MX2013009749A

MX2013009749A - Plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado y metodos para producir los mismos.

Info

Publication number: MX2013009749A
Application number: MX2013009749A
Authority: MX
Inventors: Marieke Louwers; Christophe Reuzeau; Ana Isabel Sanz Molinero; Yves Hatzfeld
Original assignee: Basf Plant Science Co Gmbh
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2013-10-01
Also published as: US20180291393A1; EP2681323A4; WO2012117324A1; BR112013021836A2; EP2681323A1; AU2012222993A2; EP2995622A1; AU2012222993A1; CA2826591A1; EA201391243A1; US20130340120A1; DE112012001017T5; CN103492573A; ZA201307172B; AR085505A1

Abstract

Se proporciona un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas mediante la expresión de modulación en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 (Proteína que contiene un Dominio de Función Desconocida), o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de fosfolipasa/carboxilesterasa (PLPCasa), y plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa, cuyas plantas tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican DUF642, o polipéptidos similares relacionados con epimerasa o ácidos nucleicos que codifican PLPCasa, y constructos que comprenden el mismo, útiles en desempeñar los métodos para mejorar los rasgos relacionados con rendimiento en plantas.

Description

PLANTAS QUE TIENEN RASGOS RELACIONADOS CON RENDIMIENTO MEJORADO Y MÉTODOS PARA PRODUCIR LOS MISMOS Antecedentes La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular y se refiere a un método para mejorar rasgos relacionados con rendimiento en plantas por la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido DUF642 (Proteína que contiene un Dominio de Función Desconocida) . La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido DUF642, cuyas plantas tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas de tipo silvestre correspondientes u otras plantas control. La invención también proporciona constructos útiles en los métodos de la invención.

La presente invención se refiere además a un método para mejorar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas por la modulación de la expresión en una planta de ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa. La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa, cuyas plantas tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas de tipo silvestre correspondientes u otras plantas control. La invención también proporciona constructos útiles en los métodos de la invención.

La presente invención también se refiere a un método para mejorar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas por la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de Fosfolipasa/carboxilesterasa (PLPCasa) . La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa, cuyas plantas tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas de tipo silvestre correspondientes u otras plantas control. La invención también proporciona constructos útiles en los métodos de la invención .

La población mundial cada vez mayor, y la reserva decreciente de tierra arable disponible para la agricultura alimenta la investigación para incrementar la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras en cosecha y horticultura utilizan técnicas de cruza selectiva para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas de cruza selectiva tienen varias desventajas, principalmente que estas técnicas tienen típicamente alto costo laboral y resultan en plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden resultar en el rasgo deseable que se pasa desde las plantas madre . Los avances en la biología molecular han permitido a la humanidad modificar el germoplasma de animales y plantas . La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la introducción subsecuente de ese material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tengan diversos rasgos económicos, agronómicos u hortícolas perfeccionados.

Un rasgo de interés económico particular es el rendimiento aumentado. El rendimiento se define normalmente como el producto medible de valor económico de una cosecha. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, el número y el tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas) , la producción de semillas, la senescencia de las hojas y más. El desarrollo de la raíz, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor temprano también pueden ser factores importantes en determinar el rendimiento. Optimizar los factores antes mencionados por lo tanto puede contribuir a incrementar el rendimiento de cosechas.

El rendimiento de semillas es un rasgo particularmente importante, puesto que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición humana y animal. Las cosechas tales como maíz, arroz, trigo, cañóla y soya representan más de la mitad de la ingesta calórica humana total, ya sea a través del consumo directo de los granos mismos o a través del consumo de productos de carne incrementados en semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchas clases de metabolitos utilizados en los procesos industriales. Las semillas que contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raíces) y un endosperma (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas) . El desarrollo de una semilla implica muchos genes, y requiere la transferencia de metabolitos desde las raíces, hojas y tallos en la semilla que crece. El endosperma, en particular, asimila los precursores metabólicos de carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar el grano.

Otros rasgos importantes para muchos cultivos es el vigor temprano. Mejorar el vigor temprano es un objetivo importante de los programas de cruza de arroz modernos en variedades de arroz tanto de clima templado como tropical. Las raíces largas son importantes para el anclaje al suelo adecuado en el arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados, y donde las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, los brotes más largos se asocian con vigor. Donde se practica la siembra de hilera, los mesocotilos más largos y los coleoptilos son importantes para la buena emergencia de plántula. La capacidad para diseñar en la ingeniería el vigor temprano en plantas puede ser de mayor importancia en la agricultura. Por ejemplo, el vigor temprano deficiente ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en el germoplasma Corn Belt en el Atlántico Europeo.

Un rasgo importante adicional es aquel de la tolerancia al estrés abiótico mejorado. El estrés abiótico es una causa principal de pérdida de cultivo a nivel mundial, que reduce el rendimiento promedio para la mayoría de las plantas de cosecha principales por más de 50% (Wang et al., Planta 218, 1-14, 2003). El estrés abiótico puede provocarse por sequía, salinidad, temperaturas extremas, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad para mejorar la tolerancia de la planta al estrés abiótico puede ser de mayor ventaja económica para los agricultores a nivel mundial y puede permitir el cultivo de cosechas durante las condiciones adversas y en territorio donde el cultivo de cosechas no puede ser posible de otra manera.

El rendimiento de la cosecha por lo tanto puede incrementarse al optimizar uno de los factores antes mencionados .

Con respecto a los polipéptidos DUF642, la familia de las proteínas DUF642 representa una región conservada encontrada en muchas de las proteínas de planta sin caracterizar. Las proteínas DUF642 se identificaron, por ejemplo, por Irshad et al., BMC Plant Biology 2008, 8:94.

Con respecto a los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, la presente invención se refiere al uso de polinucleótidos similares a relacionados con epimerasa y polipéptidos en el campo de biotecnología vegetal. Las epimerasas pueden definirse como enzimas de isomerasa que catalizan la inversión de la estereoquímica en moléculas biológicas.

Ascencio-Ibañez et al. (2008) Plant Physiology 148 (1) :436-454) han reportado entre los genes que se cambian significativamente durante la inyección de CalCuV un gen de epimerasa Arabidopsis, el cual se lista en · una tabla suplementaria (Tabla 2) de este documento. En ese documento, el gen de Arabidopsis se denomina una "proteína putativa de Isopenicilin-N-epimerasa" . Los autores describen análisis de microdisposición de la transcriptoma de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) en respuesta a la infección por virus del enrollamiento de la hoja de la col (CaLCuV) , y se indica que descubrieron 5,365 genes (tasa de falso descubrimiento <0.005) expresado diferencialmente en las hojas roseta infectadas 12 días después de la inoculación, que incluyen un gen de isomerasa Arabidopsis (At3g62130) .

Mehta y Christen (1994 Biochem Biophys Res. Commun.14 ; 198 (1) : 138-43) describen la homología de la isopenicilina-N-epimerasa a aminotransferasa.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, la familia de polipéptidos de PLPCasa contiene tanto fosfolipasas y carboxilesterasas con amplia especificidad de sustrato, y se refiere estructuralmente a hidrolasas alfa/beta. Los miembros de la superfamilia de PLPCasa se encuentran presentes en plantas, aunque también en otros organismos tales como levadura y bacteria. En Arabidopsis, el gen SOBER1 que codifica una PLPCasa se implica en la resistencia al patógeno de planta P. synringae pv tomato DC3000 (Kirik and Mudgett (2009), PNAS 106 (48) : 20532-20537) . Estudios recientes mostraron que PLPCasa podría haber surgido de una rara transferencia de gen horizontal a partir de hongos de planta (Richards et. al. (2009), The Plant Cell, 21 (7) : 1897-1911) .

Dependiendo del uso extremo, la modificación de ciertos rasgos de rendimiento puede favorecerse sobre otros . Por ejemplo, para aplicaciones tales como el forraje o la producción de madera, o un recurso bio-combustible , un aumento en las partes vegetativas de una planta puede ser deseable, y para aplicaciones tales como la producción de harina, almidón o aceite, un aumento en los parámetros de semillas puede ser particularmente deseable. Incluso entre los parámetros de semilla, algunas pueden favorecerse sobre otras, dependiendo de la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de semilla, ya sea que está se encuentre en la forma de tamaño de semilla aumentado o número de semillas aumentado.

Ahora se ha encontrado que diversos rasgos relacionados con rendimiento pueden mejorarse en plantas por la modulación de expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar a epimerasa relacionada, o un polipéptido de PLPCasa en una planta .

Descripción detallada de la invención La presente invención muestra que la expresión de modulación en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa dan plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control.

De acuerdo con una primera modalidad, la presente invención proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa y seleccionar opcionalmente plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado. De acuerdo con otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, en donde el método comprende las etapas de modular la expresión en la planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se describe en la presente y seleccionar opcionalmente para plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado.

Un método preferido para modular (de preferencia incrementar) la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa es introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa.

Cualquier referencia después de esto a una "proteína útil en los métodos de la invención" se entiende como un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente. Cualquier referencia después de esto a un "ácido nucleico útil en los métodos de la invención" se entiende como un ácido nucleico capaz de codificar tal polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa. El ácido nucleico a introducirse en una planta (y por lo tanto útil en la realización de los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifica el tipo de proteína la cual ahora se describirá, después de esto también denominado "ácido nucleico DUF642" , o "ácido nucleico similar relacionado con epimerasa" , o "ácido nucleico PLPCasa" o "gen DUF642", o "gen similar relacionado con epimerasa" o "gen PLPCasa" .

Un "polipéptido de DUF642" como se define en la presente se refiere a cualquier polipéptido que comprende un dominio DUF642 IPR006946 de acceso InterPro, de preferencia el polipéptido de DUF642 comprende la secuencia de firma FSAARTCAQ (SEQ ID NO: 194) .

El término "DUF642" o "polipéptido de DUF642" como se utiliza en la presente también se pretende para incluir homólogos como se define a continuación de "polipéptido de DUF642" .

De preferencia, el polipéptido del polipéptido de DUF642 comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 1: N [LAM] [VL] KNG [DG] FEEGP [WYH] [MI] [FLI] P [NG] [TS] [STR] [ L] GVL [LVI] P [PTS] [NKM] [LQDV] [EDV] [DE] [ED] [THY] S [PS] L [PS] [GP]W[IMT] [IV] (SEQ ID NO: 181), ,(ii) Motivo 2: [VLA] [EKAT] [KPR] G [SAM] [LRH] Y [SA] [LIV] [TI]F[SG]A [AS] RTCAQ [DLAS] E [SVRL] L [NR] [VI] (SEQ ID NO: 182) , (iii) Motivo 3: D[PE] [AT]CGP[LI] [IL]D[AS] [VIF]AI[KR] (SEQ ID NO: 183) De mayor preferencia, el polipéptido de DUF642 comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 4 : N[ML] [LV] [KR] NG [DG] FEEGPY [IF] [FLI] P [GND] [TA] [SPR] WGVL [VI] P [PS] [MN] [DIV] [EV] (SEQ ID NO: 184) , (Ü) Motivo 5: N[VI] [ST] [VAI] [SAT] [PG] [EQ] [SW] [GA] [VE] [LI]P[IM] QT [VIM] Y [TGS] S [SN] GWDSY [SA] WA[FW] (SEQ ID NO: 185) , (iii) Motivo 6: Y [SA] [IL] [TI] FSAARTCAQ [AS] E (SEQ ID NO: 186) Incluso de mayor preferencia, el polipéptido de DUF642 comprende un incremento en el orden de preferencia, al menos 2 , al menos 3 , al menos 4 , al menos 5 , o los 6 motivos .

Se derivaron los motivos 1-6 utilizando el algoritmo MEME (Bailey and Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994) . En cada posición dentro de un motivo MEME, los residuos se muestra que están presentes en el conjunto de búsqueda de secuencias con una frecuencia mayor que 0.2. Los residuos dentro de los corchetes representan alternativas .

Adicional o alternativamente, el homólogo de una proteína de DUF642 tiene un incremento en el orden de preferencia de al menos 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia general al aminoácidos representado por la SEQ ID NO: 2 ó 4, a condición de que la proteína homologa comprenda cualquiera de uno o más de los motivos conservados como se delinea en lo anterior. La identidad de secuencia general se determina utilizando un algoritmo de alineación global, tal como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys) , de preferencia con parámetros por defecto y de preferencia con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin tomar en cuenta las señales de secreción o péptidos de tránsito) .

En una modalidad, el nivel de identidad de secuencia se determina por la comparación de las secuencias de polipéptido sobre la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO : 4.

En comparación con la identidad de secuencia general, la identidad de secuencia generalmente será mayor cuando sólo se consideren los dominios o motivos conservados. De preferencia los motivos en un polipéptido de DUF642 tienen, en orden de incremento de preferencia, al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos representados por la SEQ ID NO: 181 a la SEQ ID NO: 186 (Motivos 1 a 6) .

En otras palabras, en otra modalidad se proporciona un método en donde el polipéptido de DUF642 comprende un dominio conservado (o motivo) con al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia a los motivos conservados que comienzan con el aminoácido 202 hasta el aminoácido 241 (motivo 1) , el aminoácido 108 hasta el aminoácido 132 (motivo 2) , el aminoácido 178 hasta el aminoácido 191 (motivo 3) en la SEQ ID NO: 2; los motivos conservados que comienzan con el aminoácido 202 hasta el aminoácido 230 (motivo 4) , el aminoácido 130 hasta el aminoácido 159 (motivo 5) , el aminoácido 114 hasta el aminoácido 128 (motivo 6) en la SEQ ID NO: 2; los motivos conservados que comienzan con el aminoácido 121 hasta el aminoácido 160 (motivo 1) , el aminoácido 27 hasta el aminoácido 51 (motivo 2) , el aminoácido 97 hasta el aminoácido 110 (motivo 3) en la SEQ ID NO: 4; los motivos conservados que comienzan con el aminoácido 121 hasta el aminoácido 149 (motivo 4) , el aminoácido 50 hasta el aminoácido 78 (motivo 5) , el aminoácido 33 hasta el aminoácido 47 (motivo 6) en la SEQ ID NO: 4.

Un "polipéptido similar relacionado con epimerasa" o "la proteína similar relacionada con epimerasa" como se define en la presente se refiere a cualquier polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 7: CREEGV [DE] [QK] VFVD [AG] AH [AS] IG [QSC] V [PDE] [VI] [DN] [V ] [KR] [ED] IGADFY [TV] SNLHKWFFCPP [SA] VAFL [YH] (SEQ ID NO: 273) , (Ü) Motivo 8: EF [SA] HH [DN] P [GAN] VAR [IV] NNGSFG [CS] CP [AG] S [VI] [LI] AAQ [ARK] [RN] WQ [LR] [LRQ] FL [RQA] QPD [AD] FYF [ND] xL [QRK] [PK]G (SEQ ID NO : 274), (iii) Motivo 9: S [LI] VDNATTAAAIVLQ [HQ] [VAI] [AG] [WR] [AS] FAEG [RKN] FA [KR] [GN] D [AVT] V [LV] MLH [YC] AY [GQ] [AS] VKKSI [EQH] AYV (SEQ ID NO: 275) Se derivaron los motivos 7-9 utilizando el algoritmo MEME (Bailey and Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994) . En cada posición dentro de un motivo MEME, los residuos se muestran que están presentes en el conjunto de búsqueda de secuencias con una frecuencia mayor que 0.2. Los residuos dentro de los corchetes representan alternativas.

De mayor preferencia, el polipéptido similar relacionado con epimerasa comprende en orden de incremento de preferencia, al menos 1, al menos 2 o los 3 motivos.

En otra modalidad, un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se utiliza en la presente comprende un polipéptido que tiene uno o más de los dominios como se enlista en la Tabla C, y en particular que tiene uno o más de los siguientes dominios : - un dominio como se determina con la base de datos de superfamilia y que tiene el número de acceso SSF53383; * un dominio como se determina con la base de datos HMMPanther y que tiene el número de acceso como PTHR11601 - un dominio como se determina con la base de datos H Pfam y que tiene el número de acceso PF00266; y - un dominio como se determina, con la base de datos de Gene3D y que tiene el número de acceso G3DSA:3.40.640.10 En otra modalidad preferida, un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se utiliza en la presente comprende un dominio conservado (o motivo) con al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de la identidad de secuencia a o consiste de un dominio conservado como representado por uno cualquiera de : - coordenadas de aminoácidos 32 a 449 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 10 -SEQ ID NO: 280) ; - coordenadas de aminoácidos 47 a 276 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 11-SEQ ID NO: 281) ; - coordenadas de aminoácidos 92 a 364 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 12-SEQ ID NO: 282) ; y - coordenadas de aminoácidos 59 a 323 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 13 -SEQ ID NO: 283) .

El término "polipéptido similar relacionado con epimerasa" como se utiliza en la presente también pretende incluir homólogos como se define a continuación de un "polipéptido similar relacionado con epimerasa" .

Adicional o alternativamente, el homólogo de una proteína similar relacionada con epimerasa tiene en orden de incremento de preferencia al menos 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia general al aminoácidos representado por la SEQ ID NO: 198, a condición de que la proteína homologa comprenda cualquiera de uno o más de los dominios o motivos conservados como se delinea en lo anterior. La identidad de secuencia general se determina utilizando un algoritmo de alineación global, tal como el algoritmo de Needleman unsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys) , de preferencia con los parámetros por defecto y de preferencia con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin tomar en cuenta las señales de secreción o péptidos de tránsito) .

En una modalidad, el nivel de identidad de secuencia se determina por la comparación de las secuencias de polipéptido sobre longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 198.

En comparación con una identidad de secuencia general, la identidad de secuencia generalmente será mayor cuando sólo se consideren los dominios o motivos conservados. De preferencia, los motivos en un polipéptido similar relacionado con epimerasa tiene, en orden de incremento de preferencia, al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos 1 a 7 (como se representa por la SEQ ID NO 273, 274, 275, 280, 281, 282, 283, respectivamente) como se describe en lo anterior.

Un "polipéptido de PLPCasa" como se define en la presente se refiere a cualquier polipéptido que comprende un dominio de IPR003140 de acceso InterPro que corresponde con el número de acceso de PFAM PF022030 de Fosfolipasa/carboxilesterasa (PLPCasa) .

El término "PLPCasa" o "polipéptido de PLPCasa" , como se utiliza en la presente también pretende incluir homólogos como se define a continuación de "polipéptido de PLPCasa" .

En una modalidad preferida, el polipéptido de PLPCasa comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 14: E [FY] G [KR] T [HY] WRPKG [KR] HQA IVWLHGLGDNG [LSA] S [S ]SQLL[ED] [ST] LPLPNIKWICPTA (SEQ ID NO: 348), (ii) Motivo 15: PDD [WIVL] EGLDASAAH [IV] ANLLS [TS] EP [AS] D [VI] K [VL] G [IV] G (SEQ ID NO: 349), (iii) Motivo 16: FSMGAA [IT] ALYSA [TA] C [YF] A [MHL] (SEQ ID NO: 350) En una modalidad más preferida, el polipéptido de PLPCasa comprende uno o más de los siguientes motivos : (i) Motivo 17: E [FY] G [KR] T [HY] WRPKGKH [QK] ATIVWLHGLGDNG [LS] S [SW] SQLLE [ST] LPLPNIKWICPTA (SEQ ID NO: 351) (Ü) Motivo 18: ED [GA] PDD [WLV] EGLDA [SA] AAH [IV] NLLSTEPA [DN] [VI] K (SEQ ID NO: 352) (iii) Motivo 19: [LF] GGFP [CS] TAWFD (SEQ ID NO: 353) En una modalidad preferida alternativa, el polipéptido de PLPCasa comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 20: T [HY] WRPKG [KR] HQATIVWLHG [LI] GDNG [LAG] S [SW] SQLL [ED] SLPLPN[IV] KWICPTAP [TS] RP (SEQ ID NO: 354) (ii) Motivo 21: FPCTAWFDV [GE] [ED] [LT] S [ELV] DG [PHR] DD [WI] EG [LM] DASA [AS] H [IV] ANLLS [TS] EP [AS] DV [KS] [VL] GIGGFSM (SEQ ID NO: 355) (iii) Motivo 22: FK [SP] Y [END] G [IL] GHYT [VI] P [RE] EM [GD] [ED] V [SC] [TKN] (SEQ ID NO: 356) En una modalidad más preferida, el polipéptido de PLPCasa comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 23: EFG [KR] T [HY] WRPKGKHQATIVWLHGLGDNG [LS] SS [SY] QLLE SLPLPNIKWICPTA (SEQ ID NO: 357) (ii) Motivo 24: SEDG [PH] DDWEGLDASA [AS] HIANLLSTEPADV (SEQ ID NO: 358) (iii) Motivo 25: G [IT] SDDW [LP] Y [KR] [YF] GEKSAQSLS [SM] AGFRY [VI] [AMT] FK [SP] Y (SEQ ID NO : 259) Se derivaron los motivos 14 y 25 utilizando el algoritmo MEME (Bailey and Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994) . En cada posición dentro de un motivo MEME, los residuos se muestran que están presentes en el conjunto de búsqueda de secuencias con una frecuencia mayor que 0.2. Los residuos dentro de los corchetes representan alternativas.

De mayor preferencia, el polipéptido de PLPCasa comprende en orden de incremento de preferencia, al menos 2, al menos 3 , al menos 4 , al menos 5 , al menos 6 , al menos 7 , al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 o los 12 motivos .

Adicional o alternativamente, el homólogo de una proteína de PLPCasa tiene en orden de incremento de preferencia al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia general para el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 285, a condición de que la proteína homologa comprenda cualquiera de uno o más de los motivos conservados como se delinea en lo anterior. La identidad de secuencia general se determina utilizando un algoritmo de alineación global, tal como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys) , de preferencia con los parámetros por defecto y de preferencia con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin tomar en cuenta las señales de secreción o péptidos de tránsito) . En comparación con una identidad de secuencia general, la identidad de secuencia generalmente será mayor cuando sólo se consideren los dominios o motivos conservados. De preferencia, los motivos en un polipéptido de PLPCasa tienen, en orden de incremento de preferencia, al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos representados por la SEQ ID NO: 348 a la SEQ ID NO: 359 (motivos 14 a 25) .

En otra modalidad preferida se proporciona un método en donde el polipéptido de PLPCasa comprende un dominio conservado (o motivo) con al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en el dominio conservado que inicia con el aminoácido 20 hasta el aminoácido 69 y/o el aminoácido 92 al aminoácido 118 y/o el aminoácido 194 al aminoácido 225 en la SEQ ID NO: 285) .

Los términos "dominio", "firma" y "motivo" se definen en la sección de "definiciones" en la presente.

De preferencia, la secuencia de polipéptido la cual cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquella representada en la Figura 5, agrupaciones con el grupo de polipéptido de DUF642 que comprenden la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2 y/o 4 en lugar de con cualquier otro grupo.

Además, los polipéptidos de DUF642, cuando se expresa en el arroz de acuerdo a los métodos de la presente invención como se delinea en los Ejemplos 6 y 7, dan plantas que tienen rasgos relacionados de rendimiento incrementado, en particular cuando se cultivan bajo condiciones sin estrés, el rendimiento de semilla total (Totalwgseeds) , número de semillas (nrfilledseed) , número de llenado de semilla (fillrate) , índice de cosecha, verdor antes de la floración, el número total de semillas (nrtotalseed) y para la biomasa sobre el suelo (AreaMax) .

De preferencia, la secuencia de polipéptido la cual cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 9, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos similares relacionados con epimerasa que comprenden la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 198 en lugar de con cualquier otro grupo .

Además, los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, cuando se expresan en el arroz de acuerdo con los métodos de la presente invención como se delinea en los Ejemplos 6 y 7, dan plantas que tienen rasgos relacionados de rendimiento incrementado, en particular, aumento de la biomasa y/o rendimiento de semilla aumentada, y más particularmente cualquiera de uno o más de aumento del peso total de las semillas, índice de cosecha, tasa de llenado, peso de mil granos (TKW) , biomasa sobre el suelo, y número de semillas llenas.

De preferencia, la secuencia de polipéptido la cual cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representada en la Figura 14, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos de PLPCasa que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 285 en lugar de con cualquier otro grupo.

Además, los polipéptidos de PLPCasa (al menos en su forma nativa) tienen típicamente actividad fosfolipasa y/o carboxilesterasa. Las herramientas y técnicas para medir la actividad fosfolipasa y/o carboxilesterasa son bien conocidas en la técnica, como por ejemplo, Kirik and Mudgett (2009) , PNAS 106 (48) : 20532-20537.

Además, los polipéptidos de PLPCasa, cuando se expresan en el arroz de acuerdo con los métodos de la presente invención como se delinea en los Ejemplos 6 y 7, dan plantas que tienen rasgos relacionados de rendimiento incrementado, en particular, biomasa de raíz incrementada e índice de verdor.

En una modalidad de la presente invención la función de las secuencias de ácido nucleico de la invención es para conferir información para una proteína que aumenta el rendimiento o rasgos relacionados con rendimiento, cuando una secuencia de ácido nucleico de la invención se transcribe y se traslada en una célula vegetal viva.

En una modalidad de la presente invención la función de las secuencias de ácido nucleico de la invención es para conferir la información para la síntesis de los polipéptidos de PLPCasa que aumenta el rendimiento o rasgos relacionados con rendimiento, cuando una secuencia de ácido nucleico de la invención se transcribe y se traslada en una célula vegetal viva.

La presente invención se ilustra por la transformación de plantas con la secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 1, que codifica la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 2. Sin embargo, el desempeño de la invención no se restringe a estas secuencias; los métodos de la invención pueden desempeñarse ventajosamente utilizando cualquier ácido nucleico que codifica DUF642 o polipéptido de DUF642 como se define en la presente.

Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de DUF642 se dan en la Tabla Al de la sección de Ejemplos en la presente. Tales ácidos nucleicos son útiles en el desempeño de los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla Al de la sección de ejemplos son secuencias ejemplares de ortólogos y parálogos del polipéptido de DUF642 representado por la SEQ ID NO: 2, los términos "ortólogos" y "parálogos" son como se define en la presente. Ortólogos y parálogos adicionales pueden identificarse fácilmente mediante el desempeño de una denominada búsqueda blast recíproca como se describe en la sección de definiciones; en donde la secuencia de consulta es la SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 2; o SEQ ID NO: 3 O SEQ ID NO 4, la segunda BLAST (contra-BLAST) puede estar contra las secuencias de arroz .

La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de DUF642 hasta ahora desconocidos útiles para conferir rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona por lo tanto una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (i) un ácido nucleico representado por las SEQ ID NO: 33, 39, 91, 169, 171, 175; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 33, 39, 91, 169, 171, 175; (iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 que tiene en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, O 99% de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 34, 40, 92, 170, 172, 176, y adicional o alternativamente que comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos dados en la SEQ ID NO: 181 a la SEQ ID NO: 186, y además de preferencia confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control . (iv) una molécula de ácido nucleico la cual hibridiza con una molécula de ácido nucleico del (i) a (iii) bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad y de preferencia confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control .

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, también se proporciona un polipéptido aislado seleccionado de: (i) una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 34, 40, 92, 170, 172, 176; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden de incremento de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 34, 40, 92, 170, 172, 176, y que comprende adicional o alternativamente uno o más motivos que tienen un orden de incremento de preferencia de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos dados en la SEQ ID NO: 181 a la SEQ ID NO: 186, y de preferencia confieren adicionalmente rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control ; (iii) derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en (i) o (ii) anteriores.

La presente invención se ilustra por la transformación de plantas con la secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 197, que codifica la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 198. Sin embargo, el desempeño de la invención no se restringe a estas secuencias; los métodos de la invención pueden desempeñarse ventajosamente utilizando cualquier ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa o cualquier polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en la presente.

Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos similares relacionados con epimerasas se dan en la Tabla A2 de la sección de Ejemplos en la presente. Tales ácidos nucleicos son útiles en el desempeño de los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A2 de la sección de ejemplos son secuencias ejemplares de ortólogos y parálogos del polipéptido similar relacionado con epimerasa representado por la SEQ ID NO: 198, los términos "ortólogos" y "parálogos" son como se define en la presente. Ortólogos y parálogos adicionales pueden identificarse fácilmente mediante el desempeño de una denominada búsqueda blast recíproca como se describe en la sección de definiciones; en donde la secuencia de consulta es la SEQ ID NO: 197 o SEQ ID NO: 198, la segunda BLAST (contra-BLAST) puede estar contra las secuencias de álamo.

La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifica similares relacionados con epimerasa hasta ahora desconocidos y polipéptidos similares relacionados con epimerasas útiles para conferir rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas con relación a las plantas control .

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona por lo tanto una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (i) un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 199; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 199; (iii) un ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa que tiene en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200, y adicional o alternativamente, que comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos 7 a 13 como se indica en la presente, y de preferencia adicional mejorada que confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, (iv) una molécula de ácido nucleico la cual hibridiza con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad y de preferencia confieren rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, también se proporciona un polipéptido aislado seleccionado de: (i) una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden de incremento de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200, y adicional o alternativamente, que comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos 7 a 13 como se indica en la presente, y de preferencia adicional confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control; (iii) derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en (i) o (ii) en lo anterior. La presente invención se ilustra por la transformación de plantas con la secuencia de ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 284, que codifica la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 285. Sin embargo, el desempeño de la invención no se restringe a estas secuencias, los métodos de la invención pueden desempeñarse ventajosamente utilizando cualquier ácido nucleico que codifica PLPCasa o polipéptido de PLPCasa como se define en la presente.

Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de PLPCasa se dan en la Tabla A3 de la sección de Ejemplos en la presente. Tales ácidos nucleicos son útiles en el desempeño de los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A3 de la sección de ejemplos son secuencias ejemplares de ortólogos y parálogos del polipéptido de PLPCasa representado por la SEQ ID NO: 285, los términos "ortólogos" y "parálogos" son como se definen en la presente. Los ortólogos y parálogos adicionales pueden identificarse fácilmente mediante el desempeño de una denominada búsqueda de blast recíproca como se describe en la sección de definiciones; en donde la secuencia de consulta es la SEQ ID NO: 284 o SEQ ID NO: 285, la segunda BLAST (contra-BLAST) puede estar contra las secuencias Medicago truncatula.

La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican PLPCasa y polipéptidos de PLPCasa hasta ahora desconocidos útiles para conferir rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas con relación a las plantas control .

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona por lo tanto una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (i) un ácido nucleico representado por cualquiera de las SEQ ID NO: 298, 302, 304, 312, 316, 336 ó 346; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por cualquiera de las SEQ ID NO: 298, 302, 304, 312, 316, 336 Ó 346; (iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa que tiene en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 299, 303, 305, 313, 317, 337 Ó 347, y adicional o alternativamente comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos dados en la SEQ ID NO: 348 a la SEQ ID NO: 359, y de preferencia adicional confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, (iv) una molécula de ácido nucleico la cual hibridiza con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) en condiciones de hibridación de alta rigurosidad y de preferencia confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control .

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, también se proporciona un polipéptido aislado seleccionado de: (i) una secuencia de aminoácido representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 299, 303, 305, 313, 317, 337 ó 347; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden de incremento de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 299, 303, 305, 313, 317, 337 ó 347, y adicional o alternativamente que comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos dados en la SEQ ID NO: 348 a la SEQ ID NO: 359, y de preferencia adicional confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control; (iii) derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en (i) o (ii) en lo anterior.

Las variantes de ácidos nucleicos también pueden ser útiles en la práctica de los métodos de la invención.

Los ejemplos de tales variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla Al a A3 de la sección de Ejemplos, los términos "homólogo" y "derivado" que son como se define en la presente. También son útiles en los métodos de la invención son ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla Al a A3 de la sección de Ejemplos. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional como la proteína no modificada de la que se derivan. Las variantes adicionales útiles en la práctica de los métodos de la invención son variantes en las cuales el uso de codón se optimiza en la cual los sitios objetivos de miR A se remueven.

Las variantes de ácido nucleico adicionales útiles en la práctica de los métodos de la invención incluyen porciones de ácido nucleico que codifica polipéptidos de DUF642, o polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa, ácidos nucleicos que hibridizan a los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de POI, de empalme de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de DUF642 o polipéptidos similares relacionados con epimerasas, o polipéptidos de PLPCasa, variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de DUF642 o polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa y variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de DUF642, o polipéptidos similares relacionados con epimerasa o polipéptidos de PLPCasa obtenidos por transposiciones genéticas. Los términos secuencia de hibridación, variante de empalme, variante alélica y las transposiciones genéticas son como se describen en la presente.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de DUF642, o polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa pueden necesitar ser ácidos nucleicos de longitud completa, ya que el desempeño de los métodos de la invención no depende del uso de secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una porción de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico dadas en la Tabla Al a A3 de la sección de Ejemplos, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácido dadas en la Tabla Al a A3 de la sección Ejemplos.

Puede prepararse una porción de ácido nucleico, por ejemplo, al hacer una o más eliminaciones en el ácido nucleico. Las porciones pueden utilizarse en forma aislada o pueden fusionarse a otra secuencia de codificación (o sin codificación) con el fin de, por ejemplo, para producir una proteína que combina diversas actividades. Cuando se fusiona a otra secuencia de codificación, el polipéptido resultante producido con la traslación puede ser más grande que aquel predicho para la porción de proteína.

Con respecto a 1-os polipéptidos de DUF642, las porciones útiles en los métodos de la invención, codifican un polipéptido de DUF642 como se define en la presente, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica como las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla Al de la sección de Ejemplos. De preferencia, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos dados en la Tabla Al de la sección de Ejemplos, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla Al de la sección de Ejemplos. De preferencia, la porción es de al menos 250, 300, 350, 400, 450 nucleótidos consecutivos en longitud, los nucleótidos consecutivos siendo de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico dadas en la Tabla Al de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla Al de la sección de Ejemplos.

De mayor preferencia, la porción es una porción del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1. De preferencia, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos la cual, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 5, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos de DUF642 que comprende la secuencia de aminoácido representada por los SEQ ID NO: 2 ó 4 en lugar de con cualquier otro grupo, y/o comprende al menos uno de los motivos 1 a 6 (SEQ ID NO: 181 a 186) , y/o tiene al menos 50% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 2 ó 4.

Con respecto a los polipéptidos similares relacionado con epimerasa, las porciones útiles en los métodos de la invención, codifican un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en la presente, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A2 de la sección de Ejemplos. De preferencia, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos dados en la Tabla A2 de la sección de Ejemplos, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A2 de la sección de Ejemplos. De preferencia, la porción es de al menos 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, nucleótidos consecutivos de longitud, los nucleótidos consecutivos siendo de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico dadas en la Tabla A2 de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A2 de la sección de Ejemplos. De mayor preferencia, la porción es una porción del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 197. De preferencia, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos la cual tiene una o más de las siguientes características: - cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 10, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 198 en lugar de con cualquier otro grupo; - comprende uno o más de los siguientes dominios SSF53383, PTHR11601; PF00266, y G3DSA: 3.40.640.10 - comprende cualquiera o más de los motivos 7 a 13 (como se representa por la SEQ ID NO 273, 274, 275, 280, 281, 282, 283, respectivamente), como se proporciona en la presente, y - tiene al menos 40% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 198.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, porciones útiles en los métodos de la invención, codifican un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A3 de la sección de Ejemplos. De preferencia, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos dados en la Tabla A3 de la sección de Ejemplos, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A3 de la sección de Ejemplos. De preferencia, la porción es de al menos 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 780 nucleótidos consecutivos de longitud, los nucleótidos consecutivos siendo de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico dadas en la Tabla A3 de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A3 de la sección de Ejemplos. De mayor preferencia, la porción es una porción del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 284. De preferencia, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos la cual, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 14, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos de PLPCasa comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 285 en lugar que con cualquier otro grupo, y/o comprende motivos de cualquiera de los motivos 14 a 16, de preferencia cualquiera de los motivos 17 a 19, o de preferencia cualquiera de los motivos 20 a 22, de mayor preferencia comprende cualquiera de los motivos 23 a 25, y/o tiene actividad biológica de fosfolipasa y/o carboxilesterasa, y/o tiene al menos 60% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 285.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridizar, bajo condiciones de rigurosidad reducida, de preferencia bajo condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente, o con una porción como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para intensificar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridizar el complemento de un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o con el complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las proteínas dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Las secuencias de hibridación útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente, que tiene sustancialmente la misma actividad biológica como las secuencias de aminoácidos DUF642, similar relacionada con epimerasa o PLPCasa dada en la Tabla A de la sección de Ejemplos. De preferencia, la secuencia de hibridación es capaz de hibridizar en el complemento de un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o a una porción de cualquiera de estas secuencias, una porción siendo como se define en la presente, o la secuencia de hibridización es capaz de hibridizar al complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dada en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Con respecto a los polipéptidos de DUF642, la secuencia de hibridación es de mayor preferencia capaz de hibridizar en el complemento de un ácido nucleico que codifica el polipéptido como se representa por la SEQ ID NO: l o a una porción de la misma.

De preferencia, la secuencia de hibridación codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos la cual, cuando una longitud completa y se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos de DUF642 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2 y/o 4, en lugar de con cualquier otro grupo, comprende al menos uno de los motivos 1 a 6 (SEQ ID NO: 181 al 186) , y/o tiene al menos 50% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 2 ó 4.

En una modalidad, la secuencia de hibridación es capaz de hibridizar en el complemento de un ácido nucleico como se representado por la SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 3 o una porción de la misma bajo condiciones de media o alta rigurosidad, de preferencia alta rigurosidad como se define en lo anterior. En otra modalidad, la secuencia de hibridación es capaz de hibridizar en el complemento de un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 3 bajo condiciones rigurosas.

Con respecto a los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, la secuencia de hibridación es de mayor preferencia capaz de hibridar en el complemento de un ácido nucleico que codifica los polipéptidos como se representa por la SEQ ID NO: 197 o una porción del mismo.

De preferencia, la secuencia de hibridación codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una o más de las siguientes características: - cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como uno representado en la Figura 10, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 198 en lugar de con cualquier otro grupo; - comprende uno o más de los siguientes dominios SSF53383, PTHR11601; PF00266 y G3DSA: 3. 0.640.10 - comprenda cualquiera de uno o más de los motivos 7 a 13 (como se representa por la SEQ ID NO 273, 274, 275, 280, 281, 282, 283, respectivamente) como se proporciona en la presente, y - tiene al menos 40% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 198.

En una modalidad, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar en el complemento de un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 197 o a una porción de la misma bajo condiciones de media o alta rigurosidad, de preferencia a alta rigurosidad como se definió en lo anterior. En otra modalidad, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar en el complemento de un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 197 bajo condiciones rigurosas.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, la secuencia de hibridación es de mayor preferencia capaz de hibridar en el complemento de un ácido nucleico que codifica el polipéptido como se representa por la SEQ ID NO: 284 o una porción de la mismo. En una modalidad, las condiciones de hibridación son de media rigurosidad, de preferencia de alta rigurosidad, como se define en la presente.

De preferencia, la secuencia de hibridación codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos la cual, cuando tiene una longitud completa y se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 14, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos de PLPCasa que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 285 en lugar de con cualquier otro grupo, y/o comprende motivos de cualquiera de los motivos 14 a 16, de preferencia cualquiera de los motivos 17 a 19, o de preferencia cualquiera de los motivos 20 a 22, de mayor preferencia comprende cualquier de los motivos 23 a 25, y/o tiene actividad biológica de fosfolipasa y/o carboxilesterasa, y/o tiene al menos 60% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 285.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una variante de empalme que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en lo anterior, una variante de empalme siendo como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para intensificar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Con respecto a los polipéptidos de DUF642, las variantes de empalme preferidas son las variantes de empalme de un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de la SEQ ID NO: 2. De preferencia, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos de DUF642 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2 y/o 4, en lugar de con cualquier otro grupo, comprende al menos uno de los motivos 1 a 6 (SEQ ID NO: 181 a 186) , y/o tiene al menos 50% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 2 ó 4.

Con respecto a los polipéptidos similares relacionado con epimerasa, las variantes de empalme preferidas son variantes de empalme de un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 197, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de la SEQ ID NO: 198. De preferencia, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme, tiene una o más de las siguientes características : - cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 10, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 198 en lugar de con cualquier otro grupo; - comprende uno o más de los siguientes dominios SSF53383, PTHR11601; PF00266 y G3DSA: 3.40.640.10 - comprende uno o más de los motivos 7 a 13 (como se representa por la SEQ ID NO 273, 274, 275, 280, 281, 282, 283, respectivamente) como se proporciona en la presente, y - tiene al menos 40% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 198.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, las variantes de empalme preferidas son las variantes de empalme de un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 284, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de la SEQ ID NO: 285. De preferencia, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 14, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos de PLPCasa que comprenden la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 285 en lugar de que con cualquier otro grupo, y/o comprende motivos de cualquiera de los motivos 14 a 16, de preferencia cualquiera de los motivos 17 a 19, o de preferencia cualquiera de los motivos 20 a 22, de mayor preferencia comprende cualquiera de los motivos 23 a 25, y/o tiene actividad biológica de fosfolipasa y/o carboxilesterasa, y/o tiene al menos 60% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 285.

Otra variante de ácido nucleico útil en el desempeño de los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente, una variante alélica siendo como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para intensificar mejorar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de cualquiera de los ácidos nucleicos dados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Con respecto a los polipéptidos de DUF642, los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica como el polipéptido de DUF642 de la SEQ ID NO: 2 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla Al de la sección de Ejemplos. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y se abarcan dentro de los métodos de la presente invención el uso de estos alelos naturales. De preferencia, la variante alélica es una variante alélica de SEQ ID NO: l o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de la SEQ ID NO: 2. De preferencia, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, las agrupaciones con los polipéptido de DUF642 que comprenden la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO : 2 y/o 4 , en lugar de con cualquier otro grupo, comprende al menos uno de los motivos 1 a 6 (SEQ ID NO: 181 al 186) , y/o tiene al menos 50% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 2 ó 4.

Con respecto a los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica como el polipéptido similar relacionado con epimerasa de la SEQ ID NO: 198 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla A2 de la sección de Ejemplos. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y se abarcan dentro de los métodos de la presente invención el uso de estos alelos naturales. De preferencia, la variante alélica es una variante alélica de la SEQ ID NO: 197 o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de la SEQ ID NO: 198. De preferencia, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica tiene una o más de las siguientes características: - cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 10, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 198 en lugar de con cualquier otro grupo; comprende uno o más de los siguientes dominios SSF53383, PTHR11601; PF00266 y G3DSA: 3.40.640.10 - comprende uno o más de los motivos 7 a 13 (como se representa por la SED ID NO 273, 274, 275, 280, 281, 282, 283, respectivamente), como se proporciona en la presente, y - tiene al menos 40% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 198.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica como el polipéptido de la PLPCasa de la SEQ ID NO. 285 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla A3 de la sección de Ejemplos. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y se abarcan dentro de los métodos de la presente invención el uso de estos alelos naturales. De preferencia, la variante alélica es una variante alélica de la SEQ ID NO: 284 o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de la SEQ ID NO: 285. De preferencia, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 14, las agrupaciones con los polipéptidos de PLPCasa que comprenden la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 285 en lugar de con cualquier otro grupo, y/o comprende motivos de cualquiera de los motivos 14 a 16, de preferencia cualquiera de los motivos 17 a 19, o de preferencia cualquiera de los motivos 20 a 22, de mayor preferencia comprende cualquiera de los motivos 23 a 25, y/o tiene actividad biológica de fosfolipasa y/o carboxilesterasa, y/o tiene al menos 60% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 285.

También pueden utilizarse transposiciones genéticas o evolución dirigida para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de DUF642, o polipéptidos similares relacionado con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa como se define en la presente, el término "transposiciones genéticas" siendo como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta la variante de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, la variante de ácido nucleico se obtiene por transposición genética.

Con respecto a los polipéptidos de DUF642, la secuencia de aminoácidos codificada por el variante de ácido nucleico obtenido por transposiciones genéticas, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, de preferencia las agrupaciones con el grupo de polipéptidos de DUF642 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2 y/o 4, en lugar de con cualquier otro grupo, comprende al menos uno de los motivos 1 a 6 (SEQ ID NO: 181 al 186) , y/o tiene al menos 50% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 2 ó 4.

Con respecto a los polipéptidos similares relacionado con epimerasa, la secuencia de aminoácidos codificada por el variante de ácido nucleico obtenido por transposiciones genéticas, de preferencia es una secuencia de aminoácidos que tiene una o más de las siguientes características: - cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel representado en la Figura 10, las agrupaciones con el grupo de polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 198 en lugar de con cualquier otro grupo; - comprende uno o más de los siguientes dominios SSF53383, PTHR11601; PF00266 y G3DSA: 3.40.640.10 - comprende cualquiera de uno o más de los motivos 7 a 13 (como se representa por la SEQ ID NO 273, 274, 275, 280, 281, 282, 283, respectivamente) como se proporciona en la presente, y - tiene al menos 40% de identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 198.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de ácido nucleico obtenida por transposiciones genéticas, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 14, de preferencia agrupaciones con el grupo de polipéptidos de PLPCasa que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 285 en lugar de con cualquier otro grupo, y/o comprende motivos de cualquiera de los motivos 14 a 16, de preferencia cualquiera de los motivos 17 a 19, o de preferencia cualquiera de los motivos 20 a 22, de mayor preferencia comprende cualquiera de los motivos 23 a 25, y/o tiene actividad biológica de fosfolipasa y/o carboxilesterasa, y/o tiene al menos 60% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 285.

Además, las variantes de ácidos nucleicos también pueden obtenerse por mutagénesis de sitio dirigido. Diversos métodos se encuentran disponibles para lograr la mutagénesis de sitio dirigido, los más comunes siendo métodos a base de PCR (Protocolos Actuales en Biología Molecular. Wiley Eds.) .

Con respecto a los polipéptidos de DUF642, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de DUF642 pueden derivarse de cualquier fuente natural o artificial . El ácido nucleico puede modificarse a partir de su forma nativa en composiciones y/o ambientes genómicos a través de manipulación humana deliberada. De preferencia, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642 es de una planta, de mayor preferencia de más de una planta monocotiledónea, de mayor preferencia de la familia Poaceae, de mayor preferencia el ácido nucleico es de Oryza sativa.

Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642 de la SEQ ID NO: 2 pueden generarse a partir del ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642 de la SEQ ID NO: 2 por alteración de diversos nucleótidos, por ejemplo, por mutagénesis de sitio dirigido utilizando métodos basados en PCR (véase Protocolos Actuales en Biología Molecular, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y actualizaciones anuales) ) . Los polipéptidos de DUF642 que difieren de la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 por uno o diversos aminoácidos pueden utilizarse para aumentar el rendimiento de plantas en los métodos y constructos y plantas de la invención.

Con respecto a los polipéptidos similares relacionado con epimerasa, el ácido nucleico que codifica los polipéptidos similares relacionados con epimerasa pueden derivarse de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico puede modificarse a partir de su forma nativa en la composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. De preferencia, el ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa es de una planta, de mayor preferencia de una planta dicotiledónea, adicionalmente de preferencia de la familia Salicaceae, de mayor preferencia el ácido nucleico es del género Populus, y de mayor preferencia el ácido nucleico es de Populus trichocarpa.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de PLPCasa pueden derivarse de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico puede modificarse a partir de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de la manipulación humana deliberada. De preferencia, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa es de una planta, de mayor preferencia de una planta dicotiledónea, de mayor preferencia de la familia Fabaceae, de mayor preferencia del género Medicago, de mayor preferencia el ácido nucleico es de Medicago truncatula.

Los polipéptidos de PLPCasa que difieren de la secuencia de la SEQ ID NO: 285 por uno o diversos aminoácidos (una o más sustituciones, o una o más inserciones y/o una o más eliminaciones como se define en lo anterior) pueden igualmente ser útiles para aumentar el aumentar el rendimiento de plantas en los métodos y constructos y plantas de la invención.

En otra modalidad, la presente invención se extiende al ADN cromosomal recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico útil en los métodos de la invención, en donde el ácido nucleico se encuentra presente en el ADN cromosomal como resultado de los métodos recombinantes, es decir, el ácido nucleico no se encuentra en el ADN cromosomal en su nativo circundante. El ADN cromosomal recombinante puede ser un cromosoma de origen natural, con el ácido nucleico insertado por medios recombinantes, o puede ser un mini-cromosoma o una estructura cromosómica no nativa, por ejemplo, o un cromosoma artificial. La naturaleza del ADN cromosomal puede variar, siempre y cuando se permita el paso estable en las generaciones sucesivas del ácido nucleico recombinante útil en los métodos de la invención, y permite la expresión del ácido nucleico en una célula vegetal viva que resulta en el rendimiento incrementado o aumento en los rasgos relacionados con rendimiento incrementado de la célula vegetal o una planta que comprende la célula vegetal . En una modalidad adicional el ADN cromosomal recombinante de la invención se encuentra comprendido en una célula vegetal .

El desempeño de los métodos de la invención da plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado. En particular, el desempeño de los métodos de la invención da plantas que tienen rendimiento incrementado, especialmente rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control . El término "rendimiento" y "rendimiento de semilla" se describen en más detalle en la sección de "definiciones" en la presente.

Con referencia en la presente a los rasgos relacionados con rendimiento mejorado se entiende un incremento de vigor temprano y/o en biomasa (peso) de una o más partes de una planta, los cuales pueden incluir (i) partes sobre el suelo y, de preferencia partes cosechables sobre el suelo y/o (ii) las partes bajo el suelo y de preferencia cosechables bajo el suelo. En particular, tales partes cosechables son semillas, y el desempeño de los métodos de la invención resulta en plantas que tienen rendimiento de semilla incrementado en relación con el rendimiento de semillas de las plantas control.

La presente invención proporciona un método para incrementar el rendimiento, especialmente el rendimiento de semillas de las plantas, en relación con las plantas control, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en la presente.

La presente invención también proporciona un método para incrementar el rendimiento, y más particularmente el rendimiento de semilla incrementado y/o la biomasa incrementada, en relación con las plantas control, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en la presente.

La presente invención también proporciona un método para incrementar el rendimiento, especialmente mejorando la biomasa de raíz de las plantas, en relación con las plantas control, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente .

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el desempeño de los métodos de la invención da plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento con relación a las plantas control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para aumentar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente.

El desempeño de los métodos de la invención da plantas cultivadas bajo condiciones sin estrés o bajo condiciones de sequía leve de rendimiento incrementado en relación con las plantas control cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento en las plantas cultivadas bajo condiciones sin estrés o bajo condiciones de sequía leve, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa.

El desempeño de los métodos de la invención da plantas cultivadas bajo condiciones de sequía, rendimiento incrementado en relación con las plantas control cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de sequía, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa.

El desempeño de los métodos de la invención da plantas cultivadas bajo condiciones de deficiencia de nutrientes, particularmente bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno, rendimiento aumentado en relación con las plantas control cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para aumentar los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas cultivadas bajo condiciones de deficiencia de nutrientes, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa.

El desempeño de los métodos de la invención da plantas cultivadas . bajo condiciones de estrés salino, el rendimiento aumentado en relación con las plantas control cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento en las plantas cultivadas bajo condiciones de estrés salino, el método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa.

La invención también proporciona constructos genéticos y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en plantas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de DUF642, o polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa. Los constructos genéticos pueden insertarse en los vectores, los cuales pueden estar comercialmente disponibles, adecuados a la transformación en plantas o células huésped y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también proporciona el uso de un constructo genético como se define en la presente en los métodos de la invención.

Más específicamente, la presente invención proporciona un constructo que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente; (b) una o más secuencias control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (a) y opcionalmente; (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

De preferencia, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa es como se define en la presente. El término "secuencia control" y "secuencia de terminación" son como se definen en la presente .

En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un constructo que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa como se representa por cualquiera de las SEQ ID NO: 299, 303, 305, 313, 317, 337 ó 347; (b) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (a) y opcionalmente; (c) una secuencia de terminación de transcripción.

El constructo genético de la invención puede estar comprendido de una célula huésped, célula vegetal, semilla, producto agrícola o la planta. Las plantas o células huésped se transforman con un constructo genético tal como un vector o un cásete de expresión que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente. Por lo tanto, la invención proporciona, además, plantas o células huésped transformadas con un constructo como se describe en lo anterior. En particular, la invención proporciona plantas transformadas con un constructo como se describe en lo anterior, las plantas con rasgos relacionados con rendimiento incrementado como se describe en la presente.

En una modalidad, el constructo genético de la invención confiere uno o más rasgos relacionados con rendimiento o rendimiento incrementado en una planta vegetal viva cuando se ha introducido en la célula vegetal y se expresa el ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642, o el polipéptido similar relacionado con epimerasa, o el polipéptido de PLPCasa, comprendido en el constructo genético.

El técnico especializado es muy consciente de los elementos genéticos que deben presentarse en los constructos genéticos para transformar, seleccionar y propagar exitosamente células huésped que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés se enlaza operablemente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor) .

El promotor en tal constructo genético puede ser un promotor no nativo en el ácido nucleico descrito en lo anterior, es decir, un promotor el cual no regula la expresión de los polinucleótidos descritos en la presente en su nativo circundante .

Ventajosamente, cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, puede utilizarse para manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico, pero de preferencia el promotor es de origen vegetal. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los métodos . De preferencia, el promotor constitutivo es un promotor constitutivo ubicuo de resistencia media. Véase la sección de "definiciones" en la presente para las definiciones de los diversos tipos de promotor.

El promotor constitutivo es de preferencia un promotor constitutivo ubicuo de resistencia media. De mayor preferencia es un promotor derivado de la planta, por ejemplo, un promotor de origen cromosomal de la planta, tal como un promotor de G0S2 o un promotor de sustancialmente la misma resistencia y que tiene sustancialmente el mismo patrón de expresión (un promotor funcionalmente equivalente) , de mayor preferencia el promotor es el promotor de G0S2 promotor de arroz. Además, de preferencia el promotor constitutivo se representa por una secuencia de ácido nucleico sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 189, o SEQ ID NO: 278, o SEQ ID NO: 361, de mayor preferencia el promotor constitutivo es como se representa por la SEQ ID NO: 189, o la SEQ ID NO: 278, o la SEQ ID NO: 361. Véase la sección "definiciones" en la presente para ejemplos adicionales de promotores constitutivos.

Con respecto a los polipéptidos de DUF642, debe aclararse que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642 representado por la SEQ ID NO: 1 ó 3, ni se restringe la aplicabilidad de la invención a la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642 cuando se maneja por un promotor constitutivo.

Con respecto a los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, debe aclararse que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa representado por la SEQ ID NO: 197, ni se restringe la aplicabilidad de la invención a la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa cuando se maneja por un promotor constitutivo, o cuando se maneja por un promotor específico de raíz.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, debe aclararse que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa representado por la SEQ ID NO: 284, ni se restringe la aplicabilidad de la invención a la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa cuando se maneja por un promotor constitutivo.

Con respecto a los polipéptidos de DUF642, opcionalmente , una o más secuencias de terminación pueden utilizarse en el constructo introducido en una planta. De preferencia, el constructo comprende un cásete de expresión que comprende un promotor GOS2, sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 189, enlazado operablemente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642. De mayor preferencia, el constructo comprende un terminador de zeína (t-zeina) enlazado al extremo 3' de la secuencia de codificación DUF642. De mayor preferencia, el cásete de expresión comprende una secuencia que tiene un orden de incremento de preferencia al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad en la secuencia representada por la SEQ ID NO: 187 ó 188 (pPRO: : DUF642 :: secuencia t-zeína) . Además, una o más secuencias que codifican los marcadores seleccionables pueden estar presentes en el constructo introducido en una planta.

Con respecto a los polipéptido similares relacionados con epimerasa, opcionalmente, una o más secuencias de terminación pueden utilizarse en el constructo introducido en una planta. De preferencia, el constructo comprende un cásete de expresión que comprende un promotor G0S2, sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 278, enlazado operablemente al ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa. De mayor preferencia, el constructo comprende un terminador de zeína (t-zeína) enlazado al extremo 3' de la secuencia de codificación de un polipéptido similar relacionado con epimerasa. De mayor preferencia, el cásete de expresión comprende una secuencia que tiene un orden de incremento de preferencia al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad en la secuencia representada por la SEQ ID NO: 279 (pPRO: :ERL: : secuencia t-zeína). Además, una o más secuencias que codifican los marcadores seleccionables pueden estar presentes en el constructo introducido en una planta.

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, opcionalmente, una o más secuencias de terminación pueden utilizarse en el constructo introducido en una planta. De preferencia, el constructo comprende un cásete de expresión que comprende un promotor G0S2, sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 361, enlazado operablemente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa. De mayor preferencia, el cásete de expresión comprende la secuencia representada por la SEQ ID NO: 360 (pG0S2 :: PLPCasa :: secuencia t-zeína) . Además, una o más secuencias que codifican los marcadores seleccionables pueden estar presentes en el constructo introducido en una planta.

De acuerdo con una característica preferida de la invención, la expresión modulada es la expresión incrementada. Los métodos para incrementar la expresión de los ácidos nucleicos o genes, o productos de genes, se encuentran bien documentados en la técnica y los ejemplos se proporcionan en la sección de definiciones .

Como se menciona en lo anterior, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa es al introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o polipéptido similar relacionado con epimerasa o un polipéptido de PLPCasa, sin embargo los efectos de desempeño del método, es decir, los rasgos relacionados con rendimiento mejorado también pueden lograrse utilizando otras técnicas bien conocidas, que incluyen, pero no se limitan a etiquetado por activación de ADN-T, TILLING, recombinación homóloga. Una descripción de estas técnicas se proporciona en la sección de definiciones.

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tengan rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, que comprenden la introducción y expresión en una planta de cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente .

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado, particularmente el rendimiento incrementado, más particularmente el rendimiento de semilla incrementado, cuyo método comprende : (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642, o un constructo genético que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642; y (ii) cultivar la célula vegetal bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido de DUF642 como se define en la presente.

Más específicamente, la presente invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado, particularmente rendimiento incrementado, y más particularmente rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, cuyo método comprende: (i) introducir y expresar en una planta o célula vegetal una ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa o un constructo genético que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa; y (ii) cultivar la célula vegetal bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en la presente .

Más específicamente, la presente invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado, particularmente biomasa de raíz incrementada, cuyo método comprende: (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa o un constructo genético que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa; y (ii) cultivar la célula vegetal bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente.

Cultivar la célula vegetal bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta, puede o no incluir la regeneración y/o el crecimiento hasta la madurez. Por consiguiente, en una modalidad particular de la invención, la célula vegetal transformada por el método de acuerdo con la invención es capaz de regenerarse en una planta transformada. En otra modalidad particular, la célula vegetal transformada por el método de acuerdo con la invención no es regenerable en una planta transformada, es decir, las células que no son capaces de regenerarse en una planta utilizando técnicas de cultivo celular conocidas en el arte. Aunque las células vegetales generalmente tienen la característica de totipotencia, algunas células vegetales no pueden utilizarse para regenerar o propagar plantas intactas a partir de tales células. En una modalidad de la invención, las células vegetales de la invención son tales células. En otra modalidad, las células vegetales de la invención son células vegetales que no se sustentan por sí mismas en una forma autotrófica.

