ES2356630T3

ES2356630T3 - Resistencia contra las plagas de plantas.

Info

Publication number: ES2356630T3
Application number: ES04021299T
Authority: ES
Inventors: Pieter Vos; Guus Simons; Marc Zabeau; Jelle Wijbrandi
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 1996-08-09
Filing date: 1997-08-08
Publication date: 2011-04-11
Anticipated expiration: 2017-08-08
Also published as: EP0823481A1

Abstract

Un ácido nucleico aislado que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia de ADN de la Figura 5 y donde dicho ácido nucleico, cuando es transferido a una planta que es susceptible a una plaga vegetal, es capaz de reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicha plaga vegetal.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a genes de resistencia, a construcciones de ADN, a microorganismos, a células vegetales y a plantas que contienen dichos genes de resistencia. Además, la invención se refiere a plantas genéticamente transformadas que son resistentes frente a plagas de plantas. Además, la solicitud 5 describe sondas y cebadores para la identificación de los genes de resistencia y kits de diagnóstico que contienen dichas sondas y/o cebadores. Finalmente, la invención se refiere a polipéptidos codificados por dichos genes de resistencia y a la utilización de dichos polipéptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los patógenos de las plantas son responsables de pérdidas sustanciales de plantas y productos 10 vegetales debido a la infección de la planta. Las enfermedades de las plantas, como resultado de la infección por patógenos o plagas de las plantas, ocasionan daño a las plantas y/o a los productos vegetales, reducen la producción y el rendimiento, limitan el tipo de plantas que pueden desarrollarse en ciertas áreas geográficas y como resultado ocasionan graves pérdidas (financieras) al agricultor.

Los nematodos parásitos de plantas existen en todo el mundo y la mayoría de ellos vive durante 15 casi toda su vida en la capa superior de la tierra. Aunque se considera que las pérdidas ocasionadas por la alimentación directa de los nematodos de las raíces de las plantas son de pequeña importancia, varias especies, entre ellas los nematodos de los nudos de las raíces que pertenecen a la especie Meloidogyne, los nematodos de los quistes que pertenecen a la especie Heterodera y a la especie Globodera y otros nematodos tales como la especie Nacobbus, ocasionan un grave daño y pérdidas económicas en los cultivos. Los nematodos de los nudos de las raíces existen también en todo 20 el mundo pero se encuentran más frecuentemente y en mayor número en áreas con climas más cálidos y en invernaderos. Las especies más importantes de Meloidogyne son M. incognita, M. arenaria, M. hapla y M. javanica, de las cuales M. hapla se da también en zonas climáticas más templadas.

Existen diferentes medios para controlar los patógenos de las plantas, tales como el cultivo mecánico del suelo, el tratamiento químico con pesticidas, incluyendo nematicidas e insecticidas, o la rotación de cultivos. Sin embargo, para ciertos patógenos de las plantas, especialmente nematodos, estos medios de control son insuficientes para proteger a las plantas de la infección y las enfermedades resultantes. El único medio de control eficaz implica la resistencia de la planta huésped (Russell, 1978, Plant Breeding for pest and disease resistance, Butterworths edit., pág. 485). El desarrollo de cultivos resistentes a los patógenos comunes de las plantas es uno de los principales objetivos de los agricultores hoy en día, con el fin de reducir o finalmente eliminar la considerable necesidad de 30 pesticidas. La carga para el medio ambiente de grandes cantidades de pesticidas inyectados en el suelo o pulverizados sobre los cultivos, árboles, etc., en todo el mundo, resulta cada año más grave. Además, las normas gubernamentales en los países occidentales restringen el uso o incluso prohíben la utilización de ciertos pesticidas. Por lo tanto, la necesidad de plantas que sean resistentes a uno o más de sus patógenos, o que tengan una susceptibilidad reducida a sus atacantes resulta cada vez más urgente. El desarrollo de plantas resistentes es uno de los objetivos importantes de los 35 programas actuales de cultivo de plantas. Los genotipos de plantas susceptibles a patógenos particulares son cruzados con genotipos de plantas resistentes con el fin de introducir el fenotipo resistente en la línea de reproducción.

El daño causado por los nematodos de los nudos de las raíces resulta principalmente de la invasión de las raíces de la planta por larvas, las cuales en una relación compatible con la planta se desarrollan para dar lugar a una hembra reproductora. Después de la invasión, las larvas hacen que las células de las raíces se desarrollen 40 para dar células gigantes de las cuales se alimentan. Después de la infección se forman agallas o nudos en las raíces y las raíces de la planta resultan por otra parte alteradas, se engrosan y atrofian. El sistema de las raíces no funciona bien por tanto para captar el agua y los elementos nutricionales, lo cual daña el crecimiento y desarrollo de la planta. Frecuentemente, el daño a las plantas infectadas es incrementado por hongos parásitos que atacan al tejido de la raíz debilitado. Las plantas infectadas muestran un crecimiento reducido y hojas de color pálido más pequeñas, con frutos 45 diminutos de poca calidad o incluso sin frutos, y tienden a marchitarse en los climas más cálidos (Agrios, 1988, en: Plant Pathology, Academic Press, Inc.). El daño y/o la reducción del rendimiento ocasionados por los nematodos de los nudos de las raíces es considerable en la producción agrícola total mundial. En una plantación individual las pérdidas de producción pueden ser tan elevadas como del 25-50%, o incluso el cultivo puede ser aniquilado.

Los nematodos de los nudos de las raíces de los invernaderos pueden ser controlados mediante 50 esterilización por vapor del suelo o mediante la fumigación del suelo con nematicidas. Bajo condiciones de campo, el control puede lograrse mediante la utilización de nematicidas. Sin embargo, el uso de tales productos químicos, en algunos casos muy persistentes, está siendo cada vez más debatido y en algunos países está incluso prohibido el uso de ciertos nematicidas.

La producción de genotipos genéticamente resistentes es la forma más fiable y eficaz para 55 controlar la enfermedad de los nudos de las raíces. Se ha descrito para varias especies de cultivo la disponibilidad de resistencia dentro del plasma germinal relacionado, por ejemplo, patata, algodón, tabaco, trigo, soja, tomate, berenjena, frijol común y alfalfa. La producción de resistencia está dificultada primeramente por la existencia limitada de genes de resistencia (conocidos) en el plasma germinal disponible; en segundo lugar, en algunas especies de plantas, la existencia de barreras de cruce entre la especie de planta cultivada y la especie relacionada portadora de resistencia, y en tercer 60

lugar, los ensayos para seleccionar resistencia frente a susceptibilidad a nematodos son laboriosos y por lo regular no fiables. Por lo tanto, la producción de resistencia es muy difícil de conseguir o no se consigue, o si es posible, requiere mucho tiempo.

La introducción con éxito de genes de resistencia se ha logrado en el tomate. El gen de resistencia Mi (Meloidogyne incognita) ha sido introducido en tomates cultivados, Lycopersicon esculentum, después del cruce con 5 la especie salvaje relacionada L. peruvianum (PI 128657), utilizando un cultivo de embriones. El gen Mi confiere resistencia a varias especies de Meloidogyne (Fassuliotis, 1991, en: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.). Se ha descrito que el gen de resistencia Mi es un gen dominante monogénico (Gilbert y McGuire, 1956, Proc. Am. Soc. Hortic. Sci., 68, 437-442), y está ubicado en el cromosoma 6 del tomate. También se postula que la región introgresada que comprende el locus Mi está involucrada en la concesión de resistencia al áfido de la patata 10 (Macrosiphum euphorbia) (Kaloshian y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 622-625).

Las plantas han desarrollado un mecanismo complejo de defensa frente al ataque y la infección por patógenos. Hasta la fecha, el mecanismo exacto de su sistema de defensa aún no ha sido averiguado.

La resistencia a nematodos en el tomate se expresa después de la penetración. Una vez que la larva juvenil entra en la raíz y se establece en un sitio de alimentación, se desencadena una reacción hipersensible (HR) 15 adyacente a la cabeza del nematodo que tiene como resultado la muerte local de las células del huésped. El nematodo también es afectado adversamente por esta HR y muere (Fassuliotis, 1991, en: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.). Se desconoce si existe o no un sentido de relación gen por gen (Flor, 1956, Adv. Gen., 8, 29-54) como es frecuentemente el caso en otras relaciones planta-patógeno en las que la resistencia se basa en la incompatibilidad de HR. 20

El aislamiento de genes vegetales sin conocer sus productos génicos es muy laborioso y difícil, debido a los enormes tamaños del genoma de las especies vegetales: por ejemplo, el tomate tiene un tamaño de genoma de 1000 Mb (109 pares de bases de ADN nuclear), el maíz tiene un tamaño de genoma de 3000 Mb y el trigo tiene incluso más de 16 x 109 pares de bases. La búsqueda de un gen específico entre estos billones de pares de bases solamente es posible cuando, (i) existen suficientes marcadores moleculares estrechamente unidos al gen de interés y 25 (ii) existe un buen material genético disponible (Tanksley y col., 1995, Trends in Genetics, 11, p. 63-68).

Aunque se ha descrito el aislamiento de unos cuantos genes de resistencia, ninguno de estos genes de resistencia es capaz de conferir a la planta huésped resistencia a nematodos o a áfidos. Ejemplos de dichos genes de resistencia aislados son: RPS2 de Arabidopsis (resistencia a Pseudomonas syringae que expresa avrRpt2), N del tabaco (resistencia al virus del mosaico del tabaco), Cf-9 del tomate (resistencia al patógeno fúngico de las hojas 30 Cladosporium fulvum que lleva avr9) y L6 del lino (resistencia a la estirpe fúngica del óxido de las hojas correspondiente) (Dangl, 1995, Cell, 80, 363-366).

La presente invención proporciona el primer gen de resistencia a nematodos aislado, y además, proporciona el primer gen de resistencia a áfidos aislado. Además, la presente invención se refiere a un gen de resistencia de doble función que confiere susceptibilidad reducida a nematodos así como a áfidos, y preferiblemente a 35 Meloidogyne incognita y Macrosiphum euphorbiae, respectivamente.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un ácido nucleico aislado que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia de ADN de la Figura 5 y donde dicho ácido nucleico, cuando es transferido a una planta que es susceptible a una plaga de plantas, es capaz de reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicha plaga de plantas. 40

La presente solicitud describe un ácido nucleico que contiene el gen de resistencia Mi, el cual cuando está presente y es expresado en una planta es capaz de conferir a dicha planta resistencia contra nematodos y/o áfidos. Además, la solicitud describe el gen de resistencia Mi cuya secuencia de ADN está descrita en la presente. La invención también se refiere a un producto génico codificado por el ácido nucleico aislado de la invención. Además, la presente invención se refiere a construcciones de ADN, cósmidos, vectores, cepas bacterianas, células de levadura y 45 células vegetales que contienen el ácido nucleico de la invención. La presente solicitud describe una planta genéticamente transformada, la cual es resistente a un nematodo, siendo dicho nematodo capaz de infectar la planta no transformada. Además, la invención se refiere a un ácido nucleico de la invención que, cuando está presente en una planta, es capaz de conferir a dicha planta resistencia a la infección por plagas de plantas.

Finalmente, la solicitud describe oligonucleótidos que corresponden a la secuencia de dicho gen de 50 resistencia o a parte del mismo, y kits de detección que contienen dichos oligonucleótidos.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra un mapa físico de YAC 1/1172, YAC 2/1256 y YAC 1/1084, con un tamaño de 570, 500 y 470 kb, respectivamente. Se indican la posición de los sitios de restricción de SfiI y BssHII y el tamaño de los fragmentos de restricción. Se indica la ubicación de los diferentes marcadores AFLP en los fragmentos de restricción. 55

La Figura 2 muestra un dibujo esquemático del vector cosmídico binario pJJ04541, el cual es utilizado para construir una biblioteca de cósmidos de YAC 1/546. El plásmido pRK290 (20 kb de tamaño) (Ditta y col.,

1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347-7351) fue utilizado como vector de inicio. "Tet" se refiere al gen que confiere resistencia a tetraciclina. "LB" indica la secuencia de repetición del límite izquierdo del ADN-T, y "RB" indica la repetición del límite derecho. La secuencia del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor está indicada por "p35S", y "ocs3'" indica el extremo 3' de la sintasa de octopina. "NPT" indica fosfotransferasa de neomicina, y "cos" se refiere al sitio cos del bacteriófago lambda que permite el empaquetamiento in vitro. "pDBS" indica el poliadaptador de pBluescript 5 (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.).

La Figura 3A muestra una representación esquemática de la posición detallada de los marcadores AFLP en YAC 1/1172, YAC 2/1256 y YAC 1/1084. La colocación se basa en el contig cosmídico construido para las diferentes regiones definidas.

La Figura 3B muestra una representación esquemática del contig cosmídico de la región que comprende el gen de resistencia Mi. Los cósmidos Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 y Mi-14 están representados por líneas horizontales. Se indica la ubicación de los marcadores AFLP, PM14 y PM25.

La Figura 4 muestra un mapa físico preciso de los cósmidos Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 y Mi-14 para el enzima de restricción PstI. Se indica el tamaño de los fragmentos de PstI (en kb). El fenotipo Mi, según se identificó en un ensayo de enfermedad in vitro, de las plantas R0 que contienen los diferentes cósmidos está indicado en 15 la parte del extremo derecho de la figura. El segmento de ADN del cual se determinó la secuencia de nucleótidos está indicado por una línea doble con una flecha bidireccional.

La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos de un segmento de ADN de aproximadamente 9,9 kb alrededor del marcador AFLP, PM14, y una secuencia de aminoácidos deducida del gen de resistencia Mi. El codón de inicio (ATG, posición 3263-3265) está subrayado y el codón de terminación (TAG, posición 7109-7111) está 20 doblemente subrayado, mostrando un marco de lectura abierto (ORF1) que codifica un polipéptido de 1257 aminoácidos (Figura 7A). El gen de resistencia Mi comprende dos secuencias intrónicas (mostradas en cursiva): un intrón de 1306 nucleótidos desde la posición 1936 hasta la posición 3241 y un intrón de 75 nucleótidos desde la posición 3305 hasta la posición 3379.

Un segundo codón de inicio (ATG, posición 3491-3493), el cual está en marco con el primer codón 25 de inicio, da como resultado un segundo marco de lectura abierto (ORF2) que codifica un polipéptido truncado de 1206 aminoácidos (Figura 7B).

La posición del marcador AFLP, PM14, es desde el nucleótido en posición 6921 (5'-TGCAGGA-3') hasta el nucleótido en posición 7034 (5'-AGATTA-3').

La Figura 6 muestra un mapa físico de los cósmidos Mi-11 y Mi-18 y la secuencia de nucleótidos 30 determinada del cósmido Mi-11. La secuencia está dividida en cuatro contigs: con25 (5618 pb), con10 (898 kb), con62 (2495 pb) y Mi (9870 pb). La parte inferior de la figura representa la presencia ("+") o ausencia ("-") de varios fragmentos de PCR, que corresponden a las partes del segmento de ADN de la Figura 5, que están representados como líneas horizontales de diferentes longitudes en el lado derecho de la tabla, en los diferentes fondos genéticos (clon YAC 2/1256, E. coli conteniendo el cósmido Mi-11, A. tumefaciens conteniendo el cósmido Mi-11, E. coli conteniendo el cósmido Mi-35 18, A. tumefaciens conteniendo el cósmido Mi-18, línea E22 de tomate resistente, línea 52201 de tomate susceptible, plantas R0 transformadas con el cósmido Mi-11 y plantas R0 transformadas con el cósmido Mi-18).

Secuencia de nucleótidos del cósmido Mi-11 y del cósmido Mi-18. Análisis de diferentes contigs.

Figura 7

A: muestra la secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido codificado por ORF1. 40

B: muestra la secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido truncado codificado por ORF2.

La Figura 8 muestra una representación esquemática de la estructura del gen de resistencia Mi.

La Figura 9 muestra una representación esquemática de la familia del gen de resistencia Mi.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En la presente descripción y en los ejemplos que siguen, se utilizan varios términos. Con el fin de 45 proporcionar un entendimiento claro y consistente de la especificación y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que ha de darse a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

- ácido nucleico: molécula de ADN de doble hebra. El ácido nucleico puede ser ADN genómico, ADNc, ADN sintético o cualquier otro ADN;

- oligonucleótido: una molécula de ADN de hebra sencilla corta; 50

- cebadores: en general, el término cebador se refiere a una molécula de ADN de hebra sencilla que puede iniciar la síntesis del ADN;

- hibridación de un ácido nucleico: un método para detectar secuencias de ADN relacionadas a través de la

hibridación de ADN de hebra sencilla sobre soportes tales como una membrana de nailon o papeles de filtro de nitrocelulosa. Las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de bases complementarias reformarán la estructura de doble hebra si se mezclan en solución bajo condiciones apropiadas. Se formará la estructura de doble hebra entre dos ácidos nucleicos de hebra sencilla complementarios incluso si uno está inmovilizado sobre un soporte. En un procedimiento de hibridación Southern, tiene lugar esta última situación; 5

- sonda de hibridación: para detectar una secuencia particular de ADN en el procedimiento de hibridación Southern, una molécula de ADN marcada o sonda de hibridación se hace reaccionar con el ADN fraccionado unido a un soporte tal como una membrana de nailon o un papel de filtro de nitrocelulosa. Las áreas del filtro que llevan secuencias de ADN complementarias a la sonda de ADN marcada quedan marcadas como consecuencia de la reacción de rehibridación. Las áreas del filtro que presentan tal marcaje pueden ser detectadas 10 posteriormente de acuerdo con el tipo de marca utilizado. La sonda de hibridación es producida generalmente por clonaje molecular de una secuencia de ADN específica o sintetizando un oligonucleótido sintético;

- secuencia homóloga: una secuencia que tiene al menos un 50%, preferiblemente un 60%, más preferiblemente un 70%, muy preferiblemente un 80% o incluso un 90% de identidad de secuencias con la secuencia particular, por lo que la longitud de las secuencias que serán comparadas para ácidos nucleicos es generalmente de al 15 menos 120 nucleótidos, preferiblemente de 200 nucleótidos y más preferiblemente de 300 nucleótidos y la longitud de las secuencias que serán comparadas para polipéptidos es generalmente de al menos 40 residuos de aminoácidos, preferiblemente de 65 residuos de aminoácidos y más preferiblemente de 100 residuos de aminoácidos. Alternativamente, una secuencia homóloga se refiere a una secuencia que puede hibridarse bajo condiciones rigurosas a una secuencia particular, y/o a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene 20 sustancialmente las mismas propiedades que el polipéptido codificado por la secuencia de ADN particular, y/o a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ADN particular, y/o a una secuencia de aminoácidos en la que algunos residuos de aminoácidos han sido cambiados con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido particular sin afectar sustancialmente a las propiedades principales de dicho polipéptido; 25

- condiciones rigurosas se refiere a condiciones de hibridación que permiten que una secuencia de ácido nucleico se hibride a una secuencia particular. En general, condiciones muy rigurosas se refiere a las condiciones de hibridación que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, y preferiblemente de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una secuencia particular a aproximadamente 65C en una solución que contiene sal 1 M aproximadamente, preferiblemente SSC 6 x o cualquier otra solución que tenga 30 una fuerza iónica comparable, y lavando a 65C en una solución que contiene sal 0,1 M aproximadamente, o menos, preferiblemente SSC 0,2 x o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Estas condiciones permiten la detección de secuencias que tienen alrededor de un 90% o más de identidad de secuencias. En general, condiciones menos rigurosas se refiere a las condiciones de hibridación que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, y preferiblemente de alrededor de 200 o más 35 nucleótidos, se hibride a una secuencia particular a aproximadamente 45C en una solución que contiene sal 1 M aproximadamente, preferiblemente SSC 6 x o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y lavando a temperatura ambiente en una solución que contiene sal 1 M aproximadamente, preferiblemente SSC 6 x o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Estas condiciones permiten la detección de secuencias que tengan hasta un 50% de identidad de secuencias. Los expertos en la técnica serán capaces de 40 modificar estas condiciones de hibridación con el fin de identificar secuencias que tengan una identidad que varíe entre el 50% y el 90%;

- promotor: una región de regulación de la transcripción corriente arriba desde la secuencia codificadora que contiene las secuencias reguladoras requeridas para la transcripción de la secuencia codificadora adyacente e incluye la región 5' no traducida o la llamada secuencia líder de ARNm; 45

- terminador: una región corriente abajo de la secuencia codificadora que dirige la terminación de la transcripción, también denominada región 3' no traducida, la cual incluye la señal de poliadenilación;

- gen de resistencia: un ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora como la representada en la Figura 5, o parte de la misma, o cualquier secuencia homóloga o correspondiente;

- nematodo(s): especies de Meloidogyne, tales como Meloidogyne incognita, M. arenaria o M. javanica, o cualquier 50 otro genotipo que no sea capaz de infectar un huésped que tenga un gen de resistencia de acuerdo con la invención, tales como, pero no limitándose a, otros nematodos de los nudos de las raíces, tales como M. hapla, nematodos quísticos tales como las especies de Heterodera, o las especies de Globodera, u otros nematodos tales como las especies de Nacobbus, insectos tales como el áfido de la patata o cualquier otro patógeno o plaga de las plantas; 55

- producto de un gen de resistencia: un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en la Figura 5, o parte de la misma, o cualquier secuencia de aminoácidos homóloga;

- planta R0: regenerante primario procedente de un experimento de transformación, también denominada planta transformada o planta transgénica;

- línea R1: la progenie de una planta R0 autofecundada;

- línea R2: la progenie de una planta R1 autofecundada;

- línea R1BC: la progenie de un retrocruzamiento entre una planta R1 y una planta del genotipo que se utilizó originalmente para el experimento de transformación.

En la presente solicitud, hemos podido identificar y aislar el gen de resistencia a Meloidogyne 5 incognita (Mi). El gen fue clonado a partir de un genotipo de tomate que es resistente a Meloidogyne incognita. El gen de resistencia Mi aislado de acuerdo con la invención puede ser transferido a una planta huésped susceptible utilizando transformación mediada por Agrobacterium o cualquier otro método de transformación conocido, y está implicado en la concesión de resistencia a la planta huésped frente a patógenos vegetales, especialmente nematodos. La planta huésped puede ser el tomate o cualquier otro genotipo que sea infectado por dicho patógeno vegetal. 10

La presente solicitud proporciona también una secuencia de ácido nucleico que contiene el gen de resistencia Mi, la cual está representada en la Figura 5.

Con el gen de resistencia Mi, se tiene un medio de control eficaz frente a patógenos y/o plagas de las plantas, ya que el gen puede ser utilizado para transformar genotipos de plantas susceptibles, produciendo así plantas genéticamente transformadas que tienen una susceptibilidad reducida o que son preferiblemente resistentes a un 15 patógeno o a una plaga de las plantas. En particular, una planta que es transformada genéticamente con el gen de resistencia Mi tiene una susceptibilidad reducida a los nematodos de los nudos de las raíces.

