ES2961522T3 - Evento transgénico de algodón MON 88702 y procedimientos para su detección y usos - Google Patents
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Abstract
La invención proporciona un evento transgénico de Gossypium hirsutum MON 88702, plantas, células vegetales, semillas, partes de plantas, plantas de progenie y productos básicos que comprenden el evento MON 88702. La invención también proporciona polinucleótidos específicos para el evento MON 88702, plantas, células vegetales, semillas, partes de plantas, plantas de progenie y productos básicos que comprenden polinucleótidos para el evento MON 88702. La invención también proporciona métodos relacionados con el evento MON 88702. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Evento transgénico de algodón MON 88702 y procedimientos para su detección y usos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a un evento de algodón transgénico denominado MON 88702. El evento proporciona resistencia de infestaciones de algodón por hemiptera y thysanoptera al proporcionar una proteína de toxina insecticida única no disponible previamente en plantas de algodón. Esta proteína de toxina insecticida es altamente eficaz para controlar las infestaciones de las especies Hemiptera y Thysanoptera características de las plantas de algodón. La invención también se refiere a plantas de algodón, partes de plantas, semillas de plantas, células vegetales, plantas de progenie, productos agrícolas y procedimientos relacionados con el evento MON 88702 y proporciona moléculas de nucleótidos que son exclusivas del evento, que fueron creadas con relación a la inserción de ADN transgénico en el genoma de una célula deGossypium hirsutum(algodón) y que son útiles para detectar la presencia de este evento en las muestras biológicas que contienen ácidos nucleicos de algodón.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El algodón es un cultivo importante en muchas partes del mundo y se han aplicado procedimientos biotecnológicos a para producir variedades de algodón con rasgos deseables. Uno de estos rasgos deseables es la resistencia a los insectos. La expresión de un transgén con resistencia a insectos en una planta de algodón puede conferir el rasgo deseable de resistencia a insectos. Muchos factores diferentes influencian la expresión de un transgén, que incluye la orientación y composición de los casetes que dirigen la expresión de los genes individuales transferidos al cromosoma vegetal, la ubicación cromosómica del inserto transgén y el resultado genómico de la inserción del transgén. Por ejemplo, puede haber una variación en el nivel y en el patrón de la expresión de un transgén en plantas entre los eventos individuales que difieren en el sitio de inserción cromosómica del transgén, pero que de otro modo son idénticos. También puede haber diferencias fenotípicas y agronómicas entre los eventos.
Para producir una planta de algodón transgénica que contenga un único evento de transformación, se transfiere una parte de una construcción de ADN recombinante en el genoma de una célula de algodón y, posteriormente, se cultiva la célula de algodón en una planta. Una célula de algodón, a la cual se transfiere inicialmente el evento, se regenera para producir la generación R0. La planta R0 y las plantas de la progenie de la planta R0 pueden ser evaluadas para determinar cualquier rasgo deseado, pero la efectividad del evento se puede ver afectada por factorescisy/otranscon respecto al sitio de integración en el evento de transformación. El fenotipo conferido por el evento también se puede ver afectado por el tamaño y el diseño de la construcción de ADN, el cual puede variar por la combinación de elementos genéticos en un casete de expresión, la cantidad de transgenes, la cantidad de casetes de expresión y la configuración de dichos elementos y dichos casetes. La identificación de un evento con rasgos deseables puede verse adicionalmente complicada por factores como los patrones de desarrollo, diurnos, temporales o espaciales de expresión de un transgén de la planta, o por factores extrínsecos, tal como condiciones ambientales de crecimiento de las plantas, disponibilidad de agua, disponibilidad de nitrógeno, calor o presión. Por lo tanto, la capacidad para obtener un evento que confiere un nivel deseable de expresión transgénica y un conjunto deseado de rasgos fenotípicos y agronómicos no es fácilmente predecible.
Debido a estos factores numerosos que tienen un efecto en la eficacia de un evento, es necesario producir y analizar una gran cantidad de eventos de transformación de célula vegetal individual para crear un evento que tiene expresión apropiada del rasgo deseable y características fenotípicas y agriculturales óptimas adecuadas para el éxito comercial. Crear un evento transgénico comercialmente valioso requiere caracterización molecular extensiva, así como ensayos de invernadero y de campo con numerosos eventos experimentales durante varios años, en múltiples ubicaciones y en diversas condiciones. Se recolecta una cantidad significativa de datos sobre la eficacia, fenotípicos y moleculares, y los datos y las observaciones resultantes son analizados por equipos de científicos y agrónomos con el propósito de seleccionar uno o más eventos comercialmente adecuados. Una vez que ha sido seleccionado, se utiliza dicho evento para la introgresión del rasgo transgénico deseable en otras bases genéticas mediante procedimientos de fitomejoramiento, lo cual produce una cantidad de variedades de cultivos de algodón diferentes que contienen el rasgo deseable y que se adaptan en forma adecuada a las condiciones agronómicas locales específicas.
Las plantas de algodón transgénicas son conocidas en la técnica, pero solo se han producido plantas que expresan genes con tolerancia al herbicida o toxinas Lepidopteranas. No hay plantas de algodón transgénicas para el control de Hemiptera (tal como lygus, saltaplantas de algodón y chinche verde) y plagas de Thysanoptera (tal como trips) de cultivos de algodón.
Las especies Lygus pueden amenazar un cultivo de algodón de encuadrar más temprano a través de recorte y la última formación de cápsulas. Los insectos perforan cuadrados y dañan las anteras y otros tejidos. Cuando los cuadrados tienen menos de 5 milímetros de largo, se marchitan, se ponen marrones y se caen de la planta. El daño a cuadrados más grandes puede ser a las anteras, estilos y estigma y puede interferir con la fertilización. Si muchos cuadrados caen, la planta puede poner sus recursos de energía en crecimiento vegetativo, lo cual da como resultado plantas altas, larguiluchas con cosechas reducidas. Las especies Lygus también se alimentan y destruyen los meristemos terminales, provocando plantas frondosas. Si los lygus perforan la pared de las cápsulas jóvenes (típicamente de menos de diez días) y se alimentan de semillas jóvenes, estas semillas puede que no se desarrollen. La pelusa alrededor de las semillas dañadas está teñida de amarillo, y puede que no madure normalmente.
La pulga saltona del algodón puede provocar pérdida excesiva de cuadrados de algodón, lo que da como resultado un cultivo reducido y demoras en la cosecha. La pulga saltona del algodón es una plaga de insecto del algodón clave en Texas y Oklahoma, y una plaga ocasional en Nuevo México, Arkansas, Louisiana, y otros estados del centro-sur de los Estados Unidos de América. Cuando las poblaciones grandes de las plagas de insectos no se controlan, la pérdida de cosecha puede volverse extremadamente elevada. Las ninfas y adultos de la pulga saltona del algodón se alimentan de los jugos de las partes tiernas de la planta, especialmente los brotes terminales y cuadrados pequeños. Las hojas deformes o irregulares generalmente son vistas como un resultado de esta alimentación. El daño más grande es a pequeños cuadrados que no son más grandes que una cabeza de alfiler. Los cuadrados pequeños se ponen marrones o negros y se caen luego de ser utilizados para alimentarse. Las plantas muy infestadas crecen altas y similares a un látigo, tienen crecimiento restringido de ramas de fructificación, y generalmente producen solo un par de cápsulas cerca de la punta. El insecto y su daño es por lo tanto difícil de detectar hasta que se han sufrido pérdidas económicas.
La chinche verde, una especie nativa, emergió como un importante insecto que se alimenta de cápsulas a lo largo de la costa del golfo de los Estados Unidos de América durante los últimos diez a quince años. Durante este tiempo, las cosechas de algodón han sufrido pérdidas por putrefacción de las cápsulas de algodón en áreas del sur de Texas. Los insectos chupadores que se alimentan de las cápsulas de algodón han estado implicados en la introducción de la enfermedad bacteriana que provoca la putrefacción de la cápsula. La chinche verde fue la especie dominante de insectos chupadores de cápsulas (>98 % de los insectos recolectados utilizando un balde) de florecimiento pico a tardío en campos de algodón cerca de la costa a lo largo de la curva costera del sur de Texas, del Puerto Lavaca al valle del bajo Rio Grande en 2010 y 2011. Era común en los campos que se encontraban dentro de 8 km de las aguas costeras (promedio de 0.42 insectos por planta durante florecimiento pico a tardío), pero no se detectó en los campos interiores. La putrefacción de las cápsulas de algodón se encontró en hasta 25 % de las cápsulas abiertas inspeccionadas, la enfermedad se concentró en los campos costeros donde se encontró la chinche verde, y fue el principal contribuyente al daño de la cápsula. Los resultados de los sondeos de los campos y la alimentación de la chinche verde en plantas enjauladas soportaron la asociación positiva de la presencia de chinches verdes y la posterior putrefacción de la cápsula de algodón relevante a la cosecha en cápsulas abiertas al momento de la cosecha(Armstrong, J., Brewer, M., Parker, R., y Adamzyk, J. (2013) Verde Plant Bug (Hemiptera: Miridae) Feeding Injury to Cotton Bolls Characterized by Boll Age, Size, and Damage Califications, J. Econ. Entomol. 106(1): 189D195).La alimentación de la chinche verde en las cápsulas de algodón también tiene como resultado tinción de la semilla y pelusa.
Los trips tienen mandíbulas para “perforar y chupar” que les permiten hacer un agujero en una célula de hoja, insertar sus estiletes maxilares, y succionar los fluidos celulares. Cuando los trips se alimentan de brotes terminales, en pequeñas hojas en desarrollo y en estructuras fructíferas, el daño puede ser grave. Cuando los trips se alimentan de hojas jóvenes que no se han desarrollado dentro del brote terminal, el daño resultante aumenta ya que esas hojas se desarrollan y expanden. Esto se debe a que el tejido dañado no se desarrolla de forma apropiada, mientras que el tejido sin dañar continúa creciendo. Luego de una alimentación prolongada o alimentación por grandes cantidades de trips, las plántulas tienen una apariencia desigual, con sitios de alimentación plateado visible en el tejido hoja terminal y cotiledónea. Con el tiempo, estas áreas plateadas se volverán marrones. Las hojas muy dañadas generalmente tienen una apariencia arrugada, gastada y generalmente se doblan hacia arriba en los márgenes. Las plántulas con este tipo de daño generalmente se describen como algodón con “orejas de zarigüeya”. Las grandes poblaciones de trips pueden retrasar el crecimiento, provocar la muerte del brote terminal (que da como resultado “algodón loco”), demorar la fructificación y reducir la postura. Daños por trips graves pueden tener como resultado considerables reducciones de cosecha de algodón. Las larvas y los adultos muestran una preferencia por alimentarse de y dentro de las flores, haciendo que sea particularmente difícil controlarlas con pesticidas químicos. Además,Frankliniella occidentalis(trips occidental de las flores) es un vector muy eficiente de diferentes topovirus de plantas (por ejemplo, el virus del bronceado del tomate y virus asociado a la enfermedad azul del algodonero) que provoca daño a las plantas de algodón. En general, los trips pueden impactar gravemente la postura del principio de la temporada y el vigor de la planta y puede ser muy costoso para el agricultor de algodón.
Los pesticidas químicos son los procedimientos actuales de control de insectos utilizados contraLygus hesperus(chinche lygus), Lygus lineolaris(chinche opaca de las plantas), Pseudatomoscelis seriatus(pulga saltona del algodón),Creontiades signatusDistant (chinche verde), y las plagas de thysanopteraFrankliniellaspp ySericothrips variabilis(Trips). Estas metodologías de insecticidas químicos generalmente requieren múltiples aplicaciones y diferentes tipos de pesticidas químicos. Por ejemplo, para controlar el lygus puede que se requieran de cinco a diez tratamientos por estación. Para controlar los trips, puede que se requieran dos a tres tratamientos por estación. Al menos un tratamiento es necesario para controlar la pulga saltona del algodón.
