CN114940998A - 一种玉米转录因子ZmEREB92及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供本发明提供一种玉米转录因子ZmEREB92及应用。该玉米转录因子ZmEREB92基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供一种CRISPR/Cas9介导的ZmEREB92敲除突变体玉米植株的制备方法，包括如下步骤：（1）构建含有ZmEREB92基因的表达载体；（2）将表达载体转化DH5α感受态细胞后培养获得单克隆菌株；（3）将单克隆菌株转入农杆菌，然后以玉米幼胚为材料，通过农杆菌介导的玉米幼胚进行遗传转化。本发明提供了ZmEREB92基因能够调控玉米种子萌发，进而采用转基因技术开发了CRISPR/Cas9介导的ZmEREB92敲除突变体玉米植株的制备方法，对解析玉米调控种子萌发机制，选育高活力玉米品种具有十分重要的意义。

Description

一种玉米转录因子ZmEREB92及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种玉米转录因子ZmEREB92及应用。

背景技术

玉米是一年生禾本科的草本植物，原产于中美洲和南美洲，是世界重要的粮食作物与饲料作物，也是我国十分重要的农产品，涉及食品加工、饲料加工、农产品深加工等多个产业，玉米的高产稳产对维护我国粮食安全有重大意义。然而，过去十几年间，我国玉米供求关系，已经从产大于需转变为产不足需，出现玉米常态化缺口。其原因主要是我国玉米产量与玉米品质都有待提高。与发达国家的优质玉米品种相比，我国玉米品种的发芽率以及种子活力偏低，难以适应大规模机械化作业。

种子能否良好的萌发决定了植物的命运，农业生产中，高活力的种子也是保证高产的一大要素，因此，挖掘调控玉米种子萌发的基因并解析其调控机制，对提升我国玉米种子质量，保障我国粮食安全具有重要意义。

转录调控是植物调控自身各种生命活动的重要分子机制，转录因子是转录调控的核心调节因子，可以通过结合下游靶基因的启动子激活或抑制其基因表达，从而调控植物生命活动的各个进程。AP2/ERF 转录因子家族是植物最大转录因子家族之一，在调控植物的生长发育、响应逆境胁迫方面都起到非常重要的作用（Allen M D,YamasakiK,Ohme-Takagi M et al. A novel mode of DNA recognition by a beta-sheet revealed bythe solution structure of the GCC-box binding domain in complex with DNA. The EMBO journal, 1998,17(18):5484-5496.）。AP2/ERF 转录因子可能也在调控种子萌发方面发挥重要作用。AP2结构域可能在精确调控ABA/GA平衡中发挥重要作用(Shu Kai,LiuXiao-Dong,Xie Qi et al. Two Faces of One Seed: Hormonal Regulation ofDormancy and Germination .Mol Plant, 2016, 9: 34-45.)，例如，AtABI4、SbABI4、OsAP2-39、AtCHOTTO1等AP2家族的转录因子均被报道通过调节GA\ABA平衡而调控种子萌发（Shu K, Zhang H, Wang S, et al. ABI4 Regulates Primary Seed Dormancy byRegulating the Biogenesis of Abscisic Acid and Gibberellins inArabidopsis.PLoS Genetics, 2013, 9: e1003577；Belmonte Mark F,Kirkbride RyanC,Stone Sandra L et al. Comprehensive developmental profiles of gene activityin regions and subregions of the Arabidopsis seed.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013,110(5):E435-E444；Yamagishi Kazutoshi,TatematsuKiyoshi,Yano Ryoichi et al. CHOTTO1, a doubleAP2 domain protein of Arabidopsis thaliana, regulates germination andseedling growth under excess supply of glucose and nitrate.Plant cell physiology, 2009,50(2):330-340；Yaish Mahmoud W,El-KereamyAshraf,Zhu Tong etal. The APETALA-2-like transcription factor OsAP2-39 controls keyinteractions between abscisic acid and gibberellin in rice. PLoS genetics,2010,6(9):e1001098）。但是，在玉米中，种子萌发的研究尚不够深入，调控玉米种子萌发的转录因子也少见报道。因此，有必要挖掘调控玉米种子萌发的转录因子，为选育具有高活力种子的玉米品种奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题和缺陷，本发明提供一种玉米转录因子ZmEREB92及应用。本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种玉米转录因子ZmEREB92基因，所述玉米转录因子ZmEREB92基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供一种玉米转录因子ZmEREB92蛋白，所述玉米转录因子ZmEREB92蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该蛋白具有DNA结合结构域AP2，且AP2位于氨基酸N端34到97区域内。