El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula vegetal o en la planta misma (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta) . De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce de preferencia en una planta o célula vegetal por transformación. El término "transformación" se describe en más detalle en la sección de "definiciones" en la presente.

En una modalidad, la presente invención se extiende a cualquier planta o célula vegetal producida por cualquiera de los métodos descritos en la presente, y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma.

La presente invención abarca plantas o partes de la misma (incluidas las semillas) obtenibles por los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o partes de plantas o células vegetales comprenden un transgen de ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente, de preferencia en un constructo genético tal como un cásete de expresión. La presente invención se extiende además para abarcar la progenie de una célula transformada o transfectada principal, tejido, órgano o la planta completa que se ha producido por cualquiera de los métodos anteriormente mencionados, el único requisito es que la progenie exhiba las mismas características genotipicas y/o fenotípicas como aquellas producidas por la madre en los métodos de acuerdo con la invención.

En una modalidad adicional la invención se extiende a semillas que comprenden los casetes de expresión de la invención, las constructos genéticos de la invención, o los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de DUF642, o los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o los polipéptidos de PLPCasa y/o los polipéptidos de DUF642, o los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o los polipéptidos de PLPCasa como se describe en lo anterior.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa como se define en la presente. En una modalidad, las células huésped de acuerdo con la invención son células vegetales, levaduras, bacterias u hongos. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos, constructos, cásete de expresión o el vector utilizado en el método de acuerdo con la invención son, en principio, ventajosamente todas las plantas que son capaces de sintetizar los polipéptidos utilizados en el método inventivo. En una modalidad particular, las células vegetales de la invención sobreexpresan la molécula de ácido nucleico de la invención.

Los métodos de la invención son venta osamente aplicables a cualquier planta, en particular, a cualquier planta como se define en la presente. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia de Viridiplantae , en particular plantas monocotiledoneas y dicotiledóneas, incluyendo forraje o plantas forrajeras, plantas ornamentales, cultivo de alimentos, árboles o arbustos . De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Ejemplos de plantas de cultivo incluyen, pero no se limitan a achicoria, zanahoria, mandioca, trébol, soya, remolacha, remolacha azucarera, girasol, cañóla, alfalfa, colza, linaza, algodón, tomate, papa y tabaco. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la planta es una planta monocotiledónea . Ejemplos de plantas monocotiledoneas incluyen caña de azúcar.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la planta es un cereal. Ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, trigo escaña, tef, milo y avena. En una modalidad particular, las plantas utilizadas en los métodos de la invención se seleccionan del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, soya, algodón, colza oleaginosa que incluye cañóla, caña de azúcar, remolacha azucarera y alfalfa. Ventajosamente, los métodos de la invención son más eficientes que los métodos conocidos, debido a que las plantas de la invención tienen rendimiento y/o tolerancia incrementados a un estrés ambiental comparado con las plantas control utilizadas en métodos comparables. En otra modalidad de la presente invención las plantas de la invención y las plantas utilizadas en los métodos de la invención son plantas de caña de azúcar con contenido de biomasa incrementado y/o azúcar incrementada de los brotes. En aún otra modalidad de la presente invención las plantas de la invención y las plantas utilizadas en los métodos de la invención son plantas de remolacha azucarera con contenido de biomasa incrementado y/o azúcar incrementada de la remolacha.

La invención también se extiende a partes cosechables de una planta tales como, pero no limitadas a semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos, cuyas partes cosechables comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de DUF642, o un polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un polipéptido de PLPCasa. La invención además se refiere a productos derivados o producidos, de preferencia derivados o producidos directamente, de una parte cosechable de tal planta, tal como gránulos secos, harina o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

La invención también incluye métodos para fabricar un producto que comprende a) cultivar las plantas de la invención y b) producir el producto a partir de o por las plantas de la invención o partes de las mismas, que incluyen semillas. En una modalidad adicional, los métodos comprenden las etapas de a) cultivar las plantas de la invención, b) remover las partes cosechables como se describe en la presente a partir de las plantas y c) producir el producto de, o con las partes cosechables de plantas de acuerdo con la invención.

Ejemplos de tales métodos pueden ser el cultivo de plantas de maíz de la invención, la cosecha de las mazorcas de maíz y la eliminación de los granos. Estos pueden utilizarse como pienso o procesarse en almidón y aceite como productos agrícolas. El producto puede producirse en el sitio en donde la planta se ha cultivado, o las plantas o partes de la misma pueden removerse del sitio donde la planta se ha cultivado para producir el producto. Típicamente, la planta se cultiva, las partes cosechables deseadas se remueven de la planta, si es posible en ciclos repetidos, y el producto fabricado a partir de las partes cosechables de la planta. La etapa de crecimiento de la planta puede realizarse sólo una vez cada vez que se realizan los métodos de la invención, al tiempo que permite repetidas veces las etapas de producción de producto, por ejemplo por remoción repetida de partes cosechables de las plantas de la invención y si es necesario el procesamiento adicional de estas partes para llegar al producto. También es posible que la etapa de crecimiento de las plantas de la invención se repita y las plantas o las partes cosechables se almacenen hasta que la producción del producto se realice entonces una vez para las plantas o partes de plantas acumuladas. También, las etapas de crecimiento de las plantas y la producción del producto pueden realizarse con una superposición en el tiempo, incluso simultáneamente en gran medida, o secuencialmente . En general, las plantas se hacen crecer durante algún tiempo antes de que se produzca el producto.

En una modalidad, los productos producidos por los métodos de la invención son productos de origen vegetal tales como, pero no limitados a, pienso, alimentos, suplementos de pienso, suplemento de alimentos, fibras, cosméticos o productos farmacéuticos. En otra modalidad los métodos de producción se utilizan para elaborar productos agrícolas tales como, pero no limitados a, extractos de plantas, proteínas, aminoácidos, carbohidratos, grasas, aceites, polímeros, vitaminas, y similares.

En aún otra modalidad, los polinucleótidos o los polipéptidos de la invención están comprendidos en un producto agrícola. En una modalidad particular, las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de proteína de la invención pueden utilizarse como marcadores de productos, por ejemplo, en donde un producto agrícola se produjo por los métodos de la invención. Tal marcador puede utilizarse para identificar un producto que se ha producido por un proceso ventajoso resultando no solamente en una mayor eficiencia del proceso sino también la calidad mejorada del producto debido a la calidad incrementada del material vegetal y las partes cosechables utilizadas en el proceso. Tales marcadores pueden detectarse por una variedad de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, pero no limitados a métodos basados en PCR para la detección de ácido nucleico o métodos basados en anticuerpos para detección de la proteína.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de DUF642, los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa como se describe en la presente y el uso de estos polipéptidos DUF642, o polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa en mejorar cualquiera de los rasgos relacionados con rendimiento antes mencionados en plantas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de DUF642, o polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa descritos en la presente, o los polipéptidos de DUF642, o los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o los polipéptidos de PLPCasa mismos, pueden encontrar uso en programas de cruza en los cuales un marcador de ADN se identifica que puede enlazarse genéticamente a un gen que codifica el polipéptido de DUF642, o un gen que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un gen que codifica el polipéptido de PLPCasa. Los ácidos nucleicos/genes, o los polipéptidos de DUF642, o los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o los polipéptidos de PLPCasa mismos pueden utilizarse para definir un marcador molecular. Este marcador de ADN o de proteína puede utilizarse entonces en programas de cruza para seleccionar plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado como se define en la presente en los métodos de la invención. Además, las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica el polipéptido de DUF642, o un ácido nucleico/gen que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa, o un ácido nucleico/gen que codifica el polipéptido de PLPCasa puede encontrar uso en programas de cruza asistida por un marcador. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de DUF642, o los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, o polipéptidos de PLPCasa también pueden utilizarse como sondas para mapear genética y físicamente los genes que son una parte de, y como marcadores para los rasgos enlazados a estos genes. Tal información puede ser útil en la cruza de plantas para desarrollar líneas con fenotipos deseados.

Con respecto a los polipéptidos de DUF642, en una modalidad se realiza cualquier comparación para determinar porcentajes de identidad de secuencia - en el caso de una comparación de los ácidos nucleicos sobre la región de codificación completa de la SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 3, o - en el caso de una comparación de secuencias de polipéptido sobre la longitud completa de la SEQ ID NO : 2 o SEQ ID NO : 4.

Por ejemplo, una identidad de secuencia de 50% de identidad de secuencia en esta modalidad significa que sobre la región de codificación completa de la SEQ ID NO: 1, 50 por ciento de todas las bases son idénticas entre la secuencia de SEQ ID NO: 1 y la secuencia relacionada. Similarmente , en esta modalidad una secuencia de polipéptido es 50% idéntica a la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 2, cuando el 50 por ciento de los residuos de aminoácidos de la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 2, se encuentran en el polipéptido probado cuando se comparan a partir de la metionina de partida al final de la secuencia de SEQ ID NO: 2.

Con respecto a polipéptidos similares relacionados con epimerasa, en una modalidad se realiza cualquier comparación para determinar los porcentajes de identidad de secuencia - en el caso de una comparación de ácidos nucleicos sobre la región de codificación completa de la SEQ ID NO: 197, o - en el caso de una comparación de secuencias de polipéptido sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 198.

Por ejemplo, una identidad de secuencia de 50% de la identidad de secuencia en esta modalidad significa que sobre la región de codificación completa de la SEQ ID NO: 197, 50 por ciento de todas las bases son idénticas entre la secuencia de la SEQ ID NO: 197 y la secuencia relacionada. Similarmente, en esta modalidad una secuencia de polipéptido es 50% idéntica a la secuencia del polipéptido de la SEQ ID NO: 198, cuando 50 por ciento de los residuos de aminoácidos de la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 198, se encuentran en el polipéptido probado cuando se comparan a partir de la metionina de partida hasta el final de la secuencia de SEQ ID NO: 198.

Además con respecto a los polipéptidos de DUF642, la presente invención se refiere a las siguientes modalidades específicas : 1. Un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, en donde tal polipéptido de DUF642 comprende un dominio de DUF642 IPR006946 de acceso InterPro, de preferencia el polipéptido de DUF642 comprende la secuencia de firma FSAARTCAQ (SEQ ID NO: 194) . 2. El método de acuerdo con la modalidad 1, en donde la expresión modulada se efectúa al introducir y expresar en una planta tal ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642. 3. El método de acuerdo con la modalidad 1 ó 2, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de preferencia comprenden, biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control. 4. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 3, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado se obtienen bajo condiciones sin estrés.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 4, en donde tal polipéptido de DUF642 comprende uno o más de los siguientes motivos : (i) Motivo 1: N [LAM] [VL] KNG [DG] FEEGP [WYH] [MI] [FLI]P[NG] [TS] [STR] [WL] GVL [LVI] P [PTS] [NKM] [LQDV] [EDV] [DE] [ED] [THY] S [PS] L [PS] [GP]W[IMT] [IV] (SEQ ID NO: 181) , (ii) Motivo 2: [VLA] [EKAT] [KPR] G [SAM] [LRH] Y [SA] [LIV] [TI]F[SG] A [AS] RTCAQ [DLAS] E [SVRL] L [NR] [VI] (SEQ ID NO: 182) , (iii) Motivo 3: D[PE] [AT]CGP[LI] [IL] D [AS] [VIF] AI [KR] (SEQ ID NO: 183) El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 5, en donde tal ácido nucleico que codifica un DUF642 es una planta original, de preferencia de una planta monocotiledónea, de mayor preferencia de la familia Poaceae, de mayor preferencia del género Oryza, de mayor preferencia de Oryza sativa.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 6, en donde tal ácido nucleico que codifica un DUF642 codifica cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla Al o es una porción de tal ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridar con tal ácido nucleico.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 7, en donde tal secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos dados en la Tabla Al.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 8, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia en SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 4.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 9 en donde tal ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor constitutivo, de preferencia a un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia a un promotor vegetal, de mayor preferencia a un promotor G0S2, de mayor preferencia a un promotor G0S2 de arroz .

. La planta, parte de la planta de la misma, que incluye semillas, o células vegetales, obtenibles por un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 10, en donde la planta, parte de la planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 y 5 a 9.

. El constructo que comprende: (i) el ácido nucleico que codifica un DUF642 como se define por cualquiera de las modalidades 1 y 5 a 9, (ii) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de transcripción .

. El constructo de acuerdo con la modalidad 12, en donde una de tales secuencias de control es un promotor constitutivo, de preferencia un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia un promotor vegetal, de mayor preferencia un promotor GOS2, de mayor preferencia un promotor G0S2 de arroz .

El uso de un constructo de acuerdo con la modalidad 12 ó 13 en un método para elaborar plantas que tengan rasgos relacionados con rendimiento mejorado, de preferencia el rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control .

. La planta, parte de la planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con la modalidad 12 ó 13.

El método para la producción de una planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control, que comprende: (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 y 5 a 9; y (ii) cultivar tal célula vegetal o planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

La planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, que resulta de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 y 5 a 9 o una célula vegetal transgénica derivada de la planta transgénica .

La planta transgénica de acuerdo con la modalidad 11, 15 ó 17, o una célula vegetal transgénica derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo, tal como la remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, trigo escaña, tef, milo o avena.

. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la modalidad 18, en donde tales partes cosechables son de preferencia acumulación de biomasa y/o semillas.

Los productos derivados de una planta de acuerdo con la modalidad 18 y/o a partir de las partes cosechables de una planta de acuerdo con la modalidad 19.

El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 y 5 a 9, para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para incrementar el rendimiento de semillas y/o para incrementar la biomasa en las plantas en relación con las plantas control .

La planta que tiene rendimiento incrementado, particularmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado, en relación con las plantas control, resulta a partir de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, o una célula vegetal transgénica que se origina de o que es parte de la planta transgénica. 23. Un método para la producción de un producto que comprende las etapas de crecimiento de las plantas de la invención y producir tal producto a partir de o por a. las plantas de la invención o; b. partes, incluyendo semillas, de esas plantas. 24. La planta de acuerdo con la modalidad 11, 15, o 21, o una célula vegetal transgénica que se origina de la misma, o un método de acuerdo con la modalidad 22, en donde la planta es una planta de cultivo, de preferencia una dicotiledónea tal como remolacha azucarera, alfalfa, trébol, achicoria, zanahoria, mandioca, algodón, soya, cañóla o de una monocotiledónea, tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maiz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, sécale, trigo escaña, tef , milo y avena. 25. El constructo de acuerdo con la modalidad 12 ó 13 comprendido en una célula vegetal . 26. El ADN cromosómico recombinante que comprende el constructo de acuerdo con la modalidad 12 ó 13.

Además con respecto a los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, la presente invención se refiere a los siguientes artículos específicos: 1. Un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a epimerasa, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 7: CREEGV [DE] [QK] VFVD [AG] AH [AS] IG [QSC] V [PDE] [VI] [DN] [VM] [KR] [ED] IGADFY [TV] SNLHKWFFCPP [SA] VAFL [YH] (SEQ ID NO: 273) , (ii) Motivo 8: EF [SA] HH [DN] P [GAN] VAR [IV] NNGSFG [CS] CP [AG] S [VI] [LI] AAQ [ARK] [RN] WQ [LR] [LRQ] FL [RQA] QPD [AD] FYF [ND] xL [QRK] [PK]G (SEQ ID NO: 274), (iii) Motivo 9: S [LI] VDNATTAAAIVLQ [HQ] [VAI] [AG] [WR] [AS] FAEG [RKN] FA [KR] [GN] D [AVT] V [LV] MLH [YC] AY [GQ] [AS] VKKSI [EQH] AYV (SEQ ID NO: 275) 2. El método de acuerdo con el artículo 1, en donde la expresión modulada se efectúa al introducir y expresar en una planta tal ácido nucleico que codifica tal polipéptido similar relacionado con epimerasa.

El método de acuerdo con el artículo 1 ó 2, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de preferencia comprenden, biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control .

El método de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 3, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa como se utiliza en la presente comprende un dominio conservado con. al menos 50% de la identidad de secuencia en un dominio conservado como se representa por cualquiera de : - coordenadas de aminoácidos 32 a 449 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 10) ; - coordenadas de aminoácidos 47 a 276 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 11); - coordenadas de aminoácidos 92 a 364 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 12); y - coordenadas de aminoácidos 59 a 323 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 13) .

El método de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 ó 4, en donde tal ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene al menos 40% de identidad de secuencia general en el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 198.

El método de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 5, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa es de origen vegetal, de preferencia de una planta dicotiledónea, además de preferencia de la familia Salicaceae, de mayor preferencia del género Populus, de mayor preferencia de Populus trichocarpa.

El método de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 6, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa codifica cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla A2 o es una porción de tal ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridar con tal ácido nucleico.

El método de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 7, en donde tal secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos dados en la Tabla A2.

El método de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 8, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado se obtienen bajo condiciones sin estrés. 10. El método de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 8, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado se obtienen bajo condiciones de estrés por sequía, estrés por salinidad o deficiencia de nitrógeno. 11. El método de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 10, en donde tal ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor constitutivo, de preferencia a un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia a un promotor vegetal, de mayor preferencia a un promotor GOS2, de mayor preferencia a un promotor GOS2 de arroz . 12. La planta, parte de la misma planta, que incluye las semillas, o células vegetales, obtenibles por un método de acuerdo con cualquiera de artículos l a 11, en donde la planta, parte de la planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define por cualquiera de los artículos 1 y 4 a 8. 13. La planta de acuerdo con el artículo 12 o una célula vegetal derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, sécale, trigo escaña, tef, milo o avena. 4. El constructo que comprende: (i) un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de los artículos 1 y 4 a 8; (ii) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) y, opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de transcripción . 5. El constructo de acuerdo con el artículo 14, en donde una de tales secuencias de control es un promotor constitutivo, de preferencia un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia un promotor vegetal, de mayor preferencia un promotor G0S2, de mayor preferencia un promotor G0S2 de arroz. 6. El uso de un constructo de acuerdo con el artículo 14 ó 15 en un método para elaborar plantas que tengan rasgos relacionados con rendimiento mejorado, de preferencia el rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control . 7. La planta, parte de la planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con el artículo 14 ó 15. 8. La planta de acuerdo con el artículo 17 o una célula vegetal derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, sécale, trigo escaña, tef, milo o avena. 9. El método para la producción de una planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado con respecto a las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control , que comprende : (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de los artículos 1 y 4 a 8 ; y (ii) cultivar tal célula vegetal o planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta. 20. La planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, que resulta de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de los artículos 1 y 4 a 8, o una célula vegetal transgénica derivada de la planta transgénica. 21. La planta transgénica de acuerdo con el artículo 20 o una célula vegetal transgénica derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, sécale, trigo escaña, tef, milo o avena. 2. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con cualquiera de los artículos 12-13, 17-18 ó 20-21, en donde tales partes cosechables son de preferencia acumulación de biomasa y/o semillas . 3. Los productos derivados de una planta de acuerdo con cualquiera de los artículos 12-13, 17-18 ó 20-21 y/o a partir de partes cosechables de una planta de acuerdo con el artículo 22. 4. La molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (i) un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 199; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 199; (iii) un ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa que tiene un orden de incremento de preferencia al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200, y adicional o alternativamente, comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos 7 a 13, y además de preferencia confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, (iv) una molécula de ácido nucleico la cual se hibridiza con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad y de preferencia confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control . 25. El polipéptido aislado seleccionado de: (i) una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden de incremento de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 395, de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200, y adicional o alternativamente, que comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos 7 a 13 , y además de preferencia confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control; (iii) los derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en (i) o (ii) anteriores . 6. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de los artículos l y 4 a 8 y 25; para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para incrementar el rendimiento de la semilla y/o para incrementar la biomasa en plantas en relación con las plantas control. 27. El uso de un ácido nucleico como se define en el artículo 24 y que codifica un polipéptido similar a epimerasa para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para incrementar el rendimiento de semillas en plantas en relación con las plantas control . 28. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de los artículos 1 y 4 a 8 y 25; como marcador molecular. 29. El uso de un ácido nucleico como se define en el artículo 24 y que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de los artículos 1 y 4 a 8 y 25 como marcador molecular. 30. Un método para la producción de un producto que comprende las etapas de crecimiento de las plantas de acuerdo con el artículo 12, 18 ó 20 y producir tal producto a partir de o por (i) tales plantas, o (ii) las partes, incluyendo semillas, de tales plantas . 31. El constructo de acuerdo con el artículo 14 ó 15 comprendido en una célula vegetal. 32. El ADN cromosómico recombinante que comprende el constructo de acuerdo con el artículo 14 ó 15 comprendido.

Por otra parte con respecto a los polipéptidos similares relacionados con epimerasa, la invención es en particular caracterizada por cualquiera de una o más de las siguientes modalidades: I. Un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa al introducir y expresar en una planta tal ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa tiene al menos 80% en total de identidad de secuencia a la del aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 198.

II. El método de acuerdo con la modalidad I, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa comprende uno o más de los siguientes motivos : (i) Motivo 7: CREEGV [DE] [QK] VFVD [AG] AH [AS] IG [QSG] V [PDE] [VI] [DN] [VM] [KR] [ED] IGADFY [TV] SNLHKWFFCPP [SA] VAFL [YH] (SEQ ID NO: 273) , ( ii ) Motivo 8 : EF [SA] HH [DN] P [GAN] VAR [IV] NNGSFG [CS] CP [AG] S [VI] [LI] AAQ [ARK] [RN] WQ [LR] [LRQ] FL [RQA] QPD [AD] FYF [ND]xL[QRK] [PK]G (SEQ ID NO: 274), (iii) Motivo 9: S [LI] VDNATTAAAIVLQ [HQ] [VAI] [AG] [WR] [AS] FAEG [RKN] FA [KR] [GN] D [AVT] V [LV] MLH [YC] AY [GQ] [AS] VKKSI [EQH] AYV (SEQ ID NO: 275) III. El método de acuerdo con la modalidad I o II, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden biomasa incrementada .

IV. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades I a III, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden el rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control .

V. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades I a IV, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa como se utiliza en la presente comprende al menos dos dominios conservados seleccionados del grupo que comprende PyrdxIP-dep_Trfase_major (SSF53383) , PTHR11601, Aminotran_5 (PF00266) y PyrdxIP- dep_Trfase_maj or_subl (G3DSA: 3.40.640.10), y de preferencia comprende i) un Dominio conservado Aminotran_5 e ii) al menos otro dominio conservado seleccionado del grupo que comprende PyrdxIP-dep_Trfase_major (SSF53383) , PTHR11601, y PyrdxIP-dep_Trfase_maj or_subl (G3DSA: 3.40.640.10) , VI . El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades I a IV, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa comprende un dominio conservado con al menos 50% de la identidad de secuencia en un dominio conservado como el representado por cualquiera de : - coordenadas de aminoácidos 32 a 449 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 10) ; - coordenadas de aminoácidos 47 a 276 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 11) ; - coordenadas de aminoácidos 92 a 364 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 12) ; y - coordenadas de aminoácidos 59 a 323 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 13) .

VII. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades I a VI, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa es de origen vegetal, de preferencia de una planta dicotiledónea, además de preferencia de la familia Salicaceae, de mayor preferencia del género Populus, de mayor preferencia de Populus trichocarpa.

VIII. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades I a VII, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa codifica cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla A2 o es una porción de tal ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridar con tal ácido nucleico.

IX. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades I a VIII, en donde tal secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos dados en la Tabla A2.

X. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades I a IX, en donde tal ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor G0S2 , de preferencia a un promotor G0S2 de arroz .

XI. El constructo comprende: (i) ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de las modalidades I y V a IX; (ii) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) , y de preferencia un promotor constitutivo, de preferencia a un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia a un promotor vegetal, de mayor preferencia a un promotor G0S2, de mayor preferencia a un promotor G0S2 de arroz, y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de transcripció .

XII. La planta, parte de la planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con la modalidad XI.

XIII. El método para la producción de una planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado con respecto a las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control, que comprende: (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de las modalidades I y V a IX; y (ii) cultivar tal célula vegetal o planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

XIV. La planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, que resulta de la introducción y expresión en el mismo de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de las modalidades I y V a IX; o una célula vegetal transgénica derivada de la planta transgénica. XV. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de las modalidades I y V a IX; para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para incrementar el rendimiento de semillas y/o para incrementar la biomasa de las plantas en relación con las plantas control .

Con respecto a los polipéptidos de PLPCasa, la presente invención se refiere a las siguientes modalidades específicas : 1. Un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de Fosfolipasa carboxilesterasa/ (PLPCasa) , en donde tal polipéptido de PLPCasa comprende un acceso InterPro IPR003140 que corresponde con el número de acceso PFAM PF022030 del dominio de Fosfolipasa/carboxilesterasa (PLPCasa) .

El método de acuerdo con la modalidad 1, ' en donde la expresión modulada se efectúa al introducir y expresar en una planta tal ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa.

El método de acuerdo con las modalidades 1 ó 2, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de preferencia comprenden, biomasa de raíz incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades X a 3, . en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado se obtienen bajo condiciones sin estrés.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 3, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado se obtienen bajo condiciones de estrés por sequía, estrés por salinidad o deficiencia de nitrógeno.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 5, en donde tal polipéptido de PLPCasa comprende uno o más de los siguientes motivos : (i) Motivo 14: E [FY] G [KR] T [HY] WRPKG [KR] HQATIVWLHGLGDNG [LSA] S [SW]SQLL[ED] [ST] LPLPNIKWICPTA (SEQ ID NO: 348), (ii) Motivo 15: PDD [WIVL] EGLDASAAH [IV] ANLLS [TS] EP [AS] D [VI] K [VL] G[IV]G (SEQ ID NO: 349), (Üi) Motivo 16: FSMGAA [TI] ALYSA [TA] C [YF] A [MHL] (SEQ ID NO : 350) El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 6, en donde tal ácido nucleico que codifica una PLPCasa es de origen vegetal, de preferencia de una planta dicotiledónea, además de preferencia de la familia Fabaceae, de mayor preferencia del género Medicago, de mayor preferencia de Medicago truncatula.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 7, en donde tal ácido nucleico que codifica una PLPCasa codifica cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla A3 o es una porción de tal ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridar con tal ácido nucleico.

El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 8, en donde tal secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos dados en la Tabla A3. 0. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 9, en donde tal ácido nucleico codifica el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 285. 1. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 10, en donde tal ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor constitutivo, de preferencia a un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia a un promotor vegetal, de mayor preferencia a un promotor GOS2, de mayor preferencia a un promotor GOS2 de arroz . 2. La planta, parte de la misma planta, que incluye las semillas, o célula vegetal, obtenibles por un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 11, en donde la planta, parte de la planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades l y 6 a 10. 3. El constructo comprende: (i) ácido nucleico que codifica una PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 1 y (ii) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) y, opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de transcripción . 4. El constructo de acuerdo con la modalidad 13, en donde una de tales secuencias de control es un promotor constitutivo, de preferencia un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia un promotor vegetal, de mayor preferencia un promotor G0S2, de mayor preferencia un promotor G0S2 de arroz . 5. El uso de un constructo de acuerdo con la modalidad 13 ó 14 en un método para elaborar plantas que tengan rasgos relacionados con rendimiento mejorado, de preferencia el rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia la biomasa de raíz incrementada, el índice de verdor incrementado y/o el rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control. 6. La planta, parte de la planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con la modalidad 13 ó 14. 7. El método para la producción de una planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado con respecto a las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia la biomasa de raíz incrementada, el índice de verdor incrementado y/o rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control , que comprende : (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 1 y 6 a 10; y (ii) cultivar tal célula vegetal o planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta. 8. La planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, que resulta de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 1 y 6 a 10 o una célula vegetal transgénica derivada de la planta transgénica . 19. La planta transgénica de acuerdo con la modalidad 12, 16 ó 18, o una célula vegetal transgénica derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una planta monocotiledonea tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, sécale, trigo escaña, tef, milo o avena. 20. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la modalidad 18 ó 19, en donde tales partes cosechables son de preferencia biomasa de raíz y/o semillas. 21. Los productos derivados de una planta de acuerdo con la modalidad 18 ó 19 y/o a partir de partes cosechables de una planta de acuerdo con la modalidad 20. 22. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 1 y 6 a 10 para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para la biomasa de raíz, el índice de verdor incrementado y/o rendimiento de semilla incrementado en las plantas en relación con las plantas control . 23. Un método para la producción de un producto que comprende las etapas de crecimiento de las plantas de acuerdo con la modalidad 16, 18 ó 19 y producir tal producto a partir de o por (i) tales plantas, o (ii) las partes, incluyendo semillas, de tales plantas . 24. El constructo de acuerdo con la modalidad 13 ó 14 comprendido en una célula vegetal.

La presente invención también se refiere a las modalidades: 1. Un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642, en donde tal polipéptido de DUF642 comprende la secuencia de firma FSAARTCAQ (SEQ ID NO : 194) . 2. El método de acuerdo con la modalidad 1, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido representado por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 4. 3. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 9, en donde tal ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor constitutivo, de preferencia a un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia a un promotor vegetal, de mayor preferencia a un promotor G0S2, de mayor preferencia a un promotor G0S2 de arroz . 4. La planta, parte de la misma planta, que incluye las semillas, o célula vegetal, obtenibles por un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 3, en donde la planta, parte de la planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 a 3. 5. El constructo comprende : (i) el ácido nucleico que codifica un DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 a (ii) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) y, opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de transcripción .

. El constructo de acuerdo con la modalidad 5, en donde una de tales secuencias de control es un promotor constitutivo, de preferencia un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia un promotor vegetal, de mayor preferencia un promotor GOS2, de mayor preferencia un promotor G0S2 de arroz .

El uso de un constructo de acuerdo con la modalidad 5 ó 6 en un método para elaborar plantas que tengan rasgos relacionados con rendimiento mejorado, de preferencia el rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control .

