ES2279339T3 - Uso de la secuencia reguladora del gen gos2 del arroz para la expresion genica en plantas o celulas de plantas dicotiledoneas. - Google Patents
Uso de la secuencia reguladora del gen gos2 del arroz para la expresion genica en plantas o celulas de plantas dicotiledoneas. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de una secuencia de ácido nucleico reguladora aislada que comprende una secuencia reguladora como la representada en el Nº ID SEC 1 o un fragmento funcional o una variante funcional de la misma, para conducir la expresión de una secuencia de ácido nucleico asociada en una planta o célula de planta no monocotiledónea, variante funcional que es capaz de hibridarse al ácido nucleico del Nº ID SEC: 1 bajo condiciones restrictivas.
Description
Uso de la secuencia reguladora del gen GOS2 del
arroz para la expresión génica en plantas o células de plantas
dicotiledóneas.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular de las plantas. En particular, la presente
invención describe el uso de una secuencia reguladora del gen GOS2
del arroz para la regulación de la expresión génica en células
vegetales de plantas no monocotiledóneas.
La ingeniería genética de las plantas tiene el
potencial de permitir la producción de plantas que tienen todo tipo
de rasgos deseables, tales como resistencia incrementada a
patógenos, resistencia a herbicidas, rendimiento incrementado,
tolerancia incrementada al estrés, etc. Esto se alcanza típicamente
insertando trozos adecuados de DNA procedente de una fuente
heteróloga, o de la misma fuente, en una planta. La expresión de
secuencias de DNA heterólogas en un huésped vegetal depende de la
presencia de un promotor enlazado operablemente que es funcional
dentro del huésped vegetal.
Los promotores son elementos de DNA que regulan
la transcripción en células procarióticas y eucarióticas y están
situados en la región de flanqueo 5' o aguas arriba de un gen
transcrito. La secuencia de un promotor varía en longitud y
composición de los pares de bases de gen a gen. Muchos elementos de
las secuencias reguladoras pueden estar presentes dentro de la
secuencia de un promotor. Estos elementos de las secuencias
reguladoras, que interactúan con proteínas que se unen a DNA (que
son parte del complejo de iniciación de la transcripción), están
generalmente intercalados en una secuencia promotora. Los elementos
específicos, llamados cajas de DNA, contribuyen a las
características definidas o a un patrón de activación definido para
un promotor. Muchas de estas cajas son sitios de reconocimiento a
los que pueden unirse factores de transcripción reguladores y son
parte de un estrecho mecanismo de control del promotor. Se han
descrito numerosas cajas de DNA de promotores vegetales, tales como
cajas específicas para tejidos (Chaubet y otros, Plant J. 10 (3)
425-435, 1996), cajas de pirimidina (Gubler y
Jacobsen, Plant Cell 4 (11) 1435-1441, 1992) que
influyen en el nivel de expresión o cajas G (Dolferus y otros,
Plant Physiol. 105 (4) 1075-1087, 1994), que reducen
la actividad del promotor durante la exposición a frío o
deshidratación.
La tecnología del DNA recombinante ha encontrado
ahora una amplia aplicación en la investigación y en el desarrollo
de productos. En la biología molecular, se usan frecuentemente tipos
específicos de promotores para la expresión de ácidos nucleicos o
proteínas heterólogos en organismos, en los que la expresión puede
ser constitutiva (es decir, expresión continua a través de las
células de un organismo) o limitada a partes definidas de un
organismo (es decir, expresión preferida en tejidos o células) o
limitada a ciertas fases de desarrollo o a ciertas condiciones
ambientales o fisiológicas (es decir, expresión inducible).
Existe una necesidad en diversas aplicaciones
industriales de elementos de control transcripcional capaces de
conducir la expresión génica en plantas. Por lo tanto, para obtener
una expresión génica deseada, que puede ajustarse precisamente
dependiendo de las necesidades específicas, es deseable proporcionar
una amplia serie de promotores de los que pueda elegirse uno. Los
expertos en la técnica necesitan tener a su disposición una
variedad de promotores con diferentes patrones de expresión o con
diferentes características de control del tiempo de entre los que
elegir. Para muchas aplicaciones industriales y agrónomas, cuando el
objetivo es conferir una característica dada a lo largo del
desarrollo de la planta y durante cualquier estado ambiental o
físico de la planta, se necesitaría un promotor constitutivo. Un
promotor constitutivo puede ser adecuado para conducir la expresión
de genes marcadores seleccionables o puede usarse cuando el producto
génico de un gen particular ha de aislarse y purificarse de la
planta con propósitos comerciales.
Frecuentemente, también es deseable usar
promotores que estén regulados de modo comparable entre sí y den
como resultado un patrón de expresión similar a lo largo de una
amplia gama de especies de huésped. Se han aislado hasta la fecha
muy pocos promotores vegetales constitutivos que sean activos en una
amplia gama de especies (Callis y otros, J. Biol. Chem. 265
12486-12493, 1990; Zhang y otros, Plant Cell 3
1155-1165, 1991; de Pater y otros, Plant J. 2
837-844, 1992; Mandel y otros Plant Mol. Biol. 29
995-1004, 1995; Baszczynski y otros, Maydica 42
189-201, 1997). Como resultado, el 35S del virus del
mosaico de la coliflor (CaMV 35S; Odell y otros, Nature 313
653-660, 1985) es actualmente el promotor
constitutivo más ampliamente usado en la ciencia de las plantas, e
incluso en algunas especies fúngicas. La principal desventaja de tal
promotor es sin embargo su origen viral. Las plantas transformadas
con el promotor 35S de CaMV frecuentemente muestran varias
características no deseables, tales como una silenciación eficaz de
los transgenes o una recombinación incrementada, conduciendo a
inestabilidad a lo largo del tiempo y durante generaciones
subsiguientes (Kohli y otros, Plant J. 17 591-601,
1999; Al-Kaff y otros, Nature Biotechnology 18
995-999, 2000). Además, los elementos virales a
menudo no son deseables en productos transgénicos, tanto por razones
reguladoras como por razones de aceptación pública general.
cDNA de GOS2 de arroz se aisló y
caracterizó en un programa de rastreo para genes que se expresaban
en muchos tejidos diferentes del arroz (de Pater y otros, Plant J.