El uso de pesticidas químicos para controlar las pestes de insectos aumenta el costo al agricultor que cultiva algodón, particularmente en regiones con gran infestación de insectos, reduciendo de este modo cualquier beneficio potencial que deriva de la producción de algodón. Además, el uso de diferentes pesticidas químicos con múltiples aplicaciones pueden tener un impacto negativo en medio ambiente y ser beneficioso para los insectos. Además, el desarrollo de resistencia a pesticidas químicos se ha observado en estas plagas de algodón. Por ejemplo, los trips occidental de las flores,Frankliniella occidentalisPergande, ha demostrado resistencia a una cantidad de pesticidas químicos diferentes(Sten Jensen (2006) Insecticide resistance in the western flower thrips, Frankliniella occidentalis, Integrated Pest Management Reviews, 5:131-146).También se ha observado la resistencia a múltiples clases de pesticidas químicos (carbamato, organofosfato, e insecticidas piretroides) utilizados para controlar la chinche opaca de las plantas(Lygus lineolaris) (GL Snodgrasset ál.,(2009) Acephate resistance in populations of the tarnished plant bug (Heteroptera: Miridae) from the Mississippi River Delta. J Econ Entomol, 102(2): 699-707).
Debido al costo económico y medioambiental asociado con el uso de pesticidas químcos para controlas las plagas de insectos del algodón, y el desarrollo de resistencia a pesticidas químicos, existe una necesidad de una planta de algodón que expresa una toxina insecticida activa contraLygus hesperus (chinche lygus), Lygus lineolaris (chinche opaca de las plantas), Pseudatomoscelis seriatus (pulga saltona del algodón), Creontiades signatus(Distant) (chinche verde), y las plagas de thysanopteraFrankliniellaspp ySericothrips variabilis(Trips).
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención proporciona una planta de algodón, una semilla, una parte de una planta de algodón o una célula de algodón de la misma que comprende una molécula de polinucleótido recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en S<e>Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,<s>E<q>ID<n>O:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:10. Las SEQ ID NO. caracterizan el evento del algodón MON 88702 que contiene, en un único lugar de inserción en el genoma del algodón, un casete de expresión que confiere el rasgo de resistencia a plagas de insectos hemípteros y tisanópteros.
En una realización adicional, la presente invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 y complemento completo de las mismas.
En una realización relacionada, la presente invención proporciona una molécula de ADN que comprende un segmento de polinucleótido de longitud suficiente para funcionar como una sonda de ADN que se hibrida específicamente en condiciones de hibridación estrictas con una secuencia de unión del ADN del evento de algodón m On 88702 en una muestra, comprendiendo dicha secuencia de unión una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 10, y su complemento inverso, en el que la detección de la hibridación de la molécula de ADN en condiciones de hibridación estrictas es un diagnóstico para el ADN del evento de algodón MON 88702 en una muestra, en el que una muestra representativa de semilla que comprende el evento de algodón MON 88702 se ha depositado bajo el n.° de resgistro ATCC asignado PTA-122520.
Alternativamente, la invención también se refiere a un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN que funcionan como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con una muestra que contiene ADN molde del evento de algodón MON 88702 para producir un amplicón de diagnóstico para dicho ADN del evento de algodón MON 88702 en la muestra, en la que dicho amplicón comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25.
La invención proporciona además procedimientos para detectar la presencia de un diagnóstico de segmento de ADN para el ADN del evento de algodón MON 88702 en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento:
a) poner en contacto dicha muestra con la sonda de ADN descrita anteriormente;
b) someter dicha muestra y dicha sonda de ADN a condiciones de hibridación estrictas; y
c) detectar la hibridación de dicha sonda de ADN con dicha muestra, en el que dicha etapa de detección es diagnóstica de la presencia de dicho ADN del evento del algodón MON 88702 en una muestra.
Un procedimiento adicional proporcionado por la invención es un procedimiento para detectar la presencia de un diagnóstico de segmento de ADN para el ADN del evento de algodón MON 88702 en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento:
a) poner en contacto dicha muestra con el par de moléculas de ADN descritas anteriormente;
b) realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN; y
c) detectar la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción, en el que dicho amplicón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO.4 , SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para proteger una planta de algodón de una infestación de insectos, en el que dicho procedimiento comprende proporcionar en la dieta de una plaga de insectos hemípteros o plaga de insectos tisanópteros una cantidad insecticidamente eficaz de células o tejido de la planta de algodón que comprende evento MON 88702, en el que una muestra representativa de semilla que comprende el evento de algodón Mo N 88702 se ha depositado con el n.° de resgistro ATCC asignado PTA-122520.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un microorganismo que comprende una cantidad detectable de una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 10 y complemento completo de las mismas.
La invención proporciona además procedimientos para determinar la cigosidad de una planta de algodón o semilla de algodón que comprenden el evento MON 88702 que comprende:
a) poner en contacto una muestra que comprende ADN de algodón con un conjunto de cebadores capaz de producir un primer amplicón diagnóstico para el evento MON 88702 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en S<e>Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ<i>D NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25 y un segundo diagnóstico de amplicón para ADN genómico de algodón nativo que no comprende el evento MON 88702;
i) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con la muestra y el conjunto de cebadores; y ii) detectar en la reacción de amplificación de ácido nucleico el primer diagnóstico de amplicón para el evento MON 88702, o el segundo diagnóstico de amplicón para el ADN genómico del algodón nativo que no comprende el evento MON 88702, en el que la presencia de sólo el primer amplicón es diagnóstica de una planta de algodón homocigótica para ADN del evento MON 88702 en la muestra, y la presencia tanto del primer amplicón como del segundo amplicón es diagnóstica de una planta de algodón heterocigota para el alelo del evento MON 88702; o
b) poner en contacto una muestra que comprende ADN de algodón con un conjunto de sondas que contiene al menos una primera sonda que se hibrida específicamente en condiciones de hibridación estrictas con una secuencia de unión del ADN del evento MON 88702, comprendiendo dicha secuencia de unión una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 10 y complemento inverso de los mismos, y al menos un segundo sonda que se hibrida específicamente con el ADN genómico del algodón que se alteró mediante la inserción del ADN heterólogo del evento MON 88702 y no se hibrida con el ADN del evento MON 88702,
i) hibridar el conjunto de sondas con la muestra en condiciones de hibridación estrictas, y
ii) detectar la hibridación de la primera sonda o la segunda sonda, en donde detectar la hibridación de solo la primera sonda en las condiciones de hibridación es diagnóstico para un alelo homocigótico del ADN del evento MON 88702 en la muestra, y en donde detectar la hibridación tanto de la primera sonda como la segunda sonda bajo las condiciones de hibridación es diagnóstica para un alelo heterocigoto del evento MON 88702 en una muestra de ADN; en el que una muestra representativa de semilla que comprende el evento de algodón MON 88702 se ha depositado con el n.° de resgistro ATCC asignado PTA -122520.
Los aspectos anteriores y otros aspectos de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1a es una representación diagramática de las posiciones relativas ilustradas por cada línea horizontal, de los segmentos del ADN transgénico heterólogo, el ADN genómico flanqueante, las uniones de ADN 5' y 3 ' genómicas designadas de forma arbitraria/insertadas, y posiciones relativas de secuencia exclusivas para el evento MON 88702 dentro del ADN transgenómico heterólogo que se puede utilizar para identificar el evento de algodón MON 88702; las líneas horizontales etiquetadas [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9] y [10] corresponden a la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:10, respectivamente; la barra horizontal etiquetada [10] (SEQ ID NO:10) representa el cóntigo de la secuencia de ADN flanqueante genómica 5' ([7], SEQ ID NO:7), el casete de T-ADN insertado ([9], SEQ ID NO:9), y la secuencia de ADN flanqueante 3' ([8], Se Q ID NO:8); las líneas horizontales pequeñas etiquetadas [1] (SEQ ID NO:1), [2] (SEQ ID NO:2), [3] (SEQ ID NO 3), [4] (SEQ ID NO:4), [5] (SEQ ID NO:5) y [6] (SEQ ID NO:6) representan secuencias únicas de las uniones de ADN genómico/inserto que se pueden utilizar para identificar la presencia del evento MON 88702 en una muestra biológica; las flechas gruesas etiquetadas [11] SQ21940 (SEQ ID NO:11), [12] SQ-50210 (SEQ ID NO:12), [17] SQ50844 (SEQ ID NO:17), [19] SQ50843 representan un subconjunto de cebadores utilizados en el ensayo específico del evento y el ensayo de cigosidad, y están ubicadas respecto a donde se hibridan a la SEQ ID NO:10; las flechas gruesas etiquetadas [13] PB10344 y [18] PB50279 son un subconjunto de sondas utilizadas en el ensayo específico del evento y el ensayo de cigosidad, y están ubicadas respecto a donde se hibridan a la SEQ ID NO:10.
La Figura 1b es una representación diagramática del casete de ADN-T en el vector de plásmido utilizado para transformar el evento MON 88702, presentado como la SEQ ID NO:27 ([27]); las flechas horizontales debajo [27] representan los elementos comprendidos dentro del casete de ADN-T (SEQ ID NO: 27); RB representa un elemento de borde derecho de ADN-T, E representa un elemento potenciador, P representa un elemento promotor, L representa un 5' UTR, TIC834_6 representa el elemento de secuencia de codificación TIC834_6, T representa un 3' u Tr , y LB representa un elemento de borde izquierdo de ADN-T; las líneas horizontales etiquetadas [22], [23], [24], [25], y [26] corresponden a las SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26, respectivamente y representan secuencias únicas de las uniones entre los elementos de la secuencia de codificación que se puede utilizar para identificar la presencia del evento MON 88702 en una muestra biológica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
La SEQ ID NO:1 es una secuencia de veinte nucleótidos que representa las regiones de unión 5' del ADN genómico de algodón y el casete de expresión transgénico integrado. La s Eq ID NO:1 se encuentra dentro de la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1642-1661.
La SEQ ID NO:2 es una secuencia de veinte nucleótidos que representa las regiones de unión 3' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado. La SEQ ID NO:2 se encuentra dentro de SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótido 4785-4804.
La SEQ ID NO:3 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa las regiones de unión 5' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado. La SEQ ID NO:3 se encuentra dentro de SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótido 1622-1681.
La SEQ ID NO:4 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa las regiones de unión 3' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado. La SEQ ID NO:4 se encuentra dentro de la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótido 4765-4824.
La SEQ ID NO:5 es una secuencia de cien nucleótidos que representa las regiones de unión 5' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado. La<s>E<q>ID NO:5 se encuentra dentro de SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótido 1602-1701.
La SEQ ID NO:6 es una secuencia de cien nucleótidos que representa las regiones de unión 3' del ADN genómico del algodón y el casete de expresión transgénico integrado. La s Eq ID NO:6 se encuentra dentro de la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1602-1701.
La SEQ ID NO:7 es una secuencia de 1,651 nucleótidos que representa la secuencia genómica de algodón flanqueante 5' hasta el ADN-T insertado.
La SEQ ID NO:8 es una secuencia de 2,010 nucleótidos que representa la secuencia genómica de algodón flanqueante 3' luego del ADN-T insertado. Los primeros cuatro nucleótidos de la SEQ ID NO:8 derivan de un origen desconocido y no están presentes en la variedad DP393 no transgénica que se utilizó para transformar el evento MON 88702 de algodón; y probablemente fueron introducidas durante la integración del ADN-T MON 88702.
La SEQ ID NO:9 es una secuencia de 3,143 nucleótidos correspondiente al ADN-T insertado transgénico del evento MON 88702 de algodón.
La SEQ ID NO:10 es una secuencia de 6,804 nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de cóntigo de la secuencia de nucleótidos de ADN flanqueante genómico 5', la secuencia de nucleótidos de ADN-T insertado en un evento MON 88702, y la secuencia de nucleótidos de ADN flanqueante genómica 3'; e incluye la SEQ ID NO:7 (nucleótidos 1-1651), SEQ ID NO:9 (nucleótidos 1652-4794), y SEQ ID NO:8 (nucleótidos 4795-6804).
La SEQ ID NO:11 es una secuencia de 25 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ21940, que se utiliza para identificar el ADN del evento MON 88702 de algodón en una muestra, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 4720 a 4744 de la SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO:12 es una secuencia de 24 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ-50210, que se utiliza para identificar el ADN del evento MON 88702 de algodón en una muestra, y es idéntica al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 4803 a 4826 de la SEQ ID NO:10.
La SEQ ID NO:13 es una secuencia de 22 nucleótidos correspondiente a una sonda denominada PB10344, que se utiliza para identificar el ADN del evento MON 88702 de algodón en una muestra, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 4745 a 4766 de la SEQ ID NO:10.
La SEQ ID NO:14 es una secuencia de 23 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmico al que hace referencia como SQ22496 utilizado como un control interno en el ensayo de evento para MON 88702 y se hibrida al gen de proteína portadora de acilo específico de la fibraGossypium hirsutum(ACPI) (número de registro GenBank U48777).