. La planta, parte de la planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con la modalidad 5 ó 6.

El método para la producción de una planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado con respecto a las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control , que comprende : (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 a 3; y (ii) cultivar tal célula vegetal o planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta. 10. La planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, que resulta de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 a 3 o una célula vegetal transgénica derivada de la planta transgénic . 11. La planta transgénica de acuerdo con la modalidad 4, 8 ó 10, o una célula vegetal transgénica derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, trigo escaña, tef, milo o avena. 12. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la modalidad 11, en donde tales partes cosechables son de preferencia acumulación de biomasa y/o semillas. 13. Los productos derivados de una planta de acuerdo con la modalidad 11 y/o a partir de partes cosechables de una planta de acuerdo con la modalidad 12. 14. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de DUF642 como se define en cualquiera de las modalidades 1 a 3 para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para incrementar el rendimiento de semillas y/o para incrementar la biomasa en plantas en relación con las plantas control. 15. Un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa al introducir y expresar en una planta tal ácido nucleico que codifica tal polipéptido similar relacionado con epimerasa, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa tiene al menos 80% en total de identidad de secuencia en el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 198. 16. El método de acuerdo con la modalidad 15, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa comprende uno o más de los siguientes motivos : (i) Motivo 7: CREEGV [DE] [QK] VFVD [AG] AH [AS] IG [QSC] V [PDE] [VI] [DN] [VM] [KR] [ED] IGADFY [TV] SNLHKWFFCPP [SA] VAFL [YH] (SEQ ID NO: 273) , (ii) Motivo 8: EF [SA] HH [DN] P [GAN] VAR [IV] NNGSFG [CS] CP [AG] S [VI] [LI] AAQ [ARK] [RN] WQ [LR] [LRQ] FL [RQA] QPD [AD] FYF [ND] xL [QRK] [PK]G (SEQ ID NO: 274), (iii) Motivo 9: S [LI] VDNATTAAAIVLQ [HQ] [VAI] [AG] [WR] [AS] FAEG [RK ] FA [KR] [GN] D [AVT] V [LV] MLH [YC] AY [GQ] [AS] VKKSI [EQH] AYV (SEQ ID NO: 275) 7. El método de acuerdo con la modalidad 15 ó 16, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden biomasa incrementada. 8. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 15 a 17, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden el rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control. 9. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 15 a 18, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa como se utiliza en la presente comprende al menos dos dominios conservados seleccionados del grupo que comprende PyrdxlP-dep_Trfase_major (SSF53383) , PTHR11601, Aminotran_5 (PF00266) y PyrdxIP- dep_Trfase_major_subl (G3DSA: 3.40.640.10) , y de preferencia comprende un dominio conservado Aminotran_5 y al menos otros dominios conservados seleccionados del grupo que comprende PyrdxIP- dep_Trfase_major (SSF53383) , PTHR11601, y PyrdxIP-dep_Trfase__major_subl G3DSA: 3.40.640.10) , 20. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 15 a 18, en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa comprende un dominio conservado con al menos 50% de la identidad de secuencia en un dominio conservado como se representa por cualquiera de: - coordenadas de aminoácidos 32 a 449 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 10) ; - coordenadas de aminoácidos 47 a 276 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 11); - coordenadas de aminoácidos 92 a 364 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 12) ; y - coordenadas de aminoácidos 59 a 323 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 13) . 21. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 15 a 20, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa es de origen vegetal , de preferencia de una planta dicotiledónea, además de preferencia de la familia Salicaceae, de mayor preferencia del género Populus, de mayor preferencia de Populus trichocarpa. 22. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 15 a 21, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa codifica cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla A o es una porción de tal ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridar con tal ácido nucleico . 3. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 15 a 22, en donde tal secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos dados en la Tabla A2. 4. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 15 a 23, en donde tal ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor G0S2 , de preferencia a un promotor G0S2 de arroz . 5. El constructo comprende: (i) ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de las modalidades 15 y 19 a 23; (ii) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) , y de preferencia un promotor constitutivo, de preferencia a un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia a un promotor vegetal, de mayor preferencia a un promotor G0S2, de mayor preferencia a un promotor GOS2 de arroz, y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de transcripción . 6. La planta, parte de la planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con la modalidad 25. 7. El método para la producción de una planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado con respecto a las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control, que comprende: (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de las modalidades 15 y 19 a 23; y (ii) cultivar tal célula vegetal o planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta. 8. La planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, que resulta de la introducción y expresión en el mismo de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de las modalidades 15 y 19 a 23, o una célula vegetal transgénica derivada de la planta transgénica. 9. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa como se define en cualquiera de las modalidades 15 y 19 a 23; para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para incrementar el rendimiento de semillas y/o para incrementar la biomasa de las plantas en relación con las plantas control. 0. Un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 285 u homólogos que tienen 80% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 285. 1. El método de acuerdo con la modalidad 30, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de preferencia comprenden, biomasa de raiz incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control. 2. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 30 a 31, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado se obtienen bajo condiciones sin estrés. 3. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 30 a 31, en donde tales rasgos relacionados con rendimiento mejorado se obtienen bajo condiciones de estrés por sequía, estrés por salinidad o deficiencia de nitrógeno.

. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 30 a 33, en donde tal ácido nucleico que codifica una PLPCasa es de origen vegetal, de preferencia de una planta dicotiledónea, además de preferencia de la familia Fabaceae, de mayor preferencia del género Medicago, de mayor preferencia de Medicago truncatula. 5. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 30 a 34, en donde tal ácido nucleico que codifica una PLPCasa codifica cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla A3 o es una porción de tal ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridar con tal ácido nucleico, se proporciona tal ácido nucleico que tiene 80% de la identidad de secuencia en la SEQ ID NO: 285. 6. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 30 a 35, en donde tal ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor constitutivo, de preferencia a un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia a un promotor vegetal, de mayor preferencia a un promotor GOS2, de mayor preferencia a un promotor GOS2 de arroz . 7. La planta, parte de la misma planta, que incluye las semillas, o célula vegetal, obtenibles por un método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 30 a 36, en donde la planta, parte de la planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 30 y 35 a 39. 38. El constructo comprende: (i) ácido nucleico que codifica una PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 30 y 34 a 36; (ii) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) y, opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de transcripción . 39. El constructo de acuerdo con la modalidad 38, en donde una de tales secuencias de control es un promotor constitutivo, de preferencia un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia un promotor vegetal, de mayor preferencia un promotor G0S2, de mayor preferencia un promotor GOS2 de arroz . 40. El uso de un constructo de acuerdo con la modalidad 38 ó 39 en un método para elaborar plantas que tengan rasgos relacionados con rendimiento mejorado, de preferencia el rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia la biomasa de raíz incrementada, el índice de verdor incrementado y/o el rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control . 41. La planta, parte de la planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con la modalidad 38 ó 39. 42. El método para la producción de una planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado con respecto a las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia la biomasa de raíz incrementada, el índice de verdor incrementado y/o rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas control , que comprende : a. introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 30 y 34 a 36, y b. cultivar tal célula vegetal o planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta. 43. La planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, que resulta de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 30 y 34 a 36 o una célula vegetal transgénica derivada de la planta transgénica. 4. La planta transgénica de acuerdo con la modalidad 37, 41 ó 43, o una célula vegetal transgénica derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, sécale, trigo escaña, tef, milo o avena. 5. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la modalidad 43 ó 44, en donde tales partes cosechables son de preferencia biomasa de raíz y/o semillas. 6. Los productos derivados de una planta de acuerdo con la modalidad 43 ó 44 y/o a partir de partes cosechables de una planta de acuerdo con la modalidad 45. 7. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PLPCasa como se define en cualquiera de las modalidades 30 y 34 a 36 para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para la biomasa de raíz, el índice de verdor incrementado y/o rendimiento de semilla incrementado en las plantas en relación con las plantas control .

Definiciones Las siguientes definiciones se utilizarán a través de la presente solicitud. La sección títulos y encabezado en esta solicitud son por conveniencia y propósito de referencia solamente y no afectarán en ninguna manera el significado o interpretación de esta solicitud. Los términos técnicos y expresiones utilizados dentro del alcance de esta solicitud son generalmente para dar el significado comúnmente aplicado en la técnica pertinente de biología de las plantas, biología molecular, bioinformática y cruza de plantas. Todas las siguientes definiciones de términos se aplican al contenido completo de esta solicitud. El término "esencialmente", "alrededor", "aproximadamente" y similares, junto con un atributo o un valor, particularmente también define exactamente el atributo o exactamente el valor, respectivamente. El término "alrededor" en el contexto de un valor o margen numérico dado se refiere en particular a un valor o margen que se encuentra dentro de 20%, dentro de 10%, o dentro de 5% del valor o margen dado. Como se utiliza en la presente, el término "que comprende" también abarca el término "que consiste de" .

Péptidos/Proteínas Los términos "péptidos" , "oligopéptidos" , "polipéptido" y "proteína" se utilizan en forma intercambiable en la presente y se refieren a aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud, enlazados juntos por uniones de péptido, a menos que se mencione en la presente de otra manera.

Polinucleótidos/ácidos nucleicos/secuencias de ácido nucleico/secuencia de nucleótidos Los términos "polinucleótidos" , "secuencias de ácido nucleico", "secuencias de nucleótido" , "ácidos nucleicos" , "molécula de ácido nucleico" se utilizan intercambiablemente en la presente y se refieren a nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma no ramificada polimérica de cualquier longitud.

Homólogos "Homólogos" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos , polipéptidos , proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos en relación con la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar como la proteína no modificada de la cual se derivan.

Los ortólogos y par logos son dos formas diferentes de homólogos y abarcan conceptos evolutivos utilizados para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes dentro de las mismas especies que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral; los ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de la especiación, y también se derivan de un gen ancestral común.

Una "eliminación" se refiere a la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una "inserción" se refiere a uno o más residuos de aminoácidos que se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones de N-terminal y/o C-terminal, así como también inserciones intra-secuencia de aminoácidos simples o múltiples. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones de N- o C-terminal, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Los ejemplos de las proteínas o péptidos de fusión N- o C-terminal incluyen el dominio de enlace o dominio de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de dos híbridos de levadura, las proteínas recubiertas de fago, (histidina) -6-tag, S-transferasa-tag glutationa, proteína A, proteína de unión de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag»100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina) , epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.

Una "sustitución" se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína con otaros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras a-helicoidales o estructuras de lámina ß) . Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos únicos, pero que pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales puestas en el polipéptido y pueden variar de 1 a 10 aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos son de preferencia sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las tablas de sustitución conservadoras son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds) y la Tabla 1 a continuación) .

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras Las sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos pueden realizarse fácilmente utilizando técnicas sintéticas de péptidos conocidas en el arte, tal como síntesis de péptidos de fase sólida y similares, o por manipulación de ADN recombinante . Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o eliminación de una proteína son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro de Gen T7 (USB, Cleveland, OH) , mutagénesis de Sitio Dirigido QuickChange (Stratagene, San Diego, CA) , mutagénesis de sitio dirigido mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis de sitio dirigido (véase Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, N. Y. (1989 y actualizaciones anuales)).

Derivados Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma de la proteína de origen natural, tal como la proteína de interés, comprende sustituciones de aminoácidos con residuos de aminoácidos que no ocurren naturalmente, o residuos que no son de origen natural. "Derivados" de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos alterados de origen natural (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados , miristoilados , sulfatados, etc.) o alterados de residuos que no son de origen natural comparados con la secuencia de aminoácidos de una forma del polipéptido de origen natural. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes sin aminoácido o adiciones comparadas con la secuencia de aminoácidos de la que se deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, enlazado covalente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula reportera que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos que no son de origen natural en relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína de origen natural. Además, los "derivados" también incluyen fusiones de la forma de la proteína de origen natural con péptidos etiquetados tales como FLAG, HIS6 o tiorredoxina (para una revisión de los péptidos etiquetados, véase Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol . 60, 523-533, 2003).

Dominio, Motivo/Secuencia de consenso/Firma El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de una alineación de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente . Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que están altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o función de una proteína. Identificado por su alto grado de conservación en las secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, que pueden utilizarse como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada.

El término "motivo" o "secuencia de consenso" o "firma" se refiere a una región conservada corta en la secuencia de las proteínas relacionadas evolutivamente. Los motivos son con frecuencia partes altamente conservadas de dominios, pero también pueden incluir sólo una parte del dominio, o ubicarse fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo caen fuera de un dominio definido) .

Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et . al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 95, 5857-5864; Letunic et. al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucí. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994) . Una sintaxis de perfil generalizada para motivos de secuencias biomoleculares y su función en la interpretación de secuencia automática. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R. , Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D. , Eds, pp53-61, AAAI Press. Menlo Park, Hulo et al,. Nucí. Acids. Res. 32: D134-D137, (2004)), o Pfam (Bateman et al,. Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)). Un conjunto de herramientas para análisis in silico de las secuencias de proteínas se encuentra disponible en el servidor de proteómica ExPASy (Instituto Suizo de Bioinformática (Gasteiger et al., ExPASy: el servidor de proteómica para el conocimiento y análisis de proteína hondo, Nucleic Acids Res 31:3784-3788 (2003)). Los dominios o motivos también se pueden identificar utilizando las técnicas de rutina, tales como por alineación de secuencias.

Los métodos para la alineación de secuencias por comparación son bien conocidos en la técnica, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar el alineamiento global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias que maximizan el número de coincidencias y minimizan el número de espacios. El algoritmo BLAST (Altschul et. al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar análisis BLAST se encuentra disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) . Los homólogos pueden identificarse fácilmente utilizando, por ejemplo, el algoritmo de alineación de secuencias múltiples de ClustalW (versión 1.83), con los parámetros de alineación por pares por defecto, y un método de puntuación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también pueden determinarse utilizando uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al, BMC Bioinformatics, 2003 Jul 10;4:29 MatGAT: en la aplicación que genera matrices de similitud/identidad utilizando proteínas o secuencias de ADN) . Puede realizarse la edición manual menor para optimizar la alineación entre los motivos conservados, como puede ser aparente para una persona con experiencia en la técnica. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud completa para la identificación de homólogos, también puede utilizarse los dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia pueden determinarse sobre el ácido nucleico completo o la secuencia de aminoácido o sobre los dominios seleccionados o el o los motivos conservados, utilizando los programas mencionados en lo anterior utilizando los parámetros por defecto. Para alineamientos locales, el algoritmo de Smith-Waterman es particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1) ; 195-7) .

BLAST recíproco Típicamente, esto implica un primer BLAST que involucra BLANSTing una secuencia de consulta (por ejemplo, utilizando cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos) contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la publicidad disponible de la base de datos NCBI. BLASTN o TBLASTX (que utilizan valores por defecto estándar) son generalmente utilizados cuando se inicia desde una secuencia de nucleótido, y BLASTP o TBLASTN (utilizando valores estándar por defecto) cuando se parte de una secuencia de la proteína. Los resultados de BLAST pueden opcionalmente ser filtrados. Las secuencias de longitud completa de cualquiera de los resultados filtrados o los resultados no filtrados entonces se emplean en BLASTed de nuevo (segundo BLAST) contra las secuencias de los organismos a partir de los cuales se deriva la secuencia de consulta. Los resultados del primer y segundo BLAST se comparan entonces. Se identifica un parálogo si un acierto de alta clasificación del primer BLAST es de la misma especie de la que se deriva la secuencia de consulta, después de nuevo el BLAST resulta idealmente en la secuencia de consulta contra los mayores aciertos; un ortólogo se identifica si un acierto de alta clasificación en el BLAST no es de la misma especie del que se deriva la secuencia de consulta, y de preferencia resulta de nuevo con el BLAST en la secuencia de consulta se encuentra entre los mayores aciertos.

Los aciertos de alta clasificación son aquellos que tienen un valor E bajo. Entre más bajo sea el valor de E, más significativo será el puntaje (en otras palabras, menor será la oportunidad de que el acierto se encontró por casualidad) . El cálculo del valor E se conoce bien en la técnica. Además de los valores E, las comparaciones también se clasifican por identidad de porcentaje. La identidad de porcentaje se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácidos nucleicos comparadas (o polipéptido) sobre una longitud particular. En el caso de grandes familias, ClustalW puede utilizarse, seguido por un árbol de "neighbour joining", para ayudar a visualizar el agrupamiento de los genes relacionados y para identificar ortólogos y parálogos.

Hibridación El término "hibridación" como se define en la presente es un proceso en donde la secuencia de nucleótidos complementarios sustancialmente homologa se híbrida entre sí. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en la solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios se encuentran en solución. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a una matriz tal como cuentas magnéticas, cuentas de sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede ocurrir además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una nitrocelulosa o membrana de nylon que se inmoviliza por ejemplo, por fotolitografía, por ejemplo, a un soporte de vidrio silíceo (este último conocido como disposiciones de ácido nucleico o microdisposiciones o como chips de ácidos nucleicos) . Con el fin de permitir que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido nucleico en general se desnaturalizan térmica o químicamente para fundir una doble hebra en dos hebras sencillas y/o para retirar las horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos de una hebra.

El término "rigurosidad" se refiere a las condiciones en que se lleva a cabo la hibridación. La rigurosidad de la hibridación se encuentra influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración de sal, fuerza iónica y composición reguladora de hibridación. Generalmente, las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan para ser de aproximadamente 30°C más inferiores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son cuando la temperatura es de 20°C por debajo de Tm, y las condiciones de rigurosidad alta son cuando la temperatura es 10°C por debajo de Tm. Las condiciones de hibridación de rigurosidad alta se utilizan típicamente para aislar la secuencia de hibridación que tiene alta similitud de secuencia en la secuencia de ácido nucleico objetivo. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden desviarse en secuencia y aún codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto las condiciones de hibridación de exigencia media algunas veces pueden ser necesarias para identificar tales moléculas de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura bajo resistencia iónica definida y pH, el 50% de la secuencia objetivo híbrida en una sonda perfectamente acoplada. La Tm dependiente de las condiciones de solución y la composición base y longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias hibridan más largas específicamente a temperaturas mayores . La tasa máxima de hibridación se obtiene de aproximadamente 16°C hasta 32°C por debajo de Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras de ácido nucleico promoviendo por cosiguiente la formación de híbridos; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0.4 M (para concentraciones mayores, este efecto puede ignorarse) . La formamida reduce la temperatura de fusión dúplex de ADN-ADN y de ADN-ARN con 0.6 a 0.7°C por cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite la hibridación para realizarse de 30 a 45°C, aunque la tasa de hibridación será menor. Desacoplamiento de los pares de base reduce la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. Promedio para sondas grandes, la Tm disminuye alrededor de 1°C por % de acoplamiento de base. La Tm puede calcularse utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos : 1) híbridos de ADN-ADN (Meinkoth and ahl, Anal Biochem, 138:., 267-284, 1984) : Tra = 81.5°C + 16.6xlogi0 [Na+] a + 0.41x% [G/Cb] -500x [Lc] _1-0.61x% formamida 2 ) híbridos de ADN-ARN o de ARN-ARN: Tm = 79.8 + 18.5°C ( logio [Na+] a) + 0.58 (% G/Cb) + 11.8 (% G/Cb)2 - 820/L° 3) híbridos de oligo-ADN u oligo-AR *1: Para <20 nucleótidos: Tm = 2 (In) Para 20-35 nucleótidos: Tm = 22 + 1.46 (In) a o para otro catión monovalente, pero solo exacto en el margen de 0.01-0.4M. b solo exacto para % GC en el margen de 30% a 75%. c L = longitud de dúplex en los pares de bases . d oligo, oligonucleótido, In, = longitud efectiva del cevador = 2x (No. de G/C) + (No. de A/T) .

Se puede controlar la unión especifica utilizando cualquiera de un número de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN heteróloga, ADN, y SDS al regulador de hibridación, y tratamiento con ARNasa. Para sondas no homólogas, se puede realizar una serie de hibridaciones al variar uno de (i) disminuir progresivamente la temperatura de recocido (por ejemplo de 68°C a 42°C) o (ii) disminuir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo de 50% a 0%) . El técnico experimentado está consciente de diversos parámetros que pueden alterarse durante la hibridación y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

A pesar de las condiciones de hibridación, la especificidad de hibridación también depende típicamente de la función de lavados de post-hibridación. Para retirar el fondo que resulta de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones de sal diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen resistencia iónica y temperatura de la solución de lavado final: entre menor sea la concentración de sal y mayor sea la temperatura de lavado, mayor será la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente en o por debajo de la rigurosidad de hibridación. Una hibridación positiva da una señal de que es por lo menos dos veces aquella del fondo. De manera general, las condiciones rigurosas adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o los procedimientos de detección de amplificación de gen son como se establecieron en lo anterior. También se pueden seleccionar más o menos condiciones rigurosas. El técnico experimentado está consciente de los diversos parámetros que se pueden alterar durante el lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad típicas para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos abarcan la hibridación de 65°C en lx SSC o de 42°C en lx SSC y 50% de formamida, seguido por el lavado a 65°C en 0.3x SSC. Ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para los híbridos de ADN mayores de .50 nucleótidos abarca hibridación a 50°C en 4x SSC o a 40°C en 6x SSC y 50% de formamida, seguido por el lavado a 50 °C en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud anticipada del ácido nucleico hibridado. Cuando los ácido nucleicos de la secuencia conocida se hibridan, puede determinarse la longitud del híbrido al alinear las secuencias e identificarse las regiones conservadas descritas en la presente. IX SSC es 0.15M de NaCl y 15mM de citrato de sodio; la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalraente reactivo de Denhardt 5x, 0.5-1.0% de SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 0.5% de pirofosfato de sodio.

Para los propósitos de definir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, N.Y. (1989 y actualizaciones anuales) .

Variante de empalme El término "variante de empalme" como se utiliza en la presente abarca variantes de una secuencia de ácidos nucleicos en la que se han extirpado, reemplazado, desplazado o agregado los intrones y/o exones seleccionados, en la que los intrones se han acortado o alargado. Tales variantes serán aquellas en las que la actividad biológica de la proteína se retiene sustancialmente ; esto puede lograrse al retener selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden hacerse por el hombre. Los métodos para predecir y aislar tales variantes de empalme se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6:25) .

Variante alélica Los "alelos" o "variantes alélicas" son formas alternativas de un gen dado, ubicados en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótido Únicos (los SNP) , así como también Polimorfismos de Inserción/Eliminación Pequeños (los INDEL) . El tamaño de los INDEL usualmente es menor de 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el conjunto más largo de variantes de secuencia en las cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos .

Gen endógeno Con referencia en la presente a un gen "endógeno" no solo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin que exista ninguna intervención humana) , sino también se refiere a aquel mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada subsecuentemente (re) introducida en una planta (un transgen) . Por ejemplo, una planta transgénica que contiene un transgen puede encontrar una reducción sustancial de la expresión de transgen y/o reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado se puede aislar de un organismo o puede hacerse por el hombre, por ejemplo mediante síntesis química.

Mezcla de genes/Evolución dirigida La "mezcla de genes" o "evolución dirigida" consiste de iteraciones de Mezcla de ADN seguida por la detección y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos o porciones de las mismas que codifican las proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304 (5674): 1151-4; patentes de los Estados Unidos 5,811,238 y 6,395,547).

Constructo El ADN artificial (tal como, pero, no limitado a plásmidos o ADN viral) capaz de la replicación en una célula huésped y se utiliza para la introducción de una secuencia de ADN de interés en una célula huésped u organismo huésped. Las células huésped de la invención pueden ser cualquier célula seleccionada a partir de células bacterianas, tales como Escherichia coli o células de especies de Agrobacterium, células de levadura, hongos, algas o células cianobacterianas o células vegetales. Los técnicos especializados están conscientes de los elementos genéticos que deben presentarse en el constructo genético para transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés se enlaza operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor) como se describe en la presente. Los elementos regulatorios pueden incluir la transcripción así como también los intensificadores translacionales . Aquellos con experiencia en la técnica estarán consientes de las secuencias terminadoras e intensificadoras que pueden ser adecuadas para su uso en la realización de la invención. Una secuencia de intrón también puede agregarse a la región no traducida 5' (UTR) o en la secuencia de codificación para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además del promotor, mej orador, silenciador, secuencias de intrones, las regiones de 3' UTR y/o 5' UTR) pueden ser proteínas y/o elementos de estabilización de ARN . Tales secuencias pueden ser conocidas o pueden obtenerse fácilmente por una persona con experiencia en la técnica.

Los constructos genéticos de la invención pueden incluir además un origen de secuencia de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o replicación en un tipo celular específico. Un ejemplo es cuando se requiere un constructo genético que se mantenga en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo molécula de plásmido o cósmido) . Los orígenes preferidos de la replicación incluyen, pero no se limitan a, el fl-ori y colEl .

Para la detección de la transferencia exitosa de las secuencias de ácido nucleico como se utiliza en los métodos de la invención y/o la selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso utilizar genes marcadores (o genes reporteros) . Por lo tanto, el constructo genético puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable . Los marcadores seleccionables se describen en más detalle en la sección de "definiciones" en la presente. Los genes marcadores pueden removerse o extirparse de la célula transgénica, una vez que ya no se necesiten. Las técnicas para la remoción de marcador se conocen en la técnica, se describen técnicas útiles en lo anterior en la sección de definiciones.

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor Los términos "elemento regulador" , "secuencia de control" y "promotor" todos se utilizan intercambiablemente en la presente y se toman en un contexto amplio para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos reguladora capaz de efectuar la expresión de las secuencias a las que se ligan. El término "promotor" normalmente se refiere a una secuencia de control de ácidos nucleicos corriente arriba del inicio transcripcional de un gen y el cual está implicado en el reconocimiento y unión de la polimerasa de ARN y otras proteínas, dirigiendo así la transcripción de un ácido nucleico operablemente enlazado. Abarcado por los términos anteriormente mencionados son secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (que incluye el bloque TATA la cual se requiere para inicio de la transcripción exacta, con o sin una secuencia de bloque CCAAT) y elemento reguladores adicionales (es decir secuencias activación corriente arriba, mejoradores y silenciadores) que alteran la expresión genética en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o en una forma específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de bloque -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de bloque -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o mejora o intensifica la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Un "promotor de planta" comprende elementos reguladores, los cuales median la expresión de un segmento de secuencia de codificación en las células vegetales. Un promotor de planta no necesita ser de origen vegetal, pero se puede originar de virus o micro-organismos, por ejemplo de virus que atacan las células vegetales . El "promotor de planta" también puede originarse de una célula vegetal, por ejemplo de la planta que se transforma con la secuencia de ácidos nucleicos para expresar en el proceso inventivo y describirse en la presente. Esto también aplica a las otras señales reguladoras de "planta" , tal como terminadores de "planta" . Los promotores corriente arriba de la secuencia de nucleótidos útiles en los métodos de la presente invención pueden modificarse por una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de nucleótido sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF) o la región reguladora 3' tal como los terminadores u otras regiones reguladoras 3 ' que se ubican lejos del ORF. Adicionalmente es posible que la actividad de los promotores se incremente por la modificación de su secuencia, o que se reemplacen completamente por los promotores más activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico, como se describió en lo anterior, puede enlazarse operablemente a/o comprender un promotor adecuado que exprese el gen en el punto correcto en el tiempo y en el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la resistencia al promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse por ejemplo al enlazar operablemente el promotor a un gen reportero y evaluar el nivel de expresión y patrón del gen reportero en diversos tejidos de la planta. Los genes reporteros bien conocidos adecuados incluyen por ejemplo beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa al medir la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La resistencia del promotor y/o el patrón de expresión entonces se pueden comparar con aquel de un promotor de referencia (tal como aquel utilizado en los métodos de la presente invención) . Alternativamente, se puede evaluar la resistencia del promotor al cuantificar los niveles de ARNm o al comparar los niveles de ARNm del ácido nucleico utilizado en los métodos de la presente invención, con los niveles de ARNm de los genes domésticos tal como 18S ARNr, utilizando los métodos conocidos en la técnica, tal como Transferencia Northern con análisis densitométrico de autoradiogramas , PCR o RT-PCR cuantitativo en tiempo real (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994) . De manera general "promotor débil" está destinado a un promotor que maneja la expresión de una secuencia de codificación a un nivel bajo. Por "nivel bajo" se entiende a niveles de alrededor de 1/10,000 transcriptos a a alrededor de 1/100,000 transcriptos, a alrededor de 1/500,0000 transcriptos por célula. Por el contrario, un "promotor fuerte" maneja la expresión de una secuencia de codificación a alto nivel, o alrededor de 1/10 transcriptos a alrededor de 1/100 transcriptos a alrededor de 1/1000 transcriptos por célula. De manera general, por "promotor de resistencia media" está destinado a un promotor que maneja la expresión de una secuencia de codificación a un nivel menor que un promotor fuerte, en particular a un nivel que se encuentra en todos los casos por debajo de aquel obtenido cuando se encuentra bajo el control de un promotor 35S CaMV.

Ligado operablemente El término "ligado operablemente" como se utiliza en la presente se refiere a un ligando funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés .

Promotor constitutivo Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y bajo condiciones más ambientales, en al menos una célula, tejido un órgano. La Tabla 2a siguiente ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos Promotor ubicuo Un "promotor ubicuo" se activa en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado en forma desarrollada Un "promotor regulado en forma desarrollada" es activo durante ciertas etapas de desarrollo o en partes de las plantas que experimentan cambios de desarrollo.

Promotor inducible Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a un químico (para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), estímulos ambientales o físicos, o puede ser "inducible por estrés", es decir activado cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o un "patógeno inducible" es decir activado cuando una planta se expone a la exposición de diversos patógenos.