2, 837-844, 1992). GOS2 es un gen de una
sola copia que codifica una isoforma de factor de iniciación de la
traducción elF1. El análisis de la expresión revelaba altos niveles
de mRNA en vástagos verdes, vástagos etiolados y en raíces de
plántulas. Un patrón de expresión similar se detectaba en plantas
maduras, aunque la expresión era un poco inferior en las raíces.
También se detectaban altos niveles de expresión en plantas o
cultivos de suspensión celular de otra variedad de arroz. Un
fragmento de promotor aislado era capaz de conducir la expresión de
GUS en plántulas de arroz (hoja, tejidos radicales y
coleóptilo) y en cultivos en suspensión de células de arroz. El
promotor también era activo en maíz, cebada y ballico (de Pater y
otros, Plant J. 2, 837-844, 1992; Hensgens y otros,
Plant Mol. Biol. 22, 1101-1127, 1993). Se ha
mostrado que es activo en otras plantas monocotiledóneas, con
niveles de expresión similares a los de 35S de CaMV. Barbour y
otros (WO0020571) sugieren, pero no mostraban, el uso de un
promotor de GOS2 procedente de maíz en plantas dicotiledóneas. Sin
embargo, existe poca homología entre el promotor de GOS2 de maíz y
el promotor de GOS2 de arroz que es el objeto de la presente
invención.
Se ha encontrado ahora que una secuencia
reguladora de GOS2 procedente de arroz es activa en plantas
no monocotiledóneas, y tiene un patrón y una intensidad de
expresión similares al promotor 35S de CaMV. Por consiguiente, la
presente invención trata del uso de una secuencia reguladora de
GOS2 para conducir la expresión constitutiva de ácidos
nucleicos en plantas no monocotiledóneas. Por lo tanto, la presente
invención proporciona una buena alternativa al promotor 35S de
CaMV. La secuencia reguladora de la presente invención, cuando se
enlaza a un gen útil y se transfiere a una planta o célula de
planta no monocotiledónea, permite la expresión de ese gen útil.
Además, puesto que la secuencia reguladora de la presente invención
permite la expresión constitutiva, es posible usarla como una
secuencia reguladora para conducir la expresión del gen útil
transferido en todos los tejidos en cualquier fase de desarrollo.
Por otra parte, como esta secuencia reguladora se origina de una
planta monocotiledónea, es menos probable que sea tendente a la
silenciación que la secuencia reguladora de monocotiledónea o el
promotor 35S de CaMV, cuando se usa para expresar un gen útil
transferido en plantas dicotiledóneas, tales como Arabidopsis
thaliana.
Los expertos en la técnica sabrán que la
invención descrita aquí está sometida a variaciones y modificaciones
distintas a las descritas específicamente. Debe entenderse que la
invención descrita aquí incluye todas estas variaciones y
modificaciones. La invención también incluye todas estas etapas,
características, composiciones y compuestos mencionados o indicados
en esta memoria descriptiva, individualmente o colectivamente, y
todas y cada una de las combinaciones de cualquiera o más de estas
etapas o características.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a no ser
que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra
"comprenden", y variaciones tales como "comprende" y
"que comprende", implica la inclusión de un integrante o una
etapa o un grupo de integrantes o etapas indicado pero no la
exclusión de cualquier otro integrante o etapa o grupo de
integrantes o etapas.
Según se usa aquí, el término "derivado de"
se tomará para indicar que un integrante o grupo de integrantes se
ha originado a partir de la especie especificada, pero no tiene
necesariamente que haberse obtenido directamente de la fuente
especificada. Este integrante puede modificarse substancialmente de
su forma natural en composición y/o ambiente a través de
manipulación humana deliberada.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico reguladora
aislada que comprende una secuencia reguladora como la representada
por el Nº ID SEC 1 o por un fragmento funcional o variante
funcional de la misma, para conducir la expresión de una secuencia
de ácido nucleico asociada en una planta o célula de planta no
monocotiledónea.
El término "secuencia reguladora", según se
usa aquí, se refiere a secuencias de DNA que son necesarias para
efectuar la expresión de secuencias a las que están ligadas. Las
secuencias reguladoras pueden diferir dependiendo del organismo
huésped pretendido y de la naturaleza de la secuencia que ha de
expresarse. El término "secuencia reguladora" pretende
incluir, como mínimo, todos los componentes necesarios para la
expresión y opcionalmente componentes ventajosos adicionales. De
acuerdo con una característica preferida, la secuencia de ácido
nucleico reguladora aislada es una secuencia promotora. Según se
usa aquí, un "promotor" significa una región de DNA aguas
arriba del inicio de la transcripción y que está implicada en la
unión a RNA polimerasa y otras proteínas para comenzar la
transcripción. La referencia aquí a un "promotor" ha de tomarse
en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras de
la transcripción derivadas de un gen genómico eucariótico clásico,
incluyendo la caja TATA que se requiere para una iniciación exacta
de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT y
elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras,
potenciadores y silenciadores aguas arriba) que alteran la
expresión génica en respuesta a estímulos de desarrollo y/o
externos, o de una manera específica para un tejido. Por
consiguiente, una velocidad de transcripción del promotor reprimible
disminuye en respuesta a un agente represor. Una velocidad de
transcripción del promotor inducible incrementa en respuesta a un
agente inductor. Una velocidad de transcripción del promotor
constitutivo no se regula específicamente, aunque puede variar bajo
la influencia de condiciones metabólicas generales. El término
"promotor" también incluye las secuencias reguladoras de la
transcripción de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede
incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la
transcripción de caja -10. El término "promotor" también se
usa para describir una molécula sintética o de fusión, o un derivado
que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de
ácido nucleico en una célula, un tejido o un
órgano.
órgano.
La presente invención también abarca así el uso
de fragmentos o variantes del Nº ID SEC 1, que pueden empalmarse
mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo
mediante ligación in vitro, para crear secuencias
reguladoras híbridas que comprenden mezclas de partes de elementos
reguladores de diferentes fuentes, bien naturales o bien
sintéticas. Por lo tanto, la invención también proporciona una
secuencia de ácido nucleico reguladora híbrida que comprende la
secuencia reguladora representada por el Nº ID SEC 1 o un fragmento
o una variante de la misma, funcionalmente combinada con una o más
de otras secuencias reguladoras o fragmentos de las mismas.
