CN110713529B - VvDUF642基因引起植物种子败育的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及VvDUF642的用途。本发明研究表明，表明VvDUF642基因在无核品种中持续高表达，而在有核品种中表达量无明显变化，该基因转化拟南芥以后引起拟南芥种子变形，转化番茄后引起番茄种子败育。该基因或蛋白可以用于种子败育葡萄品种的构建或筛选。

Description

VvDUF642基因引起植物种子败育的用途

技术领域

本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及VvDUF642的用途。

背景技术

葡萄(Vitis spp.)属于葡萄科葡萄属浆果，其果实可以广泛的应用于酿酒、鲜食、制汁、制干。葡萄果实因其酸甜适口，风味浓郁，营养丰富深受人们喜爱，其中天然无核葡萄因其栽培简易，易加工且食用方便而广受欢迎。在发达国家，超过50％消费的鲜食和制干葡萄为无核品种。葡萄天然无核形成途径分为单性结实型(Parthenocarpy)和种子败育型(Stenospermacarpy)，其中单性结实为授粉受精不良造成，主要出现有核品种果穗中偶见的无核果粒，而种子败育是葡萄正常受精后种子发生败育形成天然无核果实。种子败育是葡萄形成无核果实最稳定的途径，也是培育无核品种中需要保持的重要遗传特性。通过现代分子生物学方法研究葡萄无核形成的分子机理和遗传规律，可以提高培育无核葡萄新品种的效率。

对于葡萄无核形成的遗传机制，科学家进行了广泛的研究，借助现代分子生物学的研究手段，获得了较好的进展。葡萄为闭花受粉植物，开花时就已经完成了受精，因此研究葡萄种子发育过程往往从花前开始。Michael Striem教授根据葡萄种子的发育绘制了葡萄种子的败育过程，以受精为核心，分为胚珠期(花前)，受精期(开花)，种皮发育期(花后5-10天)，胚乳发育期(花后11-30天)，胚发育期(花后31-40天)，完成整个发育过程后形成正常的有核果实，如果种子败育就会留下残核或者种痕，形成无核果实。申请人利用切片对种子发育过程持续观察，完整的记录了种子的败育过程，结果表明无核葡萄品种的种子能够正常受精，但是因为种皮不能正常发育而产生败育，确定了种皮发育期为败育的关键期。在葡萄栽培生产中，有些品种如‘阳光玫瑰’可以利用赤霉酸(GA)处理花后果穗的方法获得无核果实，而处理的时间是花后5-7天(种皮发育期)，说明GA干扰正常种皮的发育可以引起种子败育。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供VvDUF642在种子败育方面的用途。

本发明提供了如下I)～V)中的任一项在诱导植物种子败育或变形中的应用；

I)、VvDUF642蛋白；

II)、在VvDUF642蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且与VvDUF642具有相同或相似功能的蛋白；

III)、编码I)或II)所述蛋白的核酸分子；

IV)、在III)的所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；

V)、能够提高I)～V)中的至少一种的水平或活性的物质。

本发明中，诱导植物种子败育或变形的物质为VvDUF642蛋白：

所述VvDUF642蛋白的编码核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明中，能够引起种子变形或败育的植物来自葡萄科、十字花科或茄科。一些实施例中，进行实验验证的植物为葡萄、拟南芥或番茄。