Promotor Específico de órgano/Especifico de tejido Un "promotor específico de órgano" o "específico de tejido" es aquel que es capaz de iniciar de preferencia la transcripción en ciertos órganos o tejidos, tal como las hojas, raíces, tejido de semilla etc. Por ejemplo, un "promotor específico de raíz" es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en raíces de planta, sustancialmente en la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripción en ciertas células solo se denominan en la presente como "específicos de célula" .

Ejemplos de promotores específicos de raíz se enlistan en la Tabla 2b siguiente: Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de raíz Un "promotor específico de semilla" es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido de semilla, pero no necesaria y exclusivamente en tejido de semillas (en los casos de expresión parcial) . El promotor específico de semilla puede activarse durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. El promotor específico de semilla puede ser específico de endospermo/aleurona/embrión . Ejemplos del promotor específico de semilla (específico de endospermo/aleurona/embrión) como se muestran en la Tabla 2c, a la Tabla 2f. Ejemplos adicionales de promotores específicos de semilla se dan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol . J. 2, 113-125, 2004), cuya descripción se incorpora en la presente para referencia como si se estableciera completamente.

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de semilla Tabla 2d: Ejemplos de promotores específicos de endospermo Tabla 2e: Ejemplos de promotores específicos de embrión: Tabla 2f: Ejemplos de promotores específicos de aleurona: Un promotor específico de tejido verde como se define en la presente es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido verde, sustancialmente con la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, mientras aún permite cualquier expresión parcial de estas otras partes de la planta.

Ejemplos de promotores específicos de tejido verde que se pueden utilizar para desarrollar los métodos de la invención se muestran en la Tabla 2g siguiente.

Tabla 2g: Ejemplos de promotores específicos de te ido verde Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristema, que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido meristemático, sustancialmente con la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, mientras aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. Ejemplos de promotores específicos de meristema verdes que pueden utilizarse para realizar los métodos de la invención como se muestran en la Tabla 2h siguiente.

Tabla 2h: Ejemplos de promotores específicos de meristema Terminador El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional cuyo procesamiento y poliadenilación de las señales 3' de un transcripto primario y la terminación de transcripción. El terminador puede derivarse del gen natural, a partir de una variedad de otros genes, o de ADN-T. El terminador que se agregar puede derivar de, por ejemplo, los genes de sintasa nopalina o sintasa octopina, o alternativamente de otros genes de planta, o de menor preferencia de cualquier otro gen eucariótico.

Marcador seleccionable (gen) /Gen reportero El "Marcador seleccionable" , "gen marcador seleccionable" o "gen reportero" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la cual se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o se transforman con un constructo de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de diferentes principios. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse de los marcadores que confieren resistencia herbicida o antibiótica, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los antibióticos (tal como nptll que fosforila neomicina y canamicina, o hpt, higromicina fosforilante, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol , ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina) , a los herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporciona resistencia contra el glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea) , o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que le permite a las plantas utilizar mannosa como fuente única de carbono o isomerasa xilosa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tal como la resistencia a 2 -desoxiglucosa) . La expresión visual de genes marcadores resulta en la formación de color (por ejemplo ß-glucuronidasa, GUS o ß-galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X-Gal) , luminiscencia (tal como el sistema de luciferina/luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de los mismos. Esta lista solo representa un número pequeño de marcadores posibles. El trabajador experto está familiarizado con tales marcadores. Se prefieren diferentes marcadores, dependiendo del organismo y el método de selección.

Se conoce que luego de la integración estable o transitoria de ácidos nucleicos dentro de células vegetales, solo una minoría de las células se toma del ADN externo y, si se desea, lo integra dentro de su genoma, dependiendo del vector de expresión utilizado y la técnica de transfección utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (tal como aquellos descritos en lo anterior) se introduce usualmente en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden utilizarse por ejemplo en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, por la eliminación por métodos convencionales. Además, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable se puede introducir dentro de una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o se utilizan en los métodos de la invención, o si no en un vector separado. Las células que se han transfectado establemente con el ácido nucleico introducido puede identificarse por ejemplo mediante la selección (por ejemplo, células que se han integrado del marcador seleccionable que sobrevive mientras que las otras células mueren) .

Debido a que los genes marcadores, particularmente los genes para resistencia a antibióticos y herbicidas ya no se requieren o no se desean en la célula huésped transgénica, una vez los ácidos nucleicos se han introducido exitosamente, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permiten la remoción o excisión de estos genes marcadores. Uno de tales métodos es aquel que se conoce como co-transformación. El método de co-transformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que lleva el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que lleva los genes marcadores. Una gran proporción de los transformantes se recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta 40% o más de los transformantes) , ambos vectores. En el caso de transformación con Agrobacteria, los transformantes usualmente reciben solo una parte del vector, es decir la secuencia flanquea por el ADN-T, que usualmente representa el cásete de expresión. Los genes marcadores pueden subsecuentemente removerse de la planta transformada al realizar cruces. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds) . Los transformantes pueden cruzarse con una fuente transposasa o los transformantes se transforman con un constructo de ácido nucleico que confiere la expresión de una transposasa, transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente 10%) , el transposón salta del genoma de la célula huésped una vez que ha tenido lugar la transformación exitosamente y se pierde. En un número adicional de casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos el gen marcador puede eliminarse al realizar cruces. En microbiología, las técnicas que se realizan hacen posible, o facilitan, la detección de tales eventos. Un método ventajoso adicional se basa en que se conocen como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que la eliminación mediante el cruce se puede dispensar. El sistema mejor conocido de este tipo es lo que se conoce como el sistema de Cre/lox. Creí es una recombinasa que remueve las secuencias ubicadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, se remueve una vez que se ha llevado acabo la transformación exitosamente, por la expresión de la recombinasa. Los sistemas de recombinación adicionales son el sistema HIN/HIX, FLP/F T y REP/STB (Tribble et al., J. Biol . Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible una integración específica de sitio dentro del genoma de planta de la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Naturalmente, estos métodos también pueden aplicarse a microorganismos tales como levadura, hongos o bacterias.

Transgénico/Transgen/Recombinante Para el propósito de la invención, "transgénico" , "transgen" o "recombinante" significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, un cásete de de expresión, un constructo genético o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con la secuencia de ácidos nucleicos, los casetes o vectores de expresión de acuerdo con la invención, todas aquellas construcciones provocadas mediante los métodos recombinantes en los cuales ya sea (a) la secuencia de ácidos nucleicos que codifica las proteínas útiles en los métodos de la invención, o (b) la o las secuencias de control genético que se enlazan operablemente con la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o (c) a) y b) no se localizan en su modalidad genética natural o se han modificado por métodos recombinantes, es posible para que la modificación tome la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. Se entiende que el ambiente genético natural significa el locus cromosómico o genómico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos se retiene de preferencia, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos en por lo menos un lado y tiene una longitud de secuencia de por lo menos 50 pb, de preferencia por lo menos 500 pb, especialmente de preferencia por lo menos 1000 pb, de mayor de preferencia por lo menos 5000 pb. Un cásete de expresión de origen natural - por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de la secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, como se definió en lo anterior - llega a ser un cásete de expresión transgénica cuando este cásete de expresión se modifica por métodos sintéticos no naturales ("artificiales") tal como, por ejemplo, el tratamiento mutagénico. Se describen métodos adecuados, por ejemplo, en la US 5,565,350 o la WO 00/15815.

Una planta transgénica para los propósitos de la invención por consiguiente se entiende que significa, como en lo anterior, que los ácido nucleicos utilizados en el método de la invención no se encuentran presentes en, o se originan a partir de, el genoma de la planta, se encuentran presentes en el genoma de la planta pero no en su locus natural en el genoma de la planta, es posible para los ácidos nucleicos expresarse homologa o heterólogamente . Sin embargo, como se menciona, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o utilizados en el método inventivo se encuentran en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que se han modificado las secuencias reguladoras de las secuencias naturales . Transgénico se entiende de preferencia que significa la expresión de los ácido nucleicos de acuerdo con la invención a un locus no natural en el genoma, es decir, tiene lugar la expresión homologa o, de preferencia, heteróloga de los ácidos nucleicos. Se mencionan aquí las plantas transgénicas preferidas.

Además se observará que en el contexto de la presente invención, el término "ácido nucleico aislado" o "polipéptido aislado" puede en algunos casos considerarse como un sinónimo para un "ácido nucleico recombinante" o un "polipéptido recombinante", respectivamente y se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que no se encuentra en su ambiente genético natural y/o que ha sido modificado por métodos recombinantes .

Modulación El término "modulación" significa en relación a la expresión o expresión del gen, un proceso en el cual el nivel de expresión se cambia por la expresión del gen en comparación con la planta control, el nivel de expresión puede aumentarse o reducirse. La expresión no modulada, original puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN estructural (ARNr, AR t) o ARNm con traducción posterior. Para el propósito de esta invención, la expresión no modular adicional también puede estar ausente de cualquier expresión. El término "modular la actividad" permitirá cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o las proteínas codificadas, que conducen al rendimiento aumentado y/o crecimiento aumentado de las plantas. La expresión puede aumentarse desde cero (ausencia de, o expresión inconmensurable) a una cierta cantidad, o puede disminuirse desde una cierta cantidad hasta cantidades pequeñas inconmensurables o cero.

Expresión El término "expresión" o "expresión de gen" significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o constructo genético específico. El término "expresión" o "expresión de gen" en particular significa la transcripción de un gen o genes o constructo genético en AR estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin traducción subsecuente del último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y procesamiento del producto de ARNm resultante .

Expresión aumentada/sobreexpresión El término "expresión aumentada" o "sobreexpresión" como se utiliza en la presente significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión tipo silvestre original. Para el propósito de esta invención el nivel de expresión tipo silvestre original también puede ser cero, es decir ausencia de expresión o expresión inmensurable.

Los métodos para aumentar la expresión de genes o productos de gen se documentan bien en el arte la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de mejoradores de transcripción o mejoradores de traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como promotores o elementos mejoradores pueden introducirse en una posición apropiada (normalmente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido con el fin de regular en forma ascendente la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, se pueden alterar los promotores endógenos in vivo mediante mutación, eliminación, y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5, 565, 350; Zarling et al., W09322443) , o se pueden introducir promotores aislados dentro de una célula vegetal en la orientación y distancia apropiada de un gen de la presente invención con para controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, es de manera general deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región de codificación de polinucleótido . La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de planta, o de ADN-T. La secuencia de extremo 3' que se va a agregar se puede derivar de, por ejemplo, los genes de sintasa nopalina o sintasa octopina, o alternativamente de otro gen de planta, o menos de preferencia de cualquier otro gen eucariótico.

También puede agregarse una secuencia de intrón a la región no traducida 5' (UT ) o la secuencia de codificación de la secuencia de codificación parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en constructos de expresión de plantas y animales se ha demostrado que aumenta la expresión génica tanto en el ARNm como los niveles de proteína hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol Cell Biol 8:.. 4395-4405; Callis et al (1987) Genes Dev. 1:1183-1200). La mejora de intrón de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz, intrón 1, 2 y 6 de Adhl-S, el intrón de Bronce- 1, son conocidos en la técnica. Para información general, véase, en The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N. Y. (1994) Expresión reducida La referencia en la presente a "expresión reducida" o "eliminación o reducción sustancial" de expresión se considera que significa una disminución en la expresión del gen endógeno y/o niveles de polipéptido y/o la actividad del polipéptido en relación con las plantas control. La reducción o eliminación sustancial se encuentra en orden de incremento de preferencia al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más reducidas en comparación con la de las plantas control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión se requiere un gen endógeno en una planta, una longitud suficiente de los nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácido nucleico. Para realizar el silenciamiento de genes, esto puede ser tan poco como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, alternativamente, esto puede ser tanto como todo el gen (incluyendo el UTR 5' y/o 3', ya sea en parte o en su totalidad) . El estiramiento de los nucleótidos contiguos puede derivarse sustancialmente del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen objetivo) , o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés. De preferencia, el estiramiento de los nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar uniones de hidrógeno con el gen objetivo (ya sea de las hebras de sentido o antisentido) , de mayor preferencia, el estiramiento de nucleótidos sustancialmente contiguos, en orden de incremento de preferencia, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencia en el gen objetivo (ya sea de las hebras de sentido o antisentido) . Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido (funcional) no se requiere para los diversos métodos discutidos en la presente para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión pueden lograrse utilizando herramientas y técnicas de rutina. Un método preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión génica endógena es por la introducción y expresión en una planta de un constructo genético en el cual el ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo cualquiera de la proteína de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente) , separados por un espaciador (ADN no codificante) .

En un método preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina sustancialmente a través del silenciamiento mediado por ARN utilizando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos derivados del gene de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) , de preferencia capaz de formar una estructura de horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende las secuencias de control. Una secuencia de ácidos nucleicos de ADN no codificante (un separador, por ejemplo un fragmento de la región de unión de matriz (MAR) , un intrón, un poli-enlazador, etc.) se ubica entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial o completa) . Esta estructura de ARN de doble hebra se denomina como el ARN de horquilla (hpARN) . El hpARN se procesa mediante la planta en los siARN que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) . El RISC divide adicionalmente los transcriptos de ARNm, reduciendo por lo tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en los polipéptidos . Para detalles generales adicionales véase por ejemplo, Grierson et al. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050).

El rendimiento de los métodos de la invención no se basa en introducir y expresar en una planta un constructo genético en la cual se clona el ácido nucleico como una repetición invertida, pero puede utilizarse cualquiera uno o más de los diversos métodos de "silenciamiento de gen" bien conocidos para lograr los mismos efectos.

Tal método para la reducción de la expresión del gen endógeno es silenciamiento mediado por ARN de la expresión de gen (regulación por disminución) . El silenciamiento en este caso se activa en una planta mediante una secuencia de ARN de doble hebra (dsARN) que es sustancialmente similar al gen endógeno objetivo. Este dsARN se procesa adicionalmente por la planta de alrededor de 20 a alrededor de 26 nucleótidos denominados ARN de interferencia corta (los siARN) . Los siARN se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que divide el transcripto de ARNm del gen endógeno objetivo, reduciendo por lo tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que se traducen en un polipéptido. De preferencia, la secuencia de ARN de doble hebra corresponde a un gen objetivo .

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN implica la introducción de las secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación de sentido en una planta. "Orientación de sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homologa a un transcripto de ARNm de la misma. Por lo tanto se puede introducir en una planta por lo menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reducirá la expresión del gen endógeno, surgiendo un fenómeno conocido como co-supresión. La reducción de la expresión de gen sería más pronunciada si diversas copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos se introducen en la planta, cuando existe una correlación positiva entre altos niveles de transcripto y la activación de la co-supresión.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN implica el uso de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de ácidos nucleicos "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos "sentido" que codifica una proteína, es decir complementaria a la hebra codificante de una molécula de ADNc de doble hebra o complementaria a una secuencia de transcripto de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es de preferencia complementaria al gen endógeno que se va silenciar. La complementariedad se puede ubicar en la "región codificante" y/o en la "región no codificante" de un gen. El término "región codificante" se refiere a una región de la secuencia . de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácido. El término "región no codificante" se refiere a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región sentido que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominado como las regiones no traducidas 5 ' y 3 ' ) .

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentidos pueden diseñarse de acuerdo con las reglas de pares de base de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos completa (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) , pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido para sólo una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (que incluye el 5' y 3' UTR ARNm) . Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de traducción de un transcripto de ARNm que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido se conoce en la técnica y puede iniciar de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ó 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos antisentido de acuerdo con la invención se puede construir utilizando síntesis química y las reacciones de ligación enzimática utilizando los métodos conocidos en el técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) se puede sintetizar químicamente utilizando los nucleótidos de origen natural o varios nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos sentido y antisentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentidos se conocen bien en la técnica. Las modificaciones de nucleótido conocidas incluyen metilación, ciclación y 'caps' y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. Otras modificaciones de nucleótidos se conocen bien en la técnica.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un secuencia de ácidos nucleicos se ha subclonado en una orientación anti-sentido (es decir, ARN transcrito del ácido nucleico insertado será de una orientación anti-sentido a un ácido nucleico objetivo de interés) . De preferencia, la producción de las secuencias de ácidos nucleicos antisentidos en plantas ocurre por medio de un constructo de ácido nucleico establemente integrado que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido ligado operablemente, y un terminador .

Las moléculas de ácido nucleico utilizadas para el silenciamiento en los métodos de la invención (si se introduce dentro de una planta o se genera in situ) se hibridan con o se unen a los transcriptos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótido convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en la ranura principal de la hélice doble. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentidos se pueden introducir dentro de una planta por transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos antisentidos se pueden modificar para dirigir las células seleccionadas y luego se administran sistémicamente . Por ejemplo, para administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentidos pueden modificarse de tal manera que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, al ligar la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también pueden suministrarse a células utilizando los vectores descritos en la presente.

De acuerdo con un aspecto adicional, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es una secuencia de ácidos nucleicos a-anoméricos . Una secuencia de ácidos nucleicos a-anoméricos forma híbridos de doble hebra específicos con ARN de complementariedad en el cual, contrario a las unidades b usuales, las hebras corren paralelas entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucí Ac Res 15: 6625-6641). La secuencia de ácidos nucleicos antisentido también puede comprender un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucí Ac Res 15, 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett . 215, 327-330) .

La reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno también puede realizarse utilizando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de dividir una secuencia de ácidos nucleicos de doble hebra, tal como un ARNm, en la que tienen una región complementaria. De este modo, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) pueden utilizarse para dividir catalíticamente los transcriptos de ARNm que codifican un polipéptido, reduciendo así sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Una ribozima que tiene especificidad para un secuencia de ácidos nucleicos puede diseñarse (véase por ejemplo: Cech et al. Patente de los Estados Unidos No. 4,987,071; y Cech et al. Patente de los Estados Unidos No. 5,116,742). Alternativamente, los transcriptos de ARNm que corresponden a una secuencia de ácidos nucleicos pueden utilizarse para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad específica de ribonucleasa de un grupo de moléculas de ARN (Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411-1418) . El uso de ribozimas para el silenciamiento del gen en plantas se conoce en la técnica (por ejemplo, Atkins et al. (1994) WO 94/00012; Lenne et al. (1995) WO 95/03404; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 y Scott et al. (1997) WO 97/38116) .

También puede llevarse a cabo el silenciamiento del gen por mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN-T o inserción de trasposón) o mediante estrategias como se describe, entre otros, por Angelí y Baulcombe ((1999) Plant J 20 (3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083), o Baulcombe (WO 99/15682) .

También puede ocurrir el silenciamiento del gen si existe una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucleico posteriormente introducido en una planta. La reducción o eliminación sustancial puede provocarse por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido puede unirse a diversas proteínas que interactúan; una o más mutaciones y/o truncaciones por lo tanto se proporciona para un polipéptido que es aún capaz de unir las proteínas que interactúan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden mostrar su función normal (tal como ligando de señalización) .

Un método adicional para el silenciamiento del gen es al dirigir la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los mej oradores) para formar estructuras helicoidales triples que evitan la transcripción del gen en células objetivo. Véase Helene, C, Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene et al., nn. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros métodos, tal como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la cual se encuentra implicado un polipéptido, se conocerán por un experto. En particular, puede preverse que las moléculas hechas por el hombre pueden ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido objetivo, o para interferir con la ruta de señalización en la cual se encuentra implicado el polipéptido objetivo.

Alternativamente, puede establecerse un programa de selección hasta identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Tales variantes naturales también pueden utilizarse por ejemplo, para realizar recombinación homologa.

Pueden utilizarse los microARN (los miARN) artificiales y/o naturales para inactivar la expresión de gen y/o la traducción de ARNm. Los miARN endógenos son ARN pequeños de hebra sencilla de normalmente 19-24 nucleótidos de largo. Estos funcionan principalmente para regular la expresión de gen y/o la traducción de ARNm. La mayor parte de los microARN de planta (los miARN) tiene complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias objetivo. Sin embargo, existen objetivos naturales con hasta cinco errores de emparejamiento. Se procesan los ARN sin codificar largos con estructuras de plegado características por ARNasas específicas de doble hebra de la familia Dicer. Con el procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) al unirse a su componente principal, una proteína Argonauta. Los MiARN sirven como componentes de especificidad de RISC, debido a que los pares base dirigen los ácidos nucleicos, la mayoría de ARNm, en el citoplasma. Los eventos reguladores subsecuentes incluyen la división y destrucción y/o inhibición translacional de ARNm objetivo. Los efectos de la sobreexpresión de miARN así se reflejan frecuentemente en niveles de ARNm reducidos de los genes objetivo.

Los microARN artificiales (los amiARN) , que tiene normalmente 21 nucleótidos de longitud, pueden diseñarse genéticamente por ingeniería específicamente para regular negativamente la expresión de gen de un solo gen o múltiples genes de interés. Los determinantes de la selección objetivo de microARN de planta se conocen bien en el arte. Los parámetros empíricos para el reconocimiento objetivo se han definido y pueden utilizarse para ayudar en el diseño de los amiARN específicos, (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517-527, 2005) . Las herramientas convenientes para el diseño y la generación de los amiARN y sus precursores también se encuentran disponibles para el público (Schwab et al., Célula vegetal 18, 1121-1133, 2006).

Para desempeño óptimo, las técnicas de silenciamiento del gen utilizadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requiere el uso de secuencia de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. De preferencia, una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta dada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requerimiento absoluto de que la secuencia de ácidos nucleicos a introducirse se origine de la misma especie de planta como la planta en la que se introducirá. Es suficiente que exista una homología sustancial entre el gen objetivo endógeno y el ácido nucleico que va a introducirse.

Se describieron en lo anterior los ejemplos de diversos métodos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la técnica sería fácilmente capaz de adaptar los métodos mencionados en lo anterior para el silenciamiento con el fin de lograr la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma a través del uso de un promotor apropiado, por ejemplo.

Transformacion El término "introducción" o "transformación" como se denomina en la presente abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno dentro de una célula huésped, independientemente del método utilizado para transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clónica subsecuente, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con un constructo genético de la presente invención y una planta completa regenerada de la misma. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clónica disponibles para, y se adapta mejor a, las especies particulares que se transforman. Los objetivos de tejido ejemplares incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledóneas, hipocotiledóneas , megagametofitos , tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares, y meristemas de raíz), e inducen tejido de meristema (por ejemplo, meristema cotiledón y meristema hipocotiledón) . El polinucleótido puede introducirse transitoria o establemente dentro de una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede integrarse dentro del genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante luego puede utilizarse para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas con experiencia en la técnica. Alternativamente, una célula vegetal que no puede regenerarse en una planta puede elegirse como célula huésped, es decir, célula vegetal transformada resultante no tiene la capacidad de regenerarse en una planta (completa) .

La transferencia de genes externos dentro del genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de planta ahora es una técnica bastante habitual. Ventajosamente, cualquiera de los diversos métodos de transformación puede utilizarse para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas de tejidos de planta o células vegetales pueden utilizarse para transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo con cañón de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Los métodos pueden seleccionarse del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito .D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de planta (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas cubierto con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327:70) infección con virus (no integrantes) y similares. Las plantas transgénicas , que incluyen plantas de cultivo transgénico, se producen de preferencia por medio de transformación mediada por Agrobacterium. Un método ventajoso de transformación es la transformación en la planta. Para este fin, es posible, por ejemplo, permitir que la agrobacteria actúe en semillas de planta o para inocular el meristema de planta con agrobacterias . Se ha probado particularmente conveniente de acuerdo con la invención permitir una suspensión de agrobacterias transformadas para actuar en la planta intacta o por lo menos en primordios florales. La planta crece posteriormente hasta que se obtienen semillas de la planta tratada (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743) . Los métodos para la transformación mediada por Agrobacterium de arroz incluyen métodos bien conocidos para la transformación del arroz, tal como aquellos descritos en cualquiera de los siguientes: la solicitud de patente Europea EP 1198985 Al, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia como si se estableciera completamente. En el caso de la transformación de maíz, el método preferido es como se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129 (1): 13-22, 2002) , cuyas descripciones se incorporan en la presente por referencia como si se estableciera completamente. Tales métodos se describen adicionalmente a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol . 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o el constructo que se va a expresar se clona de preferencia dentro de un vector, que es adecuado para transformar Agroiacterium turne aciens, por ejemplo pBinl9 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984) 8711). La agrobacteria transformada por tal vector luego puede utilizarse en la forma conocida para la transformación de plantas, tal como las plantas utilizadas como un modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana se encuentra dentro del alcance de la presente invención no se considera como una planta de cultivo) , o plantas de cultivo tal como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo al sumergir hojas magulladas u hojas picadas en una solución agrobacteriana luego cultivarlas en un medio adecuado. Se describe la transformación de las plantas por medio de Agroiacterium tumefaciens, por ejemplo, por Hofgen and Willmitzer in Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce inter alia de F.F. White, vectors for Gene Transfer in Higher Plants,· in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, p . 15-38.

Adicionalmente a la transformación de células somáticas, que entonces se han regenerado en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemas de planta y en particular aquellas células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, surgiendo en plantas transgénicas . Así, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis que se tratan con agrobacterias y las semillas se obtienen del desarrollo de plantas de las que se transforma una cierta porción y por lo tanto transgénico [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:1-9; Feldmann K (1992) . In: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289] . Los métodos alternativos son con base en la remoción repetida de las inflorescencias y la incubación del sitio de excisión en el centro de la roseta con agrobacteria transformada, por lo que las semillas transformadas pueden obtenerse de forma similar en un punto final de tiempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente efectivo es el método de infiltración de vacío con sus modificaciones tal como el método de "inmersión floral" . En el caso de infiltración por vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993) . C R Acad Sci París Life Sci, 316: 1194-1199], aunque en el caso del método de "inmersión floral" el tejido floral desarrollado se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensoactivo [Clough, SJ and Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743] . Se cosecha una cierta proporción de semillas transgénicas en ambos casos, y estas semillas pueden distinguirse de semillas no transgénicas al cultivar bajo las condiciones selectivas descritas en lo anterior. Además la transformación estable de los plástidos tiene ventajas debido a que los plástidos se heredan maternalmente en la mayor parte de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo de flujo de transgen a través del polen. La transformación del genoma de cloroplasto se logra generalmente mediante un proceso que se ha mostrado esquemáticamente en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2) , 225-229] . En resumen las secuencias que se van a transformar se clonan junto con un gen de marcador seleccionable entre las secuencias de flanqueo homologas al genoma de cloroplasto. Estas secuencias de flanqueo homologas dirigen la integración específica de sitio dentro del plastoma. Se ha descrito la transformación del plástido para muchas diferentes especies de planta y se da una revisión en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol . 2001 Sep 21; 312 (3) : 425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology.

Trends Biotechnol. 21, 20-28. El progreso biotecnológico adicional se ha reportado recientemente en la forma de transformantes de plástido libres de marcador, que pueden producirse por un gen marcador co-integrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225-229).

Las células vegetales modificadas genéticamente se pueden regenerar mediante todos los métodos con los cuales el trabajador experto se encuentra familiarizado. Se pueden encontrar métodos adecuados en las publicaciones mencionadas en lo anterior por S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hófgen and Willmitzer. Alternativamente las células vegetales modificadas genéticamente son no regenerables en una planta completa .

En general después de transformación, las células vegetales o grupos de células se seleccionan para la presencia de uno o más marcadores que se codifican por genes expresables de planta que se co-transfieren con el gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera en una planta completa. Para seleccionar las plantas transformadas, el material de planta obtenido en la transformación, como una regla, se somete a condiciones selectivas de tal manera que las plantas transformadas se pueden distinguir de plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas de la forma descrita en lo anterior se pueden plantar y, después de un periodo de cultivo inicial, se someten a selección adecuada por rociado. Una posibilidad adicional consiste en cultivar las semillas, si es apropiado después de esterilización, sobre placas de agar utilizando un agente de selección adecuado de tal manera que sólo las semillas transformadas pueden crecer en plantas. Alternativamente, las plantas transformadas se seleccionan para la presencia de un marcador seleccionable tal como aquellas descritas en lo anterior.

Después de la regeneración y transferencia de ADN, también se pueden evaluar las plantas transformadas putativamente, utilizando por ejemplo análisis Southern, para la presencia del gen de interés, número de copia y/u organización genómica. Alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN nuevamente introducido pueden supervisarse utilizando análisis Northern y/o Western, ambas técnicas se conocen bien por las persones que tienen experiencia ordinaria en la técnica.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por una variedad de medios, tal como por propagación clónica o técnicas de siembra clásica. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o TI) puede autosembrarse y seleccionarse los transformantes homozigotos de segunda generación (o T2) , y las plantas T2 después se pueden propagar adicionalmente a través de técnicas de siembra clásicas. Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y no transformadas; transformantes clónicos (por ejemplo, todas las células transformadas por contener el cásete de expresión) ; injertos de tejidos transformados o no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un vástago sin transformar) .

Etiquetado en activación de ADN-T El etiquetado en activación de ADN-T (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353), implica la inserción de ADN-T, que contiene usualmente un promotor (también puede ser un mejorador de traducción o un intrón) , en la región genómica del gen de interés o 10 kb en la dirección corriente arriba o corriente abajo de la región codificante de un gen en una configuración de tal manera que el promotor dirige la expresión del gen objetivo. Normalmente, la regulación de la expresión del gen objetivo por su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor nuevamente inducido. El promotor se incorpora típicamente en un ADN-T. Este ADN-T se inserta aleatoriamente dentro .del genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección por Agrojbacterium y conduce a expresión modificada de genes cerca del ADN-T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes cerca del promotor introducido.