Las secuencias reguladoras o los promotores
pueden contener copias adicionales de uno o más elementos
reguladores específicos, para potenciar adicionalmente la expresión
y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de una
molécula de ácido nucleico a la que están conectados operablemente.
Tales elementos reguladores pueden situarse adyacentes a una
secuencia promotora heteróloga para conducir la expresión de una
molécula de ácido nucleico en respuesta a, por ejemplo, cobre,
glucocorticoides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, cAMP,
ácido abscísico, auxina, una lesión, etileno, jasmonato o ácido
salicílico, o para conferir la expresión de una molécula de ácido
nucleico a células, tejidos u órganos específicos tales como
meristemos, hojas, raíces, embrión, flores, semillas o frutos. En
el contexto de la presente invención, la secuencia reguladora es
activa en plantas no monocotiledóneas y está representada por el Nº
ID SEC 1, un fragmento funcional o una variante funcional del
mismo. Ha de entenderse que el término "funcional", cuando se
usa con respecto a un ácido nucleico o parte del mismo, tiene una
actividad biológica esencialmente similar en comparación con el
ácido nucleico presente en la naturaleza y es capaz de conducir la
expresión en plantas no monocotiledóneas.
"Expresión" significa la producción de una
proteína o secuencia de nucleótidos en la propia célula o en un
sistema libre de células. Incluye la transcripción en un producto de
RNA, la modificación postranscripcional y/o la traducción en un
producto proteínico o un polipéptido a partir de un DNA que codifica
ese producto, así como posibles modificaciones postraduccionales.
Una secuencia codificante puede transcribirse en la dirección de
sentido o antisentido.
El término "secuencia o secuencias de ácido
nucleico", "molécula o moléculas de ácido nucleico",
"polinucleótido o polinucleótidos", "secuencia o secuencias
de nucleótidos", "secuencia o secuencias de DNA" o "gen o
genes", cuando se usa aquí, se refiere a nucleótidos, bien
ribonucleótidos (RNA) o bien desoxirribonucleótidos (DNA) o una
combinación de ambos, en una forma polímera de cualquier longitud.
Estos términos incluyen por otra parte DNA y RNA de doble hebra y
de una sola hebra. Estos términos también incluyen modificaciones de
nucleótidos conocidas en la técnica, tales como metilación,
ciclación, "protecciones", substitución de uno o más de los
nucleótidos presentes en la naturaleza por un análogo tal como
inosina, y modificaciones de la cadena principal polinucleotídica.
El término "aislado" en la presente solicitud significa
retirado de su ambiente original. Por ejemplo, un ácido nucleico
presente en el estado natural en un organismo no está aislado,
mientras que el mismo ácido nucleico separado de los ácidos
nucleicos adyacentes en los que está presente naturalmente se
considera que está "aislado".
Una secuencia de ácido nucleico puede comprender
secuencias codificantes o puede contener secuencias no codificantes.
Una "secuencia codificante" o "marco abierto de lectura"
u "ORF" se define como una secuencia de nucleótidos que puede
transcribirse a mRNA y/o traducirse en un polipéptido cuando se pone
bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, es decir
cuando la secuencia codificante u ORF está presente en una forma
expresable. La secuencia codificante u ORF está unido por un codón
de comienzo de la traducción 5' y un codón de parada de la
traducción 3'. Una secuencia codificante u ORF puede incluir, pero
no está limitado a, RNA, mRNA, cDNA, secuencias de nucleótidos
recombinantes, secuencias de nucleótidos fabricadas sintéticamente o
DNA genómico. La secuencia codificante u ORF puede estar
interrumpido por secuencias de ácido nucleico intermedias.
Las secuencias codificantes, o los genes que
codifican esencialmente la misma proteína pero aislados de
diferentes fuentes, pueden consistir en secuencias de ácido
nucleico substancialmente divergentes. Recíprocamente, pueden
diseñarse secuencias de ácido nucleico substancialmente divergentes
para efectuar la expresión esencialmente de la misma proteína.
Estas secuencias de ácido nucleico son el resultado de, por ejemplo,
la existencia de diferentes alelos de un gen dado o de la
degeneración del código genético o de diferencias en la utilización
de los codones. Así, aminoácidos tales como metionina y triptófano
son codificados por un solo codón mientras que otros aminoácidos,
tales como arginina, leucina y serina, pueden traducirse a partir de
hasta seis codones diferentes. La utilización preferidas de los
codones de diversos organismos puede encontrarse en
http://www.kazusa.or.ip/codon. Las variantes alélicas se
definen adicionalmente por comprender polimorfismos de un solo
nucleótido (SNPs) así como pequeños polimorfismos de
inserción/deleción (INDELs; el tamaño de los INDELs es habitualmente
menor que 100 pb). Los SNPs e INDELs forman el grupo más grande de
variantes de secuencia en cepas polimórficas presentes en la
naturaleza de la mayoría de los organismos.
El término "asociado", según se usa aquí, o
"enlazado operablemente" se refiere a una yuxtaposición entre
una secuencia reguladora y codificante, en donde los componentes así
descritos están en una relación que les permite funcionar en su
manera pretendida. Una secuencia reguladora "enlazada
operablemente" a una secuencia codificante está ligada de tal
modo que la expresión de la secuencia codificante se alcanza bajo
condiciones compatibles con las secuencias de control. En el caso
de que la secuencia reguladora sea un promotor, será sabido por un
experto que es preferible un ácido nucleico de doble hebra. El ácido
nucleico asociado abarca ácidos nucleicos heterólogos. Ácidos
nucleicos heterólogos se refiere a ácidos nucleicos derivados de una
fuente genética separada, por ejemplo ácidos nucleicos que se
originan desde dentro de la célula pero que no están naturalmente
situados en la célula, o que están situados en un sitio cromosómico
diferente de la célula. Los ácidos nucleicos heterólogos también
pueden derivarse de otras especies y pueden introducirse como un
transgén, por ejemplo, mediante transformación. Este transgén puede
estar substancialmente modificado desde su forma natural en
composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humana
deliberada. Además, la expresión de las secuencias de ácido
nucleico naturales puede modificarse mediante la introducción en la
planta de secuencias reguladoras de acuerdo con la invención de tal
modo que las secuencias reguladoras están enlazadas operablemente
al ácido nucleico natural. Ácido nucleico natural se refiere a ácido
nucleico en su situación natural en el genoma de un organismo.