En una realización preferida, el ácido nucleico aislado de la invención está precedido por una región promotora y seguido por una región de terminación. La región promotora debe ser funcional en células vegetales y, preferiblemente, corresponde a la región promotora nativa del gen de resistencia Mi. Sin embargo, debe reconocerse que 20 puede utilizarse cualquier región promotora heteróloga junto con las secuencias codificadoras, siempre que sea funcional en células vegetales. Preferiblemente, se utiliza un promotor constitutivo, tal como el promotor 35S del CaMV o los promotores de ADN-T, todos bien conocidos por los expertos en la técnica. Además, una región de terminación adecuada debe ser funcional en células vegetales todas bien conocidas por los expertos en la técnica.

Además, la invención se refiere a un producto génico que está codificado por el ácido nucleico de 25 acuerdo con la invención y que tiene una secuencia de aminoácidos deducida que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia de proteínas de la Figura 7A. Además, el producto del gen de resistencia Mi o un polipéptido truncado como el proporcionado en la Figura 7B, puede ser utilizado para producir anticuerpos contra el mismo, anticuerpos que pueden ser utilizados para la detección de la presencia del producto del gen de resistencia Mi.

El gen de resistencia Mi puede ser utilizado para el diseño de oligonucleótidos que sean 30 complementarios a una hebra de la secuencia de ADN según se describe en la Figura 5, o a parte de la misma, que pueden ser utilizados como sondas de hibridación, siendo marcados por consiguiente para permitir la detección, para someter a selección bibliotecas de ADN genómico o de ADNc por genes homólogos. Se describen también secuencias homólogas que pueden hibridarse a la sonda bajo condiciones de hibridación rigurosas, y que codifican un producto génico que está involucrado en la concesión de susceptibilidad reducida o resistencia a una planta frente a un patógeno 35 vegetal que normalmente infecta dicha planta.

En otro aspecto, se diseñan oligonucleótidos basados en la secuencia del gen de resistencia Mi, de tal manera que pueden ser utilizados como sondas de hibridación en el análisis Southern. Estas sondas pueden ser utilizadas como marcadores moleculares para distinguir genotipos de plantas que tengan el gen de resistencia y genotipos de plantas que carezcan del gen de resistencia. Dicha sonda puede ser utilizada como una herramienta adicional en la 40 selección. En una realización preferida de la invención, los oligonucleótidos son diseñados sobre la base de la secuencia del gen de resistencia Mi, de tal manera que pueden ser utilizados como cebadores en una reacción de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por lo que la formación de un producto de amplificación indica la presencia del gen de resistencia Mi en cierto genotipo vegetal. Dichos cebadores dirigen la amplificación de fragmentos polimórficos, llamados marcadores moleculares, los cuales están estrechamente ligados al gen de resistencia Mi. En una 45 realizaión preferida, dichos cebadores son utilizados en la amplificación selectiva de fragmentos de restricción para identificar marcadores AFLP, los cuales están estrechamente ligados al gen de resistencia Mi. La solicitud también describe kits de diagnóstico, que contienen oligonucleótidos, para la detección de la presencia o ausencia del gen de resistencia Mi dentro de un genotipo bajo estudio. Dicho kit de diagnóstico elimina la utilización de un análisis laborioso de enfermedades para seleccionar genotipos que tengan o no el gen de resistencia. 50

Además, la invención se refiere a construcciones de ADN que contienen un ácido nucleico de la invención y secuencias reguladoras funcionales en células vegetales; dicho ácido nucleico puede ser ADN genómico, ADNc, ADN sintético o ADN de cualquier otro origen. Dichas secuencias reguladoras son homólogas o heterólogas a las secuencias codificadoras del ácido nucleico de la invención.

La invención se refiere también a construcciones de ADN que contienen las secuencias 55 reguladoras, y más preferiblemente la región del promotor del gen de resistencia Mi junto con una secuencia de un gen estructural heteróloga a dichas secuencias reguladoras.

La invención también se refiere a un vector de ADN que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Los vectores adecuados pueden ser vectores de clonaje, vectores de transformación, vectores de expresión, etc..., los cuales son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Además, están dentro del ámbito de la invención células que llevan un vector que contiene un ácido nucleico de la invención. Además, están dentro del ámbito de esta invención células que llevan una construcción 5 de ADN de acuerdo con la invención.

En otra realización de la invención, el ácido nucleico de la invención puede ser transferido, utilizando técnicas de transformación generalmente conocidas, a sistemas heterólogos, tales como, pero no limitándose a, melón, tabaco, Arabidopsis thaliana, patata, remolacha, colza, pepino, pimienta, berenjena. Un sistema heterólogo se refiere a una especie de planta que es diferente de la especie de planta de la que se aisló el ácido nucleico de la 10 invención.

El ácido nucleico de la invención según es proporcionado en la presente invención tiene numerosas aplicaciones de las cuales algunas están descritas en la presente, pero las mismas no limitan el ámbito de la invención.

La presente invención será descrita adicionalmente con detalle a la vista del aislamiento del gen de 15 resistencia Mi presente en líneas de tomate que son resistentes a los nematodos de los nudos de las raíces. Para el aislamiento del gen de resistencia Mi, hemos utilizado una estrategia de clonaje basada en el mapa (clonaje posicional), que comprende las etapas siguientes:

(1) identificación de los marcadores moleculares ligados al gen de resistencia Mi,

(2) construcción de una biblioteca genómica de YAC de peso molecular alto, 20

(3) creación de mapas físicos de los marcadores moleculares en los clones de YAC y construcción de contigs de YAC,

(4) construcción de una biblioteca de cósmidos de los clones de YAC que lleven los marcadores moleculares unidos,

(5) creación de mapas físicos precisos y construcción de contigs cosmídicos, 25

(6) caracterización genética de mutantes de tomate susceptibles a los nematodos de los nudos de las raíces,

(7) transformación de plantas susceptibles con los cósmidos que forman el contig,

(8) análisis de la complementación.

Para la identificación de marcadores moleculares, hemos utilizado la tecnología de amplificación de fragmentos de restricción selectiva, de aquí en adelante también denominada tecnología AFLP, la cual amplifica 30 aleatoriamente un subgrupo de fragmentos de ADN de una mezcla compleja de muchos fragmentos de ADN y dichos fragmentos amplificados generan huellas que pueden ser analizadas. En general, el ADN total de diferentes genotipos de la misma especie de planta es sometido a la tecnología AFLP y se comparan las diferentes huellas de AFLP obtenidas de los diferentes genotipos. Los fragmentos que están presentes en un genotipo y ausentes en otro genotipo son fragmentos polimórficos y se denominan marcadores AFLP. La selectividad de las reacciones AFLP se obtiene utilizando 35 nucleótidos selectivos aleatoriamente seleccionados en el extremo 3' de los cebadores de PCR inmediatamente adyacentes a los nucleótidos del sitio del enzima de restricción. En una selección por AFLP, el ADN que va a ser estudiado es sometido a diferentes combinaciones de cebadores. La cantidad total de los diferentes cebadores que puede ser utilizada está determinada por el número de nucleótidos selectivos que son añadidos al extremo 3' (4 cebadores con 1 nucleótido selectivo, 16 cebadores con 2 nucleótidos selectivos, 64 cebadores con 3 nucleótidos 40 selectivos). Si se utilizan dos enzimas de restricción diferentes, hay entonces una cantidad doble de cebadores. Esos cebadores pueden ser utilizados en una combinación diferente. Si se utilizan todas las combinaciones posibles en una selección por AFLP, todos los fragmentos presentes deben haber sido amplificados con una de las combinaciones de cebadores (Zabeau y Vos, EP 0534858).

Para la identificación de marcadores AFLP ligados al gen de resistencia Mi, diferentes líneas de tomate fueron sometidas a una selección por AFLP. En una primera etapa, se analizaron dos grupos de líneas casi isogénicas para determinar resistencia a nematodos frente a susceptibilidad mediante la formación de huellas de AFLP utilizando los siguientes cebadores:

Cebadores de PstI 5'-GACTGCGTACATGCAGNN-3'

Cebadores de MseI 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3' 50

Las Ns indican los nucleótidos selectivos variables. En la selección por AFLP se utilizaron todos los 16 cebadores posibles para el cebador de PstI y los 64 cebadores posibles para el cebador de MseI en los dos grupos de líneas casi isogénicas, dando un total de 16 x 64 = 1024 combinaciones de cebadores ensayadas. Después del análisis de todas las huellas de AFLP, se identificaron un total de 30 marcadores AFLP candidatos ligados al gen de resistencia

Mi. Estos marcadores candidatos fueron posteriormente ensayados en un panel de líneas de tomate resistentes a nematodos y susceptibles a nematodos para la confirmación y determinación de la distancia de la unión al locus Mi. El gen de resistencia Mi fue introgresado en el tomate cultivado en 1944 a partir de Lycopersicon peruvianum. Las líneas de tomate resistentes a nematodos modernas han sido sometidas a numerosos ciclos de cruce, esperando obtener como resultado una región pequeña introgresada de Lycopersicon peruvianum con el gen de resistencia Mi. Se espera que el 5 análisis de los marcadores AFLP candidatos en estos genotipos de tomate modernos sea un buen ensayo para determinar la unión próxima al locus Mi. Un panel de 7 genotipos de tomate resistentes y 11 genotipos de tomate susceptibles fue analizado con los marcadores AFLP candidatos. Parecía que un total de 20 marcadores AFLP estaban presentes en todas las líneas resistentes y ausentes en todas las líneas susceptibles y se denominaron marcadores AFLP ligados a Mi. 10

Posteriormente, cuatro de los marcadores AFLP fueron sometidos a selección en una biblioteca genómica de alto peso molecular. El clonaje de segmentos muy grandes de ADN como cromosomas artificiales grandes en levaduras se ha convertido en una etapa esencial para el aislamiento de genes mediante clonaje posicional. La capacidad de clonaje del vector YAC permite el aislamiento de fragmentos de ADN de hasta un millón de pares de bases de longitud. La línea de tomate Lycopersicon esculentum E22, homocigota para el locus Mi, fue utilizada como una 15 fuente de ADN para construir una biblioteca de YAC. Obtuvimos una biblioteca de YAC conteniendo 3840 clones con un tamaño de inserto promedio de 520 kb, representando aproximadamente 2,2 equivalentes genómicos del genoma del tomate. Se obtuvieron tres clones de YAC positivos después de la selección por AFLP con los marcadores AFLP ligados a Mi: 1/1084, 1/1172 y 2/1256. Posteriormente, se determinó la presencia de todos los marcadores AFLP ligados a Mi en los 3 clones de YAC. Todos los marcadores parecían estar presentes en uno o más de los 3 clones de YAC, lo cual 20 permitió una primera colocación de los diferentes marcadores AFLP ligados a Mi. Los datos de AFLP indicaban que los tres clones de YAC constituían un contig solapante de aproximadamente 1,4 Mb (ver la Figura 1).

Para determinar el tamaño físico del locus Mi que contenía los marcadores AFLP ligados a Mi y que estaba contenido en los clones de YAC 1/1084, 1/1172 y/o 2/1256, se construyó un mapa de restricción de gran alcance del contig de YAC. Éste definía un segmento de ADN que contenía el locus Mi de aproximadamente 700 kb en el 25 cual estaban ubicados todos los marcadores AFLP ligados a Mi (ver la Figura 1).

Un tamaño de 700 kb es aún demasiado grande para la localización directa del gen de resistencia Mi. Dichos insertos grandes no pueden ser transformados en células vegetales directamente. Por lo tanto, se construyó una biblioteca de cósmidos de la cepa de levadura que contenía YAC 1/1172 y se construyó una biblioteca de cósmidos de la cepa de levadura que contenía YAC 2/1256 utilizando vectores cosmídicos que son adecuados para la transformación mediada por Agrobacterium. El tamaño de este vector cosmídico binario viene a ser de 29 kb y se muestra esquemáticamente en la Figura 2. La capacidad de clonaje de este vector cosmídico binario, utilizando un extracto de empaquetamiento del fago lambda, está dentro del rango de 9 a 24 kb. Se obtuvieron dos bancos de aproximadamente 250.000 clones cosmídicos cada uno a partir del ADN de levadura fraccionado por tamaños. Los bancos de cósmidos fueron sometidos a selección por hibridación de colonias utilizando como sondas fragmentos de restricción marcados de 35 los YACs. Se identificaron clones de cósmidos positivos y además, los cósmidos fueron agrupados en siete regiones definidas que cubrían la región Mi.

En la siguiente etapa, se determinó la huella del grupo de cósmidos de las siete regiones definidas utilizando la amplificación de fragmentos de restricción para determinar su orden relativo. Pudo construirse un contig cosmídico que cubría un segmento de ADN de aproximadamente 700 kb. Posteriormente, se determinó la presencia de 40 los marcadores AFLP ligados a Mi en este contig cosmídico. Se obtuvo un mapa físico del segmento de ADN que contenía el gen de resistencia Mi con las posiciones de los diferentes marcadores AFLP ligados a Mi (ver la Figura 3).

Un total de 96 cósmidos solapantes constituían conjuntamente el segmento de ADN que contenía el gen de resistencia Mi. El análisis de complementación para identificar el gen de resistencia Mi con tal grupo grande de cósmidos es una tarea muy laboriosa. Por lo tanto, la posición del gen de resistencia Mi en el contig cosmídico fue 45 determinada utilizando líneas de tomate mutantes. Estas líneas mutantes son miembros de una familia que se originó de un ancestro común y contienen un genotipo Mi de tipo salvaje (resistente a nematodos) pero un fenotipo mutante susceptible a nematodos. Después del análisis con el grupo de marcadores AFLP ligados a Mi en un gran número de estas líneas mutantes, tres marcadores AFLP ligados a Mi parecían estar ausentes en la mayoría de los mutantes. Estos marcadores AFLP, por lo tanto, mostraban una buena correlación entre el genotipo Mi de AFLP y el fenotipo Mi, en 50 constraste con los demás 17 marcadores AFLP. Dos de estos marcadores AFLP, PM14 y PM25, eran adyacentes, y se asumió que la región alrededor de estos marcadores era la posición más probable para el gen de resistencia Mi. Un grupo de 6 cósmidos solapantes que definían un segmento de ADN de aproximadamente 50 kb alrededor de los marcadores AFLP PM14 y PM25, fue seleccionado para el análisis de complementación (ver la Figura 4).

La etapa final en la identificación del gen de resistencia Mi mediante clonaje posicional es la 55 complementación del fenotipo susceptible correspondiente. Los 6 cósmidos de la región de Mi candidata fueron introducidos en Agrobacterium tumefaciens mediante transferencia por conjugación en apareamiento triparental. La presencia del cósmido en las cepas de A. tumefaciens fue determinada comparando varios patrones de enzimas de restricción, así como huellas de ADN de las cepas de A. tumefaciens con la cepa de E. coli que contenía el cósmido. Solamente aquellos cultivos de A. tumefaciens que albergaban un cósmido con el mismo patrón de ADN que el cultivo de 60 E. coli correspondiente fueron utilizados para transformar una línea de tomate susceptible. Una línea de tomate susceptible fue transformada con los cósmidos Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 y Mi-14 utilizando métodos estándar de

transformación.

Raíces de plantas R0 transformadas cultivadas in vitro fueron analizadas para determinar síntomas de enfermedad con el fin de identificar los cósmidos con el gen de resistencia. Explantes de raíces fueron transferidos a un medio solidificado en placas Petri e inoculados con diez agallas de un cultivo axénico de nemátodos del nematodo de los nudos de la raíz Meloidogyne incognita. Los síntomas de enfermedad fueron valorados seis semanas después de la 5 inoculación. Una planta transgénica es considerada resistente cuando no es visible ninguna agalla o solamente una agalla en el cultivo de su raíz. Una planta transgénica es considerada susceptible cuando al menos dos agallas han sido inducidas en el cultivo de su raíz. Las observaciones del ensayo de enfermedad in vitro revelaron que dos cósmidos fueron capaces de complementar el fenotipo susceptible. La presencia del marcador AFLP PM14 en plantas R0 resistentes indicaba que el inserto genómico presente en los cósmidos Mi-11 y Mi-18 estaba también presente en las 10 plantas R0 y estaba involucrado en la concesión de resistencia frente a Meloidogyne incognita a las plantas R0.

Los regenerantes primarios (plantas R0) de los experimentos de transformación fueron cultivados en el invernadero para que dieran semillas con el fin de obtener líneas R1, las cuales fueron analizadas para determinar síntomas de enfermedad. El ensayo de enfermedad se realizó en los plantones. Para esto, se sembraron las semillas o se transfirieron plántulas pequeñas con raíz a tierra infectada con Meloidogyne incognita y se valoraron los síntomas de 15 enfermedad de 4 a 8 semanas después de la inoculación. Las plantas se consideran resistentes cuando son visibles tres o menos agallas en las raíces. Las plantas se consideran susceptibles cuando se forman más de tres agallas en las raíces. Las observaciones del ensayo de enfermedad in vivo revelaron que las plantas R0 resistentes correspondían a los transformantes con el cósmido Mi-11.

Con el fin de confirmar la integración estable del gen de resistencia Mi en el genoma de las plantas 20 R0 transgénicas, las plantas resistentes de las líneas R1 fueron autofecundadas y cultivadas en el invernadero para que dieran semillas con el fin de obtener líneas R2. Los plantones de las líneas R2 fueron sometidos a un ensayo de enfermedad de nematodos in vivo. Los resultados obtenidos indicaban la herencia estable del gen de resistencia Mi.

Finalmente, los insertos de los cósmidos Mi-11 y Mi-18 fueron caracterizados adicionalmente. El análisis de secuenciación reveló un marco de lectura abierto grande (ORF2) de 3621 nucleótidos. La secuencia de ADN 25 se presenta en la Figura 5.

La secuencia de ADN conteniendo el gen de resistencia Mi se sometió posteriormente a estudios de mapeo de los transcritos con el fin de determinar la existencia de secuencias intrónicas. Estos estudios de mapeo de los transcritos fueron realizados de acuerdo con métodos generalmente conocidos, mediante los cuales las secuencias de ADN genómico son comparadas con secuencias de ADNc. La comparación de secuencias de ADNc y secuencias 30 genómicas reveló la existencia de dos secuencias intrónicas en el gen de resistencia Mi. Un intrón de 1306 nucleótidos está ubicado desde el nucleótido en posición 1936 al 3241 y un segundo intrón de 75 nucleótidos está ubicado desde el nucleótido en posición 3305 al 3379, según está representado en la Figura 5. Se postuló que la posición del sitio de inicio de la transcripción estaba en o corriente arriba del nucleótido 1880. El primer codón de inicio ATG está localizado en la posición nucleotídica 3263, que está 52 nucleótidos corriente arriba del segundo intrón, dando un marco de lectura 35 abierto grande (ORF1) que codifica un polipéptido de 1257 aminoácidos (Figura 7A).

Las búsquedas de homología han mostrado que los polipéptidos de acuerdo con la invención pertenecen a la clase LRR de las proteínas de resistencia de las plantas (Staskawicz y col., 1995, Science, 268, 661-667). Además, la proteína puede ser dividida en cuatro regiones designadas A a D: la región A comprende una gran cantidad de residuos de leucina, la región B comprende un motivo de un sitio de unión a nucleótidos, la región C es la 40 región LRR que contiene 13 repeticiones con la siguiente secuencia consenso:

a--a-NL-L-a---a-a/S--- (Jones y Jones, 1997, Advances in Botanical Research, 24, 89-167) y la región D no revela homología con ninguna proteína conocida.

Para la identificación y el aislamiento de secuencias homólogas que están dentro del alcance de la presente invención, se sometieron a selección bibliotecas genómicas y de ADNc con la secuencia codificadora del gen 45 de resistencia Mi como sonda bajo condiciones de hibridación rigurosas. Los clones positivos fueron aislados y utilizados para el análisis de complementación.

Se realizaron hibridaciones de transferencia Southern en el contig de YAC con un fragmento de PstI interno de la secuencia codificadora del gen de resistencia Mi. Se pudieron identificar tres regiones homólogas adicionales: dos en YAC 1/1172 y una en YAC 1/1084. Cada región comprende de 2 a 3 homólogos de Mi indicativos del 50 hecho de que la familia del gen Mi está compuesta por 10 a 12 miembros aproximadamente.

Sorprendentemente, los ensayos de enfermedad por áfidos revelaron que las plantas R0, transformadas con el cósmido Mi-11, son resistentes a Meloidogyne incognita así como resistentes a Macrosiphum euphorbiae, indicando que el inserto de genoma presente en el cósmido Mi-11 está involucrado en el hecho de conferir a las plantas R0 resistencia a nematodos, además de estar involucrado en el hecho de conferir a las plantas R0 resistencia 55 a áfidos.

Con el fin de confirmar la herencia de la resistencia a áfidos, (i) las líneas de tomate R1 previamente obtenidas que fueron derivadas de los transformantes con el cósmido Mi-11 resistentes a nematodos, (ii) las

líneas R2 derivadas de plantas R1 resistentes a nematodos autofecundadas, y (iii) las líneas R1BC obtenidas de plantas R1 resistentes a nematodos retrocruzadas con la línea de tomate susceptible 52201, fueron también analizadas para determinar su resistencia frente a M. euphorbiae. Los resultados obtenidos indicaban la herencia de la resistencia a áfidos.

Se utilizó el cósmido Mi-11 para la transformación de genotipos susceptibles a nematodos de 5 tabaco y patata, de acuerdo con los métodos generales de transformación conocidos. Raíces de plantas de tabaco y patata R0 transformadas cultivadas in vitro fueron analizadas para detectar síntomas de enfermedad según se describió previamente en la presente. Las observaciones del ensayo de enfermedad en los cultivos de raíces de las plantas transformadas, indicaron que el cósmido está implicado en el hecho de conferir a las plantas transformadas una susceptibilidad reducida a nematodos. El gen de resistencia tiene un efecto reductor de la susceptibilidad de una especie 10 de planta heteróloga a nematodos, preferiblemente a las especies de Meloidogyne, especialmente a Meloidogyne incognita.

Además, también se analizaron transformantes de tabaco para determinar su resistencia a áfidos, y pudieron identificarse plantas R0 resistentes.

El gen de resistencia tiene una doble función y tiene efecto en los sistemas heterólogos. 15

El cósmido Mi-11 fue depositado el 5 de Agosto de 1996 como plásmido pKGMi-11 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures de Baarn, Países Bajos, bajo el número de depósito CBS 822.96.

El cósmido Mi-18 fue depositado el 5 de Agosto de 1996 como plásmido pKGMi-18 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures de Baarn, Países Bajos, bajo el número de depósito CBS 821.96.

Los siguientes ejemplos proporcionarán una ilustración adicional de la presente invención, la cual 20 sin embargo no está limitada a estos ejemplos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: ENSAYO DE ENFERMEDAD

Un cultivo axénico del nematodo de los nudos de la raíz Meloidogyne incognita se mantuvo sobre raíces estériles de la variedad de tomate Moneymaker. Los cultivos de las raíces se desarrollaron en un medio B5 solidificado (Gamborg y col., 1968, Experimental Cell Research, 50, 151-158) con un 2% de sacarosa y sin hormonas.

Explantes de las raíces (1-5 cm), derivados de plantas de tomate transgénicas cultivadas in vitro, se transfirieron al medio B5 solidificado mencionado anteriormente para iniciar los cultivos de las raíces. Al mismo tiempo, cada explante de raíz fue inoculado con 10 agallas del cultivo axénico de nematodos. Las agallas se colocaron a pocos centímetros del explante de raíz. Las placas Petri con las raíces y las agallas se incubaron en la oscuridad a 25C. 30 Después de cuatro a seis semanas, se determinó el nivel de infección contando el número de agallas formadas en los cultivos de raices.