本发明实验表明，VvDUF642基因在无核品种中持续高表达，而在有核品种中表达量无明显变化，该基因转化拟南芥以后引起拟南芥种子变型，转化番茄后引起番茄种子败育。

本发明中还提供了一种引起植物种子败育或变形的制剂，包括如下i)～v)中的至少一种：

i)、VvDUF642蛋白或编码VvDUF642蛋白的核酸分子；

ii)、包含编码VvDUF642蛋白的核酸的表达载体；

iii)、含有ii)的重组宿主；

iv)、增强VvDUF642基因表达的启动子或增强子；

v)、促进VvDUF642基因表达的诱导剂。

本发明还提供了一种引起植物种子败育的方法，包括提高植物内源VvDUF642蛋白的水平和/或活性，或使不含有VvDUF642的植物表达VvDUF642蛋白。

在一些具体实施例中，所述使不含有VvDUF642的植物表达VvDUF642蛋白的方法包括：

构建包含编码VvDUF642蛋白的核酸的载体，转化入农杆菌；

以所述农杆菌感染植物种子或外植体。

本发明中，所述编码VvDUF642蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:1所示

所述表达载体的骨架载体为pCAMBIA1303，编码VvDUF642蛋白的核酸序列的插入位点为NcoⅠ和BstEⅡ。

所述重组宿主为农杆菌，具体为农杆菌LBA4404。

VvDUF642还可以作为无核葡萄筛选育种的标志物。

因此，本发明还提供了如下a)～d)中的任一项在无核葡萄筛选育种中的应用；

a)、VvDUF642蛋白的检测试剂；

b)、在VvDUF642蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且与VvDUF642具有相同或相似功能的蛋白的检测试剂；

c)、编码a)或b)所述蛋白的核酸分子的检测试剂；

d)、在c)的所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子的检测试剂。

一种筛选无核葡萄种质资源的制剂，其包括a)～d)中的至少一种：

a)、VvDUF642蛋白的检测试剂；

b)、在VvDUF642蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且与VvDUF642具有相同或相似功能的蛋白的检测试剂；

c)、编码a)或b)所述蛋白的核酸分子的检测试剂；

d)、在c)的所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子的检测试剂。

本发明所述检测包括表达量或活性水平的检测。

本发明实施例中，对VvDUF642蛋白表达水平的检测采用Western blot的方法；对VvDUF642基因转录水平的检测采用real-time PCR的方式。

一种筛选无核葡萄种质资源的方法，其包括：

检测葡萄种质的VvDUF642基因转录水平或检测VvDUF642蛋白的表达水平或活性。

所述检测的样本为葡萄的幼嫩叶片。

利用本发明所述的筛选方法，仅对葡萄的幼嫩叶片进行检测就可实现葡萄果实是否有核的预测，缩短育种周期。

本发明围绕种子败育的关键期，分离采集有核无核品种花后5-7天的种胚为核心试材，开展了转录组分析和蛋白表达分析。筛选到特异表达的蛋白60个，利用Western杂交技术进一步筛选后获得在无核葡萄中高表达的蛋白VvDUF642，转录组结果表明VvDUF642基因在无核品种中持续高表达，而在有核品种中表达量无明显变化，该基因转化拟南芥以后引起拟南芥种子变形，转化番茄后引起番茄种子败育。该基因或蛋白可以用于种子败育葡萄品种的构建或筛选。

附图说明

图1示DUF642基因转录水平的表达量，其中，CS为森田尼无核，GR为红地球；

图2示红地球和森田尼无核中DUF642的蛋白表达差异；

图3示有核和无核品种中DUF642的蛋白表达差异；

图4示DUF642基因转入拟南芥中引起拟南芥种子形状变小；

图5示DUF642基因转入拟南芥中引起拟南芥种子千粒重降低；

图6示DUF642基因在野生型拟南芥和DUF642转基因拟南芥中的表达量；

图7示DUF642基因在番茄中引起番茄种子败育，形成无核果实，果实体积降低；

图8示DUF642基因转入番茄中引起番茄平均果重降低；

图9示DUF642基因在野生型番茄和DUF642转基因番茄中的表达量。

具体实施方式

本发明提供了VvDUF642的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

所述编码VvDUF642蛋白的核酸分子包括编码VvDUF642蛋白的基因组DNA、cDNA、重组DNA或mRNA、hnRNA；或者与上述DNA、cDNA、重组DNA或mRNA呈反向互补的核酸分子。

上述核酸分子可根据实际需要进行修饰或优化，从而使基因表达更高效；例如，①可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述VvDUF642基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合受体植物的偏爱性。②或修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。③与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；④引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

本发明中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述的宿主可为真菌、细菌、藻类或细胞。

对于不含有VvDUF642的植物，可采用化学法、鸟枪法、微注射，电穿孔等方法，将VvDUF642的基因片段导入植物细胞，也可通过同源重组、锌指核酸酶、TALEN、CRISPR等方法将VvDUF642的基因片段导入植物细胞。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1.DUF642基因在无核品种中表达量增加显著高于有核品种：通过转录组对无核品种(森田尼无核)和有核品种(红地球)果实发育的5个时期(胚珠期(花前)，受精期(开花)，种皮发育期(花后5-10天)，胚乳发育期(花后11-30天)，胚发育期(花后31-40天))进行转录组测序，结果显示该基因的表达量在胚珠期和受精期没有显著差异，从种皮发育期开始，DUF642基因在无核品种中表达量持续增加，而在有核品种中表达量变化不显著(图1)。