\newpage
El término "fragmento de una secuencia" o
"parte de una secuencia" significa una secuencia truncada de la
secuencia original en cuestión. La secuencia de ácido nucleico
truncada puede variar ampliamente en longitud, siendo el tamaño
mínimo una secuencia de tamaño suficiente para proporcionar una
secuencia con al menos una función y/o actividad comparable de la
secuencia original en cuestión, mientras que el tamaño máximo no es
crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo habitualmente no
es substancialmente mayor que el requerido para proporcionar la
actividad y/o la función o funciones deseadas de la secuencia
original. Estos términos no son restrictivos al contenido del
fragmento o segmento de DNA, que puede ser cualquier DNA, con
cualquier funcionalidad. Por ejemplo, el fragmento o los segmentos
de DNA pueden consistir en un promotor pero también pueden
comprender muchos genes, con o sin elementos de control adicionales,
puede contener solo secuencias espaciadoras. Un fragmento funcional
de un promotor puede construirse sometiendo a deleción parte del
extremo 5' y/o 3', y/o sometiendo a deleción partes internas y
probando el fragmento restante con respecto a su capacidad para
conducir la expresión de un gen informador. El nivel y el patrón de
expresión de este constructo génico informador pueden compararse
entonces con los del mismo gen informador bajo el control del
promotor original a partir del cual se derivaba el fragmento.
Por otra parte, una variante de un fragmento de
DNA abarca una secuencia que muestra homología con la secuencia
mencionada y es capaz de promover la expresión de una secuencia de
DNA asociada cuando se reintroduce en una planta y se hibrida a la
secuencia mencionada o a una porción de la misma bajo condiciones
restrictivas. El experto en la técnica apreciará que en este caso
las reacciones bajo condiciones restrictivas para la hibridación se
llevan a cabo típicamente a una temperatura de entre 60ºC y 65ºC en
solución salina tamponada con citrato de intensidad 0,3 que
contiene 0,1% de SDS, seguido por enjuague a la misma temperatura
con solución salina tamponada con citrato de intensidad 0,3 que
contiene 0,1% de SDS. Con el propósito de definir el nivel de
restricción, puede hacerse referencia convenientemente a Sambrook y
otros (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.
(1989).
Una "planta no monocotiledónea" comprende
todas las especies de plantas que pertenecen al reino Plantae según
se define mediante ITIS [the Integrated Taxonomic Information System
(http://www.itis.usda.gov/index.html)], incluyendo la clase
de Magnoliopsida pero sin la clase de las Liliopsida (Liliatae,
Monocotyledonae). Las clases Magnoliopsida y Liliopsida son parte
de la división Magnoliophyta, que a su vez pertenece al subreino
Tracheobionta. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente
invención puede usarse para conducir la expresión génica en
cualquier planta no monocotiledónea, en particular es aplicable a
una planta dicotiledónea incluyendo una legumbre para pasto o
forrajera, una planta ornamental, un cultivo para consumo, un árbol
o un arbusto. Especies de plantas preferidas incluyen algodón,
patata, tomate, col, remolacha azucarera, soja, judía, girasol,
guisantes.
Ventajosamente, la secuencia reguladora
representada por el Nº ID SEC 1 o un fragmento funcional o variante
funcional de la misma es capaz de conducir la expresión de una
secuencia de ácido nucleico asociada en una planta no
monocotiledónea. Tal ácido nucleico asociado puede ser cualquier
secuencia de DNA heteróloga derivada de cualquier organismo cuya
secuencia ha de expresarse en una planta no monocotiledónea. La
secuencia de DNA heteróloga puede obtenerse a partir de cualquier
organismo, incluyendo plantas, especies de planta que pueden ser la
misma especie de planta en la que ha de introducirse la secuencia, o
puede ser diferente. Adicionalmente o alternativamente, la
secuencia de ácido nucleico asociada puede ser un ácido nucleico
endógeno enlazado operablemente a la secuencia reguladora de
acuerdo con la invención.
Por lo tanto, la invención también proporciona
el uso de un ácido nucleico regulador aislado como el definido
anteriormente para conducir la expresión de un ácido nucleico
asociado en una planta o célula de planta no monocotiledónea, en
donde dicho ácido nucleico asociado es un ácido nucleico aislado o
un ácido nucleico endógeno para la célula huésped en la que ha de
introducirse dicha secuencia de ácido nucleico reguladora
aislada.
El ácido nucleico recombinante abarca cualquier
medio para la clonación de y/o la transferencia de un ácido
nucleico a una célula huésped, incluyendo "vectores" o
"secuencias vectoriales", que pueden introducirse en un
organismo mediante transformación o transfección, y que puede bien
estar integrados en el genoma de la célula huésped o bien
mantenerse en alguna forma extracromosómicamente. Las secuencias
vectoriales comprenden generalmente un grupo de sitios únicos
reconocidos por enzimas de restricción, el sitio de clonación
múltiple (MCS), en los que pueden insertarse una o más secuencia o
secuencias no vectoriales.
Por "secuencia no vectorial" o
"inserto" se entiende de acuerdo con esto el segmento de DNA
deseado que se quiere clonar en uno o más de los sitios del MCS,
comprendido dentro de un vector. El inserto puede tener uno o más
genes.
Los "vectores de expresión" forman un
subgrupo de vectores que, en virtud de comprender las secuencias
reguladoras apropiadas que permiten la creación de un formato
expresable para la secuencia o las secuencias no vectoriales
insertadas, permiten así la transcripción y/o la traducción de un
ácido nucleico insertado en los mismos. Los vectores de expresión
son conocidos en la técnica y permiten la expresión proteínica en
organismos, incluyendo bacterias (por ejemplo, Escherichia
coli), hongos (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris), células
de insecto (por ejemplo, vectores de expresión baculovirales),
células animales (por ejemplo, células COS o CHO) y células de
planta (por ejemplo, vectores de expresión basados en el virus de
la patata X, véase, por ejemplo, Vance y otros, 1998 - WO9844097).
Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de
clonación, vectores binarios o vectores de integración.