La SEQ ID NO:15 es una secuencia de 19 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmico al que se hace referencia como SQ22497 utilizado como un control interno en el ensayo de evento para MON 88702 y se hibrida con la cadena complementaria del gen de proteína portadora de acilo específico de la fibraGossypium hirsutum(ACP1) (número de registro GenBank U48777).
La SEQ ID NO:16 es una secuencia de 20 nucleótidos correspondiente a una sonda a la que hace referencia como PB13032 utilizado como un control interno en el ensayo de evento para MON 88702 y se hibrida al gen de proteína portadora de acilo específico de la fibraGossypium hirsutum(ACP1) (número de registro GenBank U48777).
La SEQ ID NO:17 es una secuencia de 24 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ50844, que se utiliza en el ensayo de cigosidad para el ADN del evento MON 88702 en una muestra, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 4672 a 4695 de la SEQ ID NO:10.
La SEQ ID NO:18 es una secuencia de 20 nucleótidos correspondiente a una sonda denominada PB50279, que se utiliza para identificar el alelo del evento MON 88702 de algodón en una muestra para el ensayo de cigosidad, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 4735 a 4754 de la s Eq ID NO:10.
La SEQ ID NO:19 es una secuencia de 26 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ50843, que se utiliza en el ensayo de cigosidad para el ADN del evento MON 88702 en una muestra que se hibrida con los alelos de tipo salvaje y MON 88702, y es idéntica al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 4852 a 4877 de la SEQ ID NO:10.
La SEQ ID NO:20 es una secuencia de 25 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ50842, que se utiliza en el ensayo de cigosidad para el ADN del evento MON 88702 en una muestra que se hibrida solo con el alelo de ADN de tipo salvaje que no contiene el casete transgén MON 88702 insertado en una región de ADN de tipo salvaje que se perdió durante la inserción transgénica y por lo tanto no corresponde a una región a lo largo de la SEQ ID NO:10.
La SEQ ID NO:21 es una secuencia de 21 nucleótidos correspondiente a una sonda denominada PB50278, que se utiliza para identificar el alelo de tipo salvaje en el ensayo de cigosidad para el ADN del evento MON 88702 en una muestra, y se hibrida solo con el alelo de ADN de tipo salvaje que no contiene el casete de transgén MON 88702 insertado en una región de ADN de tipo salvaje que se perdió durante la inserción transgénica y por lo tanto no corresponde a una región a lo largo de la SEQ ID NO:10.
La SEQ ID NO:22 es una secuencia de 101 nucleótidos que representa la unión entre la secuencia del borde de ADN-T derecho y la secuencia potenciadora FMV 35S dentro del casete de transgén utilizado para transformar algodón DP393 para producir el evento MON 88702 de algodón que incluye 15 nucleótidos de la secuencia de borde de ADN-T derecho, 53 nucleótidos de la secuencia de intervención, y 33 nucleótidos de la secuencia potenciadora. SEQ ID NO:22 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1705-1805.
La SEQ ID NO:23 es una secuencia de 77 nucleótidos que representa la unión entre laArabidopsis thalianaHSP81.2 5' UTR y la secuencia de codificación TIC834_16 dentro del casete de transgén utilizado para transformar algodón DP393 para producir el evento MON 88702 de algodón que incluye 19 nucleótidos de la 5 ' UTR, 37 nucleótidos de la secuencia de intervención, y 21 nucleótidos de la secuencia de codificación TIC834_16. SEQ ID NO:23 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 3244-3320.
La SEQ ID NO:24 es una secuencia de 97 nucleótidos que representa la unión entre la secuencia de codificación TIC834_16 y la 3' UTR dentro del casete de transgén utilizado para transformar algodón DP393 para producir el evento MON 88702 de algodón que incluye 28 nucleótidos de la secuencia de codificación TIC834_16, 32 nucleótidos de la secuencia de intervención, y 37 nucleótidos de la secuencia 3' UTR. SEQ ID NO:24 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 4193-4289.
La SEQ ID NO:25 es una secuencia de 200 nucleótidos que representa la unión entre la 3 ' UTR y la secuencia de borde de ADN-T izquierdo dentro del casete de transgén utilizado para transformar algodón DP393 para producir el evento MON 88702 de algodón que incluye 29 nucleótidos de la secuencia 3' UTR, 138 nucleótidos de la secuencia de intervención, y 33 nucleótidos de la secuencia de borde de ADN-T izquierdo. SEQ ID NO:25 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 4424-4623.
La SEQ ID NO:26 es una secuencia de 921 nucleótidos que representa la secuencia de codificación TIC834_16 dentro del casete de transgén utilizado para transformar el algodón DP393 para producir el evento MON 88702 de algodón. SEQ ID NO:26 está ubicada dentro de la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 3300-4220.
La SEQ ID NO:27 es una secuencia de 3,598 nucleótidos que representa el casete de transgén comprendido dentro del vector de transformación de plásmido binario utilizado para transformar el algodón DP393 para producir el evento MON 88702 de algodón. La s Eq ID NO:9, la secuencia de 3143 nucleótidos correspondiente al ADN insertado transgénico del evento MON 88702 de algodón, está ubicada en la SEQ ID NO:27 en la posición de nucleótidos 254 3360.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención proporciona una planta de algodón transgénica que logra el control insecticida sobre las plagas Hemiptera y Thysanoptera de algodón mediante la expresión de TIC834_16, es decir, MON 88702. Específicamente, la expresión de la proteína inhibidora de insectos TIC834_16 en el evento MON 88702 de algodón proporciona resistencia a las plagas HemipteraLygus hesperus(chinche lygus),Lygus lineolaris(chinche opaca de las plantas),Pseudatomoscelis seriatus(pulga saltona del algodón),Creontiades signatusDistant (chinche verde), y Thysanoptera tal comoFrankliniellaspp ySericothrips variabilis(Trips). El evento MON 88702 responderá a una gran necesidad de controlar estos insectos en el mercado del algodón, ya que los insecticidas químicos generalmente no proporcionan control adecuado de estos insectos, o requieren múltiples aplicaciones durante la temporada de cultivo, aumentando el ingreso de pesticidas químicos en el medio ambiente y agregando costo a la producción de algodón.
El evento MON 88702 de algodón se produjo mediante un proceso de transformación mediado porAgrobacteriumde tejido de meristemo de algodón con un sistema binario de dos ADN-T. En este sistema, se utilizó una cepa deAgrobacteriumque emplea un vector de plásmido binario con dos casetes de transgén de ADN-T. El primer casete de transgén de ADN-T se utilizó para la selección de células de plantas de algodón transformadas utilizando un marcador seleccionable que confiere tolerancia a la espectinomicina antibiótica. El segundo casete de transgén fue el casete de expresión TIC834_16 - presentado como la SEQ ID NO: 27 en la presente - que confiere resistencia a las plagas de insectos Hemiptera y Thysanoptera. El casete de ADN-T de selección insertado de forma aleatoria en el genoma de algodón en un sitio separado del sitio de integración del ADN-T que contiene el casete de expresión TIC834_16, permitiendo de este modo la segregación de los dos segmentos de ADN-T dentro del genoma de las plantas de algodón transformadas durante el proceso de autofertilización o retrocruzamiento, por ejemplo, mediante el análisis de R1 y plantas transgénicas de generación superior.
Las células de algodón transformadas a través de este sistema binario de dos ADN-T se regeneraron en plantas de algodón intactas. Las plantas individuales que mostraron integridad del casete de ADN-T que codifica la proteína TIC834_16, la ausencia (es decir, segregación) del casete marcador seleccionable de ADN-T, y la ausencia de la secuencia de estructura de plásmido se seleccionaron para evaluación adicional.
Específicamente, más de 200 eventos transgénicos se produjeron utilizando la construcción de transformación utilizada para producir el evento MON 88702 transgénico de algodón, y treinta y ocho construcciones adicionales que comprenden TIC834_16 o variantes relacionadas de TIC834_16 se generaron y utilizaron para producir más de dos mil ciento ochenta (2180) otros eventos de algodón transgénico que se compararon con el evento MON 88702 de algodón y eventos de algodón similar. Muchos de estos eventos fueron sometidos a ensayo ELISA para evaluar la expresión en el tejido de la hoja de la proteína insecticida, TIC834_16 o variantes relacionadas. Muchos de estos mismos eventos fueron examinados para evaluar la presencia de cristales de proteína que fueron el resultado de sobreexpresión de las toxinas y fueron interferidas con eficacia. Se evaluó un subconjunto de los eventos producidos a partir de cada transformación, y la mayoría de las construcciones, en cuanto a la eficacia para controlar las plagas de insectos Hemiptera en ensayos en el campo y en jaulas. Se determinó que los elementos de expresión de plantas en la construcción utilizados para producir el evento MON 88702 de algodón proporcionaron los eventos con la mejor eficacia contra las plagas de Hemiptera evaluadas. De los eventos creados y evaluados, el evento MON 88702 se seleccionó en última instancia como el evento superior en vista de las propiedades beneficiosas y superiores proporcionadas de ese modo.
Se caracterizó el ADN plasmídico insertado en el genoma del evento MON 88702 de algodón mediante análisis molecular detallado. Este análisis incluyó: el número del inserto (número de los sitios de integración dentro del genoma de algodón), la ubicación del inserto genómico (el sitio específico en el genoma de algodón en donde se produjo la inserción), la cantidad de copias (la cantidad de copias del ADN-T dentro de un locus) y la integridad del ADN transgénico insertado. El análisis molecular detallado demostró que la construcción del plásmido que contiene el casete de expresión TIC834_16 contiene múltiples segmentos (secuencias de unión entre los elementos utilizados para crear o construir el casete de expresión). Estos segmentos (por ejemplo, las secuencias tal como se establecen en la SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y Se Q ID NO:26) no son conocidos por aparecer naturalmente en el genoma de algodón o en otros vectores o eventos de algodón transgénico; son únicos al evento MON 88702. Además, el evento MON 88702 de algodón se caracteriza como una inserción en un solo locus en el genoma de algodón, que tiene como resultado dos nuevos locus o secuencias de unión (por ejemplo, secuencias tal como se establece en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) entre el ADN insertado y el ADN del genoma de algodón que no son conocidos por aparecer naturalmente en el genoma de algodón o en otros eventos de algodón transgénico; son exclusivos del evento MON 88702. Estas secuencias de unión son útiles para detectar la presencia del evento MON 88702 en las células de algodón, tejidos de algodón, semillas de algodón y plantas de algodón o productos derivados de plantas de algodón, tal como productos básicos de algodón. En la presente se describen pares de cebadores y sondas moleculares de ADN que se han desarrollado para utilizar en la identificación de la presencia de estos diversos segmentos de unión en las muestras biológicas que contenían o que se sospecha que contenían células de algodón, semillas de algodón, partes de plantas de algodón o tejido de plantas de algodón que contiene el ADN del evento MON 88702.
El análisis molecular detallado también demostró que el evento MON 88702 contiene una sola inserción de ADN-T con una copia del casete de expresión TIC834_16. No se han identificado elementos adicionales de la construcción de transformación más que las partes de las regiones del borde derecho e izquierdo deAgrobacterium tumefaciensutilizadas para la transferencia del ADN transgénico del plásmido de transformación de la planta al genoma de algodón en el ADN del evento MON 88702. Finalmente, se realizó la amplificación térmica que produce amplicones específicos que son un diagnóstico para la presencia del evento MON 88702 en una muestra, y se realizaron análisis de las secuencias de ADN para determinar las uniones del genoma inserto a planta 5' y 3' designadas de forma arbitraria, confirmar la organización de los elementos dentro del inserto, y determinar la secuencia de ADN completa del ADN transgénico insertado (SEQ ID NO:9) en el evento de algodón MON 88702. La SEQ ID NO:7 es una secuencia que representa la secuencia de ADN genómica de algodón DP393 5' que flanquea la secuencia de ADN-T insertada presentada como la SEQ ID NO:9. La SEQ ID NO:8 es una secuencia que representa la secuencia de ADN genómica de algodón DP393 5' que flanquea la secuencia de ADN-T insertada presentada como la SEQ ID NO:9. La SEQ ID NO:10 representa una secuencia contigua (contig) que comprende la secuencia flanqueante DP3935', el ADN-T MON 88702 insertado y la secuencia flanqueante DP393 3', y por lo tanto contiene las secuencias de unión al genoma de inserto a planta.