2.果实发育过程中，DUF642蛋白表达量在无核品种中表达量增加显著高于有核品种：通过westernblot检测，DUF642蛋白的表达量在无核白中的表达量远高于玫瑰香(图2)。

3.大样本验证：选取8个品种和两个无核化处理的发育期果实作为样品进行Westernblot验证，果实发育过程中，DUF642蛋白在无核品种中高表达，而在有核品种中低表达，在醉金香和阳光玫瑰无核处理后表达量提高，证实了该基因表达量与葡萄无核性状的紧密连锁关系(图3)。

4.RNA提取

选取葡萄的幼嫩叶片，利用Bioteke植物RNA提取试剂盒提取植物总RNA。使用Thermo Scientific Nanodrop 1000微量紫外可见光分光光度计测量浓度并经琼脂糖凝胶电泳确定RNA的完整性。利用TakaRa公司的RR047反转录试剂盒得到cDNA的第一条链，作为PCR克隆的模板。

5.DUF642 cDNA序列的获得：

DUF642基因序列使用Vector NTI 11中的primer find设计引物克隆DUF642基因序列，引物见表1。PCR扩增使用NEB的PhusionTM超保真酶扩增，反应体系为：HF buffer 10μL，2.5mmol/L的dNTPs 2.5μL，模板2μL，上下游引物(10mmol/L)各2.5μL，Phusion超保真酶0.5μL，双蒸水补至50μL。PCR反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸30s，共31个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经2％的琼脂糖胶电泳，使用Omega Gel extract回收试剂盒回收扩增产物，纯化后的产物使用TaKaRa的EXTaqTM聚合酶加A，反应体系：10xbuffer2μL，2.5mmol的Mg2+2μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL，模板14μL。反应程序：72℃反应10min。参照pGEMT-easyTM载体构建说明书构建DUF642-T载体，转化E.coli DH5α大肠杆菌进行蓝白斑筛选，挑单克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序引物为T7和T7 Terminal通用引物。

表1 DUF642基因克隆引物

6.DUF642基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2 DUF642基因引起拟南芥种子变型

1.构建植物表达载体：PCR扩增模板使用测序验证过的DUF642-T质粒；植物表达载体选用pCAMBIA1303；农杆菌菌株为LBA4404；NEB的NCOⅠ和Bst EⅡ内切酶，Axygen小量质粒提取试剂盒购于郑州博美公司；1/2MS、潮霉素B、卡那霉素等购于郑州宝赛生物公司；PEG4000、Cellulase R10、Mecerozym R10、mannitol、氯化钾、MES、BSA、0.45μm滤头等购于郑州超研生物公司，构建植物表达载体pDUF642。

2.拟南芥原生质体制备转化参考Maas C的方法(Maas et al,1995)，使用激光共聚焦显微镜观察转化培养好的拟南芥原生质体。核定位信号分析预测使用Nuc Pre(http://www.sbc.su.se/～maccallr/nucpred/cgi-bin/single.cgi)。

3.农杆菌LBA4404感受态制备：在含有50mg/L利福平的LB固体培养基上划板，挑取单胞在含有50mg/L利福平的LB液体培养基中摇菌48h至菌液浑浊，按1：100比例接种到50ml新鲜的含有50mg/L利福平的LB液体培养基上摇菌5h。将菌液置于冰上冰浴30min，4℃，5000g离心5min；弃上清加入1ml 0.1％的氯化钙悬浮，冰浴5min，4℃，5000g离心5min；弃上清加入800μL0.02％的氯化钙重悬浮，分装8管每管100μL冰浴备用。

4.制备好的农杆菌感受态中加入2μg需要转化的质粒，混匀，液氮速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml LB液体培养基，28℃，200rpm，摇菌5h。离心浓缩涂到含有50mg/L利福平和50mg/L的卡那霉素的LB平板上，28℃培养48h，挑取单菌落验证。