TILLING El término "TILLING" es una abreviatura de "Lesiones Locales Inducidas en Blancos de Genomas" y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar los ácido nucleicos que codifican las proteínas con la expresión y/o actividad modificada. TILLING también permite la selección de plantas que llevan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresión modificada, ya sea en resistencia o en ubicación o en tiempo (por ejemplo si las mutaciones afectan el promotor) . Estas variantes mutantes pueden exhibir mayor actividad que aquella exhibida mediante el gen en su forma natural . TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de selección de alto rendimiento. Las etapas que siguen normalmente en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP and Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds . Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Martínez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol . 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); .(b) preparación y agrupamiento de ADN en individuos; (c) amplificación de PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, en donde la presencia de un heterodúplex en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del mutante individual; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los métodos para TILLING se conocen bien en la técnica (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5 (2) : 145-50) .

Recombinación homologa La "recombinación homologa" permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado a una posición seleccionada definida. La recombinación homologa es una tecnología estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos menores tales como levadura o el musgo Physcomitrella. Los métodos para realizar recombinación homologa en plantas se ha descrito no solo para el modelo de plantas (Offringa et al. (1990) EMBO J 9 (10 ) : 3077-84 ) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20 (10): 1030-4; Iida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15 (2):132-8), y existen procedimientos que son generalmente aplicables independientemente del organismo objetivo (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rasgos Relacionados con el Rendimiento Un "Rasgo relacionado con el rendimiento" es un rasgo o característica que se relaciona con el rendimiento de la planta. Los rasgos relacionados con el rendimiento pueden comprender uno o más de la siguiente lista no limitante de características: tiempo de florecimiento más temprano, rendimiento, biomasa, rendimiento de semillas, vigor más temprano, índice de verdor, tasa de crecimiento, rasgos agronómicos, tales como por ejemplo, tolerancia al sumergimiento (lo cual conduce a rendimiento en arroz) , Eficiencia en el Uso de Agua (WUE) , Eficiencia en el Uso de Nitrógeno (NUE) , etc.

Con referencia en la presente a rasgos relacionados con el rendimiento mejorado, en relación con las plantas control se entiende uno o más de un aumento en el vigor temprano y/o en la biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que puede incluir (i) partes aéreas y partes cosechables sobre el suelo y/o (ii) partes bajo tierra y cosechable de preferencia por debajo de la tierra. En particular, tales partes cosechables son semillas.

Rendimiento El término "rendimiento" en general significa un producto medible de valor económico, relacionado normalmente con un cultivo específico, con un área, y con un periodo de tiempo. Las partes de planta individuales directamente contribuyen al rendimiento con base en su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento actual es el rendimiento por metro cuadrado de un cultivo y año, que se determina al dividir la producción total (incluye tanto la producción cosechada como valorada) por metro cuadrado plantado.

El término "rendimiento" de una planta y "rendimiento de la planta" se puede utilizar intercambiablemente en la presente y se entiende que se refiere a biomasa vegetativa tal como biomasa de raiz y de brote, para órganos reproductivos, y/o para propágulos tales como semillas de esa planta.

Las flores en el maíz son unisexuales; las inflorescencias macho (panojas) se originan desde la región apical en el tallo y las inflorescencias hembra (espigas) surgen desde la yema axilar de los ápices. La inflorescencia hembra produce pares de espiguillas en la superficie de un eje central (mazorca) . Cada una de las espiguillas hembra encierra dos flósculos fértiles, uno de ellos madurará usualmente en un grano de maíz, una vez fecundado. Por lo tanto puede manifestarse un aumento de rendimiento en el maíz como uno o más de los siguientes: aumento en el número de plantas establecido por metro cuadrado, un aumento en el número de espigas por planta, un aumento en el número de filas, número de granos por fila, peso de grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de espiga, aumento en la tasa de llenado de semilla que es el número de flósculos llenos (es decir, flósculos que contiene semillas) , dividido por el número total de flósculos y multiplicado por 100) , entre otros .

Las inflorescencias en plantas de arroz se nombran panículas. La panícula soporta las espiguillas, que son las unidades básicas de las panículas, y que consisten en un pedúnculo y un flósculo. El flósculo es llevado en el pedúnculo e incluye una flor que está cubierta por dos glumas de protección: un gluma más grande (la lema) y un gluma más corta (la pálea) . Por lo tanto, tomando el arroz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como un aumento en uno o más de los siguientes : número de plantas por metro cuadrado, número de panículas por planta, longitud de la panícula, número de espiguillas por panícula, número de flores (o flósculos) por panícula, un aumento en la tasa de llenado de semilla que es el número de flósculos llenos (es decir, flósculos que contienen semillas) , dividido por el número total de flósculos y multiplicado por 100; un aumento en el peso de mil granos, entre otros.

Tiempo de floración temprana Las plantas que tienen un "tiempo de floración temprana" como se utiliza en la presente son plantas que comienzan a florecer antes que las plantas control . Por lo tanto este término se refiere a las plantas que muestran un inicio temprano de la floración. El tiempo de floración de las plantas puede evaluarse por el conteo del número de días ("tiempo para florecer") entre la siembra y la aparición de una primera inflorescencia. El "tiempo de floración" de una planta puede determinarse por ejemplo utilizando el método como se describe en el documento WO 2007/093444.

Vigor temprano El "Vigor temprano" se refiere un crecimiento bien balanceado saludable activo especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede resultar del aumento de idoneidad de la planta debido, por ejemplo, a las plantas que se adaptan mejor a su ambiente (es decir optimizando el uso de fuentes de energía y la partición entre brote y raíz) . Las plantas que tienen vigor temprano también muestran supervivencia incrementada de plántula y un mejor establecimiento del cultivo, que resulta frecuentemente en campos altamente uniformes (con el cultivo que crece de manera uniforme, es decir con la mayoría de las plantas que alcanzan las diversas etapas de desarrollo sustancialmente al mismo tiempo) , y frecuentemente mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, puede determinarse el vigor temprano al medir diversos factores, tales como el peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de plántula, altura de plántula, longitud de raíz, biomasa de brote y raíz y muchos más.

Tasa de crecimiento aumentada La tasa de crecimiento aumentada puede ser específica a una o más partes de una planta (incluyendo semillas) , o puede ser sustancialmente a través de toda la planta. Las plantas que tiene una tasa de crecimiento aumentada pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede significar el tiempo necesario para crecer de una semilla madura seca hasta la etapa en donde la planta ha producido semillas maduras secas, similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tal como velocidad de germinación, vigor temprano, tasa de crecimiento, índice de verdor, tiempo de floración y velocidad de maduración de semilla. El aumento en la tasa de crecimiento puede llevarse a cabo en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente el ciclo de vida de la planta completa. El índice de crecimiento aumentado durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar vigor mejorado. El aumento en el índice de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean sembradas más tarde y/o cosechadas más pronto de lo que sería de otra forma posible (un efecto similar se puede obtener con tiempo de floración más temprana) . Si la tasa de crecimiento se aumenta lo suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de las mismas especies de planta (por ejemplo siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales todas dentro de un periodo de crecimiento convencional) . De forma similar, si el índice de crecimiento se aumenta lo suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de maíz seguido por, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de plantas de soja, papa o cualquier otra planta adecuada) . Los tiempos adicionales de cosecha del mismo rizoma en el caso de algunas plantas de cultivo también puede ser posible. Alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento en producción de biomasa anual por metro cuadrado (debido a un aumento en el número de tiempos (dicho en un año) que se puede cultivar y cosechar de cualquier planta particular) . Un aumento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus contrapartes tipo silvestre, debido a las limitaciones territoriales para cosechar un cultivo se determinan frecuentemente mediante condiciones ambientales adversas al momento de plantar (estación temprana) o al momento de cosechar (última estación) . Se pueden evitar tales condiciones adversas si se acorta el ciclo de cosecha. El índice de crecimiento se puede determinar al derivar diversos parámetros desde las curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo que le toma a las plantas lograr 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que le toma a las plantas alcanzar 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Resistencia al estrés Ocurre un aumento en el rendimiento y/o tasa de crecimiento si la planta se encuentra bajo condiciones sin estrés o si la planta se expone a diversos tipos de estrés en comparación con las plantas control. Las plantas responden normalmente a la exposición al estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés severo, la planta incluso puede detener el crecimiento completamente. El estrés leve por otra parte se define en la presente como cualquier estrés al que se expone una planta que no resulta en el cese de la planta de que crezca completamente sin la capacidad de reasumir el crecimiento. El estrés leve en el sentido de la invención conduce a una reducción en el crecimiento de las plantas estresadas de menos de 40%, 35%, 30% o 25%, de mayor preferencia menos de 20% o 15% en comparación con la planta control bajo condiciones sin estrés. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticida) frecuentemente no se encuentran varios tipos de estrés en plantas cultivadas . Como una consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es frecuentemente una característica indeseable para la agricultura. El estrés abiótico puede deberse a sequía o exceso de agua, estrés anaeróbico, estrés por salinidad, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas calientes, frías o congelantes.

Los "estrés bióticos" son típicamente aquellos tipos de estrés provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, nemátodos e insectos .

El "estrés abiótico" puede ser un estrés osmótico provocado por estrés al agua, por ejemplo, debido a sequía, estrés por salinidad, estrés por congelación. El estrés abiótico también puede ser un estrés oxidativo o un estrés por frío. El "estrés por congelación" se pretende para referirse al estrés debido a temperaturas de congelación, es decir, temperaturas a las que las moléculas de agua disponibles se congelan y se convierten en hielo. El "estrés por frío", también llamado "estrés por enfriamiento", pretende hacer referencia a las bajas temperaturas, por ejemplo, temperaturas por debajo de 10 °C, o de preferencia por debajo de 5°C, pero en las cuales las moléculas de agua no se congelan. Como se reporta en Wang et al. (Plant (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente el crecimiento de la planta y la productividad. Se sabe que los tipos de estrés por sequía, salinidad, temperaturas extremas y oxidativo se interconectan y pueden inducir el crecimiento y daño celular a través de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de "cruce" entre estrés por sequía y estrés de alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, que resulta en la interrupción de homeóstasis y distribución de iones en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompaña una alta o baja temperatura, estrés por salinidad o sequía, puede provocar desnaturalización de las proteínas estructurales y funcionales. Como consecuencia, este estrés ambiental diverso f ecuentemente activa las rutas de señalización celular similares y respuestas celulares, tal como la producción de proteínas de estrés, regulación ascendente de los antioxidantes, acumulación de solutos compatibles y frena el crecimiento. El término condiciones "sin estrés" como se utiliza en la presente son aquellas condiciones ambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Las personas con experiencia en la técnica son conscientes de las condiciones normales del suelo y condiciones climáticas para una ubicación dada. Las plantas con condiciones de crecimiento óptimo, (crecimiento bajo condiciones sin estrés) normalmente el rendimiento en orden de incremento de preferencia por lo menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% o 75% de la producción promedio de tal planta en un ambiente dado. Se puede calcular la producción promedio sobre la base de una cosecha y/o estación. Las personas con experiencia en la técnica son conscientes de producciones de rendimiento promedio de un cultivo.

En particular, los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo bajo condiciones sin estrés. En un ejemplo, los métodos de la presente invención pueden realizarse bajo condiciones sin estrés tales como sequía leve para dar plantas que tengan mayor rendimiento con relación a las plantas control .

En otra modalidad, los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo bajo condiciones de estrés.

En un ejemplo, los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo bajo condiciones de estrés tales como sequía para dar plantas que tengan mayor rendimiento con relación a las plantas control.

En otro ejemplo, los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo bajo condiciones de estrés tales como la deficiencia de nutrientes para dar plantas que tengan mayor rendimiento con relación a las plantas control .

La deficiencia de nutrientes puede resultar de una falta de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

En aún otro ejemplo, los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo bajo condiciones de estrés tales como el estrés por salinidad para dar plantas que tengan mayor rendimiento con relación a las plantas control . El término estrés por salinidad no se limita a la sal común (NaCl) , sino que puede ser cualquiera de uno o más de: NaCl, KC1, LiCl, MgCl2, CaCl2, entre otros.

En aún otro ejemplo, los métodos de la presente invención pueden llevarse a cabo bajo condiciones de estrés tales como el estrés por frío o estrés por enfriamiento para dar plantas que tengan mayor rendimiento con relación a las plantas control.

Aumento/Intensificación/Mej ora Los términos "aumento" , "intensificación" o "mejora" son intercambiables y comprenderán en el mismo sentido de la aplicación por lo menos un 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, de preferencia por lo menos 15% o 20%, de mayor preferencia 25%, 30%, 35% o 40% de mayor rendimiento y/o crecimiento en comparación con plantas control como se define en la presente.

Rendimiento de semilla El rendimiento de semilla aumentado puede manifestar por sí mismo como uno o más de los siguientes: a) un aumento en la biomasa de semilla (peso total de la semilla) que puede estar sobre una semilla individual y/o por planta y/o por metro cuadrado; b) número aumentado de flores por planta; c) número aumentado de semillas; d) índice de llenado de semilla aumentado (que se expresa como la relación entre el número de flósculos llenos dividido por el número total de flÓSCUlos) ; e) índice de cosecha aumentado, que se expresa como una relación de la producción de partes cosechables, tal como semillas, dividida por la biomasa de las partes de planta sobre el suelo; y f) aumento en el peso de mil granos (TKW) , que se extrapola del número de semillas llenas contadas y su peso total . Un TKW aumentado puede resultar de un tamaño aumentado de semilla y/o peso de semilla, y también puede resultar de un aumento en el tamaño de embriones y/o endosperma.

Los términos "flósculos llenos" y "semillas llenas" pueden considerarse sinónimos .

También puede manifestarse un aumento en el rendimiento de semilla como un aumento en el tamaño de la semilla y/o volumen de la semilla. Adicionalmente, también se puede manifestar un aumento en el rendimiento de semilla en sí mismo como un aumento en el área de semilla y/o longitud de semilla y/o ancho de semilla y/o perímetro de semilla. índice de verdor El "índice de verdor" como se utiliza en la presente se calcula a partir de imágenes digitales de plantas. Para cada pixel que pertenece al objeto de la planta sobre la imagen, se calcula la relación del valor verde contra el valor rojo (en el modelo RGB por el que se codifica el color) . El índice de verdor se expresa como el porcentaje de pixeles para el que la relación de verde a rojo excede un umbral dado. Bajo condiciones de crecimiento normales, bajo condiciones de crecimiento de estrés por salinidad, y bajo condiciones de crecimiento disponibles de nutrientes reducidos, se mide el índice de verdor de las plantas en la última imagen antes de florecimiento. En contraste, bajo condiciones de crecimiento de estrés por sequía, el índice de verdor de plantas se mide en la primera imagen después de sequía.

Biomasa término "biomasa" como se utiliza en la presente se pretende para referirse al peso total de una planta. Dentro de la definición de biomasa, puede hacerse una distinción entre la biomasa de una o más partes de una planta, que puede incluir cualquiera de uno o más de los siguientes : partes sobre el suelo tales como, pero no limitadas a biomasa de brote, biomasa de semillas, biomasa de hojas, etc; partes cosechables sobre el suelo tales como, pero no limitadas a biomasa de brote, biomasa de semillas, biomasa de hojas, etc; partes bajo el suelo, tales como, pero no limitadas a biomasa de raíces, tubérculos, bulbos, etc; partes cosechables por debajo del suelo, tales como, pero no limitadas a la biomasa de raíces, tubérculos, bulbos, etc; partes cosechables parcialmente bajo el suelo, tales como, pero no limitadas a remolachas y otras áreas hipocotilo de una planta, rizomas, estolones o tallos de raíz rastrera; biomasa vegetal como la biomasa de la raíz, biomasa de brote, etc; los órganos reproductivos; y propágulos tales como semillas.

Reproducción asistida por marcadores Tales programas de reproducción algunas veces requieren introducción de variación alélica por el tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede iniciar con una recolección de las variantes alélicas del así llamado origen "natural" no provocado intencionalmente . Después se lleva a cabo la identificación de las variantes alélicas, por ejemplo, por PCR. Esto se sigue por una etapa para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y las cuales dan rendimiento aumentado. La selección se lleva a cabo normalmente al revisar el desempeño del crecimiento de plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El desempeño de crecimiento puede supervisarse en un invernadero o en el campo. Las etapas opcionales adicionales incluyen plantas cruzadas en las cuales se identificó la variante alélica superior con otra planta. Esto puede utilizarse, por ejemplo, para hacer una combinación de las características fenotípicas de interés.

Uso de sondas en (mapeo de genes) El uso de ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés para mapear genética y físicamente los genes requiere sólo una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Estos ácidos nucleicos pueden usarse como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) . Las transferencias southern blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) del ADN genómico de planta digerido de restricción se puede sondear con los ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés. Después pueden someterse los patrones de banda resultantes a análisis genéticos utilizado programas de computadora tal como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) con el fin de construir n mapa genético. Adicionalmente , los ácidos nucleicos se puede utilizar para sondear los ADN genómicos tratados con endonucleasa de restricción que contienen tranferencia Southern de un conjunto de individuos que representan el progenitor y la progenie de un cruza genética definida. La segregación de los polimorfismos de ADN se anota y se utiliza para calcular la posición del ácido nucleico que codifica la proteína de interés en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).

La producción y uso de sondas derivadas de gen de planta para su uso en mapeo genético se describen en Bematzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol . Repórter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos utilizando la metodología destacada en lo anterior o variaciones de la misma. Por ejemplo, las poblaciones de intercruce F2, poblaciones de cruza en reverso, poblaciones apareadas aleatoriamente, líneas isogénicas cercadas, y otros conjuntos de individuos pueden utilizarse para mapeo. Tales metodologías se conocen bien por aquellos con experiencia en la técnica.

También se pueden utilizar sondas de ácido nucleico para mapeo físico (es decir, reemplazo de secuencia en mapas físicos; véase Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y referencias citadas en la presente) .

En otra modalidad, las sondas de ácido nucleico se pueden utilizar en mapeo de hibridación de fluorescencia directa in situ (FISH) (Trask (1991) Trends Genet . 7:149-154) . Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clones grandes (varios kb a varios cientos de kb; véase Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), los mej oradores en la sensibilidad pueden permitir el desempeño del mapeo FISH utilizando sondas más cortas.

Se puede llevar a cabo una variedad de métodos con base en amplificación de ácido nucleico para mapeo genético y físico utilizando los ácido nucleicos. Ejemplos incluyen amplificación específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligación específica de alelo (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), reacciones de extensión de nucleótido (Sokolov (1990) Nucleic acid Res. 18:3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y Happy Mapping (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807) . Para estos métodos, la secuencia de un ácido nucleico se utiliza para diseñar y producir pares de cebador para uso en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores es bien conocido por aquellos con experiencia en la técnica. En los métodos que emplean mapeo genético basado en PC , puede ser necesario identificar las diferencias de secuencia de ADN entre los progenitores del cruce de mapeo en la región que corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos actual. Esto, sin embargo, de manera general no es necesario para métodos de mapeo .

Planta El término "planta" como se utiliza en la presente abarca plantas completas, antecesores y progenie de las plantas y partes de planta, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (que incluye tubérculos) , flores, y tejidos y órganos, en donde cada uno de los mencionados en lo anterior comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células de planta, cultivos de suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas , gametofitos, esporofitos, polen y microesporas , de nuevo en donde cada uno de los mencionados en lo anterior comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la súperfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos de alimentos, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp . , Actinidia sp . , Abelwoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas cornosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida) , Averrhoa carambola, Bambusa sp. , Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo Brassica napus, Brassica rapa ssp. [cañóla, oilseed rape, turnip rape] ) , Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp. , Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodiu spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo Elaeis guineensis, Elaeis oleífera) , Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japónica, Eucalyptus sp. , Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo Helianthus annuus) , Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo Hordeum vulgare) , Ipo oea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo Lycopersicon esculentu , Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyrifor e) , Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., O ithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo Oryza sativa, Oryza latifolia) , Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp. , Persea spp., Petroselinu crispu , Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisu spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Sécale cereale, Sesa um spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum) , Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidu , Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare) , Tropa olum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

Plantas de control La elección de plantas de control adecuadas es una parte de rutina de una configuración experimental y puede incluir plantas tipo silvestre correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. La planta de control es normalmente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que se va a evaluar. La planta control también puede ser un nulicigoto de la planta que' se va a evaluar. Los nulicigotos son individuos que perdieron el transgen mediante segregación. Además, las plantas control se cultivan en condiciones de crecimiento iguales a las condiciones de crecimiento de las plantas de la invención, es decir, en la cercanía de, y simultáneamente con, las plantas de la invención. Una "planta de control" como se utiliza en la presente no sólo se refiere a plantas completas, sino también a partes de planta, que incluye semillas y partes de semilla .

Descripción de las figuras La presente invención ahora se describirá con referencia a las siguientes figuras en las cuales: La Figura 1 representa la estructura de dominio de la SEQ ID NO: 2 con los motivos conservados.

La Figura 2 representa la estructura de dominio de la SEQ ID NO: 4 con los motivos conservados.

La Figura 3 representa una alineación múltiple de diversos polipéptidos DUF642. Estas alineaciones pueden utilizarse para definir motivos adicionales o secuencias de firma, cuando se utilizan aminoácidos conservados. Las SEQ ID NO correspondientes para las secuencias de polipéptidos alineados mostrados en la Figura 3 son: 5 10 15 20 25 La Figura 4 representa un alineamiento múltiple de una selección (ciado A) de polipéptidos DUF642 a partir de la Figura 3. Los SEQ ID NO correspondiente para las secuencias de polipéptidos alineados que se muestran en la Figura 4 son: La Figura 5 muestra un árbol filogenético de polipéptidos DUF642, como se describe en el Ejemplo 2. El ciado A se rodea, el resto de las ramas del árbol se agrupan en el ciado B. La Figura 6 muestra la tabla de MATGAT del Ejemplo 3.

La Figura 7 representa el vector binario utilizado para aumentar la expresión en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica DUF642-bajo el control de un promotor GOS2 de arroz (pGOS2) .

La Figura 8 representa la estructura de dominios de SEQ ID NO: 198 con motivos conservados.

La Figura 9 representa una alineación múltiple de polipéptidos similares relacionados con epimerasa como se editan en la tabla A. Estas alineaciones se pueden utilizar para definir nuevos motivos o secuencias de la firma, al utilizar aminoácidos conservados.

La Figura 10 muestra el árbol filogenético de polipéptidos similares relacionados con epimerasa. Para obtener el árbol, las secuencias de proteínas se alinearon con MAFFT, un árbol de Neighbour Joining (NJ) iniciado se calculó con QuickTree (100 repeticiones, incorrectas) , que se visualizó con Dendroscope (para detalles adicionales sobre el uso de las técnicas véase el ejemplo 2) .

La Figura 11 muestra la tabla MATGAT del Ejemplo 3. La Figura 12 representa el vector binario usado para aumentar la expresión en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa bajo el control de un promotor G0S2 de arroz (pGOS2) .

La Figura 13 representa la estructura de dominios de SEQ ID NO: 285 con motivos conservados.

La Figura 14 muestra el árbol filogenético de polipéptidos PLPCasa, que muestra tres agrupaciones.

La Figura 15 muestra la tabla de MatGAT del Ejemplo 3.

La Figura 16 representa el vector binario utilizado para la expresión aumentada en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica PLPCasa bajo el control de un promotor G0S2 de arroz (pGOS2) .

Ejemplos La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son sólo a modo de ilustración. Los siguientes ejemplos no se pretenden que limiten el alcance de la invención. A menos que se indique de otra forma, la presente invención emplea técnicas y métodos convencionales de biología vegetal, biología molecular, la bioinformática y la cruza de plantas .

Manipulación del ADN: a menos que se establezca de otra forma, las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con protocolos estándares descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3a Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Protocolos Actuales. Los materiales y métodos estándar para trabajo molecular de plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por el R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK) .

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos utilizadas en los métodos de la invención 1. polipéptidos DUF642 Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 se identifican entre aquellas mantenidas en la base de datos de Nucleótidos Entrez en el Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI) utilizando las herramientas de búsqueda de secuencia de base de datos, tal como la Herramienta de Alineación Local Básica (BLAST) (AltSChul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic acid Res. 25:3389-3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre las secuencias al comparar las secuencias de ácido nucleico o polipéptido con las bases de datos de secuencia y al calcular la significancia estadística de correlaciones. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de la SEC ID NO. se utilizó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones predeterminadas y el filtro para ignorar las secuencias de baja comple idad desencadenadas. El resultado del análisis se vio por comparación en forma de pares, y se clasifica de acuerdo con la escala de probabilidad (valor E) , en donde la escala refleja la probabilidad de que ocurra una alineación particular por casualidad (entre menor sea el valor E, será más signif cativo el acierto) . Además de los valores E, las comparaciones también se clasifican por el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácido nucleico comparadas (o polipéptido) sobre una longitud particular. En algunos casos, se pueden ajustar los parámetros predeterminados para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo se puede aumentar el valor E para mostrar las correlaciones menos rigurosas. De esta forma, se pueden identificar correlaciones cortas casi exactas.

La Tabla Al proporciona una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 Tabla Al: Ejemplos de ácidos nucleicos y polipéptidos de DUF642 : olipéptidos similares relacionados con epimerasa Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la SEQ ID NO: 197 y SEQ ID NO: 198 se identificaron entre aquellas mantenidas en la base de datos de Nucleótidos Entrez en el Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI) utilizando las herramientas de búsqueda de secuencia de base de datos, tal como la Herramienta de Alineación Local Básica (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol . 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic acid Res. 25:3389-3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre las secuencias al comparar las secuencias de ácido nucleico o polipéptido con las bases de datos de secuencia y al calcular la significancia estadística de correlaciones. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de la SEC ID NO. 197 se utilizó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones predeterminadas y el filtro para ignorar las secuencias de baja complejidad desencadenadas. El resultado del análisis se vio por comparación en forma de pares, y se clasifica de acuerdo con la escala de probabilidad (valor E) , en donde la escala refleja la probabilidad de que ocurra una alineación particular por casualidad (entre menor sea el valor E, será más significativo el acierto) . Además de los valores E, las comparaciones también se clasifican por el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácido nucleico comparadas (o polipéptido) sobre una longitud particular. En algunos casos, se pueden ajustar los parámetros predeterminados para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo puede aumentarse el valor E para mostrar correlaciones menos rigurosas. De esta forma, se pueden identificar correlaciones cortas casi exactas.

La Tabla A2 proporciona la SEQ ID NO: 197 y la SEQ ID NO: 198 y una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con la SEQ ID NO: 197 y la SEQ ID NO: 198 Tabla A2 : Ejemplos de ácidos nucleicos y polipéptidos relacionados con epimerasa: 3. Polipéptidos de PLPCasa Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la SEQ ID NO: 284 y la SEQ ID NO: 285 se identificaron entre aquellas mantenidas en la base de datos de Nucleótidos Entrez en el Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI) utilizando las herramientas de búsqueda de secuencia de base de datos, tal como la Herramienta de Alineación Local Básica (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol . 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic acid Res. 25:3389-3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre las secuencias al comparar las secuencias de ácido nucleico o polipéptido con las bases de datos de secuencia y al calcular la significancia estadística de correlaciones. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de la SEC ID NO. 284 se utilizó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones predeterminadas y el filtro para ignorar las secuencias de baja complejidad desencadenadas. El resultado del análisis se vio por comparación en forma de pares, y se clasifica de acuerdo con la escala de probabilidad (valor E) , en donde la escala refleja la probabilidad de que ocurra una alineación particular por casualidad (entre menor sea el valor E, será más significativo el acierto) . Además de los valores E, las comparaciones también se clasifican por el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácido nucleico comparadas (o polipéptido) sobre una longitud particular. En algunos casos, se pueden ajustar los parámetros predeterminados para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo puede aumentarse el valor E para mostrar correlaciones menos rigurosas. De esta forma, se pueden identificar correlaciones cortas casi exactas.

La Tabla A3 proporciona una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con la SEQ ID NO: 284 y la SEQ ID NO: 285 Tabla A3: Ejemplos de ácidos nucleicos y polipéptidos PLPCasa: Las secuencias se han ensamblado tentativamente y descrito públicamente por instituciones de investigación, tal como El Instituto para Investigación Genómica (TIGR que comienza con TA) . Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos de Ortólogos de Gen Eucariótico (EGO) para identificar tales secuencias relacionadas, ya sea por búsqueda de palabra clave o al utilizar el algoritmo BLAST con la secuencia de ácidos nucleicos o la secuencia de polipéptidos de interés. Se han creado bases de datos de secuencia de ácido nucleico especiales para organismos particulares, por ejemplo, para ciertos organismos procariotas, tal como por el Instituto de Genoma Conjunto. Además, el acceso a bases de datos propietarias, ha permitido la identificación de secuencias de ácido nucleico y polipéptidos novedosas .

Ejemplo 2: Alineación de secuencias para las secuencias de polipéptidos utilizadas en los métodos de la invención 1. Polipéptidos DUF642 Se realiza la alineación de las secuencias de polipéptido utilizando la alineación AlignX del Vector NTI , Invitrogen, 10.3 (2006) con penalización de espacio abierto de 10.0, penalización de extensión de espacio de 0.05 y margen de penalización de separación de espacio 8. Los polipéptidos DUF642 se encuentran alineados en la Figura 2, que muestra los polipéptidos DUF642 de los ciados A y B. La Figura 3 muestra una alineación de los polipéptidos DUF642 de ciado A (como se muestra en la Figura 5) .

Un árbol filogenético de polipéptidos DUF642 (Figura 5) se construyó por la alineación de secuencias DUF642 utilizando AFFT (Katoh y Toh (2008) -Sesiones Informativas en Bioinformática 9:286-298). Se calculó un árbol neighbour-joining utilizando Quick-Tree (Howe et al (2002) , Bioinformática 18 (11) : 1546-7) , 100 repeticiones de inicio. El dendrograma se dibujó utilizando Dendroscope (Huson et al (2007), BMC Bioinformatics , 8 (1): 460). Los niveles de confianza de 100 repeticiones de inicio se indican para las principales ramificaciones . 2. Polipéptidos similares relacionados con epimerasa Alineación de secuencias de polipéptidos se realizó utilizando MAFFT (versión 6.624, L-INS-I método - Katoh y Toh (2008) - Sesiones informativas en Bioinformática 9:286-298). Se hizo una edición manual menor para optimizar adicionalmente la alineación. Un número representativo de polipéptidos similares relacionados con epimerasa se alinearan en la Figura 9.