A menos que se indique lo contrario en la presente, los términos se entenderán de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica. Las definiciones de los términos comunes en la biología molecular también se pueden encontrar en Rieger et ál.,Glossary of Genetics:Classical and Molecular, 5.a edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1994. Tal como se usa en la presente, el término “algodón” significa las especies que pertenecen al géneroGossypium,preferentementeGossypium hirsutumL. yGossypium barbadenseL. e incluye todas las variedades de plantas que se pueden cultivar con plantas de algodón que contienen el evento MON 88702, que incluye las especies de algodón salvaje así como aquellas plantas que pertencen al géneroGossypiumque permite el cultivo entre especies.
La presente invención proporciona plantas transgénicas que se han transformado con una construcción de ADN que contiene un casete de expresión que expresa cantidades tóxicas de proteína insecticida TIC8334_16. Por cantidad tóxica se entiende una cantidad eficaz, una cantidad insecticida, una cantidad insecticida eficaz, una cantidad supresora del insecto objetivo, una cantidad pesticida eficaz, una cantidad en la dieta de los insectos en el orden Hemiptera o Thysanoptera que es insecticida y otros términos similares que se deberán entender de acuerdo al uso convencional por los expertos en la técnica pertinente. Las plantas de algodón transformadas de acuerdo con los procedimientos y con las construcciones de ADN divulgadas en la presente son resistentes a las plagas de insectos Hemiptera y Thysanoptera.
Una “planta” transgénica se produce por la transformación de una célula de la planta con ADN heterólogo, es decir, una construcción de ácido polinucleico que incluye diversas características de interés eficaces; la regeneración de una planta que resulta de la inserción del transgén en el genoma de la célula de la planta y la selección de una planta específica caracterizada por la inserción en una ubicación del genoma particular y la cantidad de características eficaces de la planta transgénica regenerada. El término “evento” se refiere a la única secuencia molecular que resulta de insertar ADN transgénico en el genoma de una planta de algodón en una ubicación específica. Esta secuencia está presente en el transformante original, y comprende el ADN insertado y que flanquea la secuencia genómica inmediatamente adyacente al ADN insertado. Dicha secuencia es exclusiva y se esperaría que se transfiera a una progenie que reciba el ADN insertado incluido el transgén de interés como resultado de un cruce sexual de la línea parental que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie resultantes de la autofertilización) y una línea parental que no contiene el ADN insertado. La presente invención también proporciona la planta transformante original y la progenie del transformante que incluye el ADN heterólogo. Dicha progenie se puede producir por un cruzamiento sexual entre plantas que comprenden el evento y otra planta en la cual la progenie incluye el ADN heterólogo. Incluso después del retrocruzamiento repetido con un padre recurrente, el evento está presente en la progenie del cruce en la misma ubicación cromosómica. La presente invención se refiere a la plantas de algodón del evento transgénico que comprende MON 88702, a su progenie y a las composiciones de ADN contenidas allí.
Se pretende que la referencia en la presente solicitud a una “molécula aislada de ADN”, o una frase o término equivalente, signifique que la molécula de ADN está presente sola o en combinación con otras composiciones, pero no está en su entorno natural. Por ejemplo, los elementos de ácido nucleico, tales como una secuencia codificante, una secuencia de intrones, una secuencia líder sin traducir, una secuencia promotora, una secuencia de terminación transcripcional y similares, que se encuentran naturalmente dentro del ADN del genoma de un organismo no se consideran “aisladas”, siempre y cuando el elemento esté dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en el que se encuentra naturalmente. Sin embargo, cada uno de estos elementos, y subpartes de estos elementos, se encuentra “aislado” dentro del alcance de la presente descripción siempre que el elemento no se encuentre dentro del genoma del organismo y en la ubicación dentro del genoma en el cual se encuentra naturalmente. De manera similar, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida o cualquier variante insecticida de origen natural de la proteína podría ser una secuencia de nucleótidos aislada siempre que la secuencia de nucleótidos no esté dentro del<a>D<n>de la bacteria en la cual la secuencia que codifica la proteína se encuentra naturalmente. Una secuencia sintética de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína insecticida de origen natural se podría considerar aislada a los fines de la presente descripción. Para los fines de la presente descripción, cualquier secuencia de nucleótidos transgénica, es decir, la secuencia de nucleótidos del ADN insertado en el genoma de las células de una planta o bacteria o presente en un vector extracromosómico, se considera una secuencia de nucleótidos aislada si está presente dentro de la estructura de plásmido o similar utilizada para transformar las células, dentro del genoma de la planta o bacteria o presente en cantidades detectables en tejidos, progenie, muestras biológicas o productos básicos derivados de la planta o bacteria.
Una “sonda” es un ácido nucleico al cual se puede unir una molécula reportera o indicadora detectable convencional, por ejemplo, un isótopo radiactivo, un ligando, un agente quimioluminiscente o una enzima. Dicha sonda es complementaria a una cadena de un ácido nucleico objetivo, en el caso de la presente invención, a una cadena de ADN de MON 88702, ya sea de una planta que contiene MON 88702 o de una muestra que incluye ADN de MON 88702. Las sondas de acuerdo con la presente invención no incluyen solamente ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico, sino que también incluyen poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y que se pueden utilizar para detectar la presencia de esa secuencia de ADN objetivo.
Los cebadores de ADN son ácidos polinucleicos que se hibridan a una cadena de ADN objetivo complementaria mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN objetivo, después se extienden a lo largo de la cadena de ADN objetivo por una polimerasa, por ejemplo, una polimerasa de ADN. Un par de cebadores de ADN o un conjunto de cebadores de ADN de la presente invención se refiere a dos cebadores de ADN útiles para la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos objetivo, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácidos polinucleicos convencionales.
Las sondas de ADN y los cebadores de ADN generalmente tienen once (11) polinucleótidos o más de longitud, generalmente dieciocho (18) polinucleótidos o más, venticuatro (24) polinucleótidos o más o treinta (30) polinucleótidos o más. Se seleccionan dichas sondas y cebadores de una longitud suficiente para hibridar específicamente con una secuencia objetivo en condiciones de hibridación de rigurosidad alta. Preferentemente, las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invención tienen similitud de secuencia completa con la secuencia objetivo, aunque se pueden diseñar, a través de procedimientos convencionales, sondas que difieren de la secuencia objetivo que mantiene la capacidad de hibridarse con secuencias objetivo.
Se pueden utilizar los cebadores y las sondas basados en el ADN genómico flanqueante y en las secuencias de insertos divulgadas en la presente para confirmar (y, de ser necesario, para corregir) las secuencias de ADN divulgadas mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante reclonación y secuenciación de dichas moléculas de ADN.
Las sondas y los cebadores de ácido nucleico de la presente invención hibridan en condiciones rigurosas con una molécula de ADN objetivo. Se puede utilizar cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico para identificar la presencia de ADN de una planta transgénica en una muestra. Las moléculas de ácidos polinucleicos también denominadas segmentos o fragmentos de ácidos nucleicos de estas son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácidos nucleicos en determinadas circunstancias. Según se emplea aquí, se dice que dos moléculas de ácido polinucleico pueden hibridarse específicamente entre sí si las dos moléculas pueden formar una estructura de ácido nucleico antiparalela, de doble cadena. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si exhibe una complementariedad completa. Tal como se usa en la presente, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario de un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son “mínimamente complementarias” si se pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan apareadas entre sí en al menos condiciones de rigor bajo convencionales. De forma similar, se dice que las moléculas son “complementarias” si se pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan apareadas entre sí en condiciones de rigor alto convencionales. Las condiciones restrictivas convencionales se describen en Sambrook et ál., 1989, y en Haymes et ál., In:Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,IRL Press, Washington, DC (1985). Por lo tanto, se permite el distanciamiento de la complementariedad completa, siempre y cuando dichos distanciamientos no impidan la capacidad de las moléculas de formar una estructura de cadena doble. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, sólo es necesario que su secuencia sea lo suficientemente complementaria para poder formar una estructura estable de doble cadena en la concentración de sal y solvente particulares que se emplean.
Según se emplea aquí, una secuencia sustancialmente homóloga es una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridará específicamente con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos con la cual se está comparando en condiciones de rigurosidad alta. Las condiciones de rigurosidad adecuadas que promueven la hibridación del ADN, por ejemplo, 6.0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45 °C, seguido de un lavado de 2.0 x SSC a 50 °C, son conocidas para los entendidos en la técnica o se pueden encontrar enCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede ser seleccionada de una baja rigurosidad de alrededor de 2,0 x SSC a 50 °C a una rigurosidad elevada de alrededor de 0,2 x SSC a 50 °C. De manera adicional, la temperatura de la etapa de lavado puede aumentar de las condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, alrededor de 22 °C, a condiciones de rigurosidad elevada a alrededor de 65 °C. Es posible variar tanto la temperatura como la sal, o ya sea la temperatura o la concentración de sal pueden mantenerse constantes al tiempo que se cambia la otra variable. En una realización preferida, un ácido polinucleico de la presente invención se hibridará específicamente a uno o más de las moléculas de ácido nucleico establecidas en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, o SEQ ID NO:26, o complementos de estas o fragmentos de cualquiera de estos en condiciones moderadamente rigurosas, por ejemplo a alrededor de 2.0 x SSC y alrededor de 65°C. En una realización particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención se hibridará específicamente a uno o más de las moléculas de ácido nucleico establecidas en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, o SEQ ID NO:26, o complementos o fragmentos de cualquiera de estos en condiciones de rigurosidad elevada. En un aspecto de la presente invención, una molécula de ácidos nucleicos marcadora preferida de la presente invención tiene la secuencia de ácidos nucleicos que se presenta en la SEQ ID NO:1, o SEQ ID NO:2, o S<e>Q ID NO:3, o SEQ ID NO:4, o SEQ ID NO:5, o SEQ ID NO:6, o SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:9, o SEQ ID NO:10; o SEQ ID NO:22, o SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:24, o SEQ ID NO:25, o SEQ ID NO:26, o complementos de estos o fragmentos de cualquiera de estos. Se puede detectar la hibridacion de la sonda con la molécula de ADN objetivo mediante cualquier cantidad de procedimientos conocidos para los expertos en la técnica, estos pueden incluir, entre otros, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioactivas, etiquetas basadas en anticuerpos y etiquetas quimioluminiscentes.
Con relación a la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos objetivo (por ejemplo, por PCR) utilizando un par de cebadores de amplificación particulares, las "condiciones de rigurosidad" son condiciones que permiten que el par de cebadores se hibride únicamente con la secuencia de ácidos nucleicos objetivo con la cual se uniría un cebador que tuviera la secuencia salvaje correspondiente (o su complemento) y, preferentemente, para producir un producto de amplificación exclusivo, el amplicón, en una reacción de amplificación térmica de ADN.
El término "específico para (una secuencia objetivo)" indica que una sonda o un cebador se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas solo con la secuencia objetivo en una muestra que comprende la secuencia objetivo.
Según se emplea aquí, “ADN amplificado” o “amplicón” se refiere al producto del procedimiento de amplificación del ácido polinucleico dirigido a una molécula de ácidos polinucleicos objetivo que forma parte de una plantilla de ácidos polinucleicos. Por ejemplo, para determinar si una planta de algodón derivada de un cruce sexual contiene ADN genómico de una planta transgénica de una planta de algodón que comprende el evento MON 88702 de la presente invención, el ADN que se extrae de una muestra de tejido de planta de algodón se puede someter a un procedimiento de amplificación de ácidos polinucleicos utilizando un par de cebadores que incluye un primer cebador derivado de una secuencia de ADN genómica en la región flanqueante del ADN heterólogo insertado del evento MON 88702 y se elonga por la polimerasa 5' a 3' en la dirección del ADN insertado. El segundo cebador, que se deriva de la molécula de ADN heterólogo insertado, se elonga por la polimerasa 5' a 3' en la dirección del ADN genómico flanqueante desde el cual se deriva el primer cebador. El amplicón puede oscilar en longitud desde la longitud combinada del par de cebadores más un par de bases de nucleótidos o más aproximadamente cincuenta pares de bases de nucleótidos, o más aproximadamente doscientos cincuenta pares de bases de nucleótidos, o más aproximadamente cuatrocientos cincuenta pares de bases de nucleótidos o más. Alternativamente, se puede derivar un par de cebadores de la secuencia genómica en ambos lados del ADN heterólogo insertado de modo de producir un amplicón que incluya la secuencia de polinucleótidos del inserto completa (por ejemplo, un cebador directo aislado de la porción genómica en el extremo 5' de la SEQ ID NO:10 y un cebador inverso aislado de la porción genómica en el extremo 3' de la SEQ ID NO:10 que amplifica una molécula de ADN que comprende la secuencia de ADN insertado (SEQ ID NO:9) que se identifica en la presente en el genoma que contiene el evento MON 88702). Un miembro de un par de cebadores derivado de la secuencia genómica de la planta adyacente al ADN transgénico insertado se ubica a una distancia de la secuencia de ADN insertada, esta distancia puede oscilar entre un par de bases de nucleótidos y aproximadamente veintemil pares de bases de nucleótidos. El uso del término “amplicón” excluye específicamente los dímeros de cebadores que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica del ADN.