Las secuencias reguladoras que aseguran la
expresión en células procarióticas y/o eucarióticas, particularmente
en plantas no monocotiledóneas, son bien conocidas para los
expertos en la técnica. Una secuencia reguladora preferida es la
secuencia reguladora listada en el Nº ID SEC 1, un fragmento
funcional o una variante funcional de la misma. Cuando se usan en
células eucarióticas, los vectores también pueden comprender
terminadores que contienen señales de poliadenilación que aseguran
el procesamiento y la poliadenilación 3' de un transcrito primario
y la terminación de la transcripción. En células vegetales, las
señales de terminación empleadas habitualmente son del gen de
nopalina sintasa o el terminador 35S de CaMV. Elementos reguladores
adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como
traduccionales. Un potenciador traduccional de planta usado a
menudo es la secuencia omega del CaMV. Se ha mostrado que la
inclusión de un intrón incrementa los niveles de expresión en hasta
100 veces en ciertas plantas (Maiti y otros, Transgenic Research 6,
143-156, 1997; Ni, Plant Journal 7 (1995),
661-676).
Ventajosamente, vectores usados en la invención
comprenden un marcador seleccionable y/o evaluable. Genes
marcadores seleccionables útiles para la selección de células de
planta, callos, tejidos vegetales y plantas transformados son bien
conocidos por los expertos en la técnica. La resistencia a
antimetabolitos es muy útil como una base para la selección: por
ejemplo, el gen dhfr confiere resistencia al metotrexato
(Reiss y otros, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13,
143-149, 1994); el gen npt confiere
resistencia a los aminoglicósidos neomicina, kanamicina y
paromomicina (Herrera-Estrella y otros, EMBO J. 2,
987-995, 1983); o el gen hpt, que confiere
resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32,
481-485, 1984). Se han descrito genes marcadores
seleccionables adicionales, tales como trpB, que permite que
las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que
permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina
(Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 8047, 1988);
manosa-6-fosfato isomerasa, que
permite que las células utilicen manosa (WO 94/20627) y orinitina
descarboxilasa, que confiere resistencia al inhibidor de ornitina
descarboxilasa,
2-(difluorometil)-DL-ornitina o
DMFO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in Molecular
Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o el gen de desaminasa
de Aspergillus terreus, que confiere resistencia a la
blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59,
2336-2338, 1995). Marcadores evaluables útiles
también son conocidos por los expertos en la técnica y están
disponibles comercialmente. Ventajosamente, el marcador es un gen
que codifica luciferasa (Giacomin, Pl. Sci. 116
59-72, 1996; Srikantha, J. Bact. 178 121, 1996),
proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389
44-47, 1996; Haseloff y otros, Proc. Natl. Acad. Sci
U.S.A. 94 2122-2127, 1997) o
\beta-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6
3901-3907, 1987). Los vectores pueden proporcionar
además sitios cebadores, por ejemplo para PCR, sitios de iniciación
y/o regulación de la transcripción y/o la traducción, sitios
recombinantes, replicones, etc.
La presente invención incluye claramente
cualquier ácido nucleico, vector o vector de expresión recombinante
que comprenda la secuencia reguladora de acuerdo con la presente
invención y/o una secuencia no vectorial como la definida
anteriormente.
De acuerdo con otra modalidad, la invención se
refiere a una célula de planta no monocotiledónea que comprende un
ácido nucleico recombinante como el descrito anteriormente. El ácido
nucleico recombinante puede integrarse establemente en el genoma de
la célula de planta no monocotiledónea. La invención también
proporciona un cultivo de células de planta, un callo, una planta o
una parte de planta derivada de estas células de planta. Además,
dentro del alcance de la presente invención, hay una parte
recolectable, un órgano, un tejido o un material de propagación de
una planta de acuerdo con la invención, que comprende una secuencia
de ácido nucleico que comprende una secuencia reguladora
representada por el Nº ID SEC: 1 o un fragmento o variante de la
misma.
Por otra parte, se proporciona un método para la
expresión de una secuencia de ácido nucleico en una célula de
planta no monocotiledónea, método que comprende introducir en esta
célula de planta una secuencia reguladora representada por el Nº ID
SEC 1 o un fragmento funcional o una variante funcional de la misma,
en donde la secuencia reguladora es capaz de conducir la expresión
de la secuencia de ácido nucleico que es una secuencia de ácido
nucleico bien aislada o bien endógena.
Medios para introducir DNA recombinante en
tejido o células de planta incluyen, pero no se limitan a,
transformación usando CaCl_{2} y variaciones de la misma
(Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (4) 557-580, 1983)),
captación de DNA directa en protoplastos (Krens y otros, Nature 296
72-74, 1982; Paszkowski y otros, EMBO J. 3
2717-2722, 1984), captación mediada por PEG hacia
protoplastos (Armstrong y otros, Plant Cell Reports 9
335-339, 1990), bombardeo de micropartículas,
electroporación (Fromm y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82
5824-5826, 1985), microinyección de DNA (Crossway y
otros, Mol. Gen. Gen. 202 179-185, 1986; Fromm y
otros Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 5824-5826,
1985), bombardeo con micropartículas de explantes de tejido o
células (Christou y otros, Plant Physiol. 87
671-674, 1988), infiltración a vacío de tejido con
ácido nucleico o, en el caso de plantas, transferencia medida por
T-DNA desde Agrobacterium al tejido de planta
según se describe esencialmente (An y otros, EMBO J. 4
277-284, 1985; Dodds, Plant genetic engineering,
1985; Herrera-Estrella y otros, EMBO J. 2
987-995, 1983; Herrera-Estrella y
otros, Nature 303 209-213, 1983).
Para el bombardeo de células con
micropartículas, una micropartícula se impulsa hacia una célula para
producir una célula transformada. Cualquier metodología y aparato
de transformación balística de células adecuados pueden usarse al
realizar la presente invención. Un aparato y procedimientos
ejemplares son analizados por Stomp y otros (patente de EE.UU. Nº
5122466) y Sanford y Wolf (patente de EE.UU. Nº 4945050). Cuando se
usan procedimientos de transformación balísticos, el constructo
génico puede incorporar un plásmido capaz de replicarse en la
célula que ha de transformarse. Ejemplos de micropartículas
adecuadas para el uso en tales sistemas incluyen esferas de oro de
1 a 5 \mum. El constructo de DNA puede depositarse sobre la
micropartícula mediante cualquier técnica adecuada, tal como
mediante precipitación.
