ1烟草亚细胞定位与蛋白表达
将实施例1得到的转化入GV3101农杆菌中,采用农杆菌侵染的方法将pSUPER-SSJMJ1-eGFP质粒转入本氏烟草,以转入pSUPER:eGFP空载质粒作为对照,取48h后的过烟草叶片进行DAPI染色,并在激光共聚焦显微镜下观察,结果如图4A所示,从左到右依次为pSUPER:SsJMJ1-eGFP绿色荧光、核定位信号、明场图片以及前三者的融合效果。标记的红色箭头、黄色箭头和蓝色箭头分别表示细胞膜、细胞核和细胞质。
SsJMJ1蛋白表达。用转染有pSUPER:SsJMJ1-eGFP质粒以及pSUPER:eGFP空载体根癌农杆菌的烟草叶片进行了SsJMJ1的蛋白表达检测,使用anti-GFP检测本氏烟草、pSUPER:eGFP和pSUPER:SsJMJ1-eGFP的蛋白表达水平,H3组蛋白为内参蛋白。结果如图4B所示。
二、SsJMJ1甘蔗原生质体亚细胞定位与组织特异性表达
分别转化pSUPER:SsJMJ1-eGFP质粒以及pSUPER:eGFP空载体到SES208割手密幼茎组织的原生质体当中,在激光共聚焦显微镜下观察,结果如图4C所示。从左到右依次为GFP荧光信号、细胞核定位标记物、明场以及混合图片。mCherry-ARF191V是一种具有RFP信号的细胞核定位标记物。图片标尺为10μm。
SsJMJ1的组织特异性表达。取经过干旱的SES208的根、茎、叶以及叶鞘,分别提取总RNA,通过反转录得到cDNA,以实施例2所示的DNA分子为引物,进行实时定量荧光PCR,以叶的表达作为参考,eEF为内参基因,结果如图4D所示。
图4结果表明,SsJMJ1主要在细胞核中表达,SsJMJ1的蛋白能完整的表达,SsJMJ1主要在甘蔗的叶鞘中表达。
实施例4、SSJMJ1对植株抗旱性的影响
一、基因过表达植株的获得
将实施例1得到的转化入GV3101农杆菌中,采用农杆菌侵染的方法将pSUPER-SSJMJ1-eGFP质粒转入Col-0,以转入pSUPER:eGFP空载质粒作为对照,将转染后的植株在含30mg/L潮霉素的1/2MS培养基上筛选,得到具有潮霉素抗性的纯合阳性植株,将得到的转基因植株分别进行DNA检测、定量检测、蛋白表达检测与荧光信号检测。
转基因株系与转入空载拟南芥中的SSJMJ1基因的表达量如图5所示,其中#7与#14与野生型拟南芥相比表达量最高且蛋白条带最明显,且在荧光显微镜下都具有eGFP荧光信号,因此选取#7与#14进行后续抗旱表型分析,UBC基因作为内参,保证cDNA的起始用量一致。
二、SSJMJ1过表达植株的抗旱表型分析
转基因株系#7与#14和转入空载质粒的拟南芥在1/2MS固体培养基上培养,一周后移苗至土壤中生长,比较抗旱性,结果如图6A所示。
结果表明,与转入空载拟南芥相比,SSJMJ1基因过表达使转基因株系#7与#14比转空载拟南芥更抗旱,复水后存活率更高(图6B),说明SSJMJ1基因能提高植物抗旱性。
三、SSJMJ1基因过表达对转基因株系离体叶片失水的影响
转基因拟南芥#7与#14和空载拟南芥在土中生长2周后,剪取同样重量的莲座叶,进行离体叶片失水实验,失水速率结果如图6C所示。
图6表明,SSJMJ1基因过表达能提高植株的抗旱性及降低离体叶片失水速率。
综上所述,本发明通过分析具有较强抗旱特性的甘蔗野生种割手密发现,干旱胁迫下甘蔗多种组蛋白修饰发生显著变化,并且组蛋白去甲基化酶基因SsJMJ1在干旱胁迫下表达水平发生显著变化,通过体外和体内验证表明,提高SsJMJ1基因表达可增强植物耐旱性。由此可见,在具有较强抗旱性的甘蔗材料分离的SsJMJ1基因可作为提高植物抗旱的重要基因资源,具有作物抗旱育种应用潜力。
本发明中披露的说明和实践,对于本技术领域的普通技术人员来说,都是易于思考和理解的,且在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进,也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种SsJMJ1基因在提高拟南芥抗旱性中的应用,其特征在于,
所述SsJMJ1基因为割手密的SsJMJ1基因;
所述SsJMJ1基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示;
所述SsJMJ1基因所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种提高拟南芥抗旱能力的方法,其特征在于,使权利要求1所述SsJMJ1基因在拟南芥中高表达,具体方法是:将含有权利要求1所述SsJMJ1基因的重组表达载体导入拟南芥中;
所述重组表达载体具体是:将权利要求1所述SsJMJ1基因的cDNA序列插入pSUPER:eGFP的克隆位点得到的。
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CN115820915B (zh) * 2022-11-30 2024-10-22 福建农林大学 甘蔗割手密种非生物胁迫条件下的荧光定量内参基因的筛选和应用
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