A fines prácticos, se debería diseñar cebadores que producen amplicones dentro de un intervalo de tamaño limitado, por ejemplo, entre 20 y 1000 bases. En general, los amplicones de tamaño más pequeño (longitud de polinucleótidos más corta) se producen de forma más confiable en las reacciones de amplificación térmica, permiten tiempos de ciclo más cortos y se pueden separar y visualizar fácilmente sobre los geles de agarosa o adaptar para el uso en ensayos de criterios de valoración tipo TAQMAN®. Se pueden producir y detectar amplicones más pequeños a través de los procedimientos conocidos en la técnica de la detección de amplicones de ADN. Además, los amplicones producidos con los pares de cebadores se pueden clonar en vectores, propagar, aislar y secuenciar o se pueden secuenciar directamente con los procedimientos conocidos en la técnica. Cualquier par de cebadores derivado de la combinación de la SEQ ID NO:7 y la SEQ ID NO:9 o la combinación de la Se Q ID No :8 y la SEQ ID NO:9 que son útiles en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para MON 88702 o su progenie es un aspecto de la invención. Cualquier molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:7 o su complemento, que es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para MON 88702 o su progenie es un aspecto de la invención. Cualquier molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:8 o su complemento, que es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para las plantas que comprenden MON 88702 o su progenie es un aspecto de la invención. Cualquier molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:9 o su complemento, que es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para MON 88702 o su progenie es un aspecto de la invención.
La amplificación de ácido polinucleico se puede lograr mediante cualquiera de los diversos procedimientos de amplificación de ácido polinucleico conocidos en la técnica, incluso la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los procedimientos de amplificación son conocidos en la técnica y se describen, entre otros, en las patentes estadounidenses N.° 4.683.195 y 4.683.202 y enPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,ed. Innis et ál., Academic Press, San Diego, 1990. Se han desarrollado procedimientos de amplificación por PCR para amplificar hasta 22 kb (kilobases) de ADN genómico y hasta 42 kb de ADN bacteriófago (Cheng et ál., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). Estos procedimientos, así como otros procedimientos conocidos en la técnica de la amplificación del ADN, se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. Se puede verificar la secuencia del inserto de ADN heterólogo o la secuencia de ADN genómico flanqueante del evento de algodón MON 88702 (y corregir si es necesario) mediante la amplificación de dichas moléculas de ADN de las semillas de algodón que contienen ADN del evento MON 88702 o de plantas de algodón cultivadas a partir de la semillas de algodón que contienen ADN del evento MON 88702 depositado en la ATCC con el número de acceso PTA-122520, la utilización de cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en el presente, seguido del secuenciamiento del ADN estándar del amplicón de PCR o sus fragmentos de ADN clonados.
Se puede detectar el amplicón de diagnóstico producido por estos procedimientos a través de diversas técnicas. Uno de estos procedimientos es Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et ál. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994) en donde se diseña un oligonucleótido de ADN que se superpone con la secuencia de ADN genómico flanqueante adyacente y la secuencia de ADN insertada. Se inmoviliza el oligonucleótido en los pocillos de una placa de microvaloración. Después de la PCR de la región de interés (utilizando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), se puede hibridar un producto de PCR de cadena única con el oligonucleótido inmovilizado y servir como una plantilla para una reacción de extensión de base única utilizando una polimerasa de ADN y trifosfatos de didesoxinucleótidos (ddNTP) marcados específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia genómica/transgén debido a la amplificación exitosa, hibridación y extensión de base única.
Otro procedimiento es la técnica de pirosecuenciación según la describió Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este procedimiento se diseña un oligonucleótido que superpone la unión de ADN genómico adyacente y ADN de inserción. Se hibrida el oligonucleótido con el producto de PCR de cadena única de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una polimerasa de ADN, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Se añaden los DNTP individualmente y la incorporación da como resultado una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia de la secuencia genómica/transgén debido a la amplificación exitosa, hibridación y extensión de base única o de varias bases.
La polarización de fluorescencia según la describe Chen et ál,(Genome Res.9:492-498, 1999) es un procedimiento que se puede utilizar para detectar el amplicón de la presente invención. Utilizando este procedimiento, se diseña un oligonucleótido que superpone la unión del ADN insertado y flanqueante genómico. Se hibrida el oligonucleótido con el producto de PCR de cadena única de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y uno en la secuencia de ADN genómico flanqueante) y se incuba en presencia de una polimerasa de ADN y un ddNTP marcado con fluorescencia. La extensión de una sola base da como resultado la incorporación de ddNTP. Se puede medir la incorporación como un cambio en la polarización con un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia genómica/transgén debido a la amplificación exitosa, hibridación y extensión de base única.
Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) se describe como un procedimiento para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN y se comprende completamente con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. En resumen, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que superpone la unión del ADN del inserto y flanqueante genómico. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia del ADN del inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se someten a ciclos en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET da como resultado la escisión y liberación del resto fluorescente lejos del resto de inactivación en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia genómica/transgén debido a una amplificación e hibridación exitosas.
Se han descrito balizas moleculares para usarse en la detección de secuencias tal como lo describe Tyangi, et ál. (Nature Biotech.14:303-308, 1996). En resumen, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que superpone la unión del ADN del inserto y genómico flanqueante. La estructura única de la sonda FRET da como resultado que contenga una estructura secundaria que mantiene los restos fluorescentes y de inactivación cerca. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia del ADN del inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se someten a ciclos en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Después de la amplificación por PCR exitosa, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia objetivo da como resultado la remoción de la estructura secundaria de la sonda y de la separación espacial de las fracciones fluorescente y extintora. Una señal fluorescente resulta de esto. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto flanqueante/transgenética debido a una amplificación e hibridación exitosas.
Los kits de detección de ADN que se basan en los procedimientos de amplificación del ADN contienen moléculas de cebadores de ADN que se hibridan específicamente con un ADN objetivo y amplifican un amplicón de diagnóstico en condiciones de reacción adecuadas. El kit puede proporcionar un procedimiento de detección basado en gel agarosa o cualquier cantidad de procedimientos para detectar el amplicón de diagnóstico que se conocen en la técnica. Se pueden desarrollar kits de detección de ADN mediante las composiciones divulgadas en la presente y son útiles para la identificación del ADN del evento de algodón MON 88702 en una muestra y se pueden aplicar a los procedimientos para el fitomejoramiento de las plantas de algodón que contienen el ADN del evento MON 88702. Un kit que contiene cebadores de ADN que son homólogos o complementarios a cualquier porción de la región genómica de la algodón, como se presenta en la SEQ ID NO:10 y a cualquier porción del ADN transgénico insertado, como se presenta en la SEQ ID NO:10 es un objeto de la invención. Se pueden utilizar las moléculas de ADN en procedimientos de amplificación del ADN (PCR) o como sondas en los procedimientos de hibridación de ácido polinucleico, es decir, análisis "southern", análisis "northern".
Las secuencias de unión pueden estar representadas por una secuencia del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25. Por ejemplo, las secuencias de unión se pueden representar arbitrariamente por las secuencias de nucleótidos proporcionadas como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. Alternativamente, las secuencias de unión se pueden representar arbitrariamente por las secuencias de nucleótidos proporcionadas como SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. Alternativamente, las secuencias de unión se pueden representar arbitrariamente por las secuencias de nucleótidos proporcionadas como SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6. Estos nucleótidos se conectan mediante enlace fosfodiéster y están presentes en el evento MON 88702 de algodón como parte del genoma de una célula de una planta recombinante. La identificación de una o más de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25 en una muestra derivada de una planta de algodón, semilla de algodón o parte de una planta de algodón es determinante que el ADN se haya obtenido del evento de algodón MON 88702 y es diagnóstico para la presencia en una muestra que contiene ADN del evento de algodón MON 88702. Por lo tanto, la invención proporciona una molécula de ADN que contiene al menos una de las secuencias de nucleótidos proporcionadas como la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y la SEQ ID NO:26. Cualquier segmento de ADN derivado del evento MON 88702 de algodón transgénico que es suficiente para incluir al menos una de las secuencias proporcionadas como la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26 está dentro del alcance de la invención. Adicionalmente, cualquier polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias descritas en este párrafo se encuentra comprendido por el alcance de la invención.
La invención proporciona moléculas de ADN ejemplares que se pueden utilizar ya sea como cebadores o como sondas para detectar la presencia de ADN derivado de una planta de algodón que comprende ADN del evento MON 88702 en una muestra. Dichos cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico objetivo y como tal son útiles para la identificación de la secuencia de ácido nucleico del evento MON 88702 de algodón a través de procedimientos de la invención descritos en la presente.
Un “cebador” es típicamente un polinucleótido altamente purificado, aislado que está diseñado para su uso en procedimientos específicos de apareamiento o hibridación que comprenden amplificación térmica. Un par de cebadores se pueden utilizar con ADN molde, por ejemplo una muestra de ADN genómico de algodón, en una amplificación térmica, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, en donde el amplicón producido de dicha reacción puede tener una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia del ADN molde ubicada entre los dos sitios en donde los cebadores se hibridaron con el molde. Según se emplea aquí, un “amplicón” es una réplica de una pieza o fragmento de ADN que se ha sintetizado utilizando técnicas de amplificación. En algunas realizaciones, un amplicón de la invención puede comprender al menos una de las secuencias proporcionadas como la SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, Se Q ID NO:17, SEQ ID NO:19. En otra realización, un amplicón puede comprender al menos una de las secuencias de unión del presente evento, tal como la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y la SEQ ID NO:26. Un cebador se diseña típicamente para hibridarse con una cadena de ADN objetivo complementaria para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN objetivo y la presencia del cebador es un punto de reconocimiento por parte de una polimerasa para iniciar la extensión del cebador (es decir, polimerización de nucleótidos adicionales en una molécula de alargamiento de nucleótido) con la cadena de ADN objetivo como molde. Los pares de cebadores, como se utilizan en la invención, se refieren al uso de dos cebadores que unen cadenas opuestas de un segmento de nucleótido de doble cadena a fin de amplificar linealmente el segmento de polinucleótido entre las posiciones objetivo para unir los miembros individuales del par de cebadores, típicamente en una reacción de amplificación térmica u otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico convencionales. Moléculas de ADN ejemplares útiles como cebadores se proporcionan como SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19. El par de cebadores proporcionado como SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12 son útiles como una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es diferente de la primera molécula de ADN y ambas son de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:10 para funcionar como cebadores de ADN que, cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación térmica con el ADN molde derivado del evento MON 88702 de algodón, producen un amplicón de diagnóstico para el ADN del evento MON 88702 de algodón en una muestra.
Una “sonda” es un ácido nucleico complementario a una hebra del ácido nucleico objetivo. Las sondas de acuerdo con la invención no incluyen solamente ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico, sino que también incluye poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y la detección de dicha unión puede ser útil para diagnosticar, discriminar, determinar o confirmar la presencia de esa secuencia de ADN objetivo en una muestra particular. Una sonda puede estar unida a una molécula reportera o indicadora detectable convencional, por ejemplo un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Moléculas de ADN de ejemplo útiles como una sonda se proporcionan como la SEQ ID NO:13 y la SEQ ID NO:18.