第三方面，本发明提供含有所述玉米转录因子ZmEREB92基因的重组表达载体。

第四方面，本发明提供一种含有所述重组表达载体的重组菌株。

第五方面，本发明提供上述玉米转录因子ZmEREB92基因、上述重组菌株在调控玉米种子萌发上的应用。

进一步地，所述玉米转录因子ZmEREB92基因通过乙烯途径调控玉米种子萌发。

第六方面，本发明提供一种CRISPR/Cas9 介导的 ZmEREB92 敲除突变体玉米植株的制备方法，包括如下步骤：

（1）构建含有ZmEREB92基因的表达载体；

（2）将表达载体转化DH5α感受态细胞后培养获得单克隆菌株；

（3）将单克隆菌株转入农杆菌，然后以玉米幼胚为材料，通过农杆菌介导的玉米幼胚进行遗传转化，即得。

进一步地，所述步骤（1）具体包括：

（1-1）在 ZmEREB92基因的N末端和 ERF 结构域内选择了两个引guide-RNA 靶向位点：EREB92-Target1和EREB92-Target2，以在该区域产生 144bp 的缺失；然后以过渡载体pSG-MU6载体为模板进行PCR扩增，引物为P200006-F和P200006-R，获得PCR产物后进行原液回收；所述EREB92-Target1的序列结构如SEQ ID NO.3所示，具体为：GAGAACGTCAGAGAAAACCATGG；所述EREB92-Target2的序列结构如SEQ ID NO.4所示，具体为：CGACCCGGCGAAGAAGAGCCGGG；所述P200006-F的序列结构如SEQ ID NO.5所示，具体为：CAATGGTCTCAATTGGAGAACGTCAGAGAAAACCATGG-GTTTTAGAGCTAGAAATA；所述P200006-R的序列结构如SEQ ID NO.6所示，具体为：TTGGGGTCTCTAAACGAGAACGTCAGAGAAAACCATGG-CAATTCGGTGCTTGCGGCT；

（1-2）将回收产物和转基因载体pCXB053分别使用bsal酶进行酶切，回收二者的酶切产物，并通过T4连接酶连接，获得含有ZmEREB92基因的表达载体。

进一步地，所述步骤（3）具体包括：

（2-1）将单克隆菌株通过电击法转入农杆菌中，得到农杆菌悬浮液；

（2-2）以玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚加入至农杆菌悬浮液中处理一段时间；之后吸去农杆菌悬浮液，加入农杆菌悬浮液放置一段时间，再加入共培养基于23℃黑暗共培养3天；

（2-3）共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天，放至含双丙氨膦的筛选培养基上，开始筛选培养两周，获得抗性愈伤组织；

（2-4）将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，于25℃、5000lx、光照条件下培养3周，获得分化小苗；

（2-5）将分化小苗转移至生根培养基上，于25℃、5000lx、光照条件下培养直到生根；再将小苗转入穴盘生长，随后移植到大田生长，收获后得到T1代ereb92突变体玉米；

（2-6）将T1代ereb92突变体玉米遗传到T3代，即得。

第七方面，本发明提供上述CRISPR/Cas9 介导的 ZmEREB92 敲除突变体玉米植株的制备方法获得的玉米植株在玉米种子萌发中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种玉米转录因子ZmEREB92基因，能够调控玉米种子萌发。进而采用转基因技术开发了一种CRISPR/Cas9 介导的 ZmEREB92 敲除突变体玉米植株的制备方法，对解析玉米调控种子萌发机制，选育高活力玉米品种具有十分重要的意义。

附图说明

此处所说明的附图是用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例以及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明实施例1中pMD19-ZmEREB92的载体图谱。

图2是本发明实施例2中pSG-MU6、pCXB053-ZmEREB92的载体图谱，其中图A表示pSG-MU6的载体图谱，图B表示pCXB053-ZmEREB92的载体图谱。