El ácido nucleico que se define anteriormente en
la presente invención, o un constructo genético que lo comprende,
puede introducirse en una célula usando cualquier método conocido
para la transfección o transformación.
La invención se refiere además a un método para
la producción de plantas, células de plantas o tejidos de plantas
transgénicas no monocotiledóneas que comprende la introducción en
una planta, una célula de planta o un tejido de planta no
monocotiledónea de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico
asociada, en donde la secuencia de ácido nucleico asociada es
heteróloga para el primer ácido nucleico. De acuerdo con otra
modalidad preferida, la invención se refiere a una célula de planta
o planta transgénica no monocotiledónea como la descrita aquí
anteriormente en donde el ácido nucleico de la invención está
establemente integrado en el genoma de la célula de planta o la
planta no monocotiledónea.
Durante la transformación de una célula con el
constructo genético de la invención, una planta entera puede
regenerarse a partir de la misma. Tejido de planta capaz de una
propagación clonal subsiguiente, ya sea mediante organogénesis o
criogénesis, puede transformarse con un constructo génico de la
presente invención y una planta entera regenerarse a partir del
mismo. El tejido particular elegido variará dependiendo de los
sistemas de propagación clonal disponibles, y mejor estudiados,
para las especies particulares que se transforman. Objetivos de
tejidos ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones,
cotiledones, hipocotilos, megagametocitos, tejido calloso, tejido
merismático existente (por ejemplo, meristemo apical, yemas
auxiliares y meristemos radicales) y tejido meristemático inducido
(por ejemplo, meristemo del cotiledón y meristemo del hipocotilo).
El término "organogénesis", según se usa aquí, significa un
procedimiento por el que se desarrollan secuencialmente vástagos y
raíces a partir de centros meristemáticos. El término
"embriogénesis", según se usa aquí, significa un procedimiento
por el que se desarrollan juntos vástagos y raíces de un modo no
concertado (no secuencialmente), ya sea a partir de células
somáticas o gametos.
Las plantas no monocotiledóneas transformadas
generadas pueden propagarse mediante una variedad de medios, tales
como mediante propagación clonal o técnicas de mejora genética
clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera
generación (o T1) puede autopolinizarse para dar transformantes de
segunda generación (o T2) homocigóticos y las plantas T2 propagarse
adicionalmente a través de técnicas de mejora genética clásicas. Las
plantas transformadas generadas contempladas aquí pueden tomar una
variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células
transformadas y células no transformadas; transformantes clonales
(por ejemplo, todas las células transformadas para contener el
casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no
transformados (por ejemplo, en plantas, un patrón radical
transformado injertado a un esqueje no transformado).
La invención no solo se refiere a una planta o
un tejido de planta no monocotiledóneas transgénica que comprende
células de planta como las descritas aquí sino que también se
extiende a las partes recolectables de la planta transgénica,
preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en semillas,
hojas, flores, frutos, cultivos tallosos, raíces, tubérculos,
rizomas y bulbos.
La invención también se refiere a la progenie
derivada de cualquiera de estas plantas o partes de plantas
transgénicas.
La presente invención también abarca el uso de
una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia
reguladora como la representada por el Nº ID SEC 1 o un fragmento
funcional o variante funcional de la misma, caracterizada como
anteriormente por conducir la expresión constitutiva de una
secuencia asociada en una célula de planta o una planta no
monocotiledónea. También se incluye el uso de un ácido nucleico
regulador híbrido como el definido anteriormente para conducir la
expresión de una secuencia de ácido nucleico asociada en una célula
de planta o una planta no monocotiledónea.
Fig. 1: Patrón de expresión de GUS típico en una
planta de Arabidopsis thaliana transformada con un constructo
p2203 y una planta de control. La secuencia reguladora de GOS2
muestra una fuerte expresión constitutiva en tejidos de vástagos,
incluyendo los petiolos, el sistema vascular, los tricomas y en las
puntas radicales. La expresión en otros tejidos radicales es
inferior, pero todavía fácilmente apreciable.
Fig. 2: Expresión de GUS bajo el control de la
secuencia reguladora de GOS2 (líneas AT0476-09 y
AT0476-11), comparada con la expresión de GUS bajo
el control del promotor 35S (línea WS35S:GUS). Para cada línea, se
probaron 5 réplicas. Las plantas mostradas tienen 2 cotiledones y 2
hojas verdaderas y se tiñeron durante 1 hora (cuadro a) o se
tiñeron durante la noche (cuadro b).
Fig 3: Expresión de GUS bajo el control de la
secuencia reguladora de GOS2 (líneas AT0476-09 y
AT0476-11), comparada con la expresión de GUS bajo
el control del promotor 35S (línea WS35S:GUS). Para cada línea, se
probaron 5 réplicas. Las plantas mostradas están en la fase de 10
hojas y se tiñeron durante 1 hora (cuadro a) o se tiñeron durante
la noche (cuadro b).
\newpage
Fig 4: Expresión de GUS bajo el control de la
secuencia reguladora de GOS2 (líneas AT0476-09 y
AT0476-11), comparada con la expresión de GUS bajo
el control del promotor 35S (línea WS35S:GUS). Para cada línea, se
probaron 5 réplicas. Las plantas mostradas están en la fase adulta
con una inflorescencia y se tiñeron durante 1 hora (cuadro a) o se
tiñeron durante la noche (cuadro b).
La presente invención se ilustrará ahora con los
siguientes ejemplos.
Todos los procedimientos de DNA se realizaron de
acuerdo con protocolos estándar (Maniatis T y otros (2001).
Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, CSH, Nueva York).
El gen de \beta-glucuronidasa
de E. coli, interrumpido por el segundo intrón del gen
ST-LS1 específico para tejido inducible por luz de
patata, se amplió a partir del vector pTHW136 (con un casete
idéntico al de pMOG553, MOGEN international n.v, Leiden, Países
Bajos). El cDNA se amplificó mediante PCR con DNA polimerasa
Platinum Pfx (Invitrogen) y usando un cebador de sentido que incluye
attB1 (Nº ID SEC 2) y un cebador de antisentido que incluye attB2
(Nº ID SEC 3).