Las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invención pueden tener similitud de secuencia completa con la secuencia objetivo, aunque se pueden diseñar, a través de procedimientos convencionales, cebadores y sondas que difieren de la secuencia objetivo que mantienen la capacidad de hibridarse preferentemente con secuencias objetivo. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como un cebador o sonda se necesita que sea lo suficientemente complementaria en secuencia para ser capaz de formar una estructura de doble cadena estable con las concentraciones particulares de solvente y sal empleadas. Se puede utilizar cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico para identificar la presencia de<a>D<n>transgénico del evento MON 88702 de algodón en una muestra. Las sondas y los cebadores son por lo general de al menos de alrededor de 11 nucleótidos, de al menos alrededor de 18 nucleótidos, de al menos alrededor de 24 nucleótidos o de al menos alrededor de 30 nucleótidos o más de longitud. Dichas sondas y cebadores se hibridan específicamente con una secuencia de ADN objetivo en condiciones de hibridación restrictivas. Las condiciones restrictivas convencionales se describen en Sambrook et ál., 1989, y en Haymes et ál., In:Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,IRL Press, Washington, DC (1985).
Se puede utilizar cualquier cantidad de procedimientos conocidos para los expertos en la técnica para aislar y manipular una molécula de ADN, o fragmento de esta, divulgados en la invención, incluso procedimientos de amplificación térmica. También es posible obtener moléculas de ADN o fragmentos de estas mediante otras técnicas, como mediante la síntesis directa del fragmento con medios químicos, como es usual con un sintetizador de oligonucleótidos automático.
Por lo tanto, las moléculas de ADN y las secuencias de nucleótidos correspondientes proporcionadas en la presente son útiles, entre otras cosas, para identificar el evento MON 88702 de algodón, seleccionar las variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento MON 88702 de algodón, detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 88702 de algodón transgénico en una muestra, y monitorear las muestras para reconocer la presencia y/o ausencia del evento MON 88702 de algodón o partes de una planta derivadas de las plantas de algodón que comprenden el evento MON 88702.
La invención proporciona plantas de algodón, células de plantas de algodón, semillas de algodón, partes de plantas de algodón (como polen, óvulo, vaina, tejido de flor, tejido de raíz, tejido de tallo y tejido de hoja), plantas de la progenie de algodón, pelusa de algodón y productos básicos de algodón. Estas plantas de algodón, células de plantas de algodón, semillas de algodón, partes de plantas de algodón, plantas de la progenie de algodón, pelusa de algodón y productos básicos de algodón contienen una cantidad detectable de un polinucleótido de la invención, es decir, como un polinucleótido que tiene al menos una de las secuencias proporcionada como la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, o SEQ ID NO:26. Las plantas de algodón, las células vegetales, las semillas, las partes de la planta y las plantas de la progenie de la invención también pueden contener uno o más transgenes adicionales. Dicho transgén adicional puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o molécula de ARN que confiere un rasgo deseable incluso, entre otros, mayor resistencia a los insectos, mayor eficacia del uso de agua, mayor rendimiento, mayor resistencia a la sequía, calidad de semillas mejorada y/o mayor tolerancia al herbicida, en donde el rasgo deseable se mide con respecto a una planta de algodón que carece de dicho transgén adicional.
La invención proporciona plantas de algodón, células de plantas de algodón, semillas de algodón, partes de plantas de algodón (como polen, óvulo, vaina, tejido de flor, tejido de raíz, tejido de tallo y tejido de hoja), plantas de la progenie de algodón derivadas de una planta de algodón transgénica que contiene ADN del evento MON 88702. Se ha depositado una muestra que representa una semilla de algodón que contiene el ADN del evento MON 88702 de acuerdo con el tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC®). El depósito de la ATCC ha cedido la Designación de depósito de patente PTA-122520 para la semilla que contiene el ADN del evento MON 88702.
La invención proporciona un microorganismo que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia que se selecciona de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y la SEQ ID NO:26 presente en su genoma. Un ejemplo de tal microorganismo es una célula vegetal transgénica. Los microorganismos, tales como las células vegetales de la invención, son útiles en diversas aplicaciones industriales que incluyen de modo no taxativo: (i) el uso como herramientas para investigación científica o industrial, (ii) el uso en cultivos para producir productos proteicos, ácidos nucleicos, lipídicos o carbohidratos endógenos o recombinantes o moléculas pequeñas que pueden ser utilizadas en posterior investigación científica o como productos industriales y (iii) el uso con técnicas modernas de cultivo de tejidos vegetales para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos vegetales que pueden ser utilizados luego en producción o investigación agrícola. La producción y uso de microorganismos tales como células de plantas transgénicas utiliza técnicas microbiológicas modernas y la intervención humana para producir un microorganismo artificial y único. En dicho proceso, se inserta el ADN recombinante en el genoma de una célula vegetal para crear una célula vegetal transgénica independiente de las células vegetales de origen natural y única. Dicha célula vegetal transgénica puede ser cultivada, entonces, como las bacterias y levaduras, mediante técnicas modernas de microbiología y pueden existir en estado unicelular no diferenciado. La nueva composición genética de la célula de la planta transgénica y el fenotipo es un efecto técnico creado por la integración del ADN heterólogo en el genoma de la célula. Otro aspecto de la invención es un procedimiento para utilizar un microorganismo de la invención. Los procedimientos para utilizar los microorganismos de la invención, tales como células vegetales transgénicas, incluyen (i) procedimientos de producción de células transgénicas mediante la integración de ADN recombinante en el genoma de la célula y el posterior uso de dicha célula para derivar de ella células adicionales con el mismo ADN heterólogo, (ii) procedimientos de cultivo de células que contienen ADN recombinante que emplean técnicas modernas de microbiología, (iii) procedimientos de producción y purificación de productos proteicos, ácidos nucleicos, lipídicos o carbohidratos endógenos o recombinantes a partir de células cultivadas y (iv) procedimientos para utilizar técnicas modernas de cultivo de tejido vegetal con células vegetales transgénicas para producir cultivos de tejido vegetal transgénico o plantas transgénicas.
Las plantas de la invención pueden pasar a lo largo del ADN del evento MON 88702, incluso el transgén insertado en el evento de algodón MON 88702, hacia la progenie. Según se emplea aquí, “progenie” incluye cualquier planta, célula de planta, semilla, y/o parte de una planta regenerable que contiene el ADN del evento MON 88702 derivado de una planta ancestro y/o que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, y SEQ ID NO:26. Las plantas, la progenie y las semillas pueden ser homocigóticas o heterocigóticas para el transgén del evento MON 88702. La progenie se puede cultivar de las semillas producidas por una planta que contiene el evento MON 88702 de algodón y/o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contiene el evento MON 88702 de algodón.
Las plantas de la progenie se puede autopolinizar (también denominado “autofertilización”) para generar una verdadera línea de fitomejoramiento de las plantas, es decir, las plantas homocigotas para el transgén. La autopolinización de la progenie adecuada puede producir plantas homocigotas para genes exógenos, agregados.
Alternativamente, las plantas de la progenie se pueden cruzar, por ejemplo, reproducir con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta híbrida o varietal. La otra planta no relacionada puede ser transgénica o no transgénica. Por lo tanto, una planta o semilla híbrida o varietal de la invención se puede derivar mediante el cruzamiento sexual de un primer padre que carece del ADN específico y único del evento MON 88702 de algodón con un segundo padre que comprende el evento MON 88702 de algodón, que da como resultado un híbrido que comprende el ADN específico y único del evento de algodón MON 88702. Cada padre puede ser un híbrido o un endogámico/varietal, siempre que los resultados del cruzamiento o fitomejoramiento en una planta o semilla de la invención, es decir, una semilla que tiene al menos un alelo que contiene el ADN del evento MON 88702 de algodón y/o una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26. Por ende, dos plantas transgénicas pueden cruzarse para producir crías híbridas que contienen dos genes exógenos agregados independientemente segregantes. Por ejemplo, el MON 88702 que contiene TIC834_16 que confiere al algodón resistencia a los insectos se puede cruzar con otras plantas de algodón transgénicas para producir una planta que tenga las características de ambos padres transgénicos. Un ejemplo de esto sería un cruzamiento de MON 88702 que contiene TIC834_16, que confiere resistencia a los insectos Hemiptera y Thysanoptera al algodón con una planta que tiene uno o más rasgos adicionales, tal como tolerancia al herbicida (por ejemplo, el evento MON 88913 de algodón(MON-88913-8) o el evento de algodón LLCotton25 (ACS-GH001-3)) y/o el control de insectos (por ejemplo, el evento MON 15985 de algodón (MON-15985-7)), que da como resultado una planta o semilla de la progenie que tiene resistencia de modo de acción doble a las plagas de insectos Hemiptera y Thysanoptera y que tiene al menos uno o más rasgos adicionales. Se contemplan también el retrocruzamiento a una planta progenitora y el cruzamiento con una planta no transgénica, así como la propagación vegetativa. Las descripciones de otros procedimientos de fitomejoramiento que se utilizan comúnmente para obtener diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, enBreeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
La invención proporciona una parte de planta que se deriva de plantas de algodón que comprenden el evento MON 88702. Según se emplea aquí, una “parte de una planta” se refiere a cualquier parte de una planta que comprende un material derivado de una planta de algodón que comprende el evento MON 88702. Las partes de una planta incluyen, entre otros, polen, óvulo, vaina, flor, raíz o tejido del tallo, fibras y hojas. Las partes de una planta pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables.
Se divulga en el presente documento pero no es parte de la invención un producto básico que se deriva de plantas de algodón que comprenden el evento MON 88702 y que contienen una cantidad detectable de un ácido nucleico específico para el evento MON 88702. Según se emplea aquí, un “producto básico” se refiere a cualquier composición o producto que comprende un material derivado de una planta de algodón, semilla de algodón entera o procesada, una o más células vegetales y/o partes de plantas que contienen el ADN del evento de algodón MON 88702. Los productos básicos pueden ser vendidos a consumidores y pueden ser viables o no. Productos básicos no viables incluyen de modo no taxativo semillas no viables; semillas enteras o procesadas, partes de semillas, y partes de plantas; fibra de algodón, pelusa de algodón, aceite de algodón y derivados de aceite de algodón tal como manteca vegetal, jabones y cosmética, proteína de algodón, harina de algodón, alimento para animales que comprende algodón, papel que comprende algodón, biomasa de algodón, mechas para velas, cordón y cuerda, bolas de algodón, guata de algodón, productos de celulosa tal como ratón, plástico, película fotográfica, celofán, ácidos grasos utilizados para varios usos industriales tal como materiales de aislamiento, linóleo, hule, impermeabilización y como una base de pintura, y productos combustibles producidos utilizando plantas de algodón y partes de plantas de algodón. Los productos finales viables incluyen, entre otros, semillas, plantas y células vegetales. Por lo tanto, las plantas de algodón que comprenden el evento<m>O<n>88702 se pueden utilizar para fabricar cualquier producto básico típicamente obtenido del algodón. Este producto básico que se deriva de las plantas de algodón que comprenden el evento MON 88702 puede contener al menos una cantidad detectable del<a>D<n>específico y único correspondiente al evento de algodón MON 88702 y puede contener, específicamente, una cantidad detectable de un polinucleótido que comprende una molécula de Ad N que tiene al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26. Puede emplearse cualquier procedimiento de detección de moléculas de nucleótidos estándar, lo que incluye los procedimientos de detección divulgados en la presente. Un producto básico se encuentra dentro del alcance de la invención si hay cualquier cantidad detectable de una molécula de ADN con al menos una secuencia que se selecciona de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y la SEQ ID NO:26 en el producto básico.
Las plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de una planta (por ejemplo polen, óvulo, vaina, flor, tejido de raíz o tallo y hojas), y los productos básicos de la invención, por lo tanto, son útiles, entre otras cosas, para cultivar plantas a fin de producir semilla y/o partes de una planta que comprenden el evento MON 88702 de algodón para fines agrícolas, producir progenie que comprende el evento MON 88702 de algodón para fines de fitomejoramiento de plantas y de investigación, utilizar con técnicas microbiológicas de las aplicaciones industriales y de investigación y vender a los consumidores.
Se proporcionan los procedimientos para producir una planta de algodón resistente a los insectos que comprende las secuencias de ADN específicas y únicas del evento m On 88702 de la invención. Las plantas transgénicas utilizadas en estos procedimientos pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Las plantas de la progenie producidas a través de estos procedimientos pueden ser plantas híbridas o varietales; se pueden cultivar de las semillas producidas por una planta que contiene el evento MON 88702 de algodón o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contiene el evento MON 88702 de algodón; y pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Posteriormente, las plantas de la progenie se pueden autopolinizar para generar una verdadera línea de fitomejoramiento de las plantas, es decir, las plantas homocigotas para el transgén, o se pueden cruzar alternativamente, por ejemplo, reproducir con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta híbrida o varietal.