图3是本发明实施例3中玉米转录因子ZmEREB92调控种子萌发示意图，图中KN5585:该基因CRISPR/Cas9突变体的野生型；ereb92-2/6：ZmEREB92的CRISPR/Cas9介导的两个稳定的T4代突变体株系；其中，A代表种子萌发第7天ereb92-2/6突变体以及野生型的萌发表型；B代表ereb92-2/6突变体以及野生型种子萌发1-7天的发芽率统计。

图4是本发明实施例3中玉米转录因子ZmEREB92部分通过赤霉素途径调控种子萌发示意图，图中KN5585:该基因CRISPR/Cas9突变体的野生型；ereb92，ZmEREB92基因的CRISPR/Cas9介导的敲除突变体株系；其中，A代表200mg/L多效唑处理下种子萌发第4天ereb92突变体以及野生型的生长表型；B代表正常条件以及200mg/L多效唑处理下ereb92突变体以及野生型萌发1-3天的发芽率统计；C代表在正常条件以及100mg/L多效唑处理下萌发1-3天的突变体与野生型之间发芽率差异量的统计。

图5是本发明实施例3中玉米转录因子ZmEREB92主要通过乙烯途径调控种子萌发示意图，图中KN5585:该基因CRISPR/Cas9突变体的野生型；ereb92，ZmEREB92基因的CRISPR/Cas9介导的敲除突变体株系；其中，A代表200mg/L1-MCP处理下种子萌发第4天ereb92突变体以及野生型的生长表型；B代表正常条件以及200mg/L1-MCP处理下ereb92突变体以及野生型萌发1-3天的发芽率统计；C代表在正常条件以及200mg/L1-MCP处理下萌发1-3天的突变体与野生型之间发芽率差异量的统计。

图6是本发明实施例3中玉米转录因子ZmEREB92部分通过脱落酸途径调控种子萌发示意图，图中KN5585:该基因CRISPR/Cas9突变体的野生型；ereb92，ZmEREB92基因的CRISPR/Cas9介导的敲除突变体株系；其中，A代表50µM ABA处理下种子萌发第4天ereb92- 2/6突变体以及野生型的生长表型；B代表正常条件以及50µM ABA处理下ereb92-2/6突变体以及野生型萌发1-3天的发芽率统计；C代表在正常条件以及50µM ABA处理下萌发1-3天的突变体与野生型之间发芽率差异量的统计。

图7是本发明实施例4中玉米转录因子ZmEREB92通过乙烯途径调控种子萌发前期胚的发育示意图，图中KN5585:该基因CRISPR/Cas9突变体的野生型；ereb92，ZmEREB92基因的CRISPR/Cas9介导的敲除突变体株系；其中，A代表正常条件下ereb92突变体及野生型种子吸胀0h、6h、24h、36h胚的切面观察图，B代表正常条件下ereb92突变体及野生型种子吸胀0h、6h、24h、36h胚的大小（胚的切面面积占种子切面总面积的比例）统计；C代表200mg/L1-MCP处理下ereb92突变体及野生型种子吸胀6h、24h、36h胚的切面观察图；D代表代表200mg/L1-MCP处理下ereb92突变体及野生型种子吸胀6h、24h、36h胚的大小（胚的切面面积占种子切面总面积的比例）统计。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

以下实施例中未做具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或按试剂盒和产品说明书进行。

实施例1

ZmEREB92基因的克隆

1）在网站phytozome V13（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）下载玉米转录因子ZmEREB92的完整CDS序列，设计特异引物进行克隆，其中，上游引物序列结构如SEQID NO.7所示，具体为：5’-CCGCAAAACAAAGGAAACGAA-3’；下游引物序列结构如SEQ ID NO.8所示，具体为：5’- TAGTACCGAATTTTCCTCGAGA-3’。

2）基因克隆使用市售玉米自交系Mo17幼苗，玉米种子播种前均使用1%过氧化氢溶液催芽6h，播种于湿润的营养土中，培养温度为28℃，光照条件为16h光照/8h黑暗，生长至第三叶完全展开后，使用禾谷镰刀菌（市售菌株）侵染其叶片，24h后，收集侵染部位叶片样品，液氮速冻，研磨粉碎后使用TRNzol试剂(Tiangen)提取RNA。并反转录为cDNA，以此为模板，使用特异引物，其中，上游引物序列结构如SEQ ID NO.9所示，具体为F：5’-CCGCAAAACAAAGGAAACGAA-3’；其中，下游引物序列结构如SEQ ID NO.10所示，具体为：5’-TAGTACCGAATTTTCCTCGAGA-3’，进行克隆，获得ZmEREB92基因片段大小为702bp，其CDS序列如SEQ ID NO.1所示，此转录因子源自于玉米Mo17，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共由234个氨基酸（*代表终止密码子）残基组成，是AP2/ERF家族转录因子中的ERF亚家族转录因子。其DNA结合结构域（AP2）位于氨基酸N端34到97区域内。