La evaluación para determinar la resistencia/susceptibilidad a M. incognita fue como sigue:

Una planta transgénica fue considerada resistente cuando ninguna agalla o menos de dos agallas fueron visibles en el cultivo de sus raíces. Una planta transgénica fue considerada susceptible cuando por lo menos dos 35 agallas fueron inducidas en el cultivo sus raíces.

EJEMPLO 2: IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES AFLP LIGADOS A UN SEGMENTO DE ADN QUE CONTENÍA EL GEN DE RESISTENCIA Mi

Líneas de tomate (Lycopersicon esculentum)

Un total de 9 líneas de tomate resistentes a Meloidogyne incognita y 13 líneas de tomate 40 susceptibles a M. incognita fueron utilizadas para identificar marcadores AFLP. Inicialmente, se realizó la selección de AFLP en dos grupos de líneas casi isogénicas 83M-R (resistente) y 83M-S (susceptible), y Motelle (resistente) y Mobox (susceptible). Los marcadores candidato que resultaron de esta primera selección fueron confirmados mediante una segunda selección en 7 líneas resistentes a M. incognita y en 11 líneas susceptibles a M. incognita.

Dos grupos de líneas casi isogénicas: 45

1. 83M-R resistente De Ruiter Zonen C.V. Bergschenhoek, Países Bajos (de aquí en adelante "De Ruiter")

2. 83M-S susceptible De Ruiter

3. Motelle resistente INRA, Montfavet, Francia

4. Mobox susceptible INRA, Montfavet, Francia 50

Las 7 líneas resistentes a M. incognita y las 11 líneas susceptibles a M. incognita para confirmación:

5. DR30 resistente De Ruiter

6. DR17 resistente De Ruiter

7. E22 resistente Enza Zaden, de Enkhuizen Zaadhandel B.V. Enkhuizen, Países Bajos (de aquí en adelante "Enza Zaden")

8. E1 resistente Enza Zaden 5

9. DR6 resistente De Ruiter

10. DR10 resistente De Ruiter

11. 1872 resistente Royal Sluis B.V., Enkhuizen, Países Bajos (de aquí en adelante "Royal Sluis")

12. Moneymaker susceptible Agricultural University Wageningen 10

13. DR12 susceptible De Ruiter

14. DR23 susceptible De Ruiter

15. GT susceptible De Ruiter

16. RZ3 susceptible Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V., De Lier, Países Bajos (de aquí en adelante "Rijk Zwaan") 15

17. RZ5 susceptible Rijk Zwaan

18. E3 susceptible Enza Zaden

19. E7 susceptible Enza Zaden

20. E16 susceptible Enza Zaden

21. RS1 susceptible Royal Sluis 20

22. RS2 susceptible Royal Sluis

Aislamiento y modificación del ADN

El ADN total de tomate de las 22 líneas descritas anteriormente fue aislado de hojas jóvenes según está descrito por Bernatzki y Tanksley (Theor. Appl. Genet., 72, 314-321). El rendimiento típico fue de 50-100 μg de ADN por gramo de material de hoja fresco. El ADN molde para el análisis por AFLP con la combinación de enzimas PstI-MseI 25 fue preparado según está descrito por Zabeau y Vos (Solicitud de Patente Europea, EP 0534858), y se describe a continuación brevemente:

Se incubaron 0,5 μg de ADN de tomate durante 1 hora a 37C con 5 unidades de PstI y 5 unidades de MseI en 40 μl de Tris.HAc 10 mM pH 7,5, MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT 5 mM, 50 ng/μl de BSA. A continuación, se añadieron 10 μl de una solución que contenía 5 pmoles de adaptadores de PstI, 50 pmoles de adaptadores de MseI, 1 30 unidad de ADN-ligasa de T4, ATP 1 mM en Tris.HAc 10 mM pH 7,5, MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT 5 mM, 50 ng/μl de BSA, y se continuó la incubación durante 3 horas a 37C. Los adaptadores se representan a continuación:

La estructura del adaptador de PstI era:

5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3'

3'-CATCTGACGCATGT-5' 35

La estructura del adaptador de MseI era:

5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'

3'-TACTCAGGACTCAT-5'

Los adaptadores fueron preparados añadiendo cantidades equimolares de ambas hebras; los adaptadores no estaban fosforilados. Después de la ligadura, la mezcla de reacción se diluyó a 500 μl con Tris.HCl 10 40 mM, EDTA 0,1 mM pH 8,0, y se almacenó a —20C. La mezcla de reacción diluida es referida además como ADN molde.

Reacciones de AFLP

Los cebadores utilizados para la selección por AFLP se presentan a continuación:

Cebadores de PstI: 5'-GACTGCGTACATGCAGNN-3' 45

Cebadores de MseI: 5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3'

Las Ns en los cebadores indican que esta parte de los cebadores era variable. En la selección por AFLP se utilizaron los 16 cebadores posibles para el cebador de PstI y los 64 cebadores posibles para el cebador de MseI. Esto daba un total de 16 x 64 combinaciones de cebadores de PstI y MseI, es decir 1024 combinaciones de cebadores. Las 1024 combinaciones de cebadores fueron todas utilizadas en la selección mediante AFLP por 5 marcadores AFLP ligados a Mi. Las reacciones de AFLP se realizaron de la siguiente manera:

Las reacciones de AFLP emplearon un cebador de PstI marcado radiactivamente y un cebador de MseI no marcado. Los cebadores de PstI fueron marcados en su extremo utilizando (γ-33P)ATP y polinucleótido quinasa de T4. Las reacciones de marcaje se realizaron en 50 μl de Tris.HCl 25 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, espermidina.3HCl 0,5 mM, utilizando 500 ng del cebador oligonucleotídico, 100 μCi de (γ-33P)ATP y 10 unidades de 10 polinucleótido quinasa de T4. Para el análisis mediante AFLP, se preparó una mezcla de reacción de 20 μl conteniendo 5 ng del cebador de PstI marcado (0,5 μl de la mezcla de reacción de marcaje), 30 ng del cebador de MseI, 5 μl del ADN molde, 0,4 unidades de polimerasa Taq, Tris.HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, 0,2 mM de los 4 dNTPs. Las reacciones de AFLP fueron realizadas utilizando el siguiente perfil de ciclo: una etapa de desnaturalización del ADN de 30 segundos a 94C, una etapa de hibridación de 30 segundos (ver más adelante), y una etapa de extensión de un 15 minuto a 72C. La temperatura de hibridación en el primer ciclo fue de 65C, posteriormente fue reducida en cada ciclo en 0,7C durante los siguientes 12 ciclos, y se continuó a 56C durante los 23 ciclos restantes. Todas las reacciones de amplificación fueron realizadas en un termociclador PE-9600 (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT, EE.UU.).

Análisis en gel de los productos de reacción de AFLP

Después de la amplificación, se mezclaron los productos de reacción con un volumen igual (20 μl) 20 de colorante de formamida (formamida 98%, EDTA 10 mM pH 8,0, y azul de bromofenol y xilenocianol como colorantes de rastreo). Las mezclas resultantes se calentaron durante 3 minutos a 90C, y después se enfriaron rápidamente en hielo. Se cargaron 2 μl de cada muestra en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (secuenciación) al 5% (Maxam y Gilbert, Methods in Enzymology, 65, 499-560). La matriz del gel se preparó utilizando acrilamida 5%, metilén bisacrilo 0,25%, urea 7,5 M en Tris 50 mM/ácido bórico 50 mM/EDTA 1 mM. A 100 ml de la solución de gel se añadieron 500 μl 25 de APS al 10% y 100 μl de TEMED y los geles fueron moldeados utilizando un aparato para geles SequiGen de 38 x 50 cm (Biorad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE.UU.). Se utilizaron peines de dientes de tiburón para formar 97 calles en las unidades de gel del SequiGen. Se utilizó Tris 100 mM/ácido bórico 100 mM/EDTA 2 mM como tampón para el proceso. Se realizó la electroforesis a una potencia constante, 110 watios, durante aproximadamente 2 horas. Después de la electroforesis, los geles se fijaron durante 30 minutos en ácido acético al 10%, se secaron sobre placas de vidrio y se 30 expusieron a pantallas Phosphorimage de Fuji durante 16 horas. Se visualizaron los patrones de huellas utilizando un sistema de análisis Phosphorimage BAS-2000 de Fuji (Fuji Photo Film Company Ltd., Japón).

Selección mediante AFLP por marcadores ligados

Se realizó una selección mediante AFLP utilizando todas las 1024 combinaciones posibles de los cebadores de PstI-MseI en los dos grupos de líneas casi isogénicas. El objetivo era identificar marcadores AFLP 35 presentes en ambas líneas resistentes y ausentes en ambas líneas susceptibles. Los geles de AFLP contenían las huellas de AFLP de 24 combinaciones de cebadores de las 4 líneas isogénicas, dando un total de 43 geles. Se identificó un total de 30 marcadores AFLP que estaban presentes en ambas líneas resistentes y ausentes en ambas líneas susceptibles. Estos marcadores son referidos como marcadores AFLP ligados a Mi candidatos.

A continuación, se realizaron reacciones de AFLP para determinar la presencia de los 30 40 marcadores candidatos en las 7 líneas de tomate resistentes y en las 11 líneas de tomate susceptibles. De los 30 marcadores candidatos, 20 marcadores parecían estar presentes en las 7 líneas resistentes y ausentes en las 11 líneas susceptibles. Estos 20 marcadores fueron utilizados en estudios adicionales para crear mapas del gen de resistencia Mi. Las combinaciones de cebadores requeridas para identificar los 20 marcadores PstI-MseI están representadas en la Tabla 1. En la columna con las combinaciones de cebadores, "PstI" se refiere a la secuencia 5'-GACTGCGTACATGCAG-3' 45 y "MseI" se refiere a la secuencia 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'. Por ejemplo, el marcador PM14 puede ser identificado utilizando el cebador de PstI que tiene la siguiente secuencia: 5'-GACTGCGTACATGCAGGA-3', y el cebador de MseI que tiene la siguiente secuencia: 5'-GATGAGTCCTGAGTAATCT-3'.

TABLA 1

Marcador: Combinación de cebadores con extensiones selectivas (NN/NNN)

PM02 PM07 PM08 PM10 PM11: PstI-AT/MseI-AAA PstI-AA/MseI-TAC PstI-CT/MseI-ACT PstI-CA/MseI-TCT PstI-TA/MseI-TGA

PM13 PM14 PM15 PM16 PM17 PM18 PM19 PM20 PM21 PM22 PM23 PM24 PM25 PM27 PM29: PstI-GA/MseI-ATC PstI-GA/MseI-TCT PstI-GT/MseI-GAC PstI-GT/MseI-TCT PstI-AT/MseI-AAG PstI-AT/MseI-TAG PstI-GG/MseI-ATT PstI-TG/MseI-AAT PstI-TG/MseI-TTT PstI-TG/MseI-GCT PstI-GT/MseI-GAA PstI-AA/MseI-CTG PstI-AC/MseI-GTG PstI-AA/MseI-CTA PstI-TA/MseI-GGA

EJEMPLO 3: CONSTRUCCIÓN Y SELECCIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE YAC DE TOMATE

Material

Se utilizó la línea de tomate Lycopersicon esculentum E22 (Enza Zaden) homocigota para el locus Mi como fuente de ADN para construir una biblioteca de YAC. Se aislaron los protoplastos de las hojas de brotes in vitro 5 que tenían de dos a tres semanas de edad según está descrito por Van Daelen y col. (Plant Mol. Biol., 12, 341-352).

Se recogieron los protoplastos viables (concentración de 50 millones de protoplastos por ml) y se mezclaron con un volumen igual de agarosa (1%, Seaplaque, FMC Bioproducts, Rockland, Maine, EE.UU.) para formar un bloque. Los protoplastos incluidos en los bloques fueron lisados con una mezcla de lisis (EDTA 0,5 M, 1% de sarcosinato de N-laurilo y 1 mg/ml de proteinasa K, pH=8,0). Después de la lisis, los bloques fueron almacenados a 4C en 10 tampón de almacenamiento (mezcla de lisis fresca) hasta su utilización. Aproximadamente 3 millones de protoplastos por bloque, para obtener aproximadamente 4,5 μg de ADN cromosómico, fueron utilizados para estudios posteriores. El plásmido pYAC4 que contenía un sitio de clonaje único de EcoRI fue utilizado como vector de clonaje y la cepa de levadura AB1380 fue utilizada como huésped (Burke y col., Science, 236, 806-812).

Construcción de la biblioteca de YAC 15

El aislamiento de ADN de peso molecular alto, la digestión parcial con EcoRI en presencia de metilasa de EcoRI, la ligadura de los brazos del vector a ADN genómico, la selección por tamaños a través de electroforesis en gel de campo pulsado y la transformación del huésped levadura, se llevaron a cabo según está descrito por Burke y col. (Science, 236, 806-812) y Larin y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4123-4127).

Todas las manipulaciones estándar se realizaron según está descrito en Molecular cloning: a 20 laboratory manual por Sambrook y col. (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Se obtuvieron finalmente 3840 clones con un tamaño de inserto promedio de 520 kb, el cual corresponde a 2,2 equivalentes de genoma y los clones individuales fueron almacenados en 40 placas de microvaloración de 96 pocillos que contenían 75 μl de una solución de YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 2% de dextrosa). 25

Selección de la biblioteca de YAC

Para reducir el número de muestras manejadas, las células de una placa de microvaloración de 96 pocillos fueron combinadas (una combinación de placa) y utilizadas para el aislamiento de ADN como se describió por Ross y col. (Nucleic Acids Res., 19, 6053). La biblioteca de YAC de tomate de 2,2 equivalentes de genoma constaba de 40 placas de microvaloración de 96 pocillos y como resultado el ADN de las 40 combinaciones de placa fue sometido a 30 selección con los marcadores AFLP, PM10, PM13, PM21 y PM25 utilizando el protocolo de AFLP como se describió en el Ejemplo 2. Se eligieron PM10, PM13, PM21 y PM25 para someter a selección las combinaciones de placa de YAC porque estos marcadores no interfieren con las bandas de fondo de la cepa de levadura AB1380. Se identificaron tres

combinaciones de placa positivas de las 40 sometidas a selección con estos cuatro marcadores AFLP como se muestra en la Tabla 2. Posteriormente, se empleó una selección secundaria con los cuatro marcadores AFLP (PM10, PM13, PM21 y PM25) de los 96 clones de YAC individuales de cada placa para encontrar la dirección correcta de los clones de YAC. Se identificaron tres clones de YAC individuales, designados 1/1084, 1/1172 y 2/1256 (Tabla 2). Posteriormente, los tres clones de YAC individuales fueron analizados con los marcadores AFLP restantes. Todos los marcadores identificados, PM02 a PM29, estaban presentes en uno o más de estos tres clones de YAC (Tabla 3). El tamaño del clon de YAC fue determinado mediante análisis electroforético en gel de campo pulsado (PFGE) utilizando un campo eléctrico homogéneo fijado al contorno (CHEF; Chu y col., Science, 235, 1582-1585) y pareció ser de 470 kb (1/1084), 570 kb (1/1172) y 500 kb (2/1256), respectivamente.

TABLA 2 10

Combinación de placa nº: PM10 PM13 PM21 PM25 YAC detectado (tamaño en kb)

2 16 4: - + - - + + + - - - + - YAC 1/1172 (570 kb) YAC 2/1256 (500 kb) YAC 1/1084 (470 kb)

TABLA 3

Marcador: 1/1172 2/1256 1/1084

PM02 PM07 PM08 PM10 PM11 PM13 PM14 PM15 PM16 PM17 PM18 PM19 PM20 PM21 PM22 PM23 PM24 PM25 PM27 PM29: - - - - - - + - + - - - - + - - - - - - - + + + + + + + - + + + + - + + + + + + + - + - - + - - - - + - - - + - - - - -

EJEMPLO 4: CONSTRUCCIÓN DE UN MAPA FÍSICO DE GRAN ALCANCE DEL CONTIG DE YAC CON Mi Y UBICACIÓN DE LOS MARCADORES AFLP 15

Los tres clones de YAC 1/1172, 2/1256 y 1/1084 fueron sometidos a digestión parcial con una concentración creciente de los enzimas de restricción SfiI y BssHII. Las muestras fueron fraccionadas por PFGE,

transferidas a una membrana Gene Screen Plus (DuPont NEN, Boston MA, EE.UU.) y analizadas por hibridación utilizando sondas de secuencias adyacentes a los extremos de acuerdo con el protocolo para el mapeo indirecto mediante marcas en los extremos según está descrito por Burke y col. (Science, 236, 806-812). Pudo construirse un mapa físico de YAC 1/1172, 2/1256 y 1/1084 para los enzimas SfiI y BssHII según se muestra en la Figura 1. El solapamiento entre los varios clones de YAC fue determinado mediante análisis de transferencia Southern utilizando los 5 fragmentos de restricción obtenidos como sonda sobre el digesto de los tres clones de YAC. Un contig de YAC con un tamaño de 1,4 Mb pudo ser construido. Con el fin de aislar los fragmentos de YAC, los digestos fueron procesados en PFGE. La digestión de YAC 1/1172 con SfiI dio como resultado dos fragmentos (200 kb y 370 kb). La digestión de YAC 2/1256 con BssHII dio como resultado cuatro fragmentos (40 kb, 90 kb, 110 kb y 260 kb), mientras que la digestión de YAC 1/1084 con BssHII dio dos fragmentos con un tamaño de 70 y 400 kb. Como resultado, el contig de YAC de 1,4 Mb 10 pudo ser separado en 8 regiones correspondientes a los 8 fragmentos de restricción obtenidos a partir de los tres clones de YAC, cubriendo la región de Mi completa y secuencias adyacentes.

Para colocar los diferentes marcadores AFLP dentro de estas 8 regiones sobre el mapa físico, los marcadores AFLP fueron utilizados como sondas de hibridación en los digestos parciales y completos de SfiI y BssHII de los clones de YAC 1/1172, 2/1256 y 1/1084. Por lo tanto, cada fragmento marcador AFLP fue cortado del gel secado y 15 eluido mediante difusión en un tampón conteniendo acetato de amonio 0,5 M, acetato de magnesio 10 mM, EDTA 1 mM (pH=8,0), SDS 0,1%, reamplificado con los cebadores de AFLP no marcados correspondientes y marcado posteriormente con 32P de acuerdo con el método de cebadores aleatorios de Feinberg y Vogelstein (Anal. Biochem., 132, 6-10). Cada marcador AFLP pudo ser asignado a una o más de las ocho regiones según está esquematizado en la Tabla 4 y la Figura 1. 20

TABLA 4

Fragmento de YAC: Marcadores AFLP ligados a Mi detectados mediante hibridación

Fragmento de SfiI 1/1172 de 200 kb Fragmento de SfiI 1/1172 de 370 kb Fragmento de BssHII 2/1256 de 260 kb Fragmento de BssHII 2/1256 de 90 kb Fragmento de BssHII 2/1256 de 110 kb Fragmento de BssHII 2/1256 de 40 kb Fragmento de BssHII 1/1084 de 70 kb Fragmento de BssHII 1/1084 de 400 kb: - PM14, PM16, PM21 PM10, PM11, PM17, PM19, PM23, PM24, PM29 PM07, PM27 PM08, PM13, PM14, PM15, PM20, PM22, PM25 PM18 PM08, PM13, PM22 PM02, PM18

EJEMPLO 5: CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA COSMÍDICA DE LOS CLONES DE YAC 1/1172 Y 2/1256

Material

El vector cosmídico binario pJJ04541 es un derivado de pJJ1881 (Jones y col., Transgenic 25 Research, 1, 285-297) y está basado en el plásmido pRK290 que contiene el gen de resistencia a tetraciclina para la selección en Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens. En el único sitio de EcoRI de pRK290, ADN-T que lleva secuencias (LB; repetición del límite izquierdo, RB significa la repetición del límite derecho) que flanquean:

- el sitio de cos del bacteriófago lambda,

- el gen de la fosfotransferasa de neomicina (Beck y col., Gene, 19, 327-336) cuya expresión está dirigida por la 30 secuencia del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell y col., Mol. Gen Genet., 223, 369-378), y

- la secuencia del poliadaptador de pBluescript (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.). El tamaño de pJJ04541 asciende a 29 kb y se muestra esquemáticamente en la Figura 2. La capacidad de clonaje de este vector cosmídico binario, utilizando extractos de empaquetamiento del fago lambda, está dentro del rango de 9 a 24 kb.

Construcción de la biblioteca 35

El ADN total de la cepa de Saccharomyces cerevisae AB1380 que contenía YAC 1/1172 y el ADN total de la cepa de Saccharomyces cerevisae AB1380 que contenía YAC 2/1256 fue aislado utilizando zimoliasa para producir protoplastos de acuerdo con Green y Olsen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1213-1217).

Se analizó una alícuota de ambos ADNs en PFGE. Ambos aislados de ADN parecían tener un tamaño de 100 kb. 40

Aproximadamente 15 μg de cada ADN fueron digeridos parcialmente con Sau3A generando moléculas con un tamaño promedio de 15-25 kb. Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a través de un gradiente de sacarosa del 10-35% durante 22 horas, 22.000 rpm a 20C en un rotor Beckman SW41. Se recogieron fracciones de 0,5 ml utilizando una aguja perforada a través del fondo del tubo de centrífuga. Una alícuota de estas fracciones fue analizada en un gel de agarosa al 0,7%. Las fracciones que contenían moléculas de ADN con un tamaño 5 de 20 kb fueron combinadas y concentradas mediante precipitación con etanol.

Posteriormente, los extremos cohesivos fueron parcialmente rellenados con dATP y dGTP utilizando la estrategia de relleno parcial de extensiones 5' de ADN producidas por endonucleasas de restricción de tipo II según está descrito por Korch (Nucleic Acids Res., 15, 3199-3220) y Loftus y col. (Biotechniques, 12, 172-176).

El vector cosmídico binario pJJ04541 fue digerido completamente con XhoI y el fragmento lineal 10 fue parcialmente rellenado con dTTP y dCTP según está descrito por Korch (Nucleic Acids Res., 15, 3199-3220).

Los fragmentos de 20 kb fueron ligados al vector cosmídico y transducidos a la cepa de E. coli XL1-Blue MR (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.) utilizando extractos de empaquetamiento del fago lambda Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.) según está recomendado por los fabricantes. La selección se realizó sobre placas de agar LB (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura y 1% de NaCl, pH 7,5) 15 conteniendo 10 mg/l de tetraciclina. Dos bancos de aproximadamente 250.000 clones de cósmidos por banco fueron producidos a partir de 2-3 μg de ADN de levadura fraccionado por tamaños de los clones de YAC 1/1172 y 2/1256, respectivamente.

Posteriormente, estos transformantes fueron almacenados en los pocillos de placas de microvaloración (96 pocillos, 100 μl del medio LB conteniendo 10 mg/l de tetraciclina). Réplicas de la cuadrícula de 96 20 pocillos de los clones cosmídicos en las placas de microvaloración fueron estampadas sobre filtros de membrana Gene Screen Plus (NEN DuPont) y se dejaron crecer hasta formar colonias sobre el medio. La hibridación de colonias, según está descrito por Sambrook y col. (en: Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) utilizando los clones de YAC 1/1172 y 2/1256 marcados con 32P reveló cósmidos positivos. De 10.000 colonias aproximadamente de YAC 1/1172 se identificaron 200 clones de cósmidos positivos aproximadamente. De 20.000 25 colonias aproximadamente de YAC 2/1256 se identificaron 300 clones de cósmidos positivos.

EJEMPLO 6: CONSTRUCCIÓN DE UN MAPA PRECISO DEL SEGMENTO DEL GEN DE RESISTENCIA Mi Y UBICACIÓN DE LOS MARCADORES AFLP

División de los cósmidos en regiones definidas

Con el fin de dividir los cósmidos en siete regiones definidas, los 200 clones de cósmidos positivos 30 de YAC 1/1172 y los 300 clones de cósmidos positivos de YAC 2/1256 fueron hibridados con 7 de los 8 fragmentos de restricción (fragmentos de YAC) como se esquematizó en el Ejemplo 4 (ver la Tabla 4 y la Figura 1). Los cósmidos positivos para cada uno de los 7 fragmentos de YAC fueron identificados. Además, se pudieron identificar cósmidos que reaccionaban positivamente con los fragmentos de restricción solapantes de los dos clones de YAC diferentes.

Construcción de un contig cosmídico del segmento del gen de resistencia Mi 35

Con el fin de construir un contig cosmídico de todos los cósmidos positivos identificados en las varias regiones definidas, se utilizó la amplificación de fragmentos de restricción. Aproximadamente 500 ng de cada cósmido fueron utilizados para la preparación del molde y los cebadores de la amplificación de los fragmentos de restricción fueron un cebador de EcoRI 5'-GACTGCGTACCAATTC-3' que no tenía ningún nucleótido selectivo y un cebador de MseI 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' que no tenía ningún nucleótido selectivo de acuerdo con el método 40 descrito en el Ejemplo 2. El cebador de EcoRI fue marcado en el extremo 5' y los 500 cósmidos fueron todos amplificados utilizando el grupo de cebadores de EcoRI/MseI. Las huellas de ADN contenían de 8 a 20 fragmentos amplificados aproximadamente. Grupos de cósmidos conteniendo fragmentos amplificados de tamaño idéntico fueron seleccionados de cada región y se volvieron a procesar en geles de poliacrilamida como se describió en el Ejemplo 2 hasta que se pudo construir una serie contigua de todos los fragmentos amplificados de todas las regiones definidas. Además, el contig 45 cosmídico de una región fue alineado con las regiones adyacentes con el fin de construir un contig cosmídico del locus Mi. De esta manera, se construyó un contig cosmídico de 96 cósmidos, que abarcaba el locus Mi, de aproximadamente 800 kb.

Ubicación detallada de los marcadores AFLP ligados a Mi en el contig cosmídico

Con el fin de ubicar los 20 marcadores AFLP ligados a Mi en el contig cosmídico, los 96 cósmidos 50 fueron digeridos con PstI seguido por análisis de transferencia Southern de acuerdo con Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-515.

Los marcadores AFLP fueron utilizados como sondas de hibridación según se describió en el Ejemplo 4 en la transferencia Southern de los 96 digestos de PstI de los cósmidos. La posición exacta de los marcadores AFLP ligados a Mi, excepto el marcador PM02, está esquematizada en la Figura 3A. 55

EJEMPLO 7: ANÁLISIS GENÉTICO DE LOS MUTANTES DE Mi

Una familia de líneas de tomate mutantes se hizo disponible a través de Enza Zaden. Estas líneas fueron derivadas de un F1 híbrido heterocigoto para el gen de resistencia Mi y heterocigoto para el gen Aps-1 (que codifica fosfatasa ácida-1), que está ligado muy estrechamente a Mi (Stevens y Rick, 1986, en: The Tomato Crop., Atherton & Rudich edit., Chapman y Hall, p. 35-109). Se pudieron determinar diferentes alelos del gen Aps-1 mediante análisis de 5 isozimas (Vallejos, 1983, en: Isozymes in plant genetics and breeding, Tanksley y Orton edit., parte A, Elsevier, Amsterdam, 469-515). El alelo Aps-11 procede de L. peruvianum y ha sido introgresado en varios genotipos de tomate resistentes a nematodos a través de cosegregación con el gen de resistencia Mi. Un esquema de estas líneas mutantes está representado a continuación:

Híbrido F1 (Aps-1 heterocigoto, fenotipo resistente a Mi) 10

 autofecundado

Líneas F2 (segregación de Aps-1 1:2:1, segregación de resistencia a Mi 3:1)

 autofecundación de plantas F2 heterocigotas (Aps-1)

Líneas F3 (segregación de Aps-1 1:2:1, segregación de resistencia a Mi 3:1)

 autofecundación de plantas F3 heterocigotas (Aps-1) 15

Líneas F4 (segregación de Aps-1 1:2:1, segregación de resistencia a Mi 3:1)

 autofecundación de plantas F4 heterocigotas (Aps-1)

Líneas F5 (segregación de Aps-1 1:2:1, susceptibles a Mi)

 autofecundación de plantas F5 heterocigotas (Aps-1)

Líneas F6 (segregación de Aps-1 1:2:1, susceptibles a Mi) 20

 autofecundación de plantas F6 homocigotas (Aps-11)

Líneas F7 (todas Aps-11, susceptibles a Mi)

 autofecundación de plantas F7 homocigotas (Aps-11)

Líneas F8 (todas Aps-11, susceptibles a Mi)

En las líneas F1, F2, F3 y F4 de esta familia la presencia del alelo Aps-11 se correlaciona con el 25 fenotipo resistente a Mi, mientras que la ausencia del alelo Aps-11 se correlaciona con el fenotipo susceptible a Mi. En la F5 y las progenies posteriores, esta correlación se pierde: todas las plantas son susceptibles a nematodos independientemente de los alelos Aps-11.

Veinte individuos de cada generación F2, F3, F4, F5, F6, F7 y F8 fueron analizados para determinar su resistencia a nematodos, para determinar la presencia del alelo Aps-1 y la presencia de los marcadores AFLP ligados 30 a Mi. El análisis de nematodos de las plántulas se realizó en tierra contaminada con agallas de raíces de M. incognita. Los resultados de resistencia a nematodos fueron como se indicó en el esquema anterior: segregación 3:1 en plantas F2, F3 y F4 y susceptibilidad en F5 y en las poblaciones de la progenie. La mayoría de los marcadores AFLP ligados a Mi indicaban un genotipo Mi idéntico igual que el marcador de isozimas de Aps-1. Sin embargo, 3 de los marcadores AFLP, PM14, PM16 y PM25 parecían segregarse con el fenotipo Mi: en la mayoría de las plantas F5, F6, F7 y F8, la 35 susceptibilidad a Mi estaba indicada por la ausencia de estos marcadores. Los marcadores AFLP PM14, PM16 y PM25 mostraron una correlación entre el genotipo Mi de AFLP y el fenotipo Mi en los mutantes. Los marcadores PM14 y PM25 están adyacentes en el mapa físico como se muestra en la Figura 3B, y, por lo tanto, se postuló que la región que rodea a estos marcadores AFLP era una buena candidata para contener el gen de resistencia Mi.

EJEMPLO 8: MAPA FÍSICO DE LOS CLONES COSMÍDICOS SOLAPANTES QUE CONTIENEN EL GEN DE 40 RESISTENCIA Mi

La identificación de los cósmidos que hibridaban con los marcadores AFLP ligados a Mi PM14 y PM25 se realizó en el Ejemplo 6. PM14 identifica a los cósmidos Mi-11, Mi-18 y Mi-01, mientras que PM25 identifica a los cósmidos Mi-18 y Mi-01.

Posteriormente, una pequeña serie de cósmidos alrededor de los cósmidos Mi-11, Mi-18 y Mi-01 45 fue seleccionada del contig cosmídico descrito en el Ejemplo 6. Se seleccionó un contig de 6 cósmidos que contenía los 3 cósmidos identificados y los cósmidos adyacentes. Estos 6 cósmidos son Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 y Mi-14. Con el fin de realizar un mapa físico preciso de estos 6 cósmidos, las muestras de ADN del contig cosmídico fueron digeridas con PstI seguido por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. El solapamiento físico entre los diferentes

cósmidos pudo ser determinado. Mediante la combinación de estos datos con los datos obtenidos con respecto a la ubicación detallada de los marcadores AFLP ligados a Mi en el contig cosmídico (ver el Ejemplo 6), pudo construirse un mapa físico preciso con la ubicación de PM14 y PM25 según se muestra en la Figura 4. Se calculó que el contig cosmídico alrededor de los marcadores AFLP PM14 y PM25 tenía 50 kb aproximadamente.

EJEMPLO 9: TRANSFORMACIÓN 5

Transferencia de los cósmidos a Agrobacterium tumefaciens

Los clones cosmídicos Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01, Mi-14 y el cósmido control pJJ04541 fueron introducidos en Agrobacterium tumefaciens mediante transferencia por conjugación en un apareamiento triparental con la cepa cooperadora HB101 (pRK2013) esencialmente de acuerdo con Deblaere y col. (Methods in Enzymology, 153, 277-292). Se cultivó E. coli en el medio LB (1% de bacto-triptona, 0,5% de extracto de bacto-levadura 10 y 1% de NaCl, pH 7,5) suplementando con 5 mg/l de tetraciclina a 37C. La cepa cooperadora HB101 (pRK2013) fue cultivada bajo condiciones idénticas en el medio LB suplementado con 100 mg/l de sulfato de kanamicina.

La cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL1 (Lazo y col., Bio/Technology, 9, 963-971, 1991) fue cultivada en medio LB suplementado con 100 mg/l de carbenicilina a 28C.

Los cultivos de una noche fueron diluidos 1:100 en medio LB sin ningún antibiótico y después de 6 15 horas de crecimiento, se mezclaron 0,1 ml del cultivo de Agrobacterium, del cultivo de la cepa cooperadora y del cultivo de una cepa de cósmido y se sembraron en placas de agar LB sin antibióticos. Después de incubación durante una noche a 28C, la mezcla fue sembrada en placas de agar con medio LB conteniendo 100 mg/l de carbenicilina y 10 mg/l de tetraciclina para seleccionar los transconjugantes. Las placas fueron incubadas durante 3-4 días a 28C. Se realizaron dos pases seriados a través de placas de agar selectivas para seleccionar colonias de Agrobacterium transconjugantes 20 individuales.

Caracterización de los transconjugantes de A. tumefaciens

Se desarrollaron cultivos a pequeña escala a partir de las colonias seleccionadas y se cultivaron en medio LB conteniendo 10 mg/l de tetraciclina. El ADN plasmídico fue aislado mediante lisis alcalina utilizando el método descrito por Ish-Horowicz y col. (Nucleic Acids Res., 9, 2989-2997, 1981) y digerido con BglII utilizando técnicas 25 estándar. Además, se realizó la amplificación de fragmentos de restricción en minipreparaciones de ADN de A. tumefaciens utilizando la combinación de enzimas EcoRI/MseI y cebadores que no tenían ningún nucleótido selectivo según se describió en el Ejemplo 6. Posteriormente, se comparó el patrón del enzima de restricción BglII así como la huella de ADN del transconjugante de A. tumefaciens con el de las minipreparaciones de ADN de la cepa de E. coli que contenía el cósmido. Solamente aquellos transconjugantes de A. tumefaciens que albergaban un cósmido con el mismo 30 patrón de ADN que el cultivo de E. coli correspondiente fueron utilizados para transformar una línea de tomate susceptible.

Transformación de una línea de tomate susceptible

Semillas de la línea de tomate susceptible 52201 (Rijk Zwaan, De Lier, Países Bajos) fueron esterilizadas superficialmente en hipoclorito de sodio al 2% durante 10 minutos, lavadas tres veces en agua destilada 35 estéril y colocadas sobre un medio de germinación (que consistía en un medio MS de potencia media de acuerdo con Murashige y Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497, con un 1% (p/v) de sacarosa y un 0,8% de agar) en jarras de vidrio o en recipientes de cultivo de polipropileno. Se dejaron germinar durante 8 días. Las condiciones de cultivo fueron 25C, una densidad de flujo de fotones de 30 μmolesm—2s—1, y un fotoperiodo de 16/24 horas.

La transformación del tomate se realizó de acuerdo con Koornneef y col. (1986), en: Tomato 40 Biotecnology, 169-178, Alan R. Liss, Inc., y se describe brevemente a continuación. Se precultivaron explantes de cotiledones de 8 días de edad durante 24 horas en placas Petri contiendo una capa alimentadora de células en suspensión de Petunia hybrida sembradas en medio MS20 (medio de cultivo de acuerdo con Murashige y Skoog (1962), Physiol. Plant., 15, 473-497, con un 2% (p/v) de sacarosa y un 0,8% de agar) suplementado con ácido α-naftalenacético 10,7 μM y 6-bencilaminopurina 4,4 μM. Los explantes fueron luego infectados con el cultivo de una noche diluido de Agrobacterium tumefaciens conteniendo los clones cosmídicos Mi-32, Mi-30, Mi-11, Mi-18, Mi-01 y Mi-14 o el vector cosmídico pJJ04541 durante 5-10 minutos, secados sobre un papel de filtro estéril y cocultivados durante 48 horas en las placas con capa alimentadora originales. Las condiciones de cultivo fueron como las descritas anteriormente. Los cultivos de una noche de Agrobacterium tumefaciens fueron diluidos en medio MS20 líquido (medio de acuerdo con Murashige y Skoog (1962) con un 2% (p/v) de sacarosa, pH 5,7) hasta una D.O.600 de 0,8. 50

Después del cocultivo, los explantes de cotiledones fueron transferidos a placas Petri con medio selectivo que consistía en MS20 suplementado con zeatina 4,56 μM, vancomicina 67,3 μM, cefotaxima 418,9 μM y sulfato de kanamicina 171,6 μM, y cultivados bajo las condiciones de cultivo descritas anteriormente. Los explantes fueron subcultivados cada tres semanas en medio fresco. Los brotes emergentes fueron disecados de los callos subyacentes y transferidos a jarras de vidrio con medio selectivo sin zeatina para que se formaran raíces. La formación de raíces en un 55 medio conteniendo sulfato de kanamicina se consideró como una indicación de la naturaleza transgénica del brote en cuestión. Los regenerantes transgénicos auténticos fueron propagados in vitro subcultivando el meristemo apical y las yemas auxiliares en jarras de vidrio con medio selectivo fresco sin zeatina.

EJEMPLO 10: ANÁLISIS DE COMPLEMENTACIÓN

Identificación de cósmidos con el gen de resistencia Mi mediante selección por resistencia en raíces de plantas transformadas

Raíces de plantas R0 transformadas cultivadas in vitro han sido sometidas al ensayo de enfermedad según se describió en el Ejemplo 1. De cada transformante se han analizado dos explantes de raíz. En total, se han analizado 72 plantas R0 de 7 transformaciones cosmídicas diferentes; 6 cósmidos que llevaban un inserto de 5 ADN de tomate y 1 cósmido, pJJ04541, sin inserto de ADN de tomate. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Sesenta y tres plantas R0 transgénicas parecían susceptibles, ya que se habían formado agallas en al menos uno de los dos cultivos de raíces. Nueve plantas R0 se clasificaron como resistentes, ya que no pudo encontrarse ninguna agalla en los cultivos de raíces. Siete plantas resistentes habían sido derivadas de la transformación con el cósmido Mi-11, mientras que dos plantas resistentes habían sido derivadas con el cósmido Mi-18, que solapa una gran parte con el cósmido 10 Mi-11. Los cósmidos Mi-11 y Mi-18 fueron utilizados para un análisis molecular posterior.

TABLA 1

Cósmido: Plantas R0

: Resistentes Susceptibles

Mi-32 Mi-30 Mi-11 Mi-18 Mi-01 Mi-14 pJJ04541: 0 0 7 2 0 0 0 8 11 4 8 10 15 7

Análisis molecular de las plantas transformadas con un fenotipo resistente

Para demostrar que el fenotipo resistente de las plantas R0 transgénicas, las cuales habían sido 15 transformadas con los cósmidos solapantes Mi-11 y Mi-18, estaba determinado por el inserto genómico presente en los diferentes cósmidos, se realizó un análisis AFLP con el marcador AFLP PM14. La amplificación selectiva de fragmentos de restricción se realizó con la combinación de cebadores que identificaban al marcador PM14 para las plantas R0 transformadas con los cósmidos Mi-11 y Mi-18. Las huellas de ADN obtenidas mostraron la presencia del marcador PM14 en las plantas resistentes, indicando que el inserto genómico presente en los cósmidos Mi-11 y Mi-18 también está presente 20 en las plantas R0 y que los dos cósmidos solapantes identificados Mi-11 y Mi-18 contienen el gen de resistencia Mi.

Los insertos de los cósmidos Mi-11 y Mi-18 y los insertos de los cósmidos adyacentes Mi-32 y Mi-30 por un lado, y de los cósmidos Mi-01 y Mi-14 por el otro lado, fueron caracterizados posteriormente. Se calculó que la región de ADN que contenía el gen de resistencia Mi, sobre la base del solapamiento entre los cósmidos Mi-11 y Mi-18, tenía 16-18 kb aproximadamente. Sobre la base de la susceptibilidad de las plantas R0 que tenían el inserto presente en 25 el cósmido Mi-30, esta región pudo ser reducida hasta 12 kb aproximadamente. Se secuenció un segmento de ADN que contenía el gen de resistencia Mi, correspondiente a la región flanqueada por los extremos derechos de los cósmidos Mi-30 y Mi-11 (ver la Figura 4).

EJEMPLO 11: SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS Y SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DEDUCIDA DEL GEN DE RESISTENCIA Mi DEL TOMATE 30

Subclonaje del segmento de ADN solapante

Para determinar la secuencia del segmento de ADN solapante en los cósmidos Mi-11 y Mi-18 que contenía el gen de resistencia Mi, se generó un grupo de subclones aleatorios con un tamaño de inserto de aproximadamente 2 kb. Se cortaron 7,5 μg de ADN purificado en CsCl de los cósmidos Mi-11 y Mi-18 durante 10 segundos a 4C con una potencia de la sonda del 15% (en 40 μl de Tris-acetato 10 mM, Mg-acetato 10 mM y K-acetato 35 50 mM) utilizando un sonicador Misonix (Misonix Inc., Farmingdale, NY, EE.UU.) (tipo XL-2020) con el soporte de la cubeta lleno de agua (tipo 431A). Posteriormente, el ADN fue calentado durante 10 minutos a 60C y enfriado a temperatura ambiente. Los extremos de los fragmentos de ADN fueron reparados agregando 10 μl de una mezcla de reparación (Tris-acetato 10 mM, Mg-acetato 10 mM, K-acetato 50 mM, 10 U de ADN polimerasa Klenow, 10 U de ADN polimerasa T4 y 2 mM de los 4 dNTP's) seguido por incubación durante 30 minutos a 20C. El ADN cortado fue separado 40 mediante electroforesis en un gel de agarosa GTG Seakem al 1% (FMC Bio Products, Rockland, ME, EE.UU.). La fracción con un tamaño de 1,8-2,2 kb fue cortada del gel y posteriormente el corte de gel fue digerido con β-agarasa I de

acuerdo con el protocolo del fabricante (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; EE.UU.) y el ADN fue precipitado.

Un vector pUC19 modificado (denominado pStuc) fue utilizado para clonar la fracción de 1,8-2,2 kb. En este vector, el fragmento BamHI/SalI de pUC19 fue reemplazado por un fragmento de ADN conteniendo sitios de restricción de StuI, SpeI y SalI utilizando dos cebadores oligonucleotídicos y técnicas de clonaje estándar según está descrito por Sambrook y col. (en: Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). La 5 fracción de 1,8-2,2 kb fue ligada a 16C en el vector pStuc digerido con StuI y desfosforilado. La mezcla de ligadura fue utilizada posteriormente para transformar células ultracompetentes Epicurean Coli XL2-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Se cultivaron colonias individuales y se almacenaron en placas de microvaloración de 384 pocillos (100 μl del medio LB conteniendo 100 mg/l de carbenicilina).

Para aislar los clones que representaban la región de ADN solapante de los cósmidos Mi-11 y Mi-10 18 que contenía el gen de resistencia Mi, se utilizaron los fragmentos de PstI de 8,6 y 4,5 kb del clon cosmídico Mi-18 (ver la Figura 4), así como el marcador AFLP PM14, como sondas de hibridación en hibridaciones de colonias. Por lo tanto, réplicas de la cuadrícula de 384 pocillos de los clones en placas de microvaloración fueron estampadas sobre filtros de membrana Gene Scren Plus (DuPont NEN, Boston, MA, EE.UU.) y se dejaron crecer en colonias sobre el medio. Se utilizaron 84 clones positivos para aislar el ADN plasmídico empleando el método de lisis alcalina según está 15 descrito por Ish-Horowicz y col., 1981, Nucl. Acids Res., 9, 2989-2997.

Análisis de la secuencia

Se utilizó el kit "ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" para llevar a cabo las reacciones de secuenciación en un sistema Gene-Amp PCR Modelo 9600 (Perkin-Elmer, Foster City, CA, EE.UU.). Se utilizaron cebadores directos e inversos de M13 estándar. Los productos de reacción fueron analizados en 20 geles de 48 cm de un ABI PRISM 377. La secuencia de ADN de 84 clones seleccionados fue determinada utilizando los cebadores de secuenciación directos e inversos estándar. El ensamblaje y el análisis de la secuencia se realizó con la versión de 1994 del programa de análisis de secuencias STADEN (Dear y Staden, 1991, Nucl. Acids Res., 19, 3907-3911). Pudo formarse una secuencia de ADN contigua de aproximadamente 9,9 kb de nucleótidos y está mostrada en la Figura 5. Pudo deducirse un marco de lectura abierto grande de 3621 nucleótidos (ORF2) que codificaba un polipéptido 25 truncado de 1206 aminoácidos (Figura 7B).

EJEMPLO 12: INFECCIÓN POR NEMATODOS DE LOS NUDOS DE LA RAÍZ: INOCULACIÓN DEL SUELO

Suelo infectado con el nematodo del nudo de la raíz Meloidogyne incognita fue preparado como sigue: se cortaron en trozos sistemas de raíces de plantas de tomate altamente infectadas con un gran número de agallas (o nudos de la raíz), y se mezclaron con tierra fresca. 30

Se sembraron semillas o se transfirieron pequeñas plántulas con raíz al suelo infectado. Las plantas se desarrollaron en un invernadero a una temperatura de 25C. Después de 4 a 8 semanas, las plantas fueron arrancadas cuidadosamente del suelo y las raíces fueron lavadas con agua con el fin de eliminar la tierra adherida. Se determinó el nivel de infección contando el número de agallas formadas.

Las plantas fueron consideradas resistentes cuando eran visibles tres agallas o menos en las 35 raíces. Las plantas fueron consideradas susceptibles cuando se formaron más de tres agallas en el sistema radicular.

EJEMPLO 13: ANÁLISIS DE COMPLEMENTACIÓN

Identificación de cósmidos con el gen de resistencia Mi mediante selección por resistencia de las progenies autofecundadas de las plantas transformadas.