Se proporcionan procedimientos para detectar la presencia de ADN derivado de una célula de algodón, tejido de algodón, semilla de algodón o planta de algodón que comprenden el evento MON 88702 de algodón en una muestra. Un procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de algodón, tejido de algodón, semilla de algodón o planta de algodón, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con al menos un cebador que puede producir una secuencia de ADN específica para el ADN del evento MON 88702 en condiciones adecuadas para la secuenciación del ADN, (iii) realizar una reacción de secuenciación del ADN y luego (iv) confirmar que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON 88702, o la construcción comprendida allí, por ejemplo una seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26. Otro procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de algodón, tejido de algodón, semilla de algodón o planta de algodón, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con un par de cebadores que puede producir un amplicón del ADN del evento MON 88702 en condiciones adecuadas para la amplificación del ADN, (iii) realizar una reacción de amplificación del ADN y luego (iv) detectar el la molécula del amplicón y/o confirmar que la secuencia de nucleótidos del amplicón comprende una secuencia de nucleótidos específica para el evento<m>O<n>88702, por ejemplo una seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, y SEQ ID NO:6. El amplicón debería ser uno que sea específico para el evento MON 88702, tal como un amplicón que comprende la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6. La detección de una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON 88702 en el amplicón es determinante y/o de diagnóstico para la presencia de ADN específico del evento MON 88702 de algodón en la muestra. Un ejemplo de un par de cebadores que puede producir un amplicón del ADN del evento MON 88702 en condiciones adecuadas para la amplificación del ADN se proporciona como SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12. Otros pares de cebadores pueden ser diseñados fácilmente por un experto en la técnica y producirían un amplicón que comprende la SEQ ID<n>O:1, o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6, en donde este par de cebadores comprende al menos un cebador dentro de la región genómica que flanquea el inserto y un segundo cebador dentro del inserto. Otro procedimiento para detectar la presencia de ADN derivado de una célula de algodón, tejido de algodón, semilla de algodón o planta de algodón que comprende el evento de algodón MON 88702 en una muestra consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de algodón, tejido de algodón, semilla de algodón o planta de algodón, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con una sonda de ADN específica para el ADN del evento MON 88702, (iii) permitir que la sonda y la muestra de ADN se hibriden en condiciones estrictas de hibridación y luego (iv) detectar la hibridación entre la sonda y la muestra de ADN objetivo. Un ejemplo de la secuencia de una sonda de ADN que es específica para el ADN del evento MON 88702 se proporciona como SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:18. Otras sondas pueden ser diseñadas fácilmente por un experto en la técnica y comprenderían al menos un fragmento de ADN genómico que flanquea el inserto y al menos un fragmento de ADN inserto, tal como las secuencias proporcionadas, de modo no taxativo, en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:10. La detección de la hibridación de la sonda para la muestra de ADN es de diagnóstico para la presencia del ADN específico del evento MON 88702 de algodón en la muestra. La ausencia de hibridación es alternativamente de diagnóstico de la ausencia del ADN específico del evento MON 88702 de algodón en la muestra.
Se proporcionan kits de detección de ADN que son útiles para la identificación del ADN del evento MON 88702 de algodón en una muestra y también se pueden aplicar a procedimientos de fitomejoramiento de plantas de algodón que contienen el ADN del evento adecuado. Dichos kits contienen los cebadores y/o sondas de ADN que comprenden los fragmentos de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, y SEQ ID NO:26. Un ejemplo de dicho kit comprende al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:10 para funcionar como una sonda de ADN útiles para detectar la presencia y/o ausencia del ADN derivado de plantas de algodón transgénicas que comprenden el evento MON 88702 en una muestra. El ADN derivado de plantas de algodón transgénicas que comprenden el evento MON 88702 comprenderían una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia que se selecciona de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y la SEQ ID NO:26. Se proporciona una molécula de ADN suficiente para el uso como una sonda de ADN que es útil para determinar, detectar o diagnosticar la presencia y/o ausencia de ADN del evento MON 88702 de algodón en una muestra como SEQ ID NO:13. Un experto en la técnica puede diseñar fácilmente otras sondas y comprenderán al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39 o al menos 40 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:10 y serán lo suficientemente únicas para el ADN del evento MON 88702 de algodón para identificar el ADN derivado del evento. Otro tipo de kit comprende un par de cebadores útil para producir un amplicón útil para detectar la presencia y/o ausencia de ADN derivado del evento MON 88702 de algodón transgénico en una muestra. Este kit emplearía un procedimiento que comprenden poner contacto una muestra de ADN objetivo con un par de cebadores como se describe en la presente, luego realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos suficiente para producir un amplicón que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 YSEQ ID NO:26, y después detectar la presencia y/o la ausencia del amplicón. Este procedimiento también puede incluir la secuenciación del amplicón o de un fragmento de este, que sería determinante, es decir, de diagnóstico, para la presencia del ADN específico del evento MON 88702 de algodón en la muestra de ADN objetivo. Un experto en la técnica puede diseñar fácilmente otros pares de cebadores y comprenderán al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, y SEQ ID NO:26 y serán lo suficientemente únicos para el ADN del evento MON 88702 de algodón para identificar el ADN derivado del evento.
Los kits y procedimientos de detección de la invención son útiles, entre otras cosas, para identificar el evento MON 88702 de algodón, seleccionar las variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento MON 88702 de algodón, detectar la presencia de ADN derivado de las plantas de algodón transgénico que comprenden el evento MON 88702 en una muestra, y monitorear las muestras para reconocer la presencia y/o ausencia de plantas de algodón que comprenden el evento MON 88702 o partes de la planta derivadas de las plantas de algodón que comprenden el evento MON 88702.
La secuencia del inserto de ADN heterólogo, las secuencias de unión o las secuencias de flanqueo del evento MON 88702 de algodón se pueden verificar (y corregir, si fuera necesario) mediante la amplificación de dichas secuencias del evento con cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en la presente, seguida de la secuenciación del ADN estándar del amplicón o del ADN clonado.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de determinadas realizaciones preferidas de la invención.
INFORMACIÓN SOBRE DEPÓSITO
Se realizó un depósito de una muestra que representa la semilla de algodón que contiene el evento MON 88702 el 11 de septiembre de 2015 de acuerdo con el tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) que tiene una dirección en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EUA, código postal 20110, y n.° de resgistro ATCC asignado PTA-122520. Será posible acceder a los depósitos mientras que la solicitud presentada ante el Comisionado de patentes y marcas se encuentre pendiente, y será él quien determine quiénes tendrán derecho a tal acceso cuando se lo soliciten. Una vez que se otorgue la patente, se eliminarán en forma irrevocable todas las restricciones relativas a la disponibilidad al público. Se mantendrá el depósito durante un período de 30 años o 5 años luego de la última solicitud, o durante el plazo de vigencia de la patente, el que sea más largo, y será reemplazado las veces que sea necesario durante el trascurso de tal período de tiempo.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Selección y caracterización molecular del evento MON 88702 de algodón
Este ejemplo describe la transformación y la selección del evento MON 88702 de algodón. Se sabe que la expresión de transgenes en las plantas se ve afectada por su posición de inserción cromosómica, tal vez debido a la estructura cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o la proximidad de los elementos de regulación transcripcional (por ejemplo, potenciadores) cercanos al sitio de integración(Kurt Weisinget ál.,(1988) Foreign genes in plants: transfer, structure, expression and applications. Annu. Rev. Genet. 22: 421-77).Por este motivo, suele ser necesario evaluar una gran cantidad de eventos de transformación para identificar un evento que demuestra la expresión óptima del gen de interés introducido. Por ejemplo, se ha observado en las plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre los eventos. También puede haber diferencias en los patrones de expresión espaciales o temporales, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos de plantas, que pueden no corresponder con los patrones esperados de los elementos reguladores transcripcionales presentes en la construcción del gen introducido.
Por estos motivos, el desarrollo de una planta de algodón transgénica que comprende una proteína insecticida que fue activa contra Hemiptera y Thysanoptera sin ningún efecto negativo en la agronomía, cultivo o viabilidad de apilado requirió el análisis exhaustivo sobre varios años de aproximadamente dos mil cuatrocientos (2400) eventos derivados de treinta y nueve (39) diferentes construcciones de vectores de plásmidos. Los casetes de expresión individuales en las treinta y nueve (39) construcciones de plásmidos variaron con respecto a las secuencias de codificación para la proteína de toxina insecticida ya sea al utilizar la secuencia de codificación TIC834_16, la secuencia de codificación TIC807 (patente estadounidense US8,609,936), o las secuencias de codificación de proteínas de toxina insecticida variante relacionada de forma cercana a TIC834_16, referida como “proteínas de la toxina Hemiptera diseñada” y a la que se hace referencia como las variantes de TIC807 en la solicitud de patente de Estados Unidos US20130269060. Los casetes de expresión individuales en las treinta y nueve (39) construcciones de plásmido también variaron con respecto al uso de diferentes elementos de regulación transcripcional y si la proteína de la toxina insecticida fue dirigida al cloroplasto o no.
El casete de transgén presentado como la SEQ ID NO:27 es la construcción utilizada para producir el evento de algodón MON 88702. Numerosas rondas de pruebas y comparación de varias construcciones de vectores de plásmido revelaron que este casete transgénico produjo los eventos con la mejor eficacia contra las dos especies Lygus,Lygus hesperus(chinche lygus) yLygus lineolaris(chinche opaca de las plantas), cuando se comparó con los eventos producidos por otros casetes transgénicos de las otras treinta y ocho (38) construcciones.
El insecto Hemiptera y Thysanoptera transgénico resistente al evento de algodón MON 88702 se creó a través de una transformación mediada porAgrobacteriumde tejido de meristemo de algodón (patente estadounidense US8,044,260) con un sistema de dos ADN-T. En este sistema, se utilizó una cepa deAgrobacteriumque emplea un vector de plásmido binario con dos casetes de transgén de ADN-T. El primer casete de transgén de ADN-T se utilizó para la selección de células de plantas de algodón transformadas utilizando un marcador seleccionable que confiere tolerancia a la espectinomicina antibiótica. El segundo casete de transgén de ADN-T - que se presenta como la SEQ ID NO:27 y se demuestra en la FIG 1b - se insertó en el genoma de algodón para conferir resistencia insecticida a las plagas de insectos Hemiptera y Thysanoptera.
El segundo casete de transgén de ADN-T presentado como la SEQ ID NO:27 y mostrado en la FIG 1b comprende un borde de ADN-T derecho (RB), un potenciador (E) derivado del promotor FMV 35S, unido de forma operativa 5' a un promotor (P) derivado de la proteína de choque térmicoArabidopsis thaliana81.2 que forma un promotor FMV/Hsp81.2 quimérico (patente estadounidense, US8,940,962), que está unida de forma operativa 5' a un 5' UTR (L) derivado de la proteína de choque térmicoArabidopsis thaliana81.2, que está unida de forma operativa 5' a la secuencia de codificación TIC834_16 (solicitud de patente estadounidense, US20130269060), que está unida de forma operativa 5' a un 3' UTR (T) derivado del gen VI de virus mosaico de coliflor 35S, seguido por un borde de ADN-T izquierdo (LB). El primer casete de selección de transgén de ADN-T insertado de forma aleatoria en el genoma de algodón en un sitio separado del sitio de integración del segundo casete de transgén de ADN-T que contiene el casete de expresión TlC834_16, permitiendo de este modo la segregación de los dos segmentos de ADN-T dentro del genoma de las plantas de algodón transformadas durante el proceso de autofertilización y/o retrocruzamiento, por ejemplo, mediante el análisis de Ri y plantas transgénicas de generación superior.
Para producir MON 88702, la variedad de algodón DP393 (Deltapine, St. Louis, MO) se transformó utilizando el sistema binario de dos ADN-T descrito anteriormente. Las células de algodón transformadas se seleccionaron utilizando espectinomicina y se regeneraron en plantas de algodón intactas. Se seleccionaron plantas con raíces con características fenotípicas normales y se transfirieron al suelo para el cultivo y la evaluación posterior. Inicialmente, se crearon doscientos quince (215) eventos a partir del sistema de transformación de dos ADN-T con un primer casete de selección de transgén de ADN-T y un segundo casete de transgén de ADN-T que contiene el casete de expresión TIC834_16 de la SEQ ID NO:27.