Un árbol filogenético de polipéptidos similares relacionados con epimerasa (Figura 10) se construyeron por la alineación de las secuencias similares relacionados con epimerasa utilizando MAFFT (Katoh y Toh (2008) - Sesiones Informativas en Bioinformática 9:286-298) . Un árbol neighbour-joining se calculó utilizando Quick-Tree (Howe et al (2002) , Bioinformatics 18 (11) : 1546-7) , 100 repeticiones de inicio. El dendrograma se dibujó utilizando Dendroscope (Huson et al (2007), BMC Bioinformatics, 8 (1):460). Los niveles de confianza para 100 repeticiones de inicio se indican para las principales ramificaciones. 3. Polipéptidos PLPCasa Alineación de las secuencias de polipéptidos se realizó utilizando un algoritmo ClustalW 2.0 de alineación progresiva (Thompson et al (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al (2003) Nucleic Acids Res 31:3497-3500) con la norma de ajuste (ajuste lento, matriz de similitud: Gonnet, penalización por espacio abierto 10, penalización de extensión de espacio: 0.2). Se realizó la edición manual menor para optimizar adicionalmente la alineación.

Un árbol filogenético de polipéptidos PLPCasa (Figura 14) se construyó por la alineación de secuencias PLPCasa utilizando MAFFT (Katoh y Toh (2008) - Sesiones Informativas en Bioinformática 9:286-298). El árbol de neighbour-joining se calculó utilizando Quick-Tree (Howe et al (2002) , Bioinformatics 18 (11) : 1546-7) , 100 repeticiones de inicio. Un dendrograma circular se dibujó utilizando Dendroscope 2.0.1 (Huson et al (2007), BMC Bioinformatics , 8 (1) :460) . Los niveles de confianza para 100 repeticiones de inicio se indican para las principales ramificaciones.

Ejemplo 3: Cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias de polipéptidos Los porcentajes globales de similitud de identidad entre las secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles en la realización de los métodos de la invención se determinaron utilizando el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics, 2003 04:29 MatGAT: Una aplicación que genera matrices de similitud/identidad utilizando las proteínas o secuencias de ADN. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka) . MatGAT genera matrices de similitud/identidad de secuencias de ADN o proteína sin la necesidad de la pre-alineación de los datos. El programa realiza una serie de alineaciones por pares utilizando el algoritmo de alineación global de Myers y Miller, se calcula la similitud y la identidad, y después se colocan los resultados en una matriz de distancia. 1. Polipéptidos de DUF642 Los resultados de un análisis por el ciado A se muestran en la Figura 6 para similitud y la identidad global sobre la longitud completa de las secuencias de polipéptidos . Se muestra la similitud de secuencia en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la parte superior de la línea de división diagonal. Los parámetros utilizados en la comparación fueron: matriz de puntuación: Blosum62, Primer Espacio: 12, Espacio de Extensión: 2. La identidad de secuencia (en %) entre las secuencias de polipéptidos DUF642 del ciado A + B útil en la realización de los métodos de la invención pueden ser tan baja como 29.7% (es generalmente mayor que 29.7%) comparada con la SEC ID NO: 2 ó 4. La identidad de secuencia (en %) entre las secuencias de polipéptidos DUF642 del ciado A útil en la realización de los métodos de la invención puede ser tan baja como 38.4% (es generalmente mayor que 38.4%) en comparación con la SEC ID NO: 2 ó 4.

Tabla Bl: Descripción de proteínas en la figura 6: 1. Os_DUF642.3 2. Os_DUF642.2 3. 0. sativa_LOC_Os01g42520.1 4. 0. sativa_LOC_Os04g41710.1 5. 0. sativa_LOC_Os04g41740.1 6. 0. sativa_LOC_Os04g41750.1 7. 0. sativa_LOC_Os04g41759.1 8. 0. sativa_LOC_Os04g41770.1 9. P . virgatum_TC46275 10 . S.bicolor_Sb03g027650.1 11 S . bicolor_Sb06g021270.1 12 S . bicolor_Sb06g021280.1 13 . S.bicolor_Sb06g021290.1 14 . S.bicolor_Sb06g021300.1 15 . S .bicolor_Sb06g021310.1 16 S . bicolor_Sb06g021320.1 17 T. aestivum_c60008104011410 18 Z .mays_TC458850 19 Z . mays_TC468877 20 Z . mays_ZM07MC22756_BFbO088AO1@22693 21 Zea_mays_GRMZM2G034985_T02 22 Zea_mays_GRMZM2G051898_T01 23 Zea_mays_GRMZM2G051912_T01 24 Zea_mays_GRMZM2G405071_T01 25 0. sativa_LOC_Os02gll040.1 26 P. virgatum_TC392 27 S . icolor_Sb04g007160.1 28 Z.mays TC467870 2. Polipéptidos similares relacionados con epimerasa Los resultados del análisis se muestran en la Figura 11 para la similitud y la identidad global sobre la longitud completa de las secuencias de polipéptidos. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisoria diagonal. Los parámetros utilizados en la comparación fueron: la matriz de puntuación: Blosum62, Primer Espacio: 12, Espacio de Extensión: 2. La identidad de secuencia (en %) entre las secuencias de polipéptidos similares relacionados con epimerasa útiles en la realización de los métodos de la invención es generalmente mayor que 40% en comparación con la SEC ID NO: 198.

Una tabla MatGAT para la alineación local de un dominio especifico, o datos en % de identidad/similitud entre los dominios específicos también puede hacerse. 3. Polipéptidos de PLPCasa Los resultados del análisis se muestran en la Figura 15 para la similitud y la identidad global sobre la longitud completa de las secuencias de polipéptidos. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisoria diagonal. Los parámetros utilizados en la comparación fueron: matriz de puntuación: Blosum62, Primer Espacio: 12, Espacio de Extensión: 2. La identidad de secuencia (en %) entre las secuencias de polipéptidos PLPCasa útiles en la realización de los métodos de la invención pueden ser tan bajas como 24%, pero generalmente es mayor que 24%, en comparación con la SEC ID NO: 285.

Tabla B2 : Descripción de proteínas en la figura 15: 1. M . truncatula_PLPCase 2. A. thaliana_AT3G15650.1 1 3. A. thaliana_ATlG52470.1#1 4. G.max_Glymal3g43990.1#1 5. G.max_Glyma08g22420.1#1 6. G.max_Glyma07g03670.1#1 7. A. thaliana_ATlG52700.1#1 8. G.max_GMO6M000001_45093526@l#l 9. P . trichocarpa_TC89207#l 10 . T.aestivum_c55164328@10990#l 11 . Z .mays_c58236581gm030403@14151#l 12 . H.vulgare_BI948365#l 13 . H.annuus_TC40709#l 14 . B.napus_TC92944#l 15 . B.napus_BN06MC12702_43481925@12666#l 16 . A. thaliana_AT5G20060.1#1 17 . B.napus_BN06M000524_46010623@523#l 18 . H.annuus_TC45565#l 19 . . truncatula_AC148176_15.5#1 20 . O.sativa_LOC_Os01g07960.1#l 21 . Z.mays_TC480822#l 22 . P.trichocarpa_scaff_Vl.l824#l 23 . P . trichocarpa_809106#l 24 . G.max_TC317555#l 25 . G.max_Glyma04g07280.1#1 26 . Z.mays_TC563901#l 27 . Z .mays_ZM07MC31087_BFb0267E17@30994#l 28 . T.aestivum_TC296583#l 29 . Zea_mays_GRMZM2G481362_T01#l 30 . 0. sativa_LOC_Os01g42690.1#1 31 . O.sativa_LOC_Os05g51050.1#l 32 . Z.mays_ZM07MC23122_BFb0221H24@23057#l Como se puede observar en la tabla MatGAT en la figura 15, la PLPCasa puede separarse en tres agrupaciones: Agrupación A: que contiene PLPCasa de origen dicotiledóneas, Agrupación B: que contiene PLPCasa de origen dicotiledóneas y monocotiledóneas y Agrupación C: que contiene PLPCasa de origen monocotiledóneas.

Ejemplo 4: Identi icación de dominios comprendidos en secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los métodos de la invención El Recursos Integrada de las Familias de Proteínas, Base de Datos de Dominios y Sitios (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firmas comúnmente utilizados para búsquedas basadas en texto y secuencias. La base de datos de InterPro combina estas bases de datos, que utilizan diferentes metodologías y distintos grados de información biológica sobre las proteínas bien caracterizadas para derivar firmas de proteínas. Las bases de datos que colaboran incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS , ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAMs . Pfam es una gran colección de múltiples alineaciones y modelos ocultos de Markov que cubren la mayor parte de dominios y familias de proteínas comunes. Pfam se aloja en el servidor del Instituto Sanger en el Reino Unido. Interpro se aloja en el Instituto de Bioinformática Europeo en el Reino Unido. 1. Polipéptidos DUF642 Los resultados de la exploración InterPro (base de datos InterPro, edición 4.7) de la secuencia polipéptido como se representa por la SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente, se presentan en la Tabla Cl .

Tabla Cl: Los resultados de la exploración InterPro (números de acceso principal) de la secuencia de polipéptido como se representa por la SEQ ID NO: 2 y 4.

En una modalidad un polipéptido DUF642 comprende un dominio conservado (o motivo) con al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a un dominio conservado del aminoácido 51 a 371 en la SEC ID NO: 2 o el aminoácido 28 a 194 de la SEQ ID NO: 4. 2. Polipéptidos similares relacionados con epimerasa Los resultados de la exploración InterPro (base de datos InterPro, edición 30.0) de la secuencia de polipéptido como se representada por la SEQ ID NO: 198 se presentan en la Tabla C2.

Tabla C2 : Resultados de exploración de InterPro (números de acc principales) de la secuencia de polipéptidos como se representa por SEQ ID NO: 198 5 10 15 Un polipéptido similar relacionado con epimerasa de acuerdo con la invención comprende un dominio conservado (o motivo) con al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia o consiste de un dominio conservado seleccionado de cualquiera de : - Coordenadas de aminoácidos 32 a 449 en la SEC ID NO: 198; Coordenadas de aminoácidos 47 a 276 en la SEC ID NO: 198; Coordenadas de aminoácidos 92 a 364 en la SEC ID NO: 198; y Coordenadas de aminoácidos 59 a 323 en la SEC ID NO: 198. 3. Polipéptidos de PLPCasa Los resultados de la exploración InterPro (Base de datos InterPro, versión 4.6) de la secuencia de polipéptido como se representa por la SEQ ID NO: 285 se presentan en la Tabla C3.

Tabla C3: Resultados de exploración InterPro (números de acceso principales) de la secuencia del polipéptido como se representa por SEQ ID En una modalidad un Polipéptido de PLPCasa comprende un dominio conservado o motivo con al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81% , 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a un dominio conservado del aminoácido 24 a 248 en la SEC ID NO: 285.

Ejemplo 5: Predicción de topología de las secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los métodos de la invención TargetP 1.1 predice la ubicación subcelular de las proteínas eucarióticas . La ubicación asignada se basa en la presencia predicha de cualquiera de las pre-secuencias N-terminales: péptido transitorio de cloroplasto (CTP) , péptido objetivo mitocondrial (MTP) o péptido de señal de ruta secretoria (SP) . Las clasificaciones en las cuales se basa la predicción final no son realmente probabilidades, y necesariamente se agregan a una. Sin embargo, la ubicación con la clasificación mayor es más probable de acuerdo con TargetP, y la relación entre las clasificaciones (la clase de conflabilidad) puede ser una indicación de qué tan cierta es una predicción. La clase de conflabilidad ( C) varía de 1 a 5, en donde 1 indica la predicción más fuerte. Para las secuencias se prevé que contienen una pre-secuencia N-terminal de un sitio de escisión potencial también se puede predecir. TargetP se mantiene en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca.

Un número de parámetros debe seleccionarse antes de analizar una secuencia, tal como un grupo de organismo (no vegetal o planta) , conjuntos de corte (ninguno, conjunto predefinido de corte, o conjunto de corte especificado por el usuario conjunto) , y el cálculo de predicción de los sitios de escisión (sí o no) .

Pueden utilizarse muchos otros algoritmos para realizar tales análisis, incluyendo: • ChloroP 1.1 alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca; • Predicción de Ubicación Subcelular de Proteínas Prowler versión 1.2 fueron alojados en el servidor del Instituto de Biociencia Molecular de la Universidad de Queensland, Brisbane, Australia; • Analista de proteoma PENCE PA-GOSUB 2.5 alojado en el servidor de la Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá; • TMHMM, alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca • PSORT (URL: psort.org) • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics , 19, 1656-1663, 2003) . o Ejemplo 6: Clonación de la secuencia de ácido nucleico utilizada en los métodos de la invención 1. Polipéptidos DUF642 La secuencia de ácido nucleico se amplificó por PCR utilizando como plantilla una biblioteca de ADNc medida de siembra de Oryza sativa hechas a la medida. El CR se realizó usando una polimerasa de ADN Tag de corrección de pruebas comercialmente disponibles en condiciones estándar, utilizando 200 ng de plantilla en una mezcla de PCR de 50 µ?.

En un primer experimento A, los cebadores utilizados fueron prml6414 (SEQ ID NO: 190; sentido): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgagaagaaaaacagagatg-3 ' y prml6415 (SEQ ID NO: 191; inverso, complementario): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtataatattacagaaggaaccg-3 ' , que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway.

En un segundo experimento B, los cebadores utilizados fueron prml6412 (SEQ ID NO: 192; sentido): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggtgctggtggtccc-3 ' y prml6413 (SEQ ID NO: 193; inverso, complementario): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttagtacgacatcgcggca-3 ' , que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway.

El fragmento de PCR amplificado se purificó también utilizando los métodos estándar. La primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción PB, se realizó entonces, durante el cual el fragmento de PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", pDUF642. El plásmido pDONR201 se compró de Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

En el primer experimento A, el clon de entrada que comprende la SEQ ID NO: 1 se utilizó entonces en una reacción de LR con un vector de destino utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites de ADN-T: un marcador seleccionable de planta; un cásete de expresión marcador seleccionable, y un cásete de Gateway recibido para recombinación in vivo LR con la secuencia de ácido nucleico de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor de arroz G0S2 (SEQ ID NO: 189) para la expresión constitutiva se ubicó corriente arriba de su cásete Gateway.

En el segundo experimento B, el clon de entrada que comprende la SEQ ID NO: 3 se utilizó entonces en una reacción de LR con un vector de destino utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites de ADN-T: un marcador seleccionable de planta; un cásete de expresión de marcador identificable, y un cásete Gateway pretendido para recombinación in vivo de LR con la secuencia de ácido nucleico de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor de GOS2 arroz (SEQ ID NO: 189) para la expresión constitutiva se ubicó corriente arriba de este cásete Gateway .

En un experimento adicional, todas las etapas como se describe en lo anterior se ejecutaron para la clonación de la SEC ID NO: 159. Los cebadores utilizados fueron prml3182 (SEQ ID NO: 195; sentido): 5'- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgtttcaaagct caacaaga-3 ' y prml3183 (SEQ ID NO: 196; inverso, complementario): 5'-ggggaccactttgta caagaaagctgggtctctttctccccattcaaac 3', que incluye los sitios AttB para la recombinación de Gateway.

El clon de entrada que comprende la SEC ID NO: 159 se utilizó entonces en una reacción LR con un vector de destino utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites de ADN-T: un marcador seleccionable de planta; un cásete de expresión de marcador identificable , y un cásete Gateway pretendido para la recombinación in vivo de LR con la secuencia de ácido nucleico de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor GOS2 de arroz (SEQ ID NO: 189) para expresión constitutiva se ubicó corriente arriba de este cásete de Gateway.

Después de la etapa de recombinación de LR, los vectores de expresión resultantes pGOS2 : :DUF642 (Figura 7) se transformaron en la cepa Agrobacterium LBA4044 de acuerdo con los métodos bien conocidos en el arte. 2. Polipéptidos similares relacionados con epimerasa Se amplificó la secuencia de ácido nucleico por PCR utilizando como plantilla una biblioteca de ADNc de siembras de Populus trichocarpa hecha a la medida. Se realizó PCR utilizando una polimerasa de ADN Taq de corrección de prueba comercialmente disponible en condiciones estándar, utilizando 200 ng de plantilla en una mezcla PCR de 50 µ?. Los cebadores utilizados fueron prml8733 (SEQ ID NO: 276; sentido, codón de inicio en negrita) : 5 ' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgcaagaaaactccaaagat 3 ' y prml8734 (SEQ ID NO: 277; inversa, complementaria) : - 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcataccttctcactctggat 3 ' , lo cual incluye los sitios de AttB para recombinación de Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purificó también utilizando métodos estándar. La primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, se realizó entonces, durante la cual el fragmento de PCR recombinado in vivo con el plásmido pDONR201 se produce, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", pERL ( "ERL" es sinónimo de "similar relacionado con epimerasa" ) · El plásmido pDONR201 se compró de Invitrogen, como parte de la tecnología de Gateway® .

El clon de entrada que comprende la SEQ ID NO: 197 se utilizó entonces en una reacción de LR con un vector de destino utilizado para transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites de ADN-T: un marcador seleccionable de planta; un cásete de expresión de marcador identificable ; y un cásete de Gateway pretendido para la recombinación in vivo de LR con la secuencia de ácido nucleico de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor G0S2 de arroz (SEQ ID NO: 278) para la expresión constitutiva se ubicó corriente arriba de este cásete Gateway.

Después de la etapa de recombinación de LR, el vector de expresión resultante pG0S2::ERL (Figura 12) se transformó en la cepa Agrobacterium LBA4044 de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. 3. Polipéptidos de PLPCasa La secuencia de ácido nucleico se amplificó por PCR utilizando como plantilla una biblioteca de ADNc de siembra de Medicago truncatula hecho a la medida. PCR se realizó utilizando una polimerasa de ADN Taq de corrección de prueba comercialmente disponible en condiciones estándar, utilizando 200 ng de plantilla en una mezcla PCR de 50 µ?. Los cebadores utilizados fueron prml5409 (SEQ ID NO: 362; sentido, codón de inicio en negrita): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgagtcacgcgcattctc-3 ' y prml5410 (SEQ ID NO: 363; inverso, complementario): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaa aatagttttgtcatttacgacg-3 ' , que incluye los sitios de AttB para recombinación de Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purificó también utilizando métodos estándar. La primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, se realizó entonces, durante la cual el fragmento de PCR recombinado in vivo con el plásmido pDONR201 se produce, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", pPLPCasa. El plásmido pDONR201 se compró de Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

El clon de entrada que comprende la SEQ ID NO: 284 se utilizó entonces en una reacción de LR con un vector de destino utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites de ADN-T: un marcador seleccionable de planta; un cásete de expresión de marcador identificable, y un cásete de Gateway pretendido para la recombinación in vivo de LR con la secuencia de ácido nucleico de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor GOS2 de arroz (SEQ ID NO: 361) para la expresión constitutiva se ubicó corriente arriba de este cásete Gateway.

Después de la etapa de recombinación de LR, el vector de expresión resultante pGOS2 : : PLPCasa (Figura 16) se transformó en la cepa Agrrobacter um LBA4044 de acuerdo con los métodos bien conocidos en el arte.

Del mismo modo un vector de expresión que comprende la SEQ ID NO: 286 se preparó utilizando los cebadores prml5411 (SEQ ID NO: 364, sentido): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgagctattctcgtcaaagc-3 ' y prml5412 (SEQ ID NO: 365; inverso, complementario): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttgctgagaagatgcttgtaaa-3 ' .

Ejemplo 7: Transformación de plantas Transformación de arroz La Agrrojbacterium que contiene el vector de expresión se utilizó para transformar plantas de Oryza sativa. Las semillas secas maduras del arroz de variedad japónica Nipponbare se descascarillaron. La esterilización se llevó a cabo mediante la incubación durante un minuto en 70% de etanol, seguido de 30 a 60 minutos, de preferencia 30 minutos en solución de hipoclorito de sodio (dependiendo del grado de contaminación) , seguido de 3 a 6 veces, de preferencia 4 veces de lavado con agua destilada estéril. Las semillas estériles se hicieron germinar entonces en un medio que contiene 2,4-D (medio de inducción de callos) . Después de la incubación a la luz durante 6 días los callos derivados de escutelo se transforman con Agrobacterium como se describe en la presente en lo siguiente. Alternativamente, la etapa de incubación en etanol fue seguida por una incubación de 30 minutos en 0.2% de HGC12, seguido de un lavado 6 veces de 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles se hicieron germinar entonces en un medio que contiene 2,4-D (medio de inducción de callos) . Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, los callos derivados de escutelo, embriogénicos se escindieron y propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o propagaron por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos se sub-cultivaron en un medio fresco 3 días antes del co-cultivo (para impulsar la actividad de división celular) .

La cepa Agrobacterium LBA4404 que contiene el vector de expresión se utilizó para co-cultivo. El Agrobacterium se inoculó en un medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. La bacteria se recolectó entonces y se suspendió en un medio de co-cultivo líquido a una densidad (OD60o) de alrededor de 1. Los callos se sumergieron en la suspensión durante 1 a 15 minutos. Los tejidos de callos se transfi ieron entonces en seco en un papel filtro y se transfirieron a un medio de co-cultivo solidificado y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25°C. Después de lavar por separado el Agrobacterium, los callos se cultivaron en un medio de 2,4-D durante 10 a 14 días (tiempo de crecimiento de indicador: 3 semanas) bajo la luz a 28 °C - 32 °C en presencia de un agente de selección. Alternativamente los callos co-cultivados se cultivaron en un medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28°C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollaron callos resistentes que crecen rápidamente. Después de la transferencia de este material al medio de regeneración, el potencial embriogénico se liberó y se desarrollaron brotes en las siguientes cuatro a seis semanas. Los brotes se escindieron a partir de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contiene auxina a partir del cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron bajo alta humedad y días cortos en un invernadero .

La transformación del arroz de variedad índica también puede hacerse de una manera similar como se da en lo anterior de acuerdo con técnicas bien conocidas para una persona con experiencia.

Aproximadamente 35 a 90 transformantes de arroz TO independientes se generaron para un constructo. Los transforman es primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo de tejido hasta un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de ADN-T, solamente plantas transgénicas de copia simple que exhiben tolerancia al agente de selección se mantuvieron para la cosecha de semillas TI. Las semillas entonces se cosecharon . tres a cinco meses después del trasplante. El método produjo transformantes de locus simple en una tasa de más del 50% (Aldemita and Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Ejemplo 8: Transformación de otros cultivos Transformación de maíz La transformación de maíz (Zea mays) se realizó con una modificación del método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14 (6) : 745-50. La transformación es dependiente del genotipo en el maíz y solamente genotipos específicos se obtienen de transformación y regeneración. La línea consanguínea A188 (Universidad de Minnesota) o híbridos con Al88 como madre son buenas fuentes de material donador para la transformación, pero otros genotipos pueden utilizarse exitosamente también. Las espigas se cosechan a partir de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando la longitud del embrión inmaduro es de aproximadamente 1 a 1.2 mm. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacteriu turnefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan a través de organogénesis. Los embriones escindidos se cultivan en un medio de inducción de callos, después el medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona aunque se pueden utilizar varios marcadores de selección) . Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollaron brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incubaron a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollaron raíces . Los brotes con raíz se trasplantaron al suelo en el invernadero. Las semillas TI se produjeron a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de trigo La transformación de trigo se realizó con el método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La variedad Bobwhite (disponible de CI YT, México) comúnmente se utiliza en la transformación. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrrojbacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan a través de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivan in vitro en un medio de inducción de callos, después del medio de regeneración, que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona aunque pueden utilizarse varios marcadores de selección) . Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollan brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento y se incuban a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que las raíces se desarrollan. Los brotes enraizados se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas TI se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de soya La soya se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente US 5,164,310 de Texas A& . Diversas variedades de soya comercial son susceptibles a la transformación por este método. La variedad Jack (disponible de la fundación Illinois Seed) se utiliza comúnmente para transformación. Las semillas de soya se esterilizaron durante siembra in vitro. El hipocotilo, la radícula y un cotiledón se escindieron de las plántulas jóvenes de siete días. El epicotilo y el cotiledón restantes se cultivan adicionalmente para desarrollar nodos axilares. Estos nodos axilares se escinden y se incuban con Agrrobacterium tu efaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de co-cultivo, las plantas se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados se escindieron y se colocaron en un medio de elongación de los brotes. Los brotes de no más de 1 cm' se colocan en un medio de enraizamiento hasta que las raíces se desarrollan. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Las semillas TI se produjeron de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de colza/'cañóla Pecíolos cotiledonares e hipocotilos de plantas jóvenes de 5-6 días se utilizaron como explantes para el cultivo de tejido y se transformaron de acuerdo a Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). La variedad Westar comercial (Agriculture Canadá) es la variedad estándar que se utiliza para la transformación, aunque otras variedades también pueden utilizarse. Las semillas de cañóla se esterilizan en la superficie en la siembra in vitro. Los explantes de pecíolo cotiledones con el cotiledón adjunto se escindieron de las plántulas in vitro, y se inocularon con Agrobacterium (que contiene el vector de expresión) mediante inmersión del extremo cortado del explante de pecíolo en la suspensión bacteria) . Los explantes se cultivan entonces durante 2 días en un medio de MSBAP-3 que contiene 3 mg/1 de BAP, 3% de sacarosa, 0.7% de Phytagar a 23 °C, 16 hr de luz. Después de dos días de co-cultivo con AgrroJbacterium, los explantes de pecíolo se transfieren al medio de MSBAP-3 que contiene 3 mg/1 de BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/1) durante 7 días, y luego se cultivan en un medio de MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y el agente de selección hasta la regeneración de brotes. Cuando los brotes tienen 5-10 mm de longitud, se cortan y se transfieren al medio de elongación de brote (MSBAP-0.5, que contiene 0.5 mg/1 de BAP) . Brotes de alrededor de 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de la raíz. Los brotes enraizados se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas TI se produjeron a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de alfalfa Un clon de regeneración de alfalfa (Medicago sativa) se transforma utilizando el método de (McKersie et al, 1999 Plant Physiol 119: 839-847) . La regeneración y transformación de alfalfa depende del genotipo y por lo tanto se requiere una regeneración de la planta. Se han descrito métodos para obtener la regeneración de plantas. Por ejemplo, éstos pueden seleccionarse de la variedad Rangelander (Agriculture Canadá) o cualquier otra variedad de alfalfa comercial como se describe por Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112) . Alternativamente, la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) ha sido seleccionada para su uso en el cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659) . Los explantes de pecíolo se co-cultivan con un cultivo durante la noche de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se co-cultivaron durante 3 días en la oscuridad en el medio de inducción SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L tioprolina, 4.35 g/L de K2S04, y 100 µp? de acetosiringinona. Los explantes se lavaron en un medio de Murashige-Skoog de mediana resistencia (Murashige and Skoog, 1962) y se colocaron en placas sobre el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona aunque con un agente de selección adecuado y antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfirieron al medio de desarrollo B0Í2Y que no contiene reguladores de crecimiento, ni antibióticos, y 50 g/1 de sacarosa. Los embriones somáticos se germinan subsecuentemente en un medio de Murashige-Skoog de mediana resistencia. Las plántulas enraizadas se trasplantaron a macetas y se hicieron crecer en un invernadero. Las semillas TI se producen a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una copia simple del inserto de ADN-T.

Transformación de algodón El algodón se transformó utilizando Agrrojbacterium turnefaciens de acuerdo con el método descrito en US 5,159,135. Las semillas de algodón son superficies esterilizadas en 3% de solución de hipoclorito de sodio durante 20 minutos y se lavaron en agua destilada con 500 g/ml de cefotaxima. Las semillas se transfieren entonces a un medio SH con 50 vg/ml de benomilo para germinación. Los hipocótilos de plántulas de 4 a 6 días se eliminaron, se cortaron en piezas de 0.5 cm y se colocan en agar a 0.8%. Una suspensión de Agrobacterium (aproximadamente 108 células por mi, diluidas a partir de un cultivo transformado durante la noche con el gen de interés y los marcadores de selección adecuados) se utiliza para la inoculación de los explantes de hipocótilo. Después de 3 días a temperatura ambiente y a la luz, los tejidos se transfieren a un medio sólido (1.6 g/1 de Gelrite) con sales de Murashige y Skoog con vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0.1 mg/1 de 2,4-D, 0.1 mg/1 de 6-furfurilaminopurina y 750 pg/ml de MgCL2, y con 50 a 100 ug/ml de cefotaxima y 400-500 ug/ml de carbenicilina para exterminar las bacterias residuales. Las líneas celulares individuales se aislan después de dos a tres meses (con subcultivos cada cuatro a seis semanas) y se cultivan adicionalmente en un medio selectivo para la amplificación de tejido (30°C, fotoperiodo de 16 horas) . Tejidos transformados se cultivan subsecuentemente además sobre el medio no selectivo durante 2 a 3 meses para dar lugar a embriones somáticos . Los embriones que se ven saludables de al menos 4 mm de longitud se transfieren a los tubos con un medio de SH en vermiculita fina, suplementada con 0.1 mg/1 de ácido indol acético, 6 furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones se cultivan a 30 °C con un fotoperiodo de 16 horas, y las plántulas en la etapa de 2 a 3 hojas se transfieren a macetas con vermiculita y nutrientes. Las plantas se fortalecen y, posteriormente, se mueven al invernadero para cultivo adicional.