Los regenerantes primarios (generación R0) de los experimentos de transformación fueron 40 cultivados en el invernadero para que produjeran semillas. Para cada cósmido, se cultivaron de diez a quince regenerantes y se recogieron las semillas R1. Las líneas R1 de al menos 7 plantas R0 de cada cósmido fueron analizadas para determinar su resistencia frente a Meloidogyne incognita con el fin de identificar cósmidos con el de resistencia. De 20 a 30 plantones o plántulas de cada línea R1 fueron inoculados y evaluados según se describió en el Ejemplo 12.

En total se analizaron 63 líneas R1 de 7 diferentes transformaciones cosmídicas; 6 cósmidos que 45 llevaban el inserto de ADN del tomate y un cósmido, pJJ04541, sin el inserto de ADN de tomate. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Cincuenta y cuatro plantas R0 transgénicas parecían ser susceptibles, ya que se formaron agallas en los sistemas de raíces de todas las plantas R1 analizadas. Nueve plantas R0 se consideraron resistentes, ya que por lo menos la mitad de las plantas de cada línea R1 tuvieron tres agallas o menos. Una línea R1 fue completamente resistente, seis líneas R1 se segregaron en una proporción de aproximadamente 3:1 (plántulas resistentes respecto a 50 susceptibles), y las progenies de dos plantas R0 se segregaron 1:1. Las nueve plantas R0 resistentes derivaban todas de transformaciones con el cósmido Mi-11.

La evidencia genética adicional de la presencia del gen de resistencia Mi en el cósmido Mi-11 se obtuvo en la siguiente generación. Las plantas R1 resistentes fueron autofecundadas. Catorce de las líneas R2 resultantes, que se originaron de cuatro plantas R0 diferentes, fueron analizadas para determinar su resistencia frente a M. 55 incognita. De veinte a treinta plantones de cada línea R2 fueron inoculados y evaluados según se describió en el Ejemplo 12. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Cinco líneas R2 fueron completamente resistentes, indicando que las

plantas R1 parentales eran homocigotas para el gen de resistencia Mi. Ocho líneas R2 se segregaron en una proporción de 3:1, indicando que sus plantas R1 parentales eran heterocigotas para el gen de resistencia Mi. Una línea R2 se segregó en una proporción de aproximadamente 1:1, y ninguna de las líneas analizadas parecía ser completamente susceptible. Estos resultados demuestran que las plantas R1 seleccionadas, las cuales derivan de varias plantas transformadas con el cósmido Mi-11, contienen el gen de resistencia Mi funcional. 5

TABLA 2

Cósmido: Número de líneas R1 de plantas R0 independientes analizadas

: Total Proporción de segregación R:S (resistentes respecto a susceptibles)


: 1:0 3:1 1:1 0:1

Mi-32: 7 0 0 0 7

Mi-30: 9 0 0 0 9

Mi-11: 9 1 6 2 0

Mi-18: 8 0 0 0 8

Mi-01: 10 0 0 0 10

Mi-14: 9 0 0 0 9

pKK04541: 11 0 0 0 11

TABLA 3

Cósmido: Número de líneas R2 de plantas R1 independientes analizadas


: 1:0 3:1 1:1 0:1

Mi-1: 14 5 8 1 0

EJEMPLO 14: ENSAYO DE INFECCIÓN CON EL ÁFIDO DE LA PATATA 10

Se inocularon plantas pequeñas de tomate (4 semanas de edad) con el áfido de la patata (Macrosiphum euphorbiae) colocando de cinco a ocho áfidos hembra sobre las hojas. Las plantas fueron cultivadas en el invernadero a una temperatura de 18 a 20C. Después de una a dos semanas, se determinó el nivel de resistencia contando el número de áfidos recién nacidos.

Las plantas fueron consideradas resistentes cuando no estaban presentes áfidos vivos en el tallo o 15 en las hojas. Las plantas eran susceptibles cuando estaban presentes áfidos recién nacidos.

EJEMPLO 15: ANÁLISIS DE COMPLEMENTACIÓN

Identificación de cósmidos con el gen de resistencia Meu-1 mediante selección por resistencia de las progenies autofecundadas de plantas transformadas.

Un subgrupo de las líneas R1 obtenidas en el Ejemplo 13 fue analizado para determinar su 20 resistencia frente a Macrosiphum euphorbiae con el fin de identificar cósmidos con el gen de resistencia Meu-1. De diez a quince plántulas de cada línea R1 fueron inoculadas y evaluadas según se describió en el Ejemplo 14. En total, se analizaron 41 líneas R1 de 7 diferentes transformaciones cosmídicas; 6 cósmidos que llevaban el inserto de ADN del tomate y un cósmido, pJJ04541, sin el inserto de ADN del tomate. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Treinta y seis plantas R0 transgénicas se consideraron susceptibles, ya que docenas de áfidos proliferaron en todas o en la mayoría de las plantas de cada línea R1. Cinco plantas R0 son resistentes, ya que por lo menos la mitad de las plantas de cada línea R1 no tuvieron áfidos vivos. Estas 5 plantas R0 resistentes habían sido todas transformadas con el cósmido Mi-11.

Los resultados obtenidos indican firmemente que las plantas R0 que derivan de transformaciones con el cósmido Mi-11, contienen un gen de resistencia Meu-1 funcional. 30

TABLA 4

Cósmido: Número de líneas R1 de plantas R0 independientes analizadas


: 1:0 3:1 1:1 0:1

Mi-32 Mi-30 Mi-11 Mi-18 Mi-01 Mi-14 pJJ04541: 4 7 7 7 6 5 5 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 4 7 2 7 6 5 5

Una evidencia genética adicional de la presencia del gen de resistencia Meu-1 en el cósmido Mi-11 se obtuvo en la siguiente generación. Veinticuatro líneas R2 que habían sido obtenidas de autofecundaciones de plantas R1 resistentes a nematodos (ver el Ejemplo 13), que se originaron de nueve plantas R0 diferentes, fueron analizadas para determinar su resistencia frente a M. euphorbiae. De once a quince plantones de cada línea R2 fueron inoculados y 5 evaluados según se describió en el Ejemplo 14. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Una línea R2 se segregó en una proporción de 3:1 y 8 líneas R2 se segregaron en una proporción de aproximadamente 1:1. En estas nueve líneas, el fenotipo de resistencia al áfido de la patata es claramente visible. Cinco líneas R2 parecían ser completamente susceptibles. Las diez líneas R2 restantes tuvieron una clasificación intermedia: se segregaron en una proporción de aproximadamente 1:3. Estos resultados indican que varias plantas R1, que son resistentes a Meloidogyne incognita y que 10 derivan de plantas R0 transformadas con el cósmido Mi-11, tienen un gen de resistencia Meu-1 funcional.

Además, ocho líneas R1BC que fueron obtenidas de plantas R1 resistentes a nematodos retrocruzadas con la línea de tomate susceptible 52201, fueron analizadas para determinar su resistencia frente a M. euphorbiae, con el fin de confirmar la herencia del gen de resistencia Meu-1 introgresado. De doce a quince plantones de cada línea R1BC fueron inoculados y evaluados según se describió en el Ejemplo 14. Los resultados se muestran en la 15 Tabla 6.

Las proporciones de segregación mostradas en la Tabla 5 y en la Tabla 6 sirven solamente para ilustrar la herencia del fenotipo de resistencia.

TABLA 5

Cósmido: Número de líneas R2 de plantas R1 independientes analizadas

Total: Proporción de segregación R:S (resistentes respecto a susceptibles)


: 1:0 3:1 1:1 1:3 0:1

Mi-11: 24 0 1 8 10 5

20

TABLA 6

Cósmido: Número de líneas R1BC de plantas R1 independientes analizadas

Total: 1:0 3:1 1:1 1:3 0:1

Mi-11: 8 0 1 5 2 0

EJEMPLO 16: CONSTRUCCIÓN DE MAPAS DE LOS TRANSCRITOS

Se realizaron estudios de construcción de mapas de los transcritos para crear un mapa de los extremos 5' y 3' del gen de resistencia Mi y para determinar si el gen de resistencia Mi contiene algún intrón. La reacción 25 en cadena de la polimerasa para amplificar partes de los transcritos del gen de resistencia Mi fue utilizada para este fin.

El ARN total del tejido de hojas del cultivo de tomate resistente E22 fue aislado de acuerdo con el método del fenol caliente según está descrito por Sambrook y col. (en: Molecular cloning: a laboratory manual, 1989,

Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se aisló el ARN poli A+ utilizando oligo(dT) biotinilado unido a Dynabeads M-280 Streptavidin (DYNAL A.S., Oslo, Noruega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se construyó una biblioteca de ADNc utilizando el kit "Superscript Rnase H Reverse Transcriptase cDNA" de Life Technologies, Inc, Gaithersburg, MD, EE.UU. y el protocolo suministrado por el fabricante.

Se obtuvieron los productos RACE 5' y 3' utilizando el kit de amplificación de ADNc Marathon de 5 Clontech (Palo Alto, CA, EE.UU.). Los cebadores utilizados fueron diseñados sobre la base de la secuencia genómica de Mi, y especialmente del extremo 5' de la secuencia codificadora de ORF2. Posteriormente, los diferentes fragmentos 5' y 3'-RACE fueron clonados en el vector de clonaje TA pCRII (Invitrogen Corporation, San Diego, CA, EE.UU.) y secuenciados utilizando protocolos estándar. Las secuencias de nucleótidos obtenidas fueron alineadas con la secuencia genómica de 9,9 kb y pudieron deducirse dos secuencias intrónicas para el extremo 5' del gen de resistencia Mi. Un 10 intrón de 1306 nucleótidos estaba ubicado desde el nucleótido en posición 1936 al nucleótido en posición 3241 y el segundo desde el nucleótido en posición 3305 al 3379 (Figura 5).

El transcrito de Mi más grande detectado con el kit de amplificación de ADNc Marathon mapea en la posición de nucleótido 1880. Por lo tanto, concluímos que el sitio de inicio de la transcripción de Mi está ubicado en o corriente arriba del nucleótido 1880. El primer codón ATG que pudo ser detectado dentro del ADNc 5' estaba situado en 15 la posición de nucleotídica 3263, 52 nucleótidos corriente arriba del segundo intrón, y pudo deducirse un marco de lectura abierto grande (ORF1) que codificaba un polipéptido de 1257 aminoácidos y está mostrado en la Figura 7A. Como resultado, este segundo intrón está ubicado entre el aminoácido 14 y el 15 del producto del gen de resistencia Mi.

EJEMPLO 17: ANÁLISIS POR PCR DE PLANTAS TRANSFORMADAS CON Mi-11 Y Mi-18

Los datos obtenidos del análisis de complementación en raíces de plantas transformadas (Ejemplo 20 10) indicaban que el gen de resistencia Mi estaba ubicado en un segmento de ADN que solapaba entre los cósmidos Mi-11 y Mi-18, excluyendo el segmento de ADN correspondiente al cósmido Mi-30, cuyos transformantes eran todos susceptibles. Se calculó que esta región tenía alrededor de 12 kb. Sin embargo, en el análisis de complementación de las progenies autofecundadas de las plantas transformadas, solamente las plantas transformadas con el cósmido Mi-11 fueron clasificadas como resistentes (Ejemplos 13 y 15). Para resolver la cuestión de porqué las plantas transformadas 25 con Mi-18 eran susceptibles, se realizó un análisis de PCR en presencia o ausencia del supuesto ORF de Mi en las plantas transformadas con Mi-11 y Mi-18.

Se analizaron las siguientes muestras de ADN:

1. Clon 2/1256 de YAC.

2-3. Cósmido Mi-11 en E. coli y en A. tumefaciens, respectivamente. 30

4-5. Cósmido Mi-18 en E. coli y en A. tumefaciens, respectivamente.

6. Línea de tomate E22 (resistente).

7. Línea de tomate 52201 (susceptible).

8-12. Cinco plantas transformadas con el cósmido Mi-11.

13-17. Cinco plantas transformadas con el cósmido Mi-18. 35

El ADN fue digerido con PstI y se ligaron adaptadores de PstI. Posteriormente, se realizó un análisis de PCR con un cebador que identificaba el sitio de PstI y tres nucleótidos selectivos adicionales o marcador PM14 y varios cebadores de PCR ubicados corriente arriba de PM14 utilizando el enzima polimerasa rTh (kit Gene Amp XL PCR; Perkin Elmer). Los productos generados variaban en tamaño desde 443 a 6110 pb y abarcan la región corriente arriba de PM14 completa del supuesto ORF de Mi (ver la Figura 6). 40

Parecía que todos los moldes generaron productos de PCR del tamaño esperado, con la excepción de las cinco plantas transformadas con el cósmido Mi-18. Solamente se formó el producto de PCR más pequeño (443 pb). Estos datos indican que la región corriente arriba de PM14 casi completa no estaba presente en las plantas transformadas con el cósmido Mi-18. Estas deleciones no tienen lugar con el cósmido Mi-18 presente en E. coli o A. tumefaciens, sino que ocurren solamente en las plantas transformadas. Por lo tanto, concluímos que estas deleciones 45 son responsables del fenotipo susceptible a Meloidogyne incognita y/o a Macrosiphum euphorbiae de las plantas transformadas con Mi-18.

EJEMPLO 18: SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DEL CÓSMIDO Mi-11

La observación de que solamente las plantas transformadas con el cósmido Mi-11 mostraban un fenotipo resistente, podría indicar que los marcos de lectura abiertos adicionales presentes en Mi-11 pueden ser candidatos para codificar resistencia frente a nematodos y/o áfidos. Por lo tanto, la secuencia de nucleótido de la región corriente arriba del ORF1 postulado fue determinada para identificar marcos de lectura abiertos adicionales.

Un grupo de subclones aleatorios con un tamaño de inserto de 2 kb fueron aislados utilizando los fragmentos de PstI de 2,1, 4,7 y 2,9 kb del clon cosmídico Mi-11 como sondas de hibridación en la hibridación de

colonias, esencialmente como se describió en el Ejemplo 11.

Cuarenta y nueve clones positivos fueron utilizados para determinar la secuencia de ADN utilizando los cebadores de secuenciación directos e inversos estándar. El ensamblaje de la secuencia y el análisis se realizaron según se describió en el Ejemplo 11.

Pudieron deducirse tres tramos contiguos de ADN con tamaños de 5618 pb (con25), 898 pb 5 (con10) y 2495 pb (con62). Los huecos entre estos tramos de ADN y la secuencia de ADN de 9870 pb que contenía el supuesto ORF de Mi (Figura 6) fueron calculados utilizando PCR y variaban entre 50 y 200 pb.

Los tres contigs determinados (con25, con10 y con62) fueron analizados para determinar la distribución de codones de parada en los seis marcos posibles. No se pudo postular ningún marco ORF significativo con un tamaño de o superior a 120 aminoácidos. Además, no se detectó ninguna homología de ADN con el supuesto ORF1. 10 Por tanto, el único ORF significativo presente en el cósmido Mi-11 era ORF1 según se describe en la Figura 5. Sobre la base de estos resultados, puede concluirse que el polinucleótido codificado por ORF1 confiere resistencia a nematodos, así como a áfidos y, por lo tanto, que el gen de resistencia Mi y el gen de resistencia Meu-1 se refieren a la misma secuencia codificadora que la representada en la Figura 5.

EJEMPLO 19: TRANSFORMACIÓN DE TABACO Y ANÁLISIS DE COMPLEMENTACIÓN 15

Transformación del tabaco

El cultivo de tabaco Petit Havana, tipo SR1, fue transformado con el cósmido Mi-11 o con el vector cosmídico pJJ04541, utilizando el protocolo descrito por Horsch y col. (Science, 227, 1229-1231, 1985).

Análisis de complementación: selección por resistencia a nematodos en cultivos de raíces de plantas de tabaco transformadas 20

Se sometieron raíces de plantas de tabaco R0 transformadas cultivadas in vitro al ensayo de enfermedad según se describió en el Ejemplo 1. De cada uno de los 31 transformantes se analizaron dos o más explantes de raíz. Además, los 17 transformantes con Mi-11 fueron todos analizados mediante PCR para determinar la presencia del supuesto ORF1 de Mi, seleccionando por un fragmento interno con un tamaño de 823 pares de bases (que se extendía desde el nucleótido en posición 4824 al 5646, ver la Figura 5). Los cebadores de PCR simple para el 25 fragmento fueron deducidos a partir de la secuencia mostrada en la Figura 5. Los cebadores utilizados tienen las siguientes secuencias:

Cebador S21: 5'-CCAAGGACAGAGGTCTAATCG-3'

Cebador S22: 5'-TTGAGGTGATGTGGTAAATGG-3'

El cebador S21 está dirigido a la secuencia desde el nucleótido en posición 4824 al 4844 y el 30 cebador S22 está dirigido a la secuencia desde el nucleótido en posición 5626 al 5646 (ver la Figura 5).

Los resultados del ensayo de enfermedad in vitro y del análisis por PCR (presencia "+" o ausencia "—" del fragmento de PCR interno) se muestran en la Tabla 7. "Mi-11" representa plantas transformadas que contienen el supuesto ORF1 de Mi y "Mi-11Δ" representa aquellas plantas transformadas que tienen una deleción en el supuesto ORF1 de Mi, según se determinó por el análisis de PCR (descrito anteriormente). Veintinueve transformantes R0 eran 35 susceptibles, ya que se habían formado agallas en al menos uno de los cultivos de raíces analizados. Generalmente, el índice de formación de agallas en las raíces de tabaco es ligeramente menor que en las raíces de tomate susceptible. Dos plantas R0 se clasificaron como resistentes a Meloidogyne incognita, ya que no pudieron encontrarse agallas en los cultivos de raíces. Ambas plantas resistentes fueron transformadas con el cósmido Mi-11 que contenía el fragmento de PCR interno que indicaba la presencia del gen de resistencia Mi. 40

TABLA 7

Genotipo: Fragmento de PCR Plantas R0

Resistentes: Susceptibles

Mi-11 Mi-11Δ pJJ04541: + - - 2 0 0 7 8 14

Análisis de complementación: selección por resistencia a áfidos en esquejes de plantas de tabaco transformadas

Se inocularon y evaluaron esquejes con raíces de plantas R0 transformadas de tabaco según se 45 describió en el Ejemplo 14. De cada uno de los 23 transformantes se analizaron dos o tres cortes para determinar su

resistencia frente a Macrosiphum euphorbiae. Los resultados del ensayo de infección y del análisis de PCR (como se describió anteriormente) se muestran en la Tabla 8. Veintiún plantas R0 se consideraron susceptibles, ya que se contaron varios áfidos vivos en al menos uno de los esquejes analizados. En general, el nivel de proliferación de los áfidos en el tabaco es bajo comparado con la proliferación en plantas de tomate susceptibles. Dos plantas R0 se clasificación como resistentes, ya que todos los esquejes de estas plantas estuvieron sin áfidos vivos. Las plantas resistentes a áfidos 5 fueron transformadas con el cósmido Mi-11, que contenía el gen de resistencia Mi, según está indicado por la presencia del fragmento de PCR interno.

TABLA 8

Genotipo: Fragmento de PCR Plantas R0

Resistentes: Susceptibles

Mi-11 Mi-11Δ pJJ04541: + - - 2 0 0 3 6 12

EJEMPLO 20: TRANSFORMACIÓN DE LA PATATA Y ANÁLISIS DE COMPLEMENTACIÓN 10

Transformación de la patata

La variedad de patata Diamant (Cebeco Zaden, B.V., Vlijmen, Países Bajos) fue utilizada para la transformación. Se transformaron explantes entre nudos de plantas cultivadas in vitro con el cósmido Mi-11 o con el vector cosmídico pJJ04541 utilizando el protocolo descrito por Ooms y col. (Theor. Appl. Genet., 73, 744-750).

Análisis de complementación: selección por resistencia a nematodos en cultivos de raíces de plantas 15 transformadas

Raíces de plantas de patata R0 transformadas cultivadas in vitro fueron sometidas al ensayo de enfermedad según se describió en el Ejemplo 1. De cada uno de los 31 transformantes se analizaron al menos 2 explantes de raíz. Además, los 26 transformantes con Mi-11 fueron analizados mediante PCR utilizando los cebadores S21 y S22 según se describió en el Ejemplo 19. Los resultados del ensayo de enfermedad in vitro y del análisis por PCR 20 (presencia "+" o ausencia "—" del fragmento de PCR interno) se muestran en la Tabla 9. "Mi-11" representa plantas transformadas que contienen el supuesto ORF1 de Mi y "Mi-11Δ" representa aquellas plantas transformadas que tienen una deleción en el supuesto ORF1 de Mi, según se determinó mediante el análisis por PCR (descrito anteriormente). Veintiocho transformantes R0 fueron susceptibles, ya que se formaron agallas en al menos uno de los cultivos de raíces. Generalmente, la tasa de formación de agallas en raíces de patata es menor que en raíces de tomate susceptibles. Tres 25 plantas R0 se clasificaron como resistentes a Meloidogyne incognita, ya que no pudieron encontrarse agallas en los cultivos de raíces. Todas estas plantas resistentes fueron transformadas con el cósmido Mi-11 que contenía el fragmento de PCR interno que indicaba la presencia del gen de resistencia Mi.

TABLA 9

Genotipo: Fragmento de PCR Plantas R0

Resistentes: Susceptibles

Mi-11 Mi-11Δ pJJ04541: + - - 3 0 0 17 6 5

30

Análisis de complementación: selección por resistencia a nematodos de esquejes de plantas transformadas

Esquejes con raíces de plantas R0 de patata transformadas con Mi-11 fueron sometidos al ensayo de enfermedad según se describió en el Ejemplo 12. De cada uno de los 19 transformantes, se analizaron de uno a tres esquejes para determinar su resistencia frente a Meloidogyne incognita. Los resultados se muestran en la Tabla 10. Además, se analizaron 36 esquejes con raíces de plantas de patata no transformadas (variedad Diamant) (como 35 controles susceptibles) y todos fueron susceptibles. Una planta R0 fue clasificada como Meloidogyne incognita, ya que no pudieron encontrarse agallas en el sistema radicular.

TABLA 10

Genotipo: Fragmento de PCR Plantas R0

Resistentes: Susceptibles

Mi-11 Mi-11Δ Control no transf.: + - - 1 0 0 12 6 1

LISTADO DE SECUENCIAS

(1) INFORMACIÓN GENERAL

(i) SOLICITANTE: 5

(A) NOMBRE: KEYGENE, N.V.