5.拟南芥种植条件为22℃，16h光照，8h黑暗，转化前两天浇足水。转化的农杆菌摇菌至OD值为2.0左右，5000g室温浓缩离心5min，弃上清加10％的蔗糖溶液重悬浮，5000g室温离心5min加10％的蔗糖溶液重悬浮至OD1.0，添加Sillwet L-77至终浓度0.02％。选择拟南芥花刚露白时转化，将花序浸泡到农杆菌菌液中1min，取出用滤纸沾吸茎上多余的菌液。22℃黑暗条件下放置两天，注意保湿，隔7天再转化一次。转化后三周左右，待果夹成熟收取种子。

6.干燥的种子放在2ml EP管中加入900μL含0.2％的吐温20的70％的乙醇摇9min。弃上清加入90％的乙醇洗3遍，最后用100％乙醇悬浮倒在灭菌的滤纸上干燥。配置1/2MS培养基，倒板前添加潮霉素B至终浓度25mg/L。将灭菌的拟南芥种子均匀的洒在1/2MS培养基上，密封放4℃冰箱中两天再转到22℃培养箱中培养，一周后观察筛选结果，可以正常生长为转基因型拟南芥阳性植株，连续筛选两代后，获得纯系T2代种子进行形态观察。

7.表型观察：

如图4所示，与野生型拟南芥的种子相比，VvDUF642基因转入拟南芥后引起拟南芥种子变小。

8.测量数据：

测量并统计野生型拟南芥种子的千粒重和转入VvDUF642基因的拟南芥种子的千粒重，结果如图5所示，结果表明DUF642基因转入拟南芥后引起拟南芥种子变小。千粒重统计显示，DUF基因的高表达导致拟南芥种子变小，由野生型0.023g变小到0.015g。

9.转基因拟南芥DUF642基因表达数据：

检测并统计野生型拟南芥种子以及转入VvDUF642基因的拟南芥种子的中DUF642基因的表达量，结果如图6，结果显示，VvDUF642基因在转基因拟南芥中高表达。

实施例3 DUF642基因引起番茄种子败育

1.番茄转基因：构建好的植物表达载体pDUF642进行番茄转基因

种子灭菌:取番茄种子数克置于无菌三角瓶中，先用无菌水清洗2min，75％酒精清洗1min，再用5％的次氯酸溶液浸泡5-8min，无菌水清洗20min，清洗2次，置于无菌滤纸板内晾干。

2.播种：将灭菌好的种子播种于培养瓶中，株距0.8～1.0cm。将剩下的灭菌的种子封好放于干燥处待下次取用，在超净台内频繁紫外光照射会降低种子发芽率。播种的培养瓶置于暗处2～3天，待种子露白发芽后置于光照组培箱内生长4～5d。培养条件：23±2℃，16h/d光照8h/d黑暗。

3.外植体的制备：番茄种子生长7～8d后，子叶完全展开，用手术刀取子叶，切除子叶柄及子叶尖，留中间部分切为2～3段作为外植体。

4.外植体预培养：番茄外植体预培养1～2d使外植体边缘膨大有利于番茄侵染转化。

5.农杆菌侵染液：农杆菌OD600为0.1～0.2，侵染10～15min，MS悬浮液PH 5.4。在无菌滤纸板内晾干，可多次置换滤纸板来吸取多余的农杆菌。

6.共培养：将晾干的外植体置于共培培养基中，在暗处培养2d。温度：23±2℃，共培培养基与预培养培养基相同。

7.延迟筛选：将共培后的外植体用1g/L的头孢水清洗15min两次(或者1g/L的头孢水清洗一次，无菌水清洗一次，各15min)。在滤纸板内晾干后，置于延迟筛选培养基中。时间3～5d，光照下培养。

8.愈伤的诱导及筛选：时间30-40d。愈伤分化及芽伸长(后期幼苗分化培养基)：时间30-40d。生根：待分化的幼苗生长至2-3cm左右，将其从愈伤上切除移至生根培养基中。时间：10-15d。

9.表型观察：

观察野生型番茄以及VvDUF642基因转入番茄后的表型，结果表明，VvDUF642基因转入番茄后引起番茄种子败育，形成无核果实(图7)。

10.测量数据：

测量并统计野生型番茄果实的平均果重、以及转入VvDUF642基因的番茄种子的平均果重，结果如图8所示，结果表明DUF642基因转入番茄后引起番茄果实变小。

11.转基因番茄DUF642基因表达数据：

检测并统计野生型番茄种子以及转入VvDUF642基因的番茄种子的中DUF642基因的表达量，结果如图9，结果显示，VvDUF642基因在转基因番茄中高表达。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> VvDUF642基因引起植物种子败育的用途