Las condiciones para la PCR eran: 2 minutos de
desnaturalización a 94ºC (1 ciclo); 35 ciclos de 1 minuto de
desnaturalización a 94ºC, 1 minuto de reasociación a 58ºC y 2
minutos de amplificación a 68ºC, y finalmente 1 ciclo de 5 minutos
de elongación a 68ºC. Un fragmento prominente con el tamaño esperado
de 2 kb se aisló del gel y se purificó usando el Zymoclean Gel DNA
Recovery Kit (Zymo Research, Orange, California).
El fragmento de PCR purificado se usó en una
reacción Gateway™ BP (Invitrogen) estándar con pDONR201 como un
vector receptor. La identidad y la composición de los pares de bases
del inserto se confirmaron mediante secuenciación. La integridad
del plásmido resultante se verificó usando digestiones de
restricción y se le dio la denominación p0604 (clon de entrada).
pDONR201 se obtuvo a partir de Invitrogen.
p0604 es un "clon de entrada" Gateway™ y se
usó como tal en una reacción Gateway™ LR estándar, con p0640 como
"vector de destino". El vector resultante era p02203, su
integridad también se comprobó mediante análisis de digestión por
restricción. El vector, que contenía como elementos funcionales
dentro de la región de T-DNA un gen marcador
seleccionable y un "casete Gateway" destinados para clonación
LR de secuencias de interés, se usó para la transformación de
Arabidopsis thaliana. La expresión de estas secuencias de
interés, al recombinarse en p0640, se condujo mediante la secuencia
reguladora que se lista en el Nº ID SEC 1.
Para las plantas parentales, aproximadamente 12
mg de semillas de Arabidopsis thaliana silvestre (ecotipo
Columbia) se suspendieron en 27,5 ml de solución de agar al 0,2%.
Las semillas se incubaron durante 2 a 3 días a una temperatura de
4ºC y a continuación se sembraron. Las plantas se germinaron bajo
condiciones estandarizadas: 22ºC durante el día, 18ºC por la noche,
con una humedad relativa de 65-70%, 12 horas de
fotoperíodo y subirrigación con agua durante 15 minutos cada 2 ó 3
días. Las plántulas se trasplantaron a continuación a macetas con un
diámetro de 5,5 cm, que contenían una mezcla de arena y turba en
una relación de 1 a 3. Las plantas se hicieron crecer a
continuación bajo las mismas condiciones estándar que se mencionan
anteriormente.
Cepa de Agrobacterium C58C1 RIF con
plásmido auxiliar pMP90 y vector p2203 se inoculó en un tubo de
plástico de 50 ml que contenía 1 ml de LB (caldo de
Luria-Bertani) sin antibiótico. El cultivo se batió
durante 8-9 h a 28ºC. A continuación, se añadieron
10 ml de LB sin antibiótico al tubo de plástico y se batió durante
la noche a 28ºC. Después de esto, se midió la DO a 600 nm. A una
densidad óptica de aproximadamente 2,0 se añadieron al cultivo 40 ml
de sacarosa al 10% y Silwet L-77 (una mezcla de
heptametiltrisiloxano modificado con poli(óxido de alquileno) al 84%
y aliloxipolietilenglicol-metil-éter al 16%, OSI
Specialties Inc) al 0,05%. El cultivo de Agrobacterium así
obtenido se usó para transformar las plantas desarrolladas.
\newpage
Cuando cada flor parental tenía una
inflorescencia de 7-10 cm de altura, las
inflorescencias se sumergieron en cultivo de Agrobacterium y
se sometieron a turbulencia suavemente durante 2-3
segundos. Para cada transformación, se usaron 2 plantas.
Posteriormente, las plantas se devolvieron a las condiciones de
crecimiento que se describen anteriormente.
5 semanas después de que las flores se
sumergieran en el cultivo de Agrobacterium, el riego de las
plantas se detuvo. Las plantas se incubaron adicionalmente a 25ºC
con un fotoperíodo de 20 horas. Una hora más tarde, las semillas se
recogieron y se pusieron en una secadora de semillas durante una
semana. A continuación, las semillas se limpiaron, se recogieron en
tubos de plástico de 15 ml y se almacenaron a 4ºC hasta el
procesamiento adicional.
Semillas T0 transgénicas se seleccionaron para
su expresión de marcador y se germinaron. Las plantas se hicieron
crecer como se describe anteriormente, hasta que se recogían
semillas T1. A las diferentes líneas se les dio el nombre
AT0476-xx, donde xx es un número.
El patrón de expresión del gen de
\beta-glucuronidasa y la fuerza de la secuencia
reguladora de GSO2 se compararon con las del promotor 35S en
Arabidopsis.
AT0476-11: casete
GOS2-GUS y casete marcador rastreable (vector p2203)
(semillas T1) AT0476-09: casete
GOS2-GUS y casete marcador rastreable (vector
p2203) (semillas T1) WS35S:GUS: casete 35S-GUS, sin
selección de marcador, línea homocigótica de Versailles (semillas
homocigóticas T2), fondo Wassilewskija (WS).
Alrededor de 100 semillas, después de mantenerse
a una temperatura de 4ºC durante al menos 2 días, se sembraron en
suelo y las plantas se cultivaron bajo condiciones estándar: 22ºC
durante el día, 18ºC por la noche, 65-70% de
humedad relativa, 12 horas de fotoperíodo, subirrigación con agua
durante 15 minutos cada 2 ó 3 días.
Cuando las plantas tenían 2 cotiledones y 2
hojas verdaderas, la expresión del marcador en líneas AT0476 se
verificó y las plantas con un patrón de expresión del marcador
uniforme se retuvieron.
A continuación, 10 plantas de cada una de las
líneas GOS2 o 35S se aislaron cuidadosamente del suelo y se
marcaron para la identificación. 5 de las plantas se tiñeron con
respecto a GUS durante 1 hora, las otras 5 plantas se tiñeron
durante la noche. El tiempo de tinción corto era necesario para
determinar cualitativamente la intensidad relativa de los
promotores. Si la reacción de tinción se saturaba en menos de 1
hora, el tiempo de incubación había de reducirse. En el caso de que
la tinción fuera azul muy débil después de 1 hora, el tiempo de
incubación puede incrementarse hasta 2-3 horas.
Finalmente, las plantas teñidas se fotografiaron. Para cada línea,
otras 20 plantas se aislaron cuidadosamente del suelo y se
transfirieron a pequeñas macetas individuales para el cultivo
adicional. Cuando las plantas habían alcanzado la fase de 10 hojas,
de nuevo se aislaron 10 plantas de cada línea, se marcaron y se
tiñeron como se describe anteriormente. Las plantas teñidas se
fotografiaron. En la época de floración, 10 plantas por línea con
silicuas en diversas fases de maduración se aislaron y se
procesaron como anteriormente.
El material se cubrió con acetona enfriada con
hielo al 90% y se incubó durante 30 minutos a 4ºC. Después de 3
lavados de 5 minutos con tampón Tris [15,76 g de Trizma HCl (Sigma
T3253) + 2,922 g de NaCl en 1 l de doble agua doblemente destilada,
pH ajustado hasta 7,0 con NaOH], el material se sumergió en una
solución de Tris/ferricianato/X-Gluc [0,8 ml de
tampón de Tris + 0,2 ml de material de ferricianato (0,33 g de
ferricianato potásico (Sigma P3667) en 10 ml de tampón de Tris)+
0,2 ml de material de X-Gluc (26,1 mg de
X-Gluc (Europa Bioproducts ML 113A) en 500 \mul
de DMSO)]. La infiltración a vacío se aplicó durante de 15 a 30
minutos. A continuación, las muestras se incubaron durante un
tiempo apropiado (hasta 16 horas) a 37ºC para el desarrollo del
color azul. Las muestras se lavaron 3 veces durante 5 minutos con
tampón de Tris. La clorofila se extrajo en una serie de etanol al
50%, 70% y 90% (cada uno durante 30 minutos) con reposiciones de la
solución al 90% si es necesario.
\newpage
La secuencia reguladora de GOS2 muestra una
fuerte expresión constitutiva en tejidos de vástago, incluyendo los
petiolos, el sistema vascular y los tricomas. Excepto para las
puntas radicales, la expresión en tejidos radicales es inferior,
pero todavía es fácilmente detectable (Fig. 1).
Para todas las plantas con el mismo tiempo de
incubación durante la tinción (1 hora o durante la noche), el
patrón de expresión de GUS era similar. La tinción de plantas GOS2
era tan fuerte como para plantas 35S, en todas las fases que se
muestreaban (2 hojas + 2 cotiledones, fase de 10 hojas y fase de
floración). La expresión de GOS2 parece igualmente fuerte e
igualmente constitutiva que la expresión de 35S en
Arabidopsis (Figs 2, 3 y 4).
<110> CropDesign N.V.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencia reguladora
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
CD-072-PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 03075207.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-01-21
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patent In versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de sentido attB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de antisentido attB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tgttgattca ttgtttgcct cc
\hfill52
Claims (8)
1. Uso de una secuencia de ácido nucleico
reguladora aislada que comprende una secuencia reguladora como la
representada en el Nº ID SEC 1 o un fragmento funcional o una
variante funcional de la misma, para conducir la expresión de una
secuencia de ácido nucleico asociada en una planta o célula de
planta no monocotiledónea, variante funcional que es capaz de
hibridarse al ácido nucleico del Nº ID SEC: 1 bajo condiciones
restrictivas.
2. Uso de una secuencia de ácido nucleico
reguladora aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de ácido nucleico asociada es una secuencia de ácido
nucleico aislada o una secuencia de ácido nucleico endógena para la
célula huésped en la que se introduce dicha secuencia de ácido
nucleico reguladora aislada.
3. Una célula de planta no monocotiledónea que
comprende o que tiene establemente integrado en su genoma un ácido
nucleico recombinante como el representado en el Nº ID SEC 1 o un
fragmento funcional o una variante funcional del mismo, variante
funcional que es capaz de hibridarse al ácido nucleico del Nº ID
SEC: 1 bajo condiciones restrictivas.
4. Una célula de planta no monocotiledónea de
acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha célula de planta no
monocotiledónea se deriva de una legumbre de pasto o forrajera, una
planta ornamental, un cultivo de consumo, un árbol o un arbusto,
preferiblemente de algodón, patata, tomate, col, remolacha
azucarera, soja, judías, girasol o guisantes.
5. Un cultivo de células de planta, un callo o
una planta que consiste esencialmente o en parte en células de
planta de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4.
6. Una parte recolectable, un órgano, un tejido
o un material de propagación de una planta de acuerdo con la
reivindicación 5, que comprende una secuencia de ácido nucleico que
comprende una secuencia reguladora como la representada en el Nº ID
SEC: 1 como un fragmento funcional o como una variante funcional de
la misma, para conducir la expresión de una secuencia de ácido
nucleico asociada en una planta o célula de planta no
monocotiledónea, variante funcional que es capaz de hibridarse al
ácido nucleico del Nº ID SEC 1 bajo condiciones restrictivas.
7. Método para la expresión de una secuencia de
ácido nucleico en una planta o célula de planta no monocotiledónea,
comprendiendo dicho método introducir en dicha planta o célula de
planta una secuencia reguladora representada por el Nº ID SEC 1 o
un fragmento funcional o una variante funcional de la misma,
variante funcional que es capaz de hibridarse al ácido nucleico del
Nº ID SEC: 1 bajo condiciones restrictivas y en donde dicha
secuencia reguladora es capaz de conducir la expresión de dicha
secuencia de ácido nucleico que es una secuencia de ácido nucleico
bien aislada o bien endógena.
8. Método para la producción de una planta, una
célula de planta o un tejido de planta transgénica no
monocotiledónea que comprende la introducción en dicha planta,
célula de planta o tejido de planta no monocotiledónea de una
primera molécula de ácido nucleico enlazada operablemente a una
secuencia de ácido nucleico heteróloga asociada, en donde dicho
primer ácido nucleico es la secuencia reguladora representada por el
Nº ID SEC: 1 o un fragmento funcional o una variante funcional de
la misma, variante funcional que es capaz de hibridarse al ácido
nucleico del Nº ID SEC: 1 bajo condiciones restrictivas, y en donde
dicha primera molécula de ácido nucleico es capaz de conducir la
expresión de dicha secuencia de ácido nucleico heteróloga
asociada.
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