3）将ZmEREB92基因片段重组到载体pMD19-T上载体图谱如图一所示，通过蓝白斑筛选、阳性克隆酶切检测和基因测序，得到重组质粒pMD19- ZmEREB92。其载体图谱如图1所示。

实施例2

ZmEREB92-CRISPR/Cas9突变体玉米植株的构建

具体方法如下：

1）为了在玉米中获得 CRISPR/Cas9 介导的 ZmEREB92 敲除突变体玉米，在ZmEREB92的N末端和 ERF 结构域内选择了两个引guide-RNA 靶向位点，（EREB92-Target1GAGAACGTCAGAGAAAACCATGG，如SEQ ID NO.3所示；EREB92-Target2CGACCCGGCGAAGAAGAGCCGGG，如SEQ ID NO.4所示）以在该区域产生 144bp 的缺失。用过渡载体pSG-MU6载体（载体图谱如图2 A所示）做模板进行PCR扩增，引物为P200006-F：CAATGGTCTCAATTG-EREB92-Target1-GTTTTAGAGCTAGAAATA，如SEQ ID NO.5所示；P200006-R：TTGGGGTCTCTAAAC-EREB92-Target2-CAATTCGGTGCTTGCGGCT，如SEQ ID NO.6所示，获得PCR产物后，取3ul点胶看条带是否正确，正确大小650bp左右，即对原液回收，使用PCR凝胶回收试剂盒。

2）随后对回收产物使用bsal酶进行酶切，同样对转基因载体pCXB053（载体图谱如图2 B所示）使用bsal酶进行酶切，使用PCR凝胶回收试剂盒回收二者酶切产物，使用T4连接酶进行连接，随后转化DH5α感受态细胞，长出菌落挑取单克隆，进行菌落PCR以及提取质粒进行基因测序,测序正确后，将测序正确的质粒通过电击法转入农杆菌EHA105 中，PCR 进行鉴定。以新鲜剥离的1mm 左右的玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL农杆菌悬浮液的2 mL 塑料离心管中，30 min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0 mL农杆菌悬浮液，放置5 min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基（市售产品）上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基（市售产品）中，于28℃黑暗培养6天后，放至含双丙氨膦的筛选培养基（市售产品）上，开始筛选培养两周，然后新的筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基（市售产品）中， 25℃，5000lx，光照培养3周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上， 25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入穴盘生长，随后移植到大田生长，收获后即为T1代ereb92突变体玉米，稳定遗传到T3代后及可进行后续的种子萌发实验。

实施例3

ereb92突变体玉米种子萌发试验

具体方法如下：

1）精选均一饱满健康的野生型和ereb92突变体玉米种子，先经浓度为75%的酒精浸泡5min后，再用NaClO（次氯酸钠）溶液浸泡消毒20 min，用去离子水反复冲洗3~4次，直到无明显次氯酸钠气味。

2）然后种子均匀地分别播种于铺有发芽纸的发芽盒中，每个发芽盒加蒸馏水7mL，每盒播种30粒为一个重复，每处理均设3-5个重复。将种子置于光照培养箱中恒温28℃，光照强度为1000Lux，相对湿度95%，光照8h黑暗14h。

3）在玉米种子萌发期间，每天观察记录萌发种子数。拍照记录，并统计其发芽率。结果表明，如图3所示与野生型相比，ereb92突变体玉米种子萌发显著更快，表明ZmEREB92确实调控种子萌发。

4）为了研究ZmEREB92是否通过激素途径调控种子萌发，分别在发芽试验中使用多种激素/激素抑制剂处理包括ABA（50µM）、GA抑制剂多效唑（200mg/mL）、ET受体抑制剂1-MCP（200mg/L），结果表明，如图4、5、6所示，三种激素/激素抑制剂使用后，ereb92与野生型之间萌发率的差异均有显著的缩小，其中使用乙烯抑制剂1-MCP（200mg/L）后，ereb92与野生型之间萌发率的差异均有显著的缩小幅度最大，表明ZmEREB92可通过乙烯途径调控种子萌发