Transformación de remolacha azucarera Las semillas de remolacha azucarera (Beta vulgaris L.) se esterilizan en 70% de etanol durante un minuto seguido de 20 minutos de agitación en 20% de blanqueador de hipoclorito, por ejemplo, blanqueador regular de Clorox® (comercialmente disponible de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA) . Las semillas se enjuagan con agua estéril y se secan con aire seguido por colocación en placas en un medio de germinación (Murashige y Skoog (MS) basado en el medio (Murashige, T., and Skoog, ., 1962. Physiol. Plant, vol . 15, 473-497) que incluye vitaminas B5 (Gamborg et al.; Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementado con 10 g/1 de sacarosa y 0.8% de agar) . El tejido de hipocótilo se utiliza esencialmente para la iniciación de cultivos de brotes de acuerdo con Hussey y Hepher (Hussey, G., and Hepher, A., 1978. Annals of Botany, 42, 477-9) y se mantienen en un medio basado en MS suplementado con 30 g/1 de sacarosa más 0.25 mg/1 de purina de bencilamino y 0.75% de agar, pH 5.8 a 23-25 °C con un fotoperiodo de 16 horas. La cepa Agrobacterium tumefaciens que lleva un plásmido binario que alberga un gen marcador seleccionable, por ejemplo nptll, se utiliza en experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, un cultivo LB líquido que incluye antibióticos se cultiva en un agitador (28°C, 150 rpm) hasta que se alcanza una densidad óptica (O.D.) a 600 nm de ~1. Los cultivos de bacterias que crecen durante la noche se centrifugan y se resuspenden en un medio de inoculación (O.D. ~1) que incluye acetosiringona, pH 5.5. El tejido base del brote se corta en rebanadas (1.0 cm x 1.0 cm x 2.0 mm aproximadamente) . El tejido se sumerge durante 30 s en un medio de inoculación bacteriano líquido. El exceso de líquido se elimina por transferencia de papel filtro. El co-cultivo ocurre durante 24-72 horas en medio basado en MS incluye 30 g/1 de sacarosa seguido por un período no-selectivo que incluye un medio basado en MS, 30 g/1 de sacarosa con 1 mg/1 de BAP para inducir el desarrollo de brotes y cefotaxima para eliminar el Agrobacterium. Después de 3-10 días de explante se transfieren a un medio selectivo similar que alberga, por ejemplo, kanamicina o G418 (50-100 mg/1 dependiente de genotipo). Los tejidos se transfirieron a un medio fresco cada 2-3 semanas para mantener la presión de selección. La muy rápida iniciación de brotes (después de 3-4 días) indica regeneración de meristemas existente en lugar de organogénesis de meristemas transgénicos recientemente desarrollados. Los brotes pequeños se transfieren después de varias rondas de subcultivo al medio de inducción de raíz que contiene 5 mg/1 de NAA y kanamicina o G418. Las etapas adicionales se toman para reducir el potencial para generar plantas transformadas que son quiméricas (parcialmente transgénicas) . Las muestras de tejido de brotes regenerados se utilizan para análisis de ADN. Otros métodos de transformación de remolacha azucarera se conocen en la técnica, por ejemplo, aquellos por Linsey y Gallois (Linsey, K. , and Gallois, P., 1990 Journal of Experimental Botany; vol . 41, No. 226; 529-36) o los métodos publicados en la solicitud internacional publicada como W09623891A.

Transformación de caña de azúcar Los husos se aislan de planta de caña de azúcar que crecen en el campo de 6 meses de edad, (Arencibia et al., 1998 Transgenic Research, vol. 7, 213-22; Enriquez-Obregon et al., 1998 Planta, vol. 206, 20-27) . El material se esteriliza por inmersión en un 20% de blanqueador de hipoclorito por ejemplo, blanqueador regular Clorox® (comercialmente disponible de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA) durante 20 minutos. Las secciones transversales alrededor de 0.5 cm se colocan en el medio en la dirección de recarga. El material vegetal se cultiva durante 4 semanas en el medio basado en MS (Murashige, T. and Skoog, ., 1962. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497) que incluye vitaminas B5 (Gamborg, 0., et al., 1968. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementada con 20 g/1 de sacarosa, 500 mg/1 de caseína hidrolizada, 0.8% de agar y 5 mg/1 de 2,4-D a 23 °C en la oscuridad. Los cultivos se transfirieron después de 4 semanas en un medio fresco idéntico. La cepa de Agrobacterium tumefaciens que transporta un plásmido binario que alberga un gen marcador seleccionable , por ejemplo HPT, se utilizan en experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, un cultivo de LB líquido que incluye antibióticos se cultiva en un agitador (28 °C, 150 rpm) hasta que alcanza una densidad óptica (O.D.) a 600 ntn de ~0.6. Los cultivos bacterianos que crecen durante la noche se centrifugan y se resuspenden en un medio de inoculación basado en MS (O.D. ~0.4) que incluye acetosiringona, pH 5.5. Las piezas de callos embriogénicos de caña de azúcar (2-4 mm) se aislan basadas en las características morfológicas como la estructura compacta y de color amarillo y se secan durante 20 min. en la campana de flujo seguido por inmersión en un medio de inoculación bacteriana líquido durante 10-20 minutos. El exceso de líquido se elimina por transferencia de papel filtro. El co-cultivo se produjo durante 3-5 días en la oscuridad sobre el papel filtro que se coloca en la parte superior de medio basado en MS que incluye vitaminas B5 que contienen 1 mg/1 de 2,4-D. Después del co-cultivo de callos se lavan con agua estéril seguido de un período de cultivo no selectivo en un medio similar que contiene 500 mg/1 de cefotaxima para eliminar el resto de células Agrobacterium. Después de 3-10 días explantes se transfieren a un medio selectivo basado en MS que incluye vitaminas B5 que contienen 1 mg/1 de 2,4-D durante otras 3 semanas que albergan 25 mg/1 de higromicina (dependiente de genotipo) . Todos los tratamientos se realizan a 23 °C bajo condiciones de oscuridad. Los callos resistentes se cultivan además en un medio que carece de 2,4-D incluyendo 1 mg/1 de BA y 25 mg/1 de higromicina bajo un fotoperiodo de 16 h de luz que resulta en el desarrollo de estructuras de brote. Los brotes se aislan y se cultivan en un medio de enraizamiento selectivo (basado en MS que incluye, 20 g/1 de sacarosa, 20 mg/1 de higromicina y 500 mg/1 de cefotaxima) . Las muestras de tejido de brotes regenerados se utilizan para análisis de ADN. Otros métodos de transformación para la caña de azúcar se conocen en la técnica, por ejemplo a partir de la solicitud internacional publicada como WO2010/151634A y la patente Europea otorgada EP1831378.

Ejemplo 9: Procedimiento de evaluación fenotípica 9.1 Configuración de evaluación Se generaron 35 a 90 transformantes de arroz T0 independientes. Se transfirieron los transformantes primarios desde una cámara de cultivo de tejido a un invernadero para cultivo y cosecha de semillas TI. Se retuvieron Seis eventos, de los cuales la progenie TI segregada 3:1 para presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, aproximadamente 10 plántulas Ti que contienen el transgen (hetero y homo-cigotos) y aproximadamente 10 plántulas TI que carecen del transgen (nulicigotos) se seleccionaron para monitorear la expresión del marcador visual . Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes crecieron lado a lado en posiciones aleatorias . Las condiciones de invernadero fueron de días cortos (12 horas de luz) , 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad, y una humedad relativa del 70%. Las plantas que crecen bajo condiciones sin estrés se regaron a intervalos regulares para asegurar que el agua y los nutrientes no fueran limitados y para satisfacer las necesidades de la planta para completar el crecimiento y desarrollo, a menos que se utilizaran en una selección de estrés.

A partir de la etapa de siembra hasta la etapa de madurez de la planta se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada una de las imágenes digitales del punto de tiempo (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) se tomaron de cada planta a partir de al menos 6 ángulos diferentes.

Eventos TI pueden evaluarse adicionalmente en la generación T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación como para la generación TI, por ejemplo, con menos eventos y/o con más individuos por evento.

Selección de sequía Las plantas TI y T2 se cultivaron en tierra para macetas bajo condiciones normales hasta que se acercaron a la etapa de espigado. Después se transfirieron a una sección "seca", en donde la irrigación se retuvo. Las sondas de humedad del suelo se insertaron en macetas elegidas aleatoriamente para monitorear el contenido de agua del suelo (SWC) . Cuando el SWC estuvo por debajo de ciertos umbrales, las plantas se regaron de forma automática re-continuamente hasta que se alcanzó de nuevo un nivel normal. Las plantas fueron entonces transferidas de nuevo a las condiciones normales. El resto del cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) fue la misma para las plantas que no se cultivaron bajo condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y el rendimiento se registraron como se detalla para el crecimiento bajo condiciones normales .

Selección de eficiencia del uso de nitrógeno Las plantas TI o T2 se cultivaron en tierra para macetas bajo condiciones normales excepto para la solución nutriente. Las macetas se regaron desde el trasplante hasta la maduración con una solución nutriente específica reducida que contiene contenido de nitrógeno N reducido (N) , usualmente entre 7 a 8 veces menos. El resto del cultivo (maduración de planta, cosecha de semillas) fue la misma que para las plantas no cultivadas bajo estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registraron como se detalla para el crecimiento bajo condiciones normales.

Selección de estrés por salinidad Las plantas TI o T2 se cultivaron en un sustrato a base de fibras de coco y partículas de arcilla cocida (Argex) (proporción de 3 a 1) . Una solución nutriente normal se utiliza durante las primeras dos semanas después del trasplante de las plántulas en el invernadero. Después de las primeras dos semanas, se agregaron 25 mM de sal (NaCl) a la solución nutriente, hasta que las plantas se cosecharon. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento bajo condiciones normales. 9.2 Análisis estadístico: prueba F Se utilizó una ANOVA (análisis de variante) de dos factores, como un modelo estadístico para la evaluación global de las características fenotípicas de la planta. Una prueba F se llevó a cabo en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se llevó a cabo para verificar si hay un efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como un efecto de gen global. El umbral de significancia para efecto del gen global verdadero se estableció en 5% del nivel de probabilidad para la prueba F. Un valor de prueba F significativo señala un efecto del gen, lo que significa que no es sólo la mera presencia o posición del gen lo que provoca las diferencias en el fenotipo .

Cuando se llevan a cabo dos experimentos con eventos traslapantes, se realiza un análisis combinado. Esto es útil para verificar la consistencia de los efectos sobre los dos experimentos, y si este es el caso, para acumular evidencia de ambos experimentos para incrementar la confianza en la conclusión. El método utilizado es un enfoque de modelo mezclado que toma en cuenta la estructura multinivel de los datos (es decir experimento - evento - segregantes) . Se obtienen los valores P al comparar la prueba de relación de probabilidad para distribución de chi cuadrada. 9.3 Parámetros medidos A partir de la etapa de siembra hasta la etapa de madurez las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo se tomaron las imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta de al menos 6 ángulos diferentes como se describe en WO2010/031780. Estas mediciones se utilizan para determinar diferentes parámetros.

Medición del parámetro relacionado con biomasa El área de la planta sobre el suelo (o biomasa foliar) ( "AreaMax" ) se determinó por el conteo del número total de píxeles en las imágenes digitales de las partes de la planta sobre el suelo discriminadas del fondo. Este valor fue en promedio de las fotografías tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió en un valor de superficie física expresado en mm al cuadrado por calibración. Los experimentos mostraron que el área de la planta sobre el suelo medida de esta manera se correlaciona con la biomasa de partes de la planta sobre el suelo. El área sobre el suelo es el área medida en el punto de tiempo en el cual la planta ha alcanzado su biomasa foliar máxima.

El incremento en la Biomasa de raíz se expresa como un incremento en la biomasa de raíz total ("rootmax") (medida como biomasa máxima de las raíces observadas durante la vida útil de una planta) ; o como un incremento en el índice raíz/brote ( "RootShlnd" ) , medido como la relación entre la masa de la raíz y la masa de brote en el período de crecimiento activo de la raíz y el brote. En otras palabras, el índice raíz/brote se define como la relación de rapidez de crecimiento de la raíz hasta la rapidez de crecimiento del brote en el período de crecimiento activo de la raíz y el brote. La biomasa de raíz puede determinarse utilizando un método como se describe en la WO 2006/029987.

Parámetros relacionados con el tiempo de desarrollo El vigor temprano es el área de la planta sobre el suelo tres semanas posteriores a la germinación. El vigor temprano se determina al contar el número total de pixeles de las partes de la planta sobre el suelo discriminadas del fondo. Este valor se promedia por las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos y se convirtió en un valor de superficie física expresado en mm al cuadrado por calibración.

AreaEmer es una indicación del desarrollo muy temprano cuando este valor disminuye comparado con las plantas control. Ésta es la relación (expresada en %) entre el tiempo que una planta necesita para hacer 30% de la biomasa final y el tiempo necesario para hacer 90% de su biomasa final.

El "tiempo para florecer" o "tiempo de florecimiento" ( "TimetoFlower" ) de la planta puede determinarse utilizando el método como se describe en O 2007/093444.

Mediciones de parámetro relacionadas con la semilla Las panículas primarias maduras se cosechan, se cuentan, embolsan, se marcan con código de barras y después se secan durante tres días en un horno a 37°C. Las panículas se trillaron entonces, y todas las semillas se recolectaron y se contaron. Las semillas suelen estar cubiertas por una cubierta exterior seca, la cascarilla. Las cascarillas llenas (en adelante también denominadas flósculos llenos) se separaron de los vacíos utilizando un dispositivo de soplado de aire. Las cascarillas vacías se descartaron y la fracción restante se contó nuevamente. Las cascarillas llenas se pesaron en una balanza analítica.

El número total de semillas se determinó al contar el número de cascarillas llenas que permanecieron después de la etapa de separación. El peso de semillas total se midió al pesar todas las cascarillas llenas cosechadas de una planta.

El peso de semilla total ("totalwgseeds") se midió al pesar todas las cascarillas llenas cosechadas de una planta .

El número total de semillas (o flósculos = "nrtotalseeds" ) por planta se determinó al contar el número de cascarillas (ya sea llenas o no) cosechadas de una planta.

El Peso de Mil Granos (TK ) se extrapolo del número de semillas contadas y su peso total ( "totalwgseeds/nrfilledseeds * 1000").

El índice de Cosecha (HI) en la presente invención se define como la relación entre el peso de semilla total y el área sobre el suelo (mm2) (= "totalwgseeds/AreaMax) , multiplicada por un factor de 106.

El número de flores por panícula ( "flowerperpan" ) como se define en la presente invención es la relación entre el número total de semillas sobre el número de panículas primarias maduras (= "nrtotalseeds/firstpan" y "firstpan" = número de panículas en la primera descarga) .

La "tasa de relleno de semilla" o wtasa de llenado de semilla" como se define en la presente invención es la proporción (expresado en %) del número de semillas llenadas (es decir, flósculos que contienen semillas = "nrfilledseeds" ) sobre el número total de semillas (es decir, el número total de flósculos = "nrtotalseed" ) . En otras palabras, el índice de llenado de semillas es el porcentaje de flósculos que se llenan con semillas.

Ejemplo 10: Resultados de la evaluación fenotipica de las plantas transgénicas 1. Polipéptidos DUF642 Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas que expresan un ácido nucleico DUF642 bajo condiciones sin estrés se presentan en lo siguiente.

En el primer experimento A utilizando la SEQ ID NO: 1, un incremento de al menos 5% se observó para el rendimiento de semilla total (Totalwgseeds) , número de semillas llenadas (nrfilledseed) , tasa de llenado de semillas (fillrate) e índice de cosecha.

Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas en la generación TI y que expresan un ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642 de la SEQ ID NO: 2 bajo condiciones sin estrés se presentan en lo siguiente en la Tabla DI. Cuando se cultivaron bajo condiciones sin estrés, se observó un incremento de al menos 5% para el rendimiento de semilla total (Totalwgseeds) , número de semillas llenadas (nrfilledseed) , tasa de llenado de semillas (fillrate) e índice de cosecha. Además, las líneas mostraron un incremento en la biomasa sobre el suelo (AreaMax) , y una línea mostró un incremento de altura máxima del centro de gravedad de la biomasa foliar (GravityYMax) .

Tabla DI : Resumen de datos para plantas de arroz transgénicas ; para cada parámetro, el incremento del porcentaje global se muestra por la generación TI) , para cada parámetro el valor p es <0.05.

En el segundo experimento B utilizando la SEQ ID NO: 3, un incremento de al menos 5% se observó para el rendimiento de semilla total (Totalwgseeds) , la tasa de llenado de semilla (fillrate) y verdor antes de la floración.

Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas en la generación TI y que expresan un ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642 de la SEQ ID NO: 4 bajo condiciones sin estrés se presentan a continuación en la Tabla D2. Cuando se cultiva bajo condiciones sin estrés, un incremento de al menos 5% se observó para el rendimiento de semilla total (Totalwgseeds) , tasa de llenado de semillas (fillrate) y el verdor antes de floración. Sin embarco, dos líneas mostraron un incremento en la biomasa sobre el suelo (AreaMax) , la altura de la punta más alta de la planta (HeightMax) y la altura máxima del centro de gravedad de la biomasa foliar (GravityYMax) .

Tabla D2 : Resumen de datos para plantas de arroz transgénicas ; para cada parámetro, el incremento de porcentaje global se muestra por la generación TI, para cada parámetro el valor p es <0.05.

En un experimento adicional, la SEQ ID NO: 159 (en ciado B) se utiliza en lugar de la SEQ ID NO: 1 en una selección de sequía como se describe en lo anterior. Los resultados de la evaluación de las plantas de arroz transgénicas en la generación TI y que expresan un ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642 de la SEQ ID NO: 160 bajo condiciones de sequía mostraron un incremento de al menos 5% del número total de semillas (nrtotalseed) y para la biomasa sobre el suelo (AreaMax) .

En aún otro experimento, las plantas de arroz transformadas con la SEQ ID NO: 173 bajo control del promotor GOS2 de arroz se utilizaron en una selección de eficiencia de uso de nitrógeno descrito en lo anterior. Las plantas de arroz transgénicas mostraron un incremento fillrate comparado con las plantas control (incremento global para las 6 líneas TI probadas fue 10%, p <0.05) . 2. Polipéptidos similares relacionados con epimerasa Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas de la generación TI que expresa el ácido nucleico que codifica un polipéptido similar relacionado con epimerasa de la SEQ ID NO: 198 bajo condiciones sin estrés se presentan a continuación en la Tabla D3.

Cuando se cultivan bajo condiciones sin estrés, se observa un incremento de al menos 5% para parámetros tales como el rendimiento de semillas, que incluye el peso total de las semillas ( totalwgseeds) , índice de cosecha, y la tasa de llenado .

Tabla D3 : Resumen de datos para las plantas de arroz transgénicas ; para cada parámetro, el incremento de porcentaje global se muestra para las plantas de la generación TI cuando se compara con las plantas control, para cada parámetro el valor p es <0.05.

Además, puede notarse que las plantas de arroz transgénicas de al menos un evento mostraron un incremento de al menos 3% para el parámetro de peso de mil granos (TKW) , cuando se compara con las plantas control .

Las plantas de arroz transgénicas de al menos dos eventos mostraron un incremento de al menos 5% (y, en particular, en promedio, 8 y 11% de incremento, respectivamente) en biomasa, particularmente la biomasa sobre el suelo (AreaMax) , cuando se compara con las plantas control .

Además, habla una clara tendencia para las plantas transgénicas de al menos cuatro eventos para tener un incremento de al menos 5% en el número de semillas llenadas (nrfilledseed) cuando se compara con las plantas control. 3. Polipéptidos de PLPCasa Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas en la generación TI y que expresan un ácido nucleico que comprende el marco de lectura abierto más largo en la SEQ ID NO: 284 bajo condiciones de estrés por deficiencia de nitrógeno se presentan a continuación. Véanse los ejemplos previos para detalles en las generaciones de las plantas transgénicas.

Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas en la generación TI y que expresan un ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa de la SEQ ID NO: 285 bajo condiciones de estrés se presentan a continuación en la Tabla D4. Cuando se cultivan bajo condiciones de estrés por deficiencia de nitrógeno, se observó un incremento de al menos 5% para la biomasa de raíz (Rootmax, la cual es la masa de Root ass máxima medida durante la vida de la planta y RootThick ax, la cual es la masa máxima de grosor de raíz medida durante la vida de la planta) .

Tabla D4 : Resumen de datos para plantas de arroz transgénicas; para cada parámetro, el incremento de porcentaje global se muestra para la generación TI, para cada parámetro el valor p es <0.05.

Además, las plantas que expresan la PLPCasa anterior mostraron dos líneas que fueron claramente positivas para el índice de verdor; tres líneas fueron claramente positivas para roothinmax, la cual es la masa máxima de raíces delgadas medidas durante la vida de la planta, y una línea fue claramente positiva para el número de semillas llenadas.

La evaluación de las plantas de arroz transgénicas que expresan un ácido nucleico que codifica el polipéptido de PLPCasa de la SEQ ID NO: 287 bajo condiciones sin estrés se presentan a continuación en la Tabla D5. Cuando se cultiva bajo condiciones sin estrés, se observó un incremento de al menos 5% para la biomasa de raíz (índice de Raíz/Brote) , y para el rendimiento de semilla (tasa de llenado) . Además, dos líneas de planta que expresan el ácido nucleico FeS de SEQ ID NO: 286 mostraron un incremento de biomasa de raíz total (incremento de respuesta de 14% y 11%, p<0.1) y una tercera línea mostró el incremento de cantidad de biomasa de raíz por debajo de un cierto umbral de espesor (RootThin, +7%, p<0.l).

Tabla D5 : Resumen de datos para plantas de arroz transgénicas ; para cada parámetro, el incremento de porcentaje global se muestra, para cada parámetro el valor p es <0.05.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica uno de: a. un polipéptido de DUF642, en donde tal polipéptido DUF642 comprende un dominio DUF642 del acceso InterPro IPR006946, de preferencia el polipéptido de DUF642 comprende la secuencia de firma FSAARTCAQ (SEQ ID NO: 194); b. un polímero similar relacionado con epimerasa, en donde tal polímero similar relacionado con epimerasa comprende uno o más de los siguientes motivos : (i) Motivo 7: CREEGV [DE] [QK] VFVD [AG] AH [AS] IG [QSC] V [PDE] [VI] [DN] [VM] [KR] [ED] IGADFY [TV] SNLHKWFFCPP [SA] VAFL [YH] (SEQ ID NO: 273) , (ii) Motivo 8: EF [SA] HH [DN] P [GAN] VAR [IV] NNGSFG [CS] CP [AG] S [VI] [LI] AAQ [ARK] [RN] WQ [LR] [LRQ] FL [RQA] QPD [AD] FYF [ND] xL [QRK] [PK]G (SEQ ID NO: 274), (iii) Motivo 9: S [LI] VDNATTAAAIVLQ [HQ] [VAI] [AG] [WR] [AS] FAEG [RKN] FA [KR] [GN] D [AVT] V [LV] MLH [YC] AY [GQ] [AS] VKKSI [EQH] AYV (SEQ ID NO: 275); o c. un polipéptido de Fosfolipasa/carboxilesterasa (PLPCasa) , en donde tal polipéptido de PLPCasa comprende un acceso InterPro IPR003140 que corresponde con el número de acceso PFAM PF022030 del dominio de Fosfolipasa/carboxilesterasa (PLPCasa) .

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la expresión modulada se efectúa al introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica el polipéptido de DUF642, el polipéptido similar relacionado con epimerasa o el polipéptido de PLPCasa.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde los rasgos relacionados con rendimiento mejorado comprenden Indice de rendimiento mejorado y/o verdor incrementado, en relación con las plantas control, y de preferencia comprende el rendimiento de biomasa incrementado y/o semillas incrementada en relación con las plantas control .

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los rasgos relacionados con rendimiento mejorado se obtienen bajo condiciones sin estrés o bajo condiciones de estrés abiótico, en donde las condiciones de estrés abiótico son una de estrés por sequia, estrés por salinidad o deficiencia de nitrógeno.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las ivindicaciones 1 a 4, a. en donde el polipéptido de DUF642 comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 1: N [LAM] [VL] KNG [DG] FEEGP [WYH] [MI] [FLI] P [NG] [TS] [STR] [WL]GVL[LVI]P[PTS] [NKM] [LQDVJ [EDV] [DE] [ED] [THY] S [PS] L [PS] [GP]W[IMT] [IV] (SEQ ID NO: 181) , (ii) Motivo 2: [VLA] [EKAT] [KPR] G [SAM] [LRH] Y [SA] [LIV] [TI]F[SG]A [AS] RTCAQ [DASJ] E [SVRL] L [NR] [VI] (SEQ ID NO: 182) , (iii) Motivo 3: D[PE] [EN]CGP[LI] [IL]D[AS] [VIF] AI [KR] (SEQ ID NO: 183); b. en donde tal polipéptido similar relacionado con epimerasa tiene al menos 40% de la identidad de secuencia global en el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 198 y/o comprende un dominio conservado con al menos 50% de identidad de secuencia en un dominio conservado como se representa por cualquiera de : - coordenadas de aminoácidos 32 a 449 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 10) ; - coordenadas de aminoácidos 47 a 276 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 11) ; - coordenadas de aminoácidos 92 a 364 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 12) ; y - coordenadas de aminoácidos 59 a 323 en la SEQ ID NO: 198 (motivo 13) c. en donde tal polipéptido de PLPCasa comprende uno o más de los siguientes motivos : (i) Motivo 14: E [FY] G [KR] T [HY] WRPKG [KR] HQATIVWLHGLGDNG [LSA] S [SW]SQLL[ED] [ST] LPLPNIKWICPTA (SEQ ID NO: 348), (ii) Motivo 15: PDD [WIVL] EGLDASAAH [IV] ANLLS [TS] EP [AS] D [VI] K [VL] G[IV]G (SEQ ID NO: 349), (iü) Motivo 16: FSMGA [TI] ALYSA [TA] C [YF] A [MHL] (SEQ ID NO : 350)

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde tal ácido nucleico es de origen vegetal, de preferencia de una planta monocotiledónea, o una planta dicotiledónea.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde tal ácido nucleico codifica cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla Al, A2 o A3, o es una porción de tal ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridar con tal ácido nucleico.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde tal secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo o cualquiera de los polipéptidos dados en la Tabla Al, A2 o A3.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde tal ácido nucleico que codifica el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia para SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 4 o codifica el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 285.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde tal ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor constitutivo, de preferencia a un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia a un promotor vegetal, de mayor preferencia a un promotor G0S2, de mayor preferencia a un promotor GOS2 de arroz.

11. La planta, parte de la misma planta, que incluye las semillas, o célula vegetal, obtenibles por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde tal planta, parte de la planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9.

12. El constructo comprende : (i) ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9; (ii) una o más secuencias de control capaces de manejar la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de transcripción.

13. El constructo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde una de tales secuencias de control es un promotor constitutivo, de preferencia un promotor constitutivo de resistencia media, de preferencia un promotor vegetal, de mayor preferencia un promotor G0S2, de mayor preferencia un promotor GOS2 de arroz .

14. El uso de un constructo de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 en un método para elaborar plantas que tengan rasgos relacionados con rendimiento mejorado, de preferencia el índice de rendimiento incrementado y/o verdor incrementado, en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada en relación con las plantas control .

15. La planta, parte de la planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13.

16. El método para la producción de una planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado con respecto a las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia un índice de rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, y/o verdor incrementado, en relación con las plantas control, que comprende : (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9; y (ii) cultivar tal célula vegetal o planta bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.

17. La planta transgénica que tiene rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control, de preferencia rendimiento incrementado en relación con las plantas control, y de mayor preferencia rendimiento de semilla incrementado y/o biomasa incrementada, que resulta de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9 o una célula vegetal transgénica derivada de la planta transgénica.

18. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 11, 15 ó 17, o una célula vegetal transgénica derivada de la misma, en donde tal planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, sorgo, escanda, espelta, trigo escaña, tef, milo o avena .

19. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 18, en donde tales partes cosechables son de preferencia biomasa de brote y/o biomasa de raíz y/o semillas .

20. Los productos derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 18 y/o a partir de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 19.

21. La molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (i) un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 199; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 199; (iii) un ácido nucleico que codifica el polipéptido similar relacionado con epimerasa que tiene un orden de incremento de preferencia al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200, y adicional o alternativamente comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia en cualquiera de uno o más de los motivos 7 a 13, y además confieren de preferencia los rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control . (iv) una molécula de ácido nucleico que hibridiza con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad y de preferencia confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control .

22. El polipéptido aislado seleccionado de: (i) una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden de incremento de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia en la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 200, y adicional o alternativamente comprende uno o más motivos que tienen en orden de incremento de preferencia de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia para cualquiera de uno o más de los motivos 7 a 13, y además de preferencia confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas control ; (iii) derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en (i) o (ii) anteriores.

23. El uso de un ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 a 9 y 21 para rasgos relacionados con rendimiento mejorado en plantas en relación con las plantas control, de preferencia para incrementar el índice de verdor y/o incrementar el rendimiento, y de mayor preferencia para incrementar el rendimiento de semillas y/o para incrementar la biomasa en plantas en relación con las plantas control.

24. Un método para la producción de un producto que comprende las etapas de crecimiento de las plantas de acuerdo con la reivindicación 11, 15, 17 ó 18 y producir tal producto a partir de o por a. tales plantas de acuerdo con las reivindicaciones 11, 15, 17 ó 18; o (ii) las partes, incluyendo semillas, de tales plantas .

25. El constructo de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 comprendido en una célula vegetal.

26. El ADN cromosómico recombinante que comprende el constructo de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13.