(B) CALLE: Agrobusiness Park, 90

(C) CIUDAD: WAGENINGEN

(E) PAÍS: Países Bajos

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6700 AE 10

(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RESISTENCIA FRENTE A PLAGAS DE LAS PLANTAS

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

(iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A) TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

(B) ORDENADOR: IBM PC compatible 15

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D) PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO)

(v) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

NÚMERO DE SOLICITUD: EP XXXXXXXXXX

(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: 20

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/EP 97/04340

(B) FECHA DE REGISTRO: 08-AGOSTO-1997

(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96401764.4

(B) FECHA DE REGISTRO: 09-AGOSTO-1996 25

(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97401101.7

(B) FECHA DE REGISTRO: 16-MAYO-1997

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1: 5

GACTGCGTAC ATGCAGNN 18

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 10

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2: 15

GATGAGTCCT GAGTAANNN 19

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 20

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3: 25

CTCGTAGACT GCGTACATGC A 21

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 14 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 30

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4: 35

CATCTGACGC ATGT 14

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 16 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO” 5

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

GACGATGAGT CCTGAG 16

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 14 pares de bases 10

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO” 15

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

TACTCAGGAC TCAT 14

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 16 pares de bases 20

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO” 25

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

GACTGCGTAC ATGCAG 16

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 16 pares de bases 30

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO” 35

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

GATGAGTCCT GAGTAA 16

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico 5

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

GACTGCGTAC ATGCAGGA 18

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10

(A) LONGITUD: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico 15

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

GATGAGTCCT GAGTAATCT 19

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A) LONGITUD: 16 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico 25

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

GACTGCGTAC CAATTC 16

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30

(A) LONGITUD: 16 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico 35

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

GATGAGTCCT GAGTAA 16

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal 5

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

CCAAGGACAG AGGTCTAATC G 21

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal 15

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “OLIGONUCLEÓTIDO”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

TTGAGGTGAT GTGGTAAATG G 21

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15: 20

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 9870 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal 25

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 3263..3304

(ix) CARACTERÍSTICA: 30

(C) NOMBRE/CLAVE: CDS

(D) LOCALIZACIÓN: 3380..7108

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

TTTTCCTCTT CATATAACTT TTTCCTTAAC CCCTCTCATG AATAATATAA TTGATGTGGA 60

TAAAGTATTA TCCTTTATGA TAAATAACGA AATTTAATAA TTTAAAGGGT GCAAATCTAT 120 35

AAAATGGAGA CGCACATTGA TAATGTCCTC TTGATTATTA TTAAAGAATT ACTCTAGCTT 180

CACAAATTTA AATTCATTAA TGCTTAATTA CATGATAAAA ACTTTAGTTG TTCTTTTTAC 240

ATGGTTTGCT AACTTTAATT TTTTTTCTTC ATATTCTTCA TTTGTTTATT ATTATTTTCT 300

AATTACTTAT TTAACTTTTA TACTCTTAAT ATTCATAACT CTCATCTTTT CATATTCATA 360

ACCTCCAAAT ATTTAAACTA AAACTTTAAG ATATCTTTTG ATATTTGTTC AATAATAAAT 420

TCAACTTCTT TATCTTATGA AACCCCTACC AAGATTATTA GGCTATTATT TTTTATTCTA 480

TAGTAAAAAC AAATGATGAA GATTCTTGAA TTTTATAGGA TATGAAAGAA GTCGATAAAA 540

TCTCAGAGAG TTATGTACTA ATTTTGTACT TATTTTTTCA TCTATATATA CATAAATCTT 600

ATAAGAATAA TGTCTATATT GTATTTTTTT CTTAAATATT ATGTTTCTTT TTAATTTTTT 660 5

TTCACTCTGT TAGACTTCTT AATTTAGTTT TCTATGAATG TTTTATTGCC GTAAGTCTTT 720

GAATTTTGTA ATTGTTACAT TTTATTATTC ATTACGATTT ACATATATAT TTCCATGAGA 780

TTTGGTCATT CTAACGTATC TATAAAAATT CACATGAAAC ACACGTGTGA AGCGCATCCT 840

CAGAAAAACT AGTGTATATA TATATATATA TATATATATA TATATATATA TATATATATA 900

TATATATATA TATATATATA TATATATTAT TCTTATTAAA AAAGAATGTC CTTATTTCAT 960 10

TTTTAATCTG GTTAAAAAAG AATAATCTCT TTCCTTTTTT GACAATATTT TAACTTTAAC 1020

TTTCCACGTA ACATGTTTAA GACAACAAAA TTAAATGACA TTTTAATCTT GTAACATAGA 1080

AAAGTAACAT ATGATAATTG TCGTTGTCCC TAAACATGAT AGATGTATAA TTCAAAAGTC 1140

AATGAATTGT ATTTTAGTAT TATATTATGA ATGAACAAAC TGTCAAGATG TGTATATATA 1200

TATATATTTT ATTCTTGTTA ATTTGGCCTT TCAAGTAATT AATTCATTGT TAGGCAGTTG 1260 15

AATTAATAAT CTCTTTTAGG AATCTTCCCA TGTGAATAAC AAGACTTATA ATAATAATAA 1320

TAAAGTCCAG ATCTTGTTTC AATTGGATCA TTTGGCAAAC AATTACTCTG TTTCTGAAAC 1380

AAGGAATAGG GCTTCTAATA TTGTAGGGGA TTTTTTTTTC TTCATTAATT TATACTTATG 1440

ATATTAATTA TTGTTTTTGA GTACATATTT TAAACTCTGT TGTTTATTTT TCTGCAAAGT 1500

TTCTCCGGTT ATATTGAACA TATACACATA TAGTACATAT ATTTATTGTA AAAAAAATAA 1560 20

TTATTATACT CCATTTCAAG AAATTATGTT TTGATATTAT ATATTAAATT CTATAATGTG 1620

GAAATTGTCA ATGTCTACAA TGTGTTTGAT GAAATGACAA CCACTTGTTT TTATCTGCAA 1680

CAGTATAAAA ATTGGCTTTG CTTCTTTTAG ATTAATATAA TATTTTACAG GTCACATATT 1740

ATATTTATAT TGTGAAAGAC AAGAGATATT GATTAAAAAA AGACTTATGG GTTTGTATTT 1800

TAATATTTCA TTCTTCTTCA TTACTAAAAG ACTTGTATCG TATATTTCAA CTACTACACT 1860 25

TGTTTTCTTA TCCAATAGCT TCAACATTAT TTCTCAAACA AAGGGTTCTC TAGCTAAACT 1920

TCAGCCTGTG TAAAGGTAAC ATCTTCTTTA TTCACAGCAT AATAACAATG AATTTGGTCG 1980

ATGTTTGAAG TAAGCTTGAA ATTTTCTCTT TCTAAGTTTG TTTGATCCAT TTAGATTCTT 2040

TTAAATACTT TTGGTATTTA AAGGACTTGT GAAGTCAATG AATTGTATTT TAGTAATCTT 2100

GCAATTCTAG ATCTAGCTAT TTGTTGTTCT CCTTTCAACC AAACTACTTC TTCAATTTGT 2160 30

CTAACAAAAA TATGTCAAAA AGGTATGAAC ATGCTTAATC GGAGATCTTT ATTGATTCTA 2220

CTTCAGCTAC TCTAAAAAAA AATCTTTTTT CCATTAAGCC CAAGTCGAGA TAGGAGAAAA 2280

ATATTATTAG AGAGATTATT AATTTAATGA CATTTTACTC TAGTTTTTTA TCAAAATAAG 2340

GGAATAATAT CCTGTTATTT AACTACCTTT TAAGCATTAT GGGTGGAAAG TAGAAAGAAG 2400

AAACATAACA GAACAGACAG TAAGTTATGC TTTAATGAGT AGATCTGTAT AGGATTACAT 2460 35

ATTTGTTTGA CTTTTCGGTG TTTCGATTAG AAAACTTACA AGTTTTTAAT ACATGTATCA 2520

TTTGTTGATT TGTCCGTTTG GCACGTCATC TGTGGTTACA AGTCACATAT GAAGTATGTC 2580

CACGAGACAC ACCGAATGTC AAGTATAGAT TTCTACTTGA TCATACACAA CTTTATCTGA 2640

GGTTGATGCC AAATTTAAAT GACTACCTAA AGCTGATATT TTAAACATTA ATCTTGTACA 2700

CGAAAACATT ATTCCTATTA CTGTTTTCTT TACCTTTACC TTATAGACTT TTTTGGCAGA 2760

AAAAAGTTAG ACAGATACAT TTGATGATGT TTACCATTCT CATTCTCTCT TTATTTTATT 2820

TTCTTTACAT TCACACGCAC AATAATTTTC TTGTAGGTTC CTTATATGCC ATATGCACAT 2880

AGACGAATCT AGGATTTGAT ATTTACAAGT TTCTATGTCG ACGTCATATT AATATCAATA 2940

ATAATTAGAT TGACAATCAC ATATTTATAA TATTAAGTCG ATAACTTTCT TCTTTGTATA 3000 5

GGTTGGAAAA GTAATGGTAA ACGAGCAGGA CTCCTTTTTC TTTTTTTTGT AAATAATTAA 3060

CAGTTGTGAG ATTTTATGTT TGTGACTTCA TGTCATAAAC ATTTTGATGT GTGATTAAGA 3120

TTGACATTTC CAATTGTGCG AGTCTAAAAT TACTATATGT GAAAATAGTG ATATTATTGA 3180

TTATTCGTAT TTTTTCATCT TCTTTCTCCT GTTAAAGTTT TATCTACTTT TTATTCATCA 3240

GGTCTTGAGA AAAAGTAGAA TC ATG GAA AAA CGA AAA GAT ATT GAA GAA GCA 3292 10

Met Glu Lys Arg Lys Asp Ile Glu Glu Ala

1 5 10

AAC AAC TCA TTG GTATGTTATT TTATAGAGTA AACTGTAAAG TATTGAATTA 3344

Asn Asn Ser Leu

TAGATATGTG GCTTTAAAAT GTATTATTTT GGCAG GTG TTA TTT TCT GCT CTT 3397 15

Val Leu Phe Ser Ala Leu

1 5

AGC AAG GAC ATT GCC AAT GTT CTA ATT TTC CTA GAG AAT GAG GAA AAT 3445

Ser Lys Asp Ile Ala Asn Val Leu Ile Phe Leu Glu Asn Glu Glu Asn

10 15 20 20

CAA AAA GCT CTT GAC AAA GAT CAA GTT GAA AAG CTA AAA TTG AAA ATG 3493

Gln Lys Ala Leu Asp Lys Asp Gln Val Glu Lys Leu Lys Leu Lys Met

25 30 35

GCA TTT ATT TGT ACA TAT GTT CAG CTT TCT TAT TCC GAT TTT GAG CAG 3541

Ala Phe Ile Cys Thr Tyr Val Gln Leu Ser Tyr Ser Asp Phe Glu Gln 25

40 45 50

TTT GAA GAT ATA ATG ACT AGA AAT AGA CAA GAG GTT GAG AAT CTG CTT 3589

Phe Glu Asp Ile Met Thr Arg Asn Arg Gln Glu Val Glu Asn Leu Leu

55 60 65 70

CAA TCA CTT TTG GAT GAT GAT GTC CTT ACT AGC CTC ACC AGT AAT ATG 3637 30

Gln Ser Leu Leu Asp Asp Asp Val Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asn Met

75 80 85

GAT GAC TGT ATC AGC TTG TAT CAT CGT TCT TAT AAA TCA GAT GCC ATC 3685

Asp Asp Cys Ile Ser Leu Tyr His Arg Ser Tyr Lys Ser Asp Ala Ile

90 95 100 35

ATG ATG GAT GAG CAA TTG GAC TTC CTC CTC TTG AAT CTG TAT CAT CTA 3733

Met Met Asp Glu Gln Leu Asp Phe Leu Leu Leu Asn Leu Tyr His Leu

105 110 115

TCC AAG CAT CAC GCT GAA AAG ATA TTT CCT GGA GTG ACT CAA TAT GAA 3781

Ser Lys His His Ala Glu Lys Ile Phe Pro Gly Val Thr Gln Tyr Glu 5

120 125 130

GTT CTT CAG AAT GTA TGT GGC AAC ATA AGA GAT TTC CAT GGG TTG ATA 3829

Val Leu Gln Asn Val Cys Gly Asn Ile Arg Asp Phe His Gly Leu Ile

135 140 145 150

CTG AAT GGT TGC ATT AAG CAT GAG ATG GTT GAG AAT GTC TTA CCT CTG 3877 10

Leu Asn Gly Cys Ile Lys His Glu Met Val Glu Asn Val Leu Pro Leu

155 160 165

TTT CAA CTC ATG GCT GAA AGA GTA GGA CAC TTC CTT TGG GAG GAT CAG 3925

Phe Gln Leu Met Ala Glu Arg Val Gly His Phe Leu Trp Glu Asp Gln

170 175 180 15

ACT GAT GAA GAC TCT CGG CTC TCC GAG CTA GAT GAG GAT GAA CAC AAT 3973

Thr Asp Glu Asp Ser Arg Leu Ser Glu Leu Asp Glu Asp Glu His Asn

185 190 195

GAT AGA GAC TCT CGA CTC TTC CAG CTA ACA CAT CTA CTC TTG AAG ATT 4021

Asp Arg Asp Ser Arg Leu Phe Gln Leu Thr His Leu Leu Leu Lys Ile 20

200 205 210

GTT CCA ACT GAA CTG GAG GTT ATG CAC ATA TGT TAT ACA AAT TTG AAA 4069

Val Pro Thr Glu Leu Glu Val Met His Ile Cys Tyr Thr Asn Leu Lys

215 220 225 230

GCT TCA ACT TCA GCA GAA GTT GGA CGC TTC ATT AAG AAG CTC CTG GAA 4117 25

Ala Ser Thr Ser Ala Glu Val Gly Arg Phe Ile Lys Lys Leu Leu Glu

235 240 245

ACC TCA CCG GAT ATT CTC AGA GAA TAT ATC ATT CAA CTA CAA GAG CAT 4165

Thr Ser Pro Asp Ile Leu Arg Glu Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Glu His

250 255 260 30

ATG TTA ACT GTT ATT CCC CCT AGC ACT TTA GGG GCT CGA AAC ATT CAT 4213

Met Leu Thr Val Ile Pro Pro Ser Thr Leu Gly Ala Arg Asn Ile His

265 270 275

GTC ATG ATG GAA TTC CTA TTA CTT ATT CTT TCT GAT ATG CCC AAG GAC 4261

Val Met Met Glu Phe Leu Leu Leu Ile Leu Ser Asp Met Pro Lys Asp

280 285 290

TTT ATT CAT CAT GAC AAA CTT TTT GAT CTC TTG GCT CAT GTT GGA ACA 4309

Phe Ile His His Asp Lys Leu Phe Asp Leu Leu Ala His Val Gly Thr 5

295 300 305 310

CTT ACC AGG GAG GTA TCG ACT CTT GTA CGT GAC TTG GAA GAG AAA TTA 4357

Leu Thr Arg Glu Val Ser Thr Leu Val Arg Asp Leu Glu Glu Lys Leu

315 320 325

AGG AAT AAA GAG GGT AAT AAC CAA ACA AAT TGT GCA ACC CTA GAC TTG 4405 10

Arg Asn Lys Glu Gly Asn Asn Gln Thr Asn Cys Ala Thr Leu Asp Leu

330 335 340

CTG GAA AAT ATT GAA CTC CTC AAG AAA GAT CTC AAA CAT GTT TAT CTG 4453

Leu Glu Asn Ile Glu Leu Leu Lys Lys Asp Leu Lys His Val Tyr Leu

345 350 355 15

AAA GCC CCA AAT TCA TCT CAA TGT TGC TTC CCC ATG AGT GAT GGA CCA 4501

Lys Ala Pro Asn Ser Ser Gln Cys Cys Phe Pro Met Ser Asp Gly Pro

360 365 370

CTC TTC ATG CAT CTT CTA CAC ATG CAC TTA AAT GAT TTG CTA GAT TCT 4549

Leu Phe Met His Leu Leu His Met His Leu Asn Asp Leu Leu Asp Ser 20

375 380 385 390

AAT GCT TAT TCA ATT TCT TTG ATA AAG GAA GAA ATC GAG TTG GTG AGT 4597

Asn Ala Tyr Ser Ile Ser Leu Ile Lys Glu Glu Ile Glu Leu Val Ser

395 400 405

CAA GAA CTG GAA TTC ATA AGA TCA TTC TTT GGG GAT GCT GCT GAG CAA 4645 25

Gln Glu Leu Glu Phe Ile Arg Ser Phe Phe Gly Asp Ala Ala Glu Gln

410 415 420

GGA TTG TAT AAA GAT ATC TGG GCA CGT GTT CTA GAT GTG GCT TAT GAG 4693

Gly Leu Tyr Lys Asp Ile Trp Ala Arg Val Leu Asp Val Ala Tyr Glu

425 430 435 30

GCA AAA GAT GTC ATA GAT TCA ATT ATT GTT CGA GAT AAT GGT CTC TTA 4741

Ala Lys Asp Val Ile Asp Ser Ile Ile Val Arg Asp Asn Gly Leu Leu

440 445 450

CAT CTT ATT TTC TCA CTT CCC ATT ACC ATA AAG AAG ATC AAA CTT ATC 4789

His Leu Ile Phe Ser Leu Pro Ile Thr Ile Lys Lys Ile Lys Leu ILe

455 460 465 470

AAA GAA GAG ATC TCT GCT TTA GAT GAG AAC ATT CCC AAG GAC AGA GGT 4837

Lys Glu Glu Ile Ser Ala Leu Asp Glu Asn Ile Pro Lys Asp Arg Gly 5

475 480 485

CTA ATC GTT GTG AAC TCT CCC AAG AAA CCA GTT GAG AGA AAG TCA TTG 4885

Leu Ile Val Val Asn Ser Pro Lys Lys Pro Val Glu Arg Lys Ser Leu

490 495 500

ACA ACT GAT AAA ATA ATT GTA GGT TTT GAG GAG GAG ACA AAC TTG ATA 4933 10

Thr Thr Asp Lys Ile Ile Val Gly Phe Glu Glu Glu Thr Asn Leu Ile

505 510 515

CTT AGA AAG CTC ACC AGT GGA CCC GCA GAT TTA GAT GTC ATT TCG ATC 4981

Leu Arg Lys Leu Thr Ser Gly Pro Ala Asp Leu Asp Val Ile Ser Ile

520 525 530 15

ACC GGT ATG CCG GGT TCA GGT AAA ACT ACT TTG GCA TAC AAA GTA TAC 5029

Thr Gly Met Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Tyr Lys Val Tyr

535 540 545 550

AAT GAT AAG TCA GTT TCT AGA CAT TTT GAC CTT CGT GCA TGG TGC ACG 5077

Asn Asp Lys Ser Val Ser Arg His Phe Asp Leu Arg Ala Trp Cys Thr 20

555 560 565

GTC GAT CAA GGA TAT GAC GAC AAG AAG TTG TTG GAT ACA ATT TTC AGT 5125

Val Asp Gln Gly Tyr Asp Asp Lys Lys Leu Leu Asp Thr Ile Phe Ser

570 575 580

CAA GTT AGT GGC TCA GAT TCA AAT TTG AGT GAG AAT ATT GAT GTT GCT 5173 25

Gln Val Ser Gly Ser Asp Ser Asn Leu Ser Glu Asn Ile Asp Val Ala

585 590 595

GAT AAA TTG CGG AAA CAA CTG TTT GGA AAG AGG TAT CTT ATT GTC TTA 5221

Asp Lys Leu Arg Lys Gln Leu Phe Gly Lys Arg Tyr Leu Ile Val Leu

600 605 610 30

GAT GAT GTG TGG GAT ACT ACT ACA TTG GAT GAG TTG ACA AGA CCT TTT 5269

Asp Asp Val Trp Asp Thr Thr Thr Leu Asp Glu Leu Thr Arg Pro Phe

615 620 625 630

CCT GAA GCT AAG AAA GGA AGT AGG ATT ATT TTG ACA ACT CGA GAA AAG 5317

Pro Glu Ala Lys Lys Gly Ser Arg Ile Ile Leu Thr Thr Arg Glu Lys

635 640 645

GAA GTG GCT TTG CAT GGA AAG CTG AAC ACT GAT CCT CTT GAC CTT CGA 5365

Glu Val Ala Leu His Gly Lys Leu Asn Thr Asp Pro Leu Asp Leu Arg 5

650 655 660

TTG CTA AGA CCA GAT GAA AGT TGG GAA CTT TTA GAG AAA AGG ACA TTT 5413

Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ser Trp Glu Leu Leu Glu Lys Arg Thr Phe

665 670 675

GGT AAT GAG AGT TGC CCT GAT GAA CTA TTA GAT GTC GGT AAA GAA ATA 5461 10

Gly Asn Glu Ser Cys Pro Asp Glu Leu Leu Asp Val Gly Lys Glu Ile

680 685 690

GCC GAA AAT TGT AAA GGG CTT CCT TTG GTG GCT GAT CTG ATT GCT GGA 5509

Ala Glu Asn Cys Lys Gly Leu Pro Leu Val Ala Asp Leu Ile Ala Gly

695 700 705 710 15

GTC ATT GCT GGG AGG GAA AAG AAA AGG AGT GTG TGG CTT GAA GTT CAA 5557

Val Ile Ala Gly Arg Glu Lys Lys Arg Ser Val Trp Leu Glu Val Gln

715 720 725

AGT AGT TTG AGT TCT TTT ATT TTG AAC AGT GAA GTG GAA GTG ATG AAA 5605

Ser Ser Leu Ser Ser Phe Ile Leu Asn Ser Glu Val Glu Val Met Lys 20

730 735 740

GTT ATA GAA TTA AGT TAT GAC CAT TTA CCA CAT CAC CTC AAG CCA TGC 5653

Val Ile Glu Leu Ser Tyr Asp His Leu Pro His His Leu Lys Pro Cys

745 750 755

TTG CTT CAC TTT GCA AGT TGG CCG AAG GAC ACT CCT TTG ACA ATC TAT 5701 25

Leu Leu His Phe Ala Ser Trp Pro Lys Asp Thr Pro Leu Thr Ile Tyr

760 765 770

TTG TTG ACT GTT TAT TTG GGT GCT GAA GGA TTT GTG GAA AAG ACG GAG 5749

Leu Leu Thr Val Tyr Leu Gly Ala Glu Gly Phe Val Glu Lys Thr Glu

775 780 785 790 30

ATG AAG GGT ATA GAA GAA GTG GTG AAG ATT TAT ATG GAT GAT TTA ATT 5797

Met Lys Gly Ile Glu Glu Val Val Lys Ile Tyr Met Asp Asp Leu Ile

795 800 805

TCC AGT AGC TTG GTA ATT TGT TTC AAT GAG ATA GGT GAT ATA CTG AAT 5845

Ser Ser Ser Leu Val Ile Cys Phe Asn Glu Ile Gly Asp Ile Leu Asn

810 815 820

TTC CAA ATT CAT GAT CTT GTG CAT GAC TTT TGT TTG ATA AAA GCA AGA 5893

Phe Gln Ile His Asp Leu Val His Asp Phe Cys Leu Ile Lys Ala Arg 5

825 830 835

AAG GAA AAT TTG TTT GAT CGG ATA AGA TCA AGT GCT CCA TCA GAT TTG 5941

Lys Glu Asn Leu Phe Asp Arg Ile Arg Ser Ser Ala Pro Ser Asp Leu

840 845 850

TTG CCT CGT CAA ATT ACC ATT GAT TAT GAT GAG GAG GAG GAG CAC TTT 5989 10

Leu Pro Arg Gln Ile Thr Ile Asp Tyr Asp Glu Glu Glu Glu His Phe

855 860 865 870

GGG CTT AAT TTT GTC ATG TTC GAT TCA AAT AAG AAA AGG CAT TCT GGT 6037

Gly Leu Asn Phe Val Met Phe Asp Ser Asn Lys Lys Arg His Ser Gly

875 880 885 15

AAA CAC CTC TAT TCT TTG AGG ATA AAT GGA GAC CAG CTG GAT GAC AGT 6085

Lys His Leu Tyr Ser Leu Arg Ile Asn Gly Asp Gln Leu Asp Asp Ser

890 895 900

GTT TCT GAT GCA TTT CAC CTA AGA CAC TTG AGG CTT ATT AGA GTG TTG 6133

Val Ser Asp Ala Phe His Leu Arg His Leu Arg Leu Ile Arg Val Leu 20

905 910 915

GAC CTG GAA CCC TCT TTA ATC ATG GTG AAT GAT TCT TTG CTG AAT GAA 6181

Asp Leu Glu Pro Ser Leu Ile Met Val Asn Asp Ser Leu Leu Asn Glu

920 925 930

ATA TGC ATG TTG AAT CAT TTG AGG TAC TTA AGA ATT CGG ACA CAA GTT 6229 25

Ile Cys Met Leu Asn His Leu Arg Tyr Leu Arg Ile Arg Thr Gln Val

935 940 945 950

AAA TAT CTG CCT TTC TCT TTC TCA AAC CTC TGG AAT CTA GAA AGT CTG 6277

Lys Tyr Leu Pro Phe Ser Phe Ser Asn Leu Trp Asn Leu Glu Ser Leu

955 960 965 30

TTT GTG TCT AAC AAA GGA TCA ATC TTG GTA CTA TTA CCG AGA ATT TTG 6325

Phe Val Ser Asn Lys Gly Ser Ile Leu Val Leu Leu Pro Arg Ile Leu

970 975 980

GAT CTT GTA AAG TTG CGA GTG CTG TCC GTG GGT GCT TGT TCT TTC TTT 6373

Asp Leu Val Lys Leu Arg Val Leu Ser Val Gly Ala Cys Ser Phe Phe

985 990 995

GAT ATG GAT GCA GAT GAA TCA ATA TTG ATA GCA AAG GAC ACA AAG TTA 6421

Asp Met Asp Ala Asp Glu Ser Ile Leu Ile Ala Lys Asp Thr Lys Leu 5

1000 1005 1010

GAG AAC TTG AGA ATA TTA GGG GAA CTG TTG ATT TCC TAT TCG AAA GAT 6469

Glu Asn Leu Arg Ile Leu Gly Glu Leu Leu Ile Ser Tyr Ser Lys Asp

1015 1020 1025 1030

ACA ATG AAT ATT TTC AAA AGG TTT CCC AAT CTT CAG GTG CTT CAG TTT 6517 10

Thr Met Asn Ile Phe Lys Arg Phe Pro Asn Leu Gln Val Leu Gln Phe

1035 1040 1045

GAA CTC AAG GAG TCA TGG GAT TAT TCA ACA GAG CAA CAT TGG TTC CCG 6565

Glu Leu Lys Glu Ser Trp Asp Tyr Ser Thr Glu Gln His Trp Phe Pro

1050 1055 1060 15

AAA TTG GAT TGC CTA ACT GAA CTA GAA ACA CTC TGT GTA GGT TTT AAA 6613

Lys Leu Asp Cys Leu Thr Glu Leu Glu Thr Leu Cys Val Gly Phe Lys

1065 1070 1075

AGT TCA AAC ACA AAC CAC TGT GGG TCC TCT GTT GCG ACA AAT CGG CCG 6661

Ser Ser Asn Thr Asn His Cys Gly Ser Ser Val Ala Thr Asn Arg Pro 20

1080 1085 1090

TGG GAT TTT CAC TTC CCT TCA AAT TTG AAA GAA CTG TTG TTG TAT GAC 6709

Trp Asp Phe His Phe Pro Ser Asn Leu Lys Glu Leu Leu Leu Tyr Asp

1095 1100 1105 1110

TTT CCT CTG ACA TCC GAT TCA CTA TCA ACA ATA GCG AGA CTG CCC AAC 6757 25

Phe Pro Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser Thr Ile Ala Arg Leu Pro Asn

1115 1120 1125

CTT GAA AAT TTG TCC CTT TAT GAT ACA ATC ATC CAG GGA GAA GAA TGG 6805

Leu Glu Asn Leu Ser Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Gln Gly Glu Glu Trp

1130 1135 1140 30

AAC ATG GGG GAG GAA GAC ACT TTT GAG AAT CTC AAA TTT TTG AAC TTG 6853

Asn Met Gly Glu Glu Asp Thr Phe Glu Asn Leu Lys Phe Leu Asn Leu

1145 1150 1155

CGT CTA CTG ACT CTT TCC AAG TGG GAG GTT GGA GAG GAA TCC TTC CCC 6901

Arg Leu Leu Thr Leu Ser Lys Trp Glu Val Gly Glu Glu Ser Phe Pro 35

1160 1165 1170

AAT CTT GAG AAA TTA AAA CTG CAG GAA TGT GGT AAG CTT GAG GAG ATT 6949

Asn Leu Glu Lys Leu Lys Leu Gln Glu Cys Gly Lys Leu Glu Glu Ile

1175 1180 1185 1190

CCA CCT AGT TTT GGA GAT ATT TAT TCA TTG AAA TTT ATC AAA ATT GTA 6997

Pro Pro Ser Phe Gly Asp Ile Tyr Ser Leu Lys Phe Ile Lys Ile Val

1195 1200 1205

AAG AGT CCT CAA CTT GAA GAT TCT GCT CTC AAG ATT AAG AAA TAC GCT 7045

Lys Ser Pro Gln Leu Glu Asp Ser Ala Leu Lys Ile Lys Lys Tyr Ala 5

1210 1215 1220

GAA GAT ATG AGA GGA GGG AAC GAG CTT CAG ATC CTT GGC CAG AGG AAT 7093

Glu Asp Met Arg Gly Gly Asn Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Lys Asn

1225 1230 1235

ATC CCC TTA TTT AAG TAGCATTTTG GTTGAACTTT GCTTGGTGAT ATTGTATATG 7148 10

Ile Pro Leu Phe Lys

1240

ATTAAAATAT CCTGTGATGA GATTCCTCTT AGTTTCTTTT AACAAAAAAT ATAATTTTTA 7208

TAAGTACACA TATCGTTTGT TAATTTGTCC ATTTGTGATT GCAAGTCACA CATGAGGTAT 7268

GTTCGTATTA TGGGTTTCAA CTTGATCAGA CGTAATTTTA AGATAAGTGC TTATATGATG 7328 15

TTGCATGCCA GATGGAAGTG ACTATGTGAA GTTTATATTT TAAACATTAA TCTTGTATAC 7388

CAAACTACTA TTCCTATGCT ATGTTGTTTG CCATTGTCGT TCTCTCTTTA TTTTTTTTCT 7448

TTCCATTCAC ACACACATTA ATTTTCTAGT AGACCGCATA TTACTACATC TGTATTGTCC 7508

GTATACAAGA CGAATCCAGG ATTTGATGTT TACAAGTATT TGTGAAGAAT CCAGGATTTG 7568

ATGTTTACAA GACAATTAGA TTCATATATG TATAGGATTT TGACAGAAAC TGAGGGATTC 7628 20

ACATGACAAT TACTCTGTGG ATTTGCCTTT GGCTGTCCAA ACCTCCTTTG TGTCTAACTT 7688

CGTCTGAAGT CCCATTTATA TGCTCAAAGC TCAGTCAAGG TACTGATTCA AAAGCTAGGC 7748

TGTGAAGTAA ACTTTAAAAT GATATTGCTG CAAAGTCGCT CAACAAAGGG TCATAACCAT 7808

CACTACAACT ACACAAGCTC AAGCAAGTAA ACGCGGGTGA AAGATTAACA TAGATCGCTA 7868

TCCCCTGCAA AAGCTAAGGA AAGCATCTCT AACTTCTTAG CATGTACTCA AACACACGAT 7928 25

CTGTAAGGAT GCCAGAAAGA GAAAGTTACG TTGCCGCAAT TCCTTACAGT GTTGCACAAT 7988

GTCCCCAAAA CCAACATCAC ACTACAAAAA AAGGCTCAAA TTCTGGGGGT TATAATTAGA 8048

CGGTCAATAA CCCCTGCAAT TTAGTGTTGT GGAGGTTGAA TAAACTCCTC CAATTAGGAG 8108

TGTCACAATT AAGTCGCGTG GGATTCTTGG CACATCCCGG TAAGGTTAAC TAGCGGGGGT 8168

TTTGAACCCC AACCGCATTT CAAACTAGGA GTCGAAACCC CAACGATTTG TGAACTCGGG 8228 30

GGAGTCAAAA ACCCCCGCAA TAAATGATTT TTACATTAAA ATTAATAGGA GCTTGGACCC 8288

CTGTGATTTA TGAAATATAA CTTTTTGTAG CATTTGCCAG AAATATTCAA TTTTAGATAC 8348

TAATAATAAA TTAATTAACT AACATGTGCA TCATTATTCA AAGGACATAT TAGTATTAAG 8408

AAATAATACA ATATTCAACA CAAAAGTACC CAAACTCAAG ATAGGATCAG TTTATGGAAC 8468

TTCAACTAGT TTCACTATAA TTATTGTCAC TAACATCAGC TGGCTGCAAA GGAGAATACA 8528 35

TAATAAGTGA CTTTATCCAA ACTCAAAATC ATGGCTGAAT GTAGTAAAAC ACCAAAGATT 8588

ATAATAATTT CCATTAATTA TCATATACTA CACAACAACA AACTTAAAAC AATATAGAAA 8648

AGGATTAAAC CATTTACACA AGCAATGATT CTATACCATT TCAAAACGAC AACATACTGT 8708

ACTACTAAAC AAGACACCAT CAAACTGATT TGGACAAATA TTAACAATAG TTAAAACATG 8768

AACAAAGAAT CTCAGGTTTC TTGTCAGTAG AAAAGAGACA GACTAGGAAC TGGAGTGCTA 8828

TTTTTCTTAT AAGAGACAAT TAATGTTTAC TTCTTTATAT TTTGACTATA AGTTGATTGG 8888

TTATAATGTT TACGAGGTTG TATATAATCC GATGTTCAAT GATATGACTT TCCTATTGAC 8948

TGAAATGCTT GAACGCAAAC AGTATATCTA GATTAAGAAT GAGGACGAAT TACCTCTAGA 9008

GGCATGGGTA ATGGAAGCAT AACTCCTTGA TAATGGTTGT TAGCCCACTG CAAGTCACAA 9068 5

AACAAAACAT CCGTAATATT AACATACTAA GGTTGTAAGC ACTAAACGAC AACAACTATG 9128

CCTCAATCCC AACTAAGTTG GAATCGACTA TATGAATACT CACAATTTCG ATTTATAGAC 9188

AAAGATACTA GTAGAAATGA CGTCTTTCCT TTCTATGTTA ACACTTGGAC AGAGAATGTT 9248

AAAGACTTAC AACAACAGAA AAGAGTTAAA ATCATTTAAT TGAGCAAGGA TTTCAAAACG 9308

ACAACACAAT ATACTCAATT TTTCGACGGA AACAACTGGT TGGACAACAG TGCTATTTGT 9368 10

AACTCCAATG AACAACACTG CAACGTACAT GTATCTCATT GCACTAAATA AATCCCGTTG 9428

AGAGTAACAT ATCAATAGTT ACGAACAATA TGATCACGAC AAAGGATTGT AAGTACCACA 9488

GGACAAGTCA TGCTTGCATG AAAAACGGAT ATGTAAAGAA CCAAAATCCT GCTGCTGAAA 9548

TAAGCAGTTA TGATTATCCA AAAATCATGA ATACACATGC ACTTGAGTTT GTTCCAAGAA 9608

AAACACAACC AACTACTGTC GCAAGTGAAG ATTCAAAAGT GACTATTGAT GTTAATTCTT 9668 15

CCACAAGGTT GAATAATTTT GTCACTATAG GATTTAAGAC GAAGAAGAAA CAGGCGACAA 9728

TTTTGTAAGC ATAGACCTTC TTATGCAACT ATGAGCTGGT ATGCTATTCA TTTTCTTTAC 9788

TCGTAAAAAT CGTTGATACT AAAGAATGCC AATCCAGTCC TGCTGAATAG GCGCCAGGTG 9848

ACTGGTTGCT GTTAATAATT TT 9870

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16: 20

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 14 aminoácidos

(B) TIPO: ácido nucleico

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 25

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

Met Glu Lys Arg Lys Asp Ile Glu Glu Ala Asn Asn Ser Leu

1 5 10

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30

(A) LONGITUD: 1243 aminoácidos

(B) TIPO: ácido nucleico

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17: 35

Val Leu Phe Ser Ala Leu Ser Lys Asp Ile Ala Asn Val Leu Ile Phe

1 5 10 15

Leu Glu Asn Glu Glu Asn Gln Lys Ala Leu Asp Lys Asp Gln Val Glu

20 25 30

Lys Leu Lys Leu Lys Met Ala Phe Ile Cys Thr Tyr Val Gln Leu Ser

35 40 45

Tyr Ser Asp Phe Glu Gln Phe Glu Asp Ile Met Thr Arg Asn Arg Gln

50 55 60

Glu Val Glu Asn Leu Leu Gln Ser Leu Leu Asp Asp Asp Val Leu Thr 5

65 70 75 80

Ser Leu Thr Ser Asn Met Asp Asp Cys Ile Ser Leu Tyr His Arg Ser

85 90 95

Tyr Lys Ser Asp Ala Ile Met Met Asp Glu Gln Leu Asp Phe Leu Leu

100 105 110 10

Leu Asn Leu Tyr His Leu Ser Lys His His Ala Glu Lys Ile Phe Pro

115 120 125

Gly Val Thr Gln Tyr Glu Val Leu Gln Asn Val Cys Gly Asn Ile Arg

130 135 140

Asp Phe His Gly Leu Ile Leu Asn Gly Cys Ile Lys His Glu Met Val 15

145 150 155 160

Glu Asn Val Leu Pro Leu Phe Gln Leu Met Ala Glu Arg Val Gly His

165 170 175

Phe Leu Trp Glu Asp Gln Thr Asp Glu Asp Ser Arg Leu Ser Glu Leu

180 185 190 20

Asp Glu Asp Glu His Asn Asp Arg Asp Ser Arg Leu Phe Gln Leu Thr

195 200 205

His Leu Leu Leu Lys Ile Val Pro Thr Glu Leu Glu Val Met His Ile

210 215 220

Cys Tyr Thr Asn Leu Lys Ala Ser Thr Ser Ala Glu Val Gly Arg Phe 25

225 230 235 240

Ile Lys Lys Leu Leu Glu Thr Ser Pro Asp Ile Leu Arg Glu Tyr Ile

245 250 255

Ile Gln Leu Gln Glu His Met Leu Thr Val Ile Pro Pro Ser Thr Leu

260 265 270 30

Gly Ala Arg Asn Ile His Val Met Met Glu Phe Leu Leu Leu Ile Leu

275 280 285

Ser Asp Met Pro Lys Asp Phe Ile His His Asp Lys Leu Phe Asp Leu

290 295 300

Leu Ala His Val Gly Thr Leu Thr Arg Glu Val Ser Thr Leu Val Arg 35

305 310 315 320

Asp Leu Glu Glu Lys Leu Arg Asn Lys Glu Gly Asn Asn Gln Thr Asn

325 330 335

Cys Ala Thr Leu Asp Leu Leu Glu Asn Ile Glu Leu Leu Lys Lys Asp

340 345 350

Leu Lys His Val Tyr Leu Lys Ala Pro Asn Ser Ser Gln Cys Cys Phe

355 360 365

Pro Met Ser Asp Gly Pro Leu Phe Met His Leu Leu His Met His Leu

370 375 380 5

Asn Asp Leu Leu Asp Ser Asn Ala Tyr Ser Ile Ser Leu Ile Lys Glu

385 390 395 400

Glu Ile Glu Leu Val Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Arg Ser Phe Phe

405 410 415

Gly Asp Ala Ala Glu Gln Gly Leu Tyr Lys Asp Ile Trp Ala Arg Val 10

420 425 430

Leu Asp Val Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Val Ile Asp Ser Ile Ile Val

435 440 445

Arg Asp Asn Gly Leu Leu His Leu Ile Phe Ser Leu Pro Ile Thr Ile

450 455 460 15

Lys Lys Ile Lys Leu Ile Lys Glu Glu Ile Ser Ala Leu Asp Glu Asn

465 470 475 480

Ile Pro Lys Asp Arg Gly Leu Ile Val Val Asn Ser Pro Lys Lys Pro

485 490 495

Val Glu Arg Lys Ser Leu Thr Thr Asp Lys Ile Ile Val Gly Phe Glu 20

500 505 510

Glu Glu Thr Asn Leu Ile Leu Arg Lys Leu Thr Ser Gly Pro Ala Asp

515 520 525

Leu Asp Val Ile Ser Ile Thr Gly Met Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr

530 535 540 25

Leu Ala Tyr Lys Val Tyr Asn Asp Lys Ser Val Ser Arg His Phe Asp

545 550 555 560

Leu Arg Ala Trp Cys Thr Val Asp Gln Gly Tyr Asp Asp Lys Lys Leu

565 570 575

Leu Asp Thr Ile Phe Ser Gln Val Ser Gly Ser Asp Ser Asn Leu Ser 30

580 585 590

Glu Asn Ile Asp Val Ala Asp Lys Leu Arg Lys Gln Leu Phe Gly Lys

595 600 605

Arg Tyr Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asp Thr Thr Thr Leu Asp

610 615 620 35

Glu Leu Thr Arg Pro Phe Pro Glu Ala Lys Lys Gly Ser Arg Ile Ile

625 630 635 640

Leu Thr Thr Arg Glu Lys Glu Val Ala Leu His Gly Lys Leu Asn Thr

645 650 655

Asp Pro Leu Asp Leu Arg Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ser Trp Glu Leu

660 665 670

Leu Glu Lys Arg Thr Phe Gly Asn Glu Ser Cys Pro Asp Glu Leu Leu

675 680 685

Asp Val Gly Lys Glu Ile Ala Glu Asn Cys Lys Gly Leu Pro Leu Val 5

690 695 700

Ala Asp Leu Ile Ala Gly Val Ile Ala Gly Arg Glu Lys Lys Arg Ser

705 710 715 720

Val Trp Leu Glu Val Gln Ser Ser Leu Ser Ser Phe Ile Leu Asn Ser

725 730 735 10

Glu Val Glu Val Met Lys Val Ile Glu Leu Ser Tyr Asp His Leu Pro

740 745 750

His His Leu Lys Pro Cys Leu Leu His Phe Ala Ser Trp Pro Lys Asp

755 760 765

Thr Pro Leu Thr Ile Tyr Leu Leu Thr Val Tyr Leu Gly Ala Glu Gly 15

770 775 780

Phe Val Glu Lys Thr Glu Met Lys Gly Ile Glu Glu Val Val Lys Ile

785 790 795 800

Tyr Met Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Val Ile Cys Phe Asn Glu

805 810 815 20

Ile Gly Asp Ile Leu Asn Phe Gln Ile His Asp Leu Val His Asp Phe

820 825 830

Cys Leu Ile Lys Ala Arg Lys Glu Asn Leu Phe Asp Arg Ile Arg Ser

835 840 845

Ser Ala Pro Ser Asp Leu Leu Pro Arg Gln Ile Thr Ile Asp Tyr Asp 25

850 855 860

Glu Glu Glu Glu His Phe Gly Leu Asn Phe Val Met Phe Asp Ser Asn

865 870 875 880

Lys Lys Arg His Ser Gly Lys His Leu Tyr Ser Leu Arg Ile Asn Gly

885 890 895 30

Asp Gln Leu Asp Asp Ser Val Ser Asp Ala Phe His Leu Arg His Leu

900 905 910

Arg Leu Ile Arg Val Leu Asp Leu Glu Pro Ser Leu Ile Met Val Asn

915 920 925

Asp Ser Leu Leu Asn Glu Ile Cys Met Leu Asn His Leu Arg Tyr Leu 35

930 935 940

Arg Ile Arg Thr Gln Val Lys Tyr Leu Pro Phe Ser Phe Ser Asn Leu

945 950 955 960

Trp Asn Leu Glu Ser Leu Phe Val Ser Asn Lys Gly Ser Ile Leu Val

965 970 975

Leu Leu Pro Arg Ile Leu Asp Leu Val Lys Leu Arg Val Leu Ser Val

980 985 990

Gly Ala Cys Ser Phe Phe Asp Met Asp Ala Asp Glu Ser Ile Leu Ile

995 1000 1005 5

Ala Lys Asp Thr Lys Leu Glu Asn Leu Arg Ile Leu Gly Glu Leu Leu

1010 1015 1020

Ile Ser Tyr Ser Lys Asp Thr Met Asn Ile Phe Lys Arg Phe Pro Asn

1025 1030 1035 1040

Leu Gln Val Leu Gln Phe Glu Leu Lys Glu Ser Trp Asp Tyr Ser Thr 10

1045 1050 1055

Glu Gln His Trp Phe Pro Lys Leu Asp Cys Leu Thr Glu Leu Glu Thr

1060 1065 1070

Leu Cys Val Gly Phe Lys Ser Ser Asn Thr Asn His Cys Gly Ser Ser

1075 1080 1085 15

Val Ala Thr Asn Arg Pro Trp Asp Phe His Phe Pro Ser Asn Leu Lys

1090 1095 1100

Glu Leu Leu Leu Tyr Asp Phe Pro Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser Thr

1105 1110 1115 1120

Ile Ala Arg Leu Pro Asn Leu Glu Asn Leu Ser Leu Tyr Asp Thr Ile 20

1125 1130 1135

Ile Gln Gly Glu Glu Trp Asn Met Gly Glu Glu Asp Thr Phe Glu Asn

1140 1145 1150

Leu Lys Phe Leu Asn Leu Arg Leu Leu Thr Leu Ser Lys Trp Glu Val

1155 1160 1165 25

Gly Glu Glu Ser Phe Pro Asn Leu Glu Lys Leu Lys Leu Gln Glu Cys

1170 1175 1180

Gly Lys Leu Glu Glu Ile Pro Pro Ser Phe Gly Asp Ile Tyr Ser Leu

1185 1190 1195 1200

Lys Phe Ile Lys Ile Val Lys Ser Pro Gln Leu Glu Asp Ser Ala Leu 30

1205 1210 1215

Lys Ile Lys Lys Tyr Ala Glu Asp Met Arg Gly Gly Asn Glu Leu Gln

1220 1225 1230

Ile Leu Gly Gln Lys Asn Ile Pro Leu Phe Lys

1235 1240 35

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1257 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