<130> MP1923206

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagagctg tggcgtttct tttgctacta ttgtgcgcca cctgccacat tgccttatcc 60

ttcaccgacg gactattacc gaatgggaac ttcgagctgg ggccgaagcc atcggacatg 120

aagggaacgg aggtgatagg cccgcacgcc ataccggaat gggaaacatc gggtttcatc 180

gagtacataa aagcaggaca aaaacaaggc gacatgttgc tggtcgtccc tgaaggagcc 240

ttcgcagtca ggctggggaa cgaggcttcc ataaaacaga gagtgaaggt gatcaaggga 300

atgtactatt ccattacctt tagtgccgcc agaacctgcg cccaggagga gcgcttgaac 360

atatcagtgg cgcccgactg gggagtcctg cctatgcaaa ctctgtacag cagcaacggc 420

tgggactcct acgcctgggc gttccaggct gattacgatg tgatcgagat cgtcatacat 480

aacccaggcg tagaggagga tccagcttgt ggaccgttga tcgattccgt tgctttcagg 540

gctctgtatc ctcccagacc ttccagcaag aacctactga aaaatggtgg gtttgaagag 600

ggcccatatg tgttccccaa cacatcctgg ggagttctca tcccacccaa cattgaagat 660

gatcactctc cgctccctgg ttggatggtg gagtccctca aagccgtcaa gtacatcgac 720

tccgaccact tctccgtgcc gcaggagaaa cgtgcggtgg agctggtggc cggaaaagag 780

agtgccatag cccaagtagc cagaaccatc cctggcaaaa catatgcgct ctcattctca 840

gtaggagatg ccagcaactc ctgtgaaggg tccatggtgg tggaggcctt cgccggcagg 900

gacaccatca aggtgccata tgaatcaaag ggcaaaggag gcttcaagcg ggctgttctc 960

cgttttgtag cggtatccaa ccgaacccga atcatgttcc tgagcacatt ctataccatg 1020

aggagtgatg actatgcctc cctctgtgga cctgttcttg acgatgtgaa gctgctcagc 1080

ctccgcactc ctcctaggca catctaa 1107

Claims (8)

1.如SEQ ID NO:1所示序列的核酸在诱导植物种子败育或变形中的应用；所述植物为葡萄、拟南芥或番茄。

2.一种引起植物种子败育或变形的制剂，其特征在于，包括如下i)～v)中的至少一种：

i)、编码VvDUF642蛋白的核酸分子；

ii)、包含编码VvDUF642蛋白的核酸的表达载体；

iii)、含有ii)的农杆菌；

所述植物来自葡萄、拟南芥或番茄；

所述编码VvDUF642蛋白的核酸的序列如SEQ ID NO:1所示，所述VvDUF642蛋白由上述序列编码。

3.一种引起植物种子败育的方法，其特征在于，提高植物内源VvDUF642蛋白的水平和/或活性，或使不含有VvDUF642的植物表达VvDUF642蛋白；所述植物来自葡萄科、拟南芥或番茄；所述VvDUF642蛋白由如SEQ ID NO:1所示的核酸序列编码。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述使不含有VvDUF642的植物表达VvDUF642蛋白的方法包括：构建包含编码VvDUF642蛋白的核酸的载体，转化入农杆菌；以所述农杆菌感染植物种子或外植体。

5.如下a)～b)中的任一项在无核葡萄筛选育种中的应用；

a)、VvDUF642蛋白的检测试剂；

b)、编码VvDUF642蛋白的核酸分子的检测试剂；

所述编码VvDUF642蛋白的核酸分子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述VvDUF642蛋白由上述序列编码。

6.一种筛选无核葡萄种质资源的制剂，其特征在于，包括a)～b)中的至少一种：

a)、VvDUF642蛋白的检测试剂；

b)、编码VvDUF642蛋白的核酸分子的检测试剂；

所述编码VvDUF642蛋白的核酸分子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述VvDUF642蛋白由上述序列编码。

7.一种筛选无核葡萄种质资源的方法，其特征在于，包括：

检测葡萄种质的VvDUF642基因转录水平或检测VvDUF642蛋白的表达水平或活性；所述VvDUF642蛋白由如SEQ ID NO:1所示的核酸序列编码。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测的样本为葡萄的幼嫩叶片。

Images