实施例4

ereb92突变体玉米种子胚部切面观察试验

具体方法如下：

1）精选均一饱满健康的野生型和ereb92突变体玉米种子，先经浓度为75%的酒精浸泡5min后，再用NaClO（次氯酸钠）溶液浸泡消毒20 min，用去离子水反复冲洗3~4次，直到无明显次氯酸钠气味。

2）然后种子均匀地分别播种于铺有发芽纸的发芽盒中，每个发芽盒加蒸馏水7mL，将种子置于光照培养箱中恒温28℃，光照强度为1000Lux，相对湿度95%，光照8h黑暗14h。然后，分别取吸胀后0h、6h、24h、48h种子，用解剖刀沿着种子胚部正中纵切，在体式显微镜下观察并拍照。结果表明，如图7 A、B所示ereb92突变体玉米种子胚的吸胀膨大更快，具有更高的活力。这说明ZmEREB92同样调控种子萌发初期胚的发育。

4）为了研究ZmEREB92是否同样通过乙烯途径调控胚的发育，使用200mg/L的1-MCP溶液代替蒸馏水处理种子吸胀过程，同样取吸胀后0h、6h、24h、48h种子，用解剖刀沿着种子胚部正中纵切，在体式显微镜下观察并拍照。发现1-MCP处理后，如图7 C、D所示，发现ereb92突变体与野生型之间胚的大小差异消失，表明ZmEREB92是同样通过乙烯途径调控胚的发育。

综上所述，本发明提供了ZmEREB92基因能够调控玉米种子萌发，并且采用转基因技术开发的CRISPR/Cas9 介导的 ZmEREB92 敲除突变体玉米植株技术对解析玉米调控种子萌发机制，选育高活力玉米品种具有十分重要的意义。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种玉米转录因子ZmEREB92及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> ZmEREB92基因(Zea mays)

<400> 1

atggcgccga gaacgtcaga gaaaaccatg gcaccggcgg cggccgctgc cacggggctc 60

gcgctcagcg tcggcggcgg cggcggggcc ggcggcccgc actacagagg cgtgaggaag 120

cggccgtggg gccggtacgc ggcggagatc cgcgacccgg cgaagaagag ccgggtgtgg 180

ctcggcacct acgacacggc cgaggacgcc gcgcgggcct acgacgccgc cgcgcgcgag 240

taccgcggcg ccaaggccaa gaccaacttc ccttacccct cgtgcgtgcc cctctccgca 300

gccggttgcc ggagcagcaa cagcagcacc gtcgagtcct tcagcagcga cgcgcaggcg 360

cccatgcagg ccatgccgct cccgccgtcg ctcgagctgg acctgttcca ccgcgcggcg 420

gccgcggcca cgggcacggg cgctgccgcc gtacgcttcc ctttcggcag catccccgtt 480

acgcacccgt actacttctt cgggcaggcc gcagccgcag ccgcggaagc agggtgccgt 540

gtgctcaagc tggcgccggc ggtcaccgtg gcgcagagcg actccgactg ttcgtcggta 600

gtggatctgt cgccgtcgcc accggccgct gtgtcggcga ggaagcccgc cgcgttcgat 660

ctcgacctga actgctcacc gccgacggag gcggaagcct ag 702

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> ZmEREB92基因的编码蛋白(Zea mays)

<400> 2

Met Ala Pro Arg Thr Ser Glu Lys Thr Met Ala Pro Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Val Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Pro His Tyr Arg Gly Val Arg Lys Arg Pro Trp Gly Arg Tyr Ala Ala

35 40 45

Glu Ile Arg Asp Pro Ala Lys Lys Ser Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr

50 55 60

Asp Thr Ala Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Ala Ala Arg Glu

65 70 75 80

Tyr Arg Gly Ala Lys Ala Lys Thr Asn Phe Pro Tyr Pro Ser Cys Val

85 90 95

Pro Leu Ser Ala Ala Gly Cys Arg Ser Ser Asn Ser Ser Thr Val Glu

100 105 110

Ser Phe Ser Ser Asp Ala Gln Ala Pro Met Gln Ala Met Pro Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Leu Glu Leu Asp Leu Phe His Arg Ala Ala Ala Ala Ala Thr

130 135 140

Gly Thr Gly Ala Ala Ala Val Arg Phe Pro Phe Gly Ser Ile Pro Val

145 150 155 160

Thr His Pro Tyr Tyr Phe Phe Gly Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu

165 170 175

Ala Gly Cys Arg Val Leu Lys Leu Ala Pro Ala Val Thr Val Ala Gln

180 185 190

Ser Asp Ser Asp Cys Ser Ser Val Val Asp Leu Ser Pro Ser Pro Pro

195 200 205

Ala Ala Val Ser Ala Arg Lys Pro Ala Ala Phe Asp Leu Asp Leu Asn

210 215 220

Cys Ser Pro Pro Thr Glu Ala Glu Ala

225 230

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaacgtca gagaaaacca tgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgacccggcg aagaagagcc ggg 23

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caatggtctc aattggagaa cgtcagagaa aaccatgggt tttagagcta gaaata 56

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggggtctc taaacgagaa cgtcagagaa aaccatggca attcggtgct tgcggct 57

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgcaaaaca aaggaaacga a 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagtaccgaa ttttcctcga ga 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgcaaaaca aaggaaacga a 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tagtaccgaa ttttcctcga ga 22

Claims (10)

1.一种玉米转录因子ZmEREB92基因，其特征在于：所述玉米转录因子ZmEREB92基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种玉米转录因子ZmEREB92蛋白，其特征在于：所述玉米转录因子ZmEREB92蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该蛋白具有DNA结合结构域AP2，且AP2位于氨基酸N端34到97区域内。

3.含有权利要求1所述的玉米转录因子ZmEREB92基因的重组表达载体。

4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组菌株。

5.权利要求1所述的玉米转录因子ZmEREB92基因或者权利要求4所述的重组菌株在调控玉米种子萌发上的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述玉米转录因子ZmEREB92基因通过乙烯途径调控玉米种子萌发。

7.一种CRISPR/Cas9 介导的 ZmEREB92 敲除突变体玉米植株的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）构建含有ZmEREB92基因的表达载体；

（2）将表达载体转化DH5α感受态细胞后培养获得单克隆菌株；

（3）将单克隆菌株转入农杆菌，然后以玉米幼胚为材料，通过农杆菌介导的玉米幼胚进行遗传转化，即得。

8.根据权利要求7所述的一种CRISPR/Cas9 介导的 ZmEREB92 敲除突变体玉米植株的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）具体包括：

（1-1）在 ZmEREB92基因的N末端和 ERF 结构域内选择了两个引guide-RNA 靶向位点：EREB92-Target1和EREB92-Target2，以在该区域产生 144bp 的缺失；然后以过渡载体pSG-MU6载体为模板进行PCR扩增，引物为P200006-F和P200006-R，获得PCR产物后进行原液回收；所述EREB92-Target1的序列结构如SEQ ID NO.3所示，所述EREB92-Target2的序列结构如SEQ ID NO.4所示，所述P200006-F的序列结构如SEQ ID NO.5所示，所述P200006-R的序列结构如SEQ ID NO.6所示；

（1-2）将回收产物和转基因载体pCXB053分别使用bsal酶进行酶切，回收二者的酶切产物，并通过T4连接酶连接，获得含有ZmEREB92基因的表达载体。

9.根据权利要求7所述的一种CRISPR/Cas9 介导的 ZmEREB92 敲除突变体玉米植株的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）具体包括：

（2-1）将单克隆菌株通过电击法转入农杆菌中，得到农杆菌悬浮液；

（2-2）以玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚加入至农杆菌悬浮液中处理一段时间；之后吸去农杆菌悬浮液，加入农杆菌悬浮液放置一段时间，再加入共培养基于23℃黑暗共培养3天；

（2-3）共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天，放至含双丙氨膦的筛选培养基上，开始筛选培养两周，获得抗性愈伤组织；

（2-4）将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，于25℃、5000lx、光照条件下培养3周，获得分化小苗；

（2-5）将分化小苗转移至生根培养基上，于25℃、5000lx、光照条件下培养直到生根；再将小苗转入穴盘生长，随后移植到大田生长，收获后得到T1代ereb92突变体玉米；

（2-6）将T1代ereb92突变体玉米遗传到T3代，即得。

10.权利要求7~9任意一项所述的制备方法获得的玉米植株在玉米种子萌发中的应用。

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