Met Glu Lys Arg Lys Asp Ile Glu Glu Ala Asn Asn Ser Leu Val Leu 5

1 5 10 15

Phe Ser Ala Leu Ser Lys Asp Ile Ala Asn Val Leu Ile Phe Leu Glu

20 25 30

Asn Glu Glu Asn Gln Lys Ala Leu Asp Lys Asp Gln Val Glu Lys Leu

35 40 45 10

Lys Leu Lys Met Ala Phe Ile Cys Thr Tyr Val Gln Leu Ser Tyr Ser

50 55 60

Asp Phe Glu Gln Phe Glu Asp Ile Met Thr Arg Asn Arg Gln Glu Val

65 70 75 80

Glu Asn Leu Leu Gln Ser Leu Leu Asp Asp Asp Val Leu Thr Ser Leu 15

85 90 95

Thr Ser Asn Met Asp Asp Cys Ile Ser Leu Tyr His Arg Ser Tyr Lys

100 105 110

Ser Asp Ala Ile Met Met Asp Glu Gln Leu Asp Phe Leu Leu Leu Asn

115 120 125 20

Leu Tyr His Leu Ser Lys His His Ala Glu Lys Ile Phe Pro Gly Val

130 135 140

Thr Gln Tyr Glu Val Leu Gln Asn Val Cys Gly Asn Ile Arg Asp Phe

145 150 155 160

His Gly Leu Ile Leu Asn Gly Cys Ile Lys His Glu Met Val Glu Asn 25

165 170 175

Val Leu Pro Leu Phe Gln Leu Met Ala Glu Arg Val Gly His Phe Leu

180 185 190

Trp Glu Asp Gln Thr Asp Glu Asp Ser Arg Leu Ser Glu Leu Asp Glu

195 200 205 30

Asp Glu His Asn Asp Arg Asp Ser Arg Leu Phe Gln Leu Thr His Leu

210 215 220

Leu Leu Lys Ile Val Pro Thr Glu Leu Glu Val Met His Ile Cys Tyr

225 230 235 240

Thr Asn Leu Lys Ala Ser Thr Ser Ala Glu Val Gly Arg Phe Ile Lys 35

245 250 255

Lys Leu Leu Glu Thr Ser Pro Asp Ile Leu Arg Glu Tyr Ile Ile Gln

260 265 270

Leu Gln Glu His Met Leu Thr Val Ile Pro Pro Ser Thr Leu Gly Ala

275 280 285

Arg Asn Ile His Val Met Met Glu Phe Leu Leu Leu Ile Leu Ser Asp

290 295 300

Met Pro Lys Asp Phe Ile His His Asp Lys Leu Phe Asp Leu Leu Ala

305 310 315 320 5

His Val Gly Thr Leu Thr Arg Glu Val Ser Thr Leu Val Arg Asp Leu

325 330 335

Glu Glu Lys Leu Arg Asn Lys Glu Gly Asn Asn Gln Thr Asn Cys Ala

340 345 350

Thr Leu Asp Leu Leu Glu Asn Ile Glu Leu Leu Lys Lys Asp Leu Lys 10

355 360 365

His Val Tyr Leu Lys Ala Pro Asn Ser Ser Gln Cys Cys Phe Pro Met

370 375 380

Ser Asp Gly Pro Leu Phe Met His Leu Leu His Met His Leu Asn Asp

385 390 395 400 15

Leu Leu Asp Ser Asn Ala Tyr Ser Ile Ser Leu Ile Lys Glu Glu Ile

405 410 415

Glu Leu Val Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Arg Ser Phe Phe Gly Asp

420 425 430

Ala Ala Glu Gln Gly Leu Tyr Lys Asp Ile Trp Ala Arg Val Leu Asp 20

435 440 445

Val Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Val Ile Asp Ser Ile Ile Val Arg Asp

450 455 460

Asn Gly Leu Leu His Leu Ile Phe Ser Leu Pro Ile Thr Ile Lys Lys

465 470 475 480 25

Ile Lys Leu Ile Lys Glu Glu Ile Ser Ala Leu Asp Glu Asn Ile Pro

485 490 495

Lys Asp Arg Gly Leu Ile Val Val Asn Ser Pro Lys Lys Pro Val Glu

500 505 510

Arg Lys Ser Leu Thr Thr Asp Lys Ile Ile Val Gly Phe Glu Glu Glu 30

515 520 525

Thr Asn Leu Ile Leu Arg Lys Leu Thr Ser Gly Pro Ala Asp Leu Asp

530 535 540

Val Ile Ser Ile Thr Gly Met Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala

545 550 555 560 35

Tyr Lys Val Tyr Asn Asp Lys Ser Val Ser Arg His Phe Asp Leu Arg

565 570 575

Ala Trp Cys Thr Val Asp Gln Gly Tyr Asp Asp Lys Lys Leu Leu Asp

580 585 590

Thr Ile Phe Ser Gln Val Ser Gly Ser Asp Ser Asn Leu Ser Glu Asn

595 600 605

Ile Asp Val Ala Asp Lys Leu Arg Lys Gln Leu Phe Gly Lys Arg Tyr

610 615 620

Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asp Thr Thr Thr Leu Asp Glu Leu 5

625 630 635 640

Thr Arg Pro Phe Pro Glu Ala Lys Lys Gly Ser Arg Ile Ile Leu Thr

645 650 655

Thr Arg Glu Lys Glu Val Ala Leu His Gly Lys Leu Asn Thr Asp Pro

660 665 670 10

Leu Asp Leu Arg Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ser Trp Glu Leu Leu Glu

675 680 685

Lys Arg Thr Phe Gly Asn Glu Ser Cys Pro Asp Glu Leu Leu Asp Val

690 695 700

Gly Lys Glu Ile Ala Glu Asn Cys Lys Gly Leu Pro Leu Val Ala Asp 15

705 710 715 720

Leu Ile Ala Gly Val Ile Ala Gly Arg Glu Lys Lys Arg Ser Val Trp

725 730 735

Leu Glu Val Gln Ser Ser Leu Ser Ser Phe Ile Leu Asn Ser Glu Val

740 745 750 20

Glu Val Met Lys Val Ile Glu Leu Ser Tyr Asp His Leu Pro His His

755 760 765

Leu Lys Pro Cys Leu Leu His Phe Ala Ser Trp Pro Lys Asp Thr Pro

770 775 780

Leu Thr Ile Tyr Leu Leu Thr Val Tyr Leu Gly Ala Glu Gly Phe Val 25

785 790 795 800

Glu Lys Thr Glu Met Lys Gly Ile Glu Glu Val Val Lys Ile Tyr Met

805 810 815

Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Val Ile Cys Phe Asn Glu Ile Gly

820 825 830 30

Asp Ile Leu Asn Phe Gln Ile His Asp Leu Val His Asp Phe Cys Leu

835 840 845

Ile Lys Ala Arg Lys Glu Asn Leu Phe Asp Arg Ile Arg Ser Ser Ala

850 855 860

Pro Ser Asp Leu Leu Pro Arg Gln Ile Thr Ile Asp Tyr Asp Glu Glu 35

865 870 875 880

Glu Glu His Phe Gly Leu Asn Phe Val Met Phe Asp Ser Asn Lys Lys

885 890 895

Arg His Ser Gly Lys His Leu Tyr Ser Leu Arg Ile Asn Gly Asp Gln

900 905 910

Leu Asp Asp Ser Val Ser Asp Ala Phe His Leu Arg His Leu Arg Leu

915 920 925

Ile Arg Val Leu Asp Leu Glu Pro Ser Leu Ile Met Val Asn Asp Ser

930 935 940 5

Leu Leu Asn Glu Ile Cys Met Leu Asn His Leu Arg Tyr Leu Arg Ile

945 950 955 960

Arg Thr Gln Val Lys Tyr Leu Pro Phe Ser Phe Ser Asn Leu Trp Asn

965 970 975

Leu Glu Ser Leu Phe Val Ser Asn Lys Gly Ser Ile Leu Val Leu Leu 10

980 985 990

Pro Arg Ile Leu Asp Leu Val Lys Leu Arg Val Leu Ser Val Gly Ala

995 1000 1005

Cys Ser Phe Phe Asp Met Asp Ala Asp Glu Ser Ile Leu Ile Ala Lys

1010 1015 1020 15

Asp Thr Lys Leu Glu Asn Leu Arg Ile Leu Gly Glu Leu Leu Ile Ser

1025 1030 1035 1040

Tyr Ser Lys Asp Thr Met Asn Ile Phe Lys Arg Phe Pro Asn Leu Gln

1045 1050 1055

Val Leu Gln Phe Glu Leu Lys Glu Ser Trp Asp Tyr Ser Thr Glu Gln 20

1060 1065 1070

His Trp Phe Pro Lys Leu Asp Cys Leu Thr Glu Leu Glu Thr Leu Cys

1075 1080 1085

Val Gly Phe Lys Ser Ser Asn Thr Asn His Cys Gly Ser Ser Val Ala

1090 1095 1100 25

Thr Asn Arg Pro Trp Asp Phe His Phe Pro Ser Asn Leu Lys Glu Leu

1105 1110 1115 1120

Leu Leu Tyr Asp Phe Pro Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser Thr Ile Ala

1125 1130 1135

Arg Leu Pro Asn Leu Glu Asn Leu Ser Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Gln 30

1140 1145 1150

Gly Glu Glu Trp Asn Met Gly Glu Glu Asp Thr Phe Glu Asn Leu Lys

1155 1160 1165

Phe Leu Asn Leu Arg Leu Leu Thr Leu Ser Lys Trp Glu Val Gly Glu

1170 1175 1180 35

Glu Ser Phe Pro Asn Leu Glu Lys Leu Lys Leu Gln Glu Cys Gly Lys

1185 1190 1195 1200

Leu Glu Glu Ile Pro Pro Ser Phe Gly Asp Ile Tyr Ser Leu Lys Phe

1205 1210 1215

Ile Lys Ile Val Lys Ser Pro Gln Leu Glu Asp Ser Ala Leu Lys Ile

1220 1225 1230

Lys Lys Tyr Ala Glu Asp Met Arg Gly Gly Asn Glu Leu Gln Ile Leu

1235 1240 1245

Gly Gln Lys Asn Ile Pro Leu Phe Lys 5

1250 1255

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1206 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido 10

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

Met Ala Phe Ile Cys Thr Tyr Val Gln Leu Ser Tyr Ser Asp Phe Glu 15

1 5 10 15

Gln Phe Glu Asp Ile Met Thr Arg Asn Arg Gln Glu Val Glu Asn Leu

20 25 30

Leu Gln Ser Leu Leu Asp Asp Asp Val Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asn

35 40 45 20

Met Asp Asp Cys Ile Ser Leu Tyr His Arg Ser Tyr Lys Ser Asp Ala

50 55 60

Ile Met Met Asp Glu Gln Leu Asp Phe Leu Leu Leu Asn Leu Tyr His

65 70 75 80

Leu Ser Lys His His Ala Glu Lys Ile Phe Pro Gly Val Thr Gln Tyr 25

85 90 95

Glu Val Leu Gln Asn Val Cys Gly Asn Ile Arg Asp Phe His Gly Leu

100 105 110

Ile Leu Asn Gly Cys Ile Lys His Glu Met Val Glu Asn Val Leu Pro

115 120 125 30

Leu Phe Gln Leu Met Ala Glu Arg Val Gly His Phe Leu Trp Glu Asp

130 135 140

Gln Thr Asp Glu Asp Ser Arg Leu Ser Glu Leu Asp Glu Asp Glu His

145 150 155 160

Asn Asp Arg Asp Ser Arg Leu Phe Gln Leu Thr His Leu Leu Leu Lys 35

165 170 175

Ile Val Pro Thr Glu Leu Glu Val Met His Ile Cys Tyr Thr Asn Leu

180 185 190

Lys Ala Ser Thr Ser Ala Glu Val Gly Arg Phe Ile Lys Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Thr Ser Pro Asp Ile Leu Arg Glu Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Glu

210 215 220

His Met Leu Thr Val Ile Pro Pro Ser Thr Leu Gly Ala Arg Asn Ile

225 230 235 240 5

His Val Met Met Glu Phe Leu Leu Leu Ile Leu Ser Asp Met Pro Lys

245 250 255

Asp Phe Ile His His Asp Lys Leu Phe Asp Leu Leu Ala His Val Gly

260 265 270

Thr Leu Thr Arg Glu Val Ser Thr Leu Val Arg Asp Leu Glu Glu Lys 10

275 280 285

Leu Arg Asn Lys Glu Gly Asn Asn Gln Thr Asn Cys Ala Thr Leu Asp

290 295 300

Leu Leu Glu Asn Ile Glu Leu Leu Lys Lys Asp Leu Lys His Val Tyr

305 310 315 320 15

Leu Lys Ala Pro Asn Ser Ser Gln Cys Cys Phe Pro Met Ser Asp Gly

325 330 335

Pro Leu Phe Met His Leu Leu His Met His Leu Asn Asp Leu Leu Asp

340 345 350

Ser Asn Ala Tyr Ser Ile Ser Leu Ile Lys Glu Glu Ile Glu Leu Val 20

355 360 365

Ser Gln Glu Leu Glu Phe Ile Arg Ser Phe Phe Gly Asp Ala Ala Glu

370 375 380

Gln Gly Leu Tyr Lys Asp Ile Trp Ala Arg Val Leu Asp Val Ala Tyr

385 390 395 400 25

Glu Ala Lys Asp Val Ile Asp Ser Ile Ile Val Arg Asp Asn Gly Leu

405 410 415

Leu His Leu Ile Phe Ser Leu Pro Ile Thr Ile Lys Lys Ile Lys Leu

420 425 430

Ile Lys Glu Glu Ile Ser Ala Leu Asp Glu Asn Ile Pro Lys Asp Arg 30

435 440 445

Gly Leu Ile Val Val Asn Ser Pro Lys Lys Pro Val Glu Arg Lys Ser

450 455 460

Leu Thr Thr Asp Lys Ile Ile Val Gly Phe Glu Glu Glu Thr Asn Leu

465 470 475 480 35

Ile Leu Arg Lys Leu Thr Ser Gly Pro Ala Asp Leu Asp Val Ile Ser

485 490 495

Ile Thr Gly Met Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Tyr Lys Val

500 505 510

Tyr Asn Asp Lys Ser Val Ser Arg His Phe Asp Leu Arg Ala Trp Cys

515 520 525

Thr Val Asp Gln Gly Tyr Asp Asp Lys Lys Leu Leu Asp Thr Ile Phe

530 535 540 5

Ser Gln Val Ser Gly Ser Asp Ser Asn Leu Ser Glu Asn Ile Asp Val

545 550 555 560

Ala Asp Lys Leu Arg Lys Gln Leu Phe Gly Lys Arg Tyr Leu Ile Val

565 570 575

Leu Asp Asp Val Trp Asp Thr Thr Thr Leu Asp Glu Leu Thr Arg Pro 10

580 585 590

Phe Pro Glu Ala Lys Lys Gly Ser Arg Ile Ile Leu Thr Thr Arg Glu

595 600 605

Lys Glu Val Ala Leu His Gly Lys Leu Asn Thr Asp Pro Leu Asp Leu

610 615 620 15

Arg Leu Leu Arg Pro Asp Glu Ser Trp Glu Leu Leu Glu Lys Arg Thr

625 630 635 640

Phe Gly Asn Glu Ser Cys Pro Asp Glu Leu Leu Asp Val Gly Lys Glu

645 650 655

Ile Ala Glu Asn Cys Lys Gly Leu Pro Leu Val Ala Asp Leu Ile Ala 20

660 665 670

Gly Val Ile Ala Gly Arg Glu Lys Lys Arg Ser Val Trp Leu Glu Val

675 680 685

Gln Ser Ser Leu Ser Ser Phe Ile Leu Asn Ser Glu Val Glu Val Met

690 695 700 25

Lys Val Ile Glu Leu Ser Tyr Asp His Leu Pro His His Leu Lys Pro

705 710 715 720

Cys Leu Leu His Phe Ala Ser Trp Pro Lys Asp Thr Pro Leu Thr Ile

725 730 735

Tyr Leu Leu Thr Val Tyr Leu Gly Ala Glu Gly Phe Val Glu Lys Thr 30

740 745 750

Glu Met Lys Gly Ile Glu Glu Val Val Lys Ile Tyr Met Asp Asp Leu

755 760 765

Ile Ser Ser Ser Leu Val Ile Cys Phe Asn Glu Ile Gly Asp Ile Leu

770 775 780 35

Asn Phe Gln Ile His Asp Leu Val His Asp Phe Cys Leu Ile Lys Ala

785 790 795 800

Arg Lys Glu Asn Leu Phe Asp Arg Ile Arg Ser Ser Ala Pro Ser Asp

805 810 815

Leu Leu Pro Arg Gln Ile Thr Ile Asp Tyr Asp Glu Glu Glu Glu His

820 825 830

Phe Gly Leu Asn Phe Val Met Phe Asp Ser Asn Lys Lys Arg His Ser

835 840 845 5

Gly Lys His Leu Tyr Ser Leu Arg Ile Asn Gly Asp Gln Leu Asp Asp

850 855 860

Ser Val Ser Asp Ala Phe His Leu Arg His Leu Arg Leu Ile Arg Val

865 870 875 880

Leu Asp Leu Glu Pro Ser Leu Ile Met Val Asn Asp Ser Leu Leu Asn 10

885 890 895

Glu Ile Cys Met Leu Asn His Leu Arg Tyr Leu Arg Ile Arg Thr Gln

900 905 910

Val Lys Tyr Leu Pro Phe Ser Phe Ser Asn Leu Trp Asn Leu Glu Ser

915 920 925 15

Leu Phe Val Ser Asn Lys Gly Ser Ile Leu Val Leu Leu Pro Arg Ile

930 935 940

Leu Asp Leu Val Lys Leu Arg Val Leu Ser Val Gly Ala Cys Ser Phe

945 950 955 960

Phe Asp Met Asp Ala Asp Glu Ser Ile Leu Ile Ala Lys Asp Thr Lys 20

965 970 975

Leu Glu Asn Leu Arg Ile Leu Gly Glu Leu Leu Ile Ser Tyr Ser Lys

980 985 990

Asp Thr Met Asn Ile Phe Lys Arg Phe Pro Asn Leu Gln Val Leu Gln

995 1000 1005 25

Phe Glu Leu Lys Glu Ser Trp Asp Tyr Ser Thr Glu Gln His Trp Phe

1010 1015 1020

Pro Lys Leu Asp Cys Leu Thr Glu Leu Glu Thr Leu Cys Val Gly Phe

1025 1030 1035 1040

Lys Ser Ser Asn Thr Asn His Cys Gly Ser Ser Val Ala Thr Asn Arg 30

1045 1050 1055

Pro Trp Asp Phe His Phe Pro Ser Asn Leu Lys Glu Leu Leu Leu Tyr

1060 1065 1070

Asp Phe Pro Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser Thr Ile Ala Arg Leu Pro

1075 1080 1085 35

Asn Leu Glu Asn Leu Ser Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Gln Gly Glu Glu

1090 1095 1100

Trp Asn Met Gly Glu Glu Asp Thr Phe Glu Asn Leu Lys Phe Leu Asn

1105 1110 1115 1120

Leu Arg Leu Leu Thr Leu Ser Lys Trp Glu Val Gly Glu Glu Ser Phe

1125 1130 1135 5

Pro Asn Leu Glu Lys Leu Lys Leu Gln Glu Cys Gly Lys Leu Glu Glu

1140 1145 1150

Ile Pro Pro Ser Phe Gly Asp Ile Tyr Ser Leu Lys Phe Ile Lys Ile

1155 1160 1165

Val Lys Ser Pro Gln Leu Glu Asp Ser Ala Leu Lys Ile Lys Lys Tyr 10

1170 1175 1180

Ala Glu Asp Met Arg Gly Gly Asn Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Lys

1185 1190 1195 1200

Asn Ile Pro Leu Phe Lys

1205 15

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido un gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la EPO renuncia a toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción 5

· EP 0534858 A, Zabeau y Vos [0034] [0064]

· EP 9704340 W [0143]

· EP 96401764 A [0143]

· EP 97401101 A [0143]

Literatura distinta de patentes citada en la descripción 10

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· Murashige; Skoog. Physiol. Plant., vol. 15, 473-497 [0099] 5

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· Ooms y col. Theor. Appl. Genet., vol. 73, 744-750 [0140] 10

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un ácido nucleico aislado que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia de ADN de la Figura 5 y donde dicho ácido nucleico, cuando es transferido a una planta que es susceptible a una plaga vegetal, es capaz de reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicha plaga vegetal.
2.- El ácido nucleico de la reivindicación 1 que es capaz, cuando es transferido a una planta huésped que es susceptible a una plaga vegetal, de convertir dicha planta huésped en resistente a dicha plaga vegetal. 5
3.- El ácido nucleico de la reivindicación 1 que, que cuando es transferido a una planta huésped, es capaz de convertirla en resistente a insectos.
4.- Un ácido nucleico aislado que es capaz de, cuando es transferido a una planta que es susceptible a una plaga vegetal, reducir la susceptibilidad de dicha planta a dicha plaga vegetal, donde dicho ácido nucleico es un ADN homólogo que tiene al menos un 50% de identidad con una secuencia que comienza en la posición 10 nucleotídica 3263 y termina en la posición nucleotídica 7111 de la secuencia de la Figura 5.
5.- Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que tiene al menos un 50% de identidad con el inserto genómico presente en el plásmido pKGMi-11, estando depositado dicho plásmido pKGMi-11 en la Centraal Bureau Voor Schimmelkultures en Baam, Países Bajos, bajo el Número de depósito CBS822.96.
6.- Una construcción de ADN recombinante que contiene un ácido nucleico de acuerdo con 15 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7.- Una construcción de ADN recombinante de la reivindicación 6 que contiene un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho ácido nucleico está bajo el control de un promotor que es funcional en una célula vegetal, siendo dicho promotor endógeno o exógeno para dicha célula vegetal, y eficaz para controlar la transcripción de dicha secuencia de ADN en tales células vegetales. 20
8.- Una construcción de ADN recombinante de la reivindicación 7, en la cual dicho promotor es una secuencia promotora situada 5’ corriente arriba del nucleótido 3263 según se proporciona en la Figura 5, o cualquier secuencia de ADN homóloga que tenga al menos un 50% de identidad con dicha secuencia promotora y contenga las secuencias reguladoras requeridas para la transcripción de la secuencia codificadora adyacente.
9.- Un vector adecuado para transformar células vegetales, conteniendo dicho vector una 25 construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
10.- Células bacterianas que contienen un vector de acuerdo con la reivindicación 9.
11.- Células vegetales que contienen una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
12.- Una planta que contiene células vegetales de acuerdo con la reivindicación 11. 30
13.- Una planta de acuerdo con la reivindicación 12 que tiene una susceptibilidad a insectos reducida.
14.- Una semilla que contiene una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
15.- Un proceso para obtener plantas con susceptibilidad reducida a una plaga vegetal, que comprende las etapas siguientes:

i) la inserción en el genoma de una célula vegetal de una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8,

ii) la obtención de células vegetales transformadas,

iii) la regeneración de plantas transformadas genéticamente a partir de dichas células vegetales transformadas, y 40

iv) opcionalmente, la propagación de dichas plantas.
16.- Un proceso de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicha plaga vegetal es un insecto.
17.- Un proceso para proteger las plantas en cultivo frente a una infección por una plaga vegetal, que comprende:

i) la inserción en el genoma de una célula vegetal de una construcción de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8,

ii) la obtención de plantas transformadas, y

iii) el cultivo de dichas plantas transformadas.
18.- Un polipéptido que es el producto de expresión de un ácido nucleico o de un ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y que tiene al menos un 50% de identidad con la secuencia de proteínas de la Figura 7A.
19.- Un ARN aislado que tiene una secuencia de ácido ribonucleico de un transcrito de la secuencia de ADN de la reivindicación 1 ó 2. 5