Luego de la caracterización molecular preliminar, ciento treinta y tres (133) eventos se identificaron como calidad suficiente para evaluación y pruebas adicionales. Los eventos se analizaron utilizando un combinación de técnicas analíticas tal como TaqMan y/o análisis PCR para determinar la presencia del segundo casete de transgén de ADN-T que contiene el casete de expresión TIC834_16 y el número de copia del casete. A partir de este análisis, treinta y cinco (35) eventos R1 de una sola copia se seleccionaron y se cultivaron en la cámara de crecimiento y se evaluó su eficacia contraLygus lineolaris(chinche opaca de las plantas). El ensayo se llevó a cabo en tres (3) experimentos separados debido al límite de tamaño de las cámaras de crecimiento.
Los treinta y cinco (35) eventos se caracterizaron adicionalmente en mayor detalle molecular y fenotípicamente. Las plantas que demostraron eficacia luego se dejaron autopolinizarse y echar semillas para la caracterización adicional y el análisis de R2 y las generaciones posteriores. Del análisis de eficacia adicional veinticuatro (24) eventos se seleccionaron para análisis adicional y caracterización. Cada evento se analizó mediante análisis de transferencia Southern para determinar el número de la copia del casete de transgén que contiene el casete de expresión TIC834_16 de la SEQ ID NO:27, el punto de inserción dentro del genoma de algodón y la presencia de la estructura. Si se detectó la presencia de una estructura, el evento se analizó adicionalmente utilizando técnicas de amplificación de ADN para determinar si la estructura estaba unida al casete de transgén que contiene el casete de expresión TIC834_16 de la SEQ ID NO:27 y si un kilobase de la secuencia que flanquea los bordes izquierdo y derecho se encontraba en un gen nativo. A partir de este análisis doce (12) eventos permanecieron.
De los doce (12) eventos, un evento demostró la inserción del borde izquierdo en un gen nativo (evento 12), cuatro eventos demostraron la inserción del borde derecho en un gen nativo (Eventos 3, 7, 9 y 10) y cinco eventos no fueron capaces de ser caracterizados para la secuencia flanqueante (Eventos 5, 6, 8 y 9). Todos los doce (12) eventos fueron utilizados en posteriores evaluaciones de eficacia para proporcionar comparadores para el rendimiento. Específicamente, los doce (12) eventos se evaluaron y analizaron para ver la eficacia de resistencia a insectos en estudios en jaula de plantas enteras en cámaras de crecimiento, rendimiento de algodón de plantas de algodón transformadas y expresión de proteína.
Eficacia de resistencia a los insectos
Para evaluar la eficacia contraLygus lineolaris(chinche opaca de las plantas), cinco semillas R1 se sembraron en macetas de 10 pulgadas para cada uno de los doce (12) eventos de algodón transgénicos. Una variedad de algodón DP393 sin transformar se utilizó como un control negativo. Las plantas se mantuvieron en una cámara medioambiental con un fotoperíodo de dieciséis (16) horas de luz y treinta y dos (32) grados Celsius y ocho (8) horas de oscuridad a veintitrés (23) grados Celsius, y una intensidad de luz entre ochocientos (800) y novecientos (900) micro-Einsteins. De cuarenta (40) a cuarenta y cinco (45) días luego de la plantación, las plantas individuales se encerraron en una jaula hecha de láminas de “polinización” de plástico respirable (Vilutis and Company Inc, Frankfort, IL). Las mangas de las láminas se aseguraron al tallo principal justo sobre la superficie del suelo utilizando un amarre de Velcro®. Se recolectaron dos pares deLygus lineolarisadultos masculino y femenino sexualmente maduros (seis días de edad) de un cultivo de laboratorio en un tubo de plástico de fondo redondo de catorce mililitros (Bacton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ) y utilizados para cada planta. Los adultos se liberaron en cada jaula individual a través de una pequeña hendidura en el lado de la jaula y luego la jaula se cerró de forma segura para que los insectos no se escapasen. Se dejó que los insectos se reprodujeran y las plantas se mantuvieron en la jaula por veintiún (21) días.
Luego de veintiún (21) días, las plantas se cortaron debajo de las jaulas y se mudaron a un laboratorio donde los insectos se recolectaron para cada planta y se contaron. Antes de abrir la jaula, las plantas se agitaron de forma vigorosa para asegurar que todos los insectos cayeran de sus sitios de alimentación a la base de la jaula. Luego la base de la jaula se abrió y todo el material de la planta se quitó y se colocó en una lámina negra. Los insectos se recolectaron utilizando un aspirador. La planta luego se inspeccionó minuciosamente para recuperar cualquier insecto restante. La cantidad de insectos recolectados y su etapa de desarrollo se registró para cada planta. Los conteos de insectos se dividieron en varios grupos basándose en la madurez del Lygus: las ninfas hasta el 3er estadio, 4to estadio, 5to estadio y adultos. La Tabla 1 muestra la cantidad promedio de Lygus para cada uno de los doce eventos donde “SEM” es el error estándar del medio.
Tabla 1. Cantidad promedio de Lygus lineolaris (chinche opaca de las plantas) recuperada de plantas de algodón enjauladas transformadas con el casete de transgén que contiene el casete de expresión TIC834_16 de la SEQ ID NO:27.
Tal como se demostró en la Tabla 1, todos los eventos que expresan TIC834_16 demostraron resistencia aLygus lineolaris.El evento 2/MON 88702 proporcionó control superior de Lygus en este ensayo.
Rendimiento de algodón de plantas de algodón transformado
Para evaluar el rendimiento, los doce (12) eventos se cultivaron en el campo hasta madurez completa. Cuatro (4) filas de plantas de algodón se cultivaron para cada evento. El algodón se cultivó en dos puntos temporales diferentes durante el ciclo de crecimiento para cada fila. Los eventos se evaluaron para ver la presencia de TIC834_16. Si una fila tenía plantas a las que le faltaba TIC834_16, toda la fila se excluyó del ensayo de rendimiento. El rendimiento para cada evento se proporciona en la Tabla 2 y está expresada como libras de semillas de algodón (lb S.C.). Tal como se demostró en la Tabla 2, el evento de algodón MON 88702 proporcionó rendimiento superior.
Tabla 2. Rendimiento de las plantas de algodón transformadas con el casete de transgén que contiene el casete de expresión TIC834_16 de la SEQ ID NO:27.
Expresión de proteínas
La expresión de proteína se determinó utilizando las plantas derivadas de la semilla R2. Las plantas se cultivaron en el invernadero para cada uno de los doce (12) eventos que se evaluaron. Los tejidos se muestrearon en dos diferentes puntos temporales. Se cosecharon hojas y cuadrados a cuarenta y cinco (45) días luego de plantar (45L y 45S, respectivamente), y la hoja se cosechó a setenta (70) días luego de la plantación (70L). La expresión de la proteína se midió utilizando ELISA en tejido liofilizado y se expresó como partes por millón (ppm).
La expresión promedio de cada evento se proporciona en la Tabla 3. Tal como se demostró en la Tabla 3, la expresión de TIC834_16 varía con cada evento y dentro de cada tejido. El nivel de expresión no se correlaciona necesariamente con el nivel de las plantas de resistencia a lygus.
Tabla 3. Expresión de proteína promedio en tejidos seleccionados de plantas de algodón R2enjauladas transformadas con el casete de transgén que contiene el casete de expresión TIC834_16 de la SEQ ID NO:27.
Luego de varios años de caracterización extensiva, dos eventos resaltaron del resto como que proporcionan elevada resistencia al lygus, características fenotípicas beneficiosas, y rendimiento superior relativo al DP393 no transformado; evento 2 (MON 88702) y evento 10. Las secuencias flanqueantes izquierda y derecha de ambos eventos se utilizaron para BLAST contra los ensamblajes propietarios de ambos el genoma tetraploide de algodón de altura TM1(Gossypium hirsutum)y el genoma diploide de algodón D(Gossypium raimondii)para identificar cualquier tema potencial con la inserción en genes de algodón identificados, por lo tanto potencialmente interrumpiendo un gen nativo.
Inserción de un casete transgénico en un gen nativo puede ser problemático con respecto a la aprobación mediante agencias reguladoras. Tales observaciones pueden provocar que un producto no sea aprobado o que experimentación y caracterización extensiva sea realizada para demostrar que la inserción dentro del gen nativo no cause efectos perjudiciales en la planta. El evento 2/MON 88702 no parecía estar insertado dentro de un gen basándose en el conjunto de TM1 de algodón de altura y el genoma diploide de algodón D. En contraste, mientras que el Evento 10 no pareció insertarse dentro de un gen basándose en el conjunto de TM1 de algodón de altura, basándose en el conjunto de algodón D parecía que la inserción del casete transgénico ocurrió dentro del segundo intrón de un gen endógeno. Por lo tanto, el evento 10 tuvo una inserción de casete transgénico en un gen de algodón endógeno.
Dado que el evento 2/MON 88702 no tenía un problema de inserción, proporcionó un rendimiento superior en comparación con el evento 10 en estudios de campo, tuvo una caracterización molecular preferida, y demostró un rendimiento excelente durante varios años en ensayos de campo y jaula (como se presenta anteriormente y en los Ejemplos más adelante), se identificó como el evento superior y por lo tanto el evento seleccionado para comercialización.
EJEMPLO 2
El evento de algodón MON 88702 demuestra resistencia a infestaciones artificiales de Lygus hesperus (chinche lygus) y Lygus lineolaris (chinche opaca de las plantas) en ensayos en jaula en campo abierto.
MON 88702 proporciona resistencia a la especie Lygus,Lygus hesperus(chinche opaca de las plantas) yLygus lineolaris(chinche opaca de las plantas), tal como se demostró en el presente Ejemplo. Los experimentos en jaulas en campo abierto se llevaron a cabo durante temporadas de cultivo consecutivas. Ensayos contraLygus lineolarisse llevaron a cabo en Illinois en el año 1 y se repitieron en Tennessee en el año 2. Ensayos contraLygus hesperusse llevaron a cabo en Arizona en el año 1 y se repitieron en Arizona en el año 2. Las semillas del evento de algodón MON 88702 y el control negativo DP393 tratado con Acceleron® (que contiene fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb) se cultivaron en dos (2) parcelas de filas de quince (15) pies. De quince (15) a veinte (20) días luego de la plantación, las plantas se afinaron para lograr una postura uniforme. De treinta y cinco (35) a cuarenta (40) días luego de la plantación, se examinaron plantas individuales cuidadosamente para quitar cualquier peste y depredadores presentes. Una vez que todas las pestes y depredadores se quitaron, las plantas se encerraron en una jaula (150 X 228 centímetros) hecha de gasa sólida blanca (JoAnne Fabrics, número de artículo 8139875). La manga de gasa inferior se aseguró al tallo de la planta principal justo sobre la superficie del suelo y la manga superior se ató utilizando un amarre de Velcro®. Se colocaron postes de metal al final de cada fila y la parte superior de cada jaula se unió a una cuerda para mantener las jaulas en una posición erguida.
Las ninfas lygus se recolectaron de campos de alfalfa o canola y se criaron en el laboratorio. En el día de la eclosión, los adultos se recolectaron y se mudaron a un nuevo recipiente para monitorear su etapa de desarrollo. Al menos cien (100) a ciento cincuenta (150) adultos a una proporción de sexo de aproximadamente 1:1 se colocaron en recipientes de plástico grandes que proporcionaron cohorte uniforme para un apareamiento exitoso. En el día de la infestación, todos los adultos tenían al menos seis (6) días de vida mientras las plantas de algodón tenían cuarenta y cinco (45) a cincuenta (50) días luego de la plantación (es decir, la etapa de encuadramiento pico). Dos pares de adultos masculinos y femeninos se recolectaron en tubos de plástico de quince mililitros y se llevaron al campo.
Cada jaula se abrió desde la parte superior y se volvió a examinar para quitar cualquier peste y depredador que se pudo haber pasado por alto en la inspección previa o que haya nacido luego del enjaulado. Las plantas luego se infectaron al liberar los adultos lygus en la jaula. Ocho (8) plantas se infectaron por tratamiento. Se dejó que los insectos se reprodujeran y se dejó que la progenie resultante se alimentase en la planta de algodón enjaulada durante treinta (30) días. Luego de este período de tiempo, las plantas se cosecharon y la presencia de lygus para cada planta se recolectó y se registró tal como se describe en el Ejemplo 1.
La Tabla 4 y Tabla 5 muestran los conteos de insectos de la próxima generación promedio durante los años 1 y 2 paraLygus lineolarisyLygