CN113151307A

CN113151307A - 一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用

Info

Publication number: CN113151307A
Application number: CN202110656111.8A
Authority: CN
Inventors: 许力; 杨文武; 徐兴阳; 高茜; 米其利; 许�永; 刘欣; 蒋佳芮; 向海英; 曾婉俐; 李雪梅; 邓乐乐; 张建铎
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113151307B

Abstract

本发明涉及一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用，其核苷酸序列如SEQ I D NO.1所示。本发明提供的烟草乙烯响应转录因子相关的基因NtERF010，利用CR I SPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtERF010基因获得在抗逆胁迫下表达量降低的基因编辑植株；在干旱胁迫与盐胁迫条件下，基因编辑植株的长势弱于对照植株，为烟草乙烯响应转录因子研究及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。

Description

一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用。

背景技术

植物乙烯响应转录因子是属于一个庞大的基因家族,乙烯响应转录因子(ERF)具有由大约60-70个氨基酸组成的能够与DNA特异结合的保守结构域，具备AP2/ERF超家族所有成员的典型特征。乙烯响应转录因子(ERF)是乙烯信号途径的关键成分，被认为是植物特有的转录因子。在植物的抗性响应中，大量的转录因子家族参与了防御基因的表达调控，是与植物抗逆相关的转录因子，该因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。在农业生产中，鉴定和利用关键的转录因子对提高作物的病原抗性意义重大。由于乙烯响应转录因子在植物中的生理重要作用，已成为广泛的生化和分子生物学研究的主题。

乙烯响应转录因子参与多种生物学过程,包括植物生长、花发育、果实发育、种子发育、损伤、病菌防御、高盐、干旱等环境胁迫响应等。乙烯响应因子ERF在植物中的研究，水稻OsERF4a和OsERF10a的基因过表达提高了植株对干旱胁迫的耐性，并胁迫抗性相关基因的表达发生改变。玉米乙烯响应因子基因ZmEREB180能够增强渍害胁迫后植株的存活能力；玉米过表达株系根系系统发育显著增强，尤其是渍水胁迫后不定根的生长发育显著增强。甘蓝型油菜BnERF104基因在转基因拟南芥中的超表达提高了病原相关蛋白(PR)防御素PDF1.2和几丁质酶ChiB基因的表达量，显著增强了对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。

烟草作为我国重要的经济作物和模式作物，研究烟草乙烯响应转录因子基因响应非生物逆境胁迫的分子机制具有重要意义。在烟草乙烯响应转录因子基因克隆与功能研究方面，有研究者最近发现3个NtERF家族的转录因子NtERF1、NtERF32和NtERF121可直接结合NtPMT1a启动子上的GCC-box响应元件。烟草中过表达和基因沉默NtERF32分别上调和下调尼古丁的合成。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用，为研究烟草抗逆能力与基因功能提供遗传材料和理论依据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括1065bp个碱基，该基因来源于烟草(Nicotiana tabacum，命名为NtERF010)。

优选的，所述烟草乙烯响应转录因子相关的基因的编码蛋白，氨基酸序列如SEQID NO.2所示，包括354个氨基酸。

本发明还提供上述烟草乙烯响应转录因子的基因在烟草抗逆方面的应用。将该基因编辑后，烟草在种子萌发期与对照种子相比，对于盐胁迫更敏感，以及在四叶一心时期进行干旱胁迫处理，显示比对照植株对干旱更敏感。在干旱胁迫或盐胁迫条件下，NtERF010基因编辑植株的长势弱于对照植株。这为基因功能的研究将为烟草遗传改良提供遗传材料和理论依据。

本发明的有益效果是：

本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtERF010基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtERF010基因发生编辑的红花大金元植株。本发明通过在种子萌发苗期进行不同程度盐胁迫处理，发现NtERF010基因编辑植株的生长(地上部分、根长)均明显弱于对照(未转化)植株；在四叶一心的时期利用20％浓度PEG-6000模拟干旱处理编辑植株与对照植株，发现NtERF010基因编辑植株萎蔫而对照(未转化)植株较正常。

综上所述，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtERF010基因获得在抗逆胁迫下长势较弱的基因编辑植株，这为烟草乙烯响应转录因子研究及烟草抗逆性研究提供遗传材料和理论依据。

附图说明

图1A和图1B均为对照(未转化)植株和基因编辑植株萌发期在不同浓度盐胁迫处理条件下对比图，其中图1A为培养皿分布示意图，图1B为盐胁迫对照图；

图2为对照(未转化)植株叶片和基因编辑植株叶片在四叶一心时期，20％浓度PEG-6000模拟干旱处理下的对照图。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。

本申请中所使用的烟草品种为红花大金元，一种商品化烟草品种。

实施例1

本实施例主要就烟草乙烯响应转录因子相关的基因NtERF010的获得过程，简要介绍如下。

以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用：

按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。

1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：

Total RNA 1μg

Oligo(dT)(10μM) 1.5μL

ddH₂O up to 15μL

将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：

上述体系放入PCR仪中，42℃65min，65℃10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。

通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：

F：5’-ATGGCAGGAAATGGGGAAGC-3’，(SEQ ID No.3)

R：5’-TCAGTTATCTTCCTCGCAAC-3’；(SEQ ID No.4)

以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：

扩增体系(50μL)：

混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃2.5min，共30个循环；72℃10min；12℃Hold。

对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草乙烯响应转录因子相关的基因NtERF010序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，共包括1065bp个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，共包括354个氨基酸，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。

实施例2

利用实施例1中所获得烟草乙烯响应转录因子相关的基因NtERF010，本发明进一步构建了CRISPR/Cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。

选择NtERF010基因中较特异的23nt核苷酸序列(SEQ ID No.5)为CRISPR/Cas9的引导序列，并将该序列片段与CRISPR/Cas9载体(由西南大学提供)进行连接，获得转化的克隆子，进行PCR扩增检测，后将PCR阳性克隆送测序公司进行测序确认，最后得到CRISPR/Cas9-NtERF010编辑载体。

利用上一步所构建的CRISPR/Cas9-NtERF010编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化试验，以敲除植物体内的烟草乙烯响应转录因子相关的基因NtERF010，相关实验过程简要介绍如下。

将烟草种子点种于培养皿中，待长到4片子叶(15-20d)，便可将其移入培养瓶中(含80mL MS液体培养基)，每瓶2株，于25±1℃、光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d条件继续培养40d，备用。

取出-80℃保存的LBA4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。待感受态刚刚解冻时，加入含有编辑NtERF010基因的2μL质粒，轻轻弹混匀，置于冰上。后将混匀的液体转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1mL的YEB液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h。8,000rpm离心菌体弃掉上清培养基，然后用200μL的YEB液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d。

在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用MS液体制备含有CRISPR/Cas9-NtERF010编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液(OD₆₀₀＝0.6-0.8)。利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min。之后将叶盘置于含2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA的MS固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。之后进行继代培养，放置于含2.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+250mg/L Cb+50mg/L Kan的MS固体培养基上，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m²·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d，直至分化芽形成，每7-10d更换一次分化培养培养基，更换5-6次；培养至分化芽形成；将已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有500mg/L羧苄青霉素与50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件与分化培养条件一致，培养8-14d；再生植株生根培养，将分化芽切下，插入含有500mg/L羧苄青霉素与50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件与分化培养条件一致，培养7-10d，获得经LBA4404农杆菌介导转化NtERF010基因的再生植株，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得NtERF010基因编辑植株。

实施例3

利用实施例2中分子检测确定为NtERF010基因敲除植株，进行收种获得基因编辑素材。随后进行种子盐胁迫处理，选择NtERF010基因编辑烟草种子与对照(未转化)种子，选取饱满无明显缺陷的种子进行表面消毒，之后分别点种于MS培养基中进行培养；培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下，水平放置进行培养，并进行观察。

盐胁迫(100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L NaCl)处理培养基和MS培养基的制备。

待烟草种子生长约3-4d，待种子露白时选取同一时期种子(10-20颗)小心移至于步骤(2)中盐胁迫(100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L NaCl)处理培养基；培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养12-25d，垂直放置进行培养，并进行观察。放置MS培养基上露白的原因，以防止由于种子活力不同，发芽时间不一致。垂直放置培养，保证幼苗垂直向下，以便根长测量。

观察记录萌发状态、根长及根的状态、叶片大小及叶色等，初步确定烟草种子在萌发期的抗逆性。

同一培养皿中处理包括(对照)及基因编辑材料种子(结果如图1A和图1B所示)。

实施例4

利用实施例3中同一份NtERF010基因敲除素材种子，进行播种到漂浮育苗盘上。随后将幼苗移栽到花盆中进行生长，待幼苗生长至4叶一心时期进行干旱胁迫处理，选择NtERF010基因编辑烟草种子与对照(未转化)种子，选取饱满无明显缺陷的种子进行播种，放置于温室进行培养；

待播种后生长25-30d时，将其移栽至花盆中继续生长，待生长至四叶一心时期，进行20％浓度PEG-6000浇灌处理，每3d浇灌一次，15d后拍照记录植株的萎蔫程度。

结果表明，烟草乙烯响应转录因子相关的基因NtERF010在干旱胁迫条件下与对照植株相比表现为萎蔫(结果如图2所示)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因及其应用

<130> WPC211813

<141> 2021-06-11

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1065

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum(NtERF010)

<400> 1

atggcaggaa atggggaagc aagattaaag acaatagtag gtgtcacgaa caaccttcta 60

gattccatca acgaagccgt tagggaaatg caacgccaag tgctacacct gagggagata 120

ttcccccccc cccctccgca cgaaagcgtg actgtctcac gcgagaggga aacctcaaca 180

tccgcagccg gagaagcacc accggctgtg aaaaggctat tagaagagtg gtttacaaac 240

accttgagca acttactcga caaacccgct caaagggata tcggaggcac aatacacgta 300

gaaactacaa ctgacgccga tgagccagaa actccatgca caagtaacac tcatactgtc 360

attgatgcag gtaacgatgc acttacggcc atcttaaaga aaatggaaga aatggaaaat 420

gagaacaaaa cgctccttga tcagatgaag gagcatcagg aaagggtcga taaaatacct 480

agcgctccga agttgctacc aaaatgtgac gtaggccgat tcggtagatt ttcatcaata 540

cttatagagg ttcctttatt gggaaagaga aaaccaaaag gaggaattgt aattttgatg 600

gtttcgatga tggaaggaga aaagagaaag caaaggcaac accaacaaga taagccatat 660

agaggtataa ggatgaggaa gtggggtaaa tgggttgctg aaattagaga accaaataaa 720

aggtctcgaa tttggcttgg ttcttactct tcccctgttg ccgccgctcg agcttatgac 780

accgccgtat tttatctcag aggtcctacg gctaggctta atttccctga atgtatagtt 840

aatgatgacc gtgaacttca cgatctatct gctgcttcta ttcgcaaaaa agctactgaa 900

gttggtgcta gagttgatgc tttgcaaact gccgcccttc ataataattc gtctgcaggt 960

tctactgaat ccaacagtaa ttcaaatatt aacccgagaa gggttactat taagccggat 1020

ttgaatgaat atcctagccc tgaaagttgc gaggaagata actga 1065

<210> 2

<211> 354

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum(NtERF010)

<400> 2

Met Ala Gly Asn Gly Glu Ala Arg Leu Lys Thr Ile Val Gly Val Thr

1 5 10 15

Asn Asn Leu Leu Asp Ser Ile Asn Glu Ala Val Arg Glu Met Gln Arg

20 25 30

Gln Val Leu His Leu Arg Glu Ile Phe Pro Pro Pro Pro Pro His Glu

35 40 45

Ser Val Thr Val Ser Arg Glu Arg Glu Thr Ser Thr Ser Ala Ala Gly

50 55 60

Glu Ala Pro Pro Ala Val Lys Arg Leu Leu Glu Glu Trp Phe Thr Asn

65 70 75 80

Thr Leu Ser Asn Leu Leu Asp Lys Pro Ala Gln Arg Asp Ile Gly Gly

85 90 95

Thr Ile His Val Glu Thr Thr Thr Asp Ala Asp Glu Pro Glu Thr Pro

100 105 110

Cys Thr Ser Asn Thr His Thr Val Ile Asp Ala Gly Asn Asp Ala Leu

115 120 125

Thr Ala Ile Leu Lys Lys Met Glu Glu Met Glu Asn Glu Asn Lys Thr

130 135 140

Leu Leu Asp Gln Met Lys Glu His Gln Glu Arg Val Asp Lys Ile Pro

145 150 155 160

Ser Ala Pro Lys Leu Leu Pro Lys Cys Asp Val Gly Arg Phe Gly Arg

165 170 175

Phe Ser Ser Ile Leu Ile Glu Val Pro Leu Leu Gly Lys Arg Lys Pro

180 185 190

Lys Gly Gly Ile Val Ile Leu Met Val Ser Met Met Glu Gly Glu Lys

195 200 205

Arg Lys Gln Arg Gln His Gln Gln Asp Lys Pro Tyr Arg Gly Ile Arg

210 215 220

Met Arg Lys Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Lys

225 230 235 240

Arg Ser Arg Ile Trp Leu Gly Ser Tyr Ser Ser Pro Val Ala Ala Ala

245 250 255

Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Val Phe Tyr Leu Arg Gly Pro Thr Ala Arg

260 265 270

Leu Asn Phe Pro Glu Cys Ile Val Asn Asp Asp Arg Glu Leu His Asp

275 280 285

Leu Ser Ala Ala Ser Ile Arg Lys Lys Ala Thr Glu Val Gly Ala Arg

290 295 300

Val Asp Ala Leu Gln Thr Ala Ala Leu His Asn Asn Ser Ser Ala Gly

305 310 315 320

Ser Thr Glu Ser Asn Ser Asn Ser Asn Ile Asn Pro Arg Arg Val Thr

325 330 335

Ile Lys Pro Asp Leu Asn Glu Tyr Pro Ser Pro Glu Ser Cys Glu Glu

340 345 350

Asp Asn

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum(NtERF010)

<400> 3

atggcaggaa atggggaagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum(NtERF010)

<400> 4

tcagttatct tcctcgcaac 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum(NtERF010)

<400> 5

atctcagagg tcctacggct agg 23

Claims

1.一种烟草乙烯响应转录因子相关的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草乙烯响应转录因子相关的基因，其特征在于，所述烟草乙烯响应转录因子相关的基因的编码蛋白。

3.根据权利要求2所述的烟草乙烯响应转录因子相关的基因，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.上述权利要求1至3中任一项烟草乙烯响应转录因子相关的基因的应用，其特征在于，基因编辑烟草乙烯响应转录因子相关的基因获得的植株具有对干旱胁迫与盐胁迫的抗性。

5.根据权利要求4所述的烟草乙烯响应转录因子相关的基因的应用，其特征在于，基因编辑是通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除烟草乙烯响应转录因子相关的基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了烟草乙烯响应转录因子相关的基因发生编辑的烟草植株。

6.根据权利要求4所述的烟草乙烯响应转录因子相关的基因的应用，其特征在于，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，烟草乙烯响应转录因子相关的基因编辑植株的长势弱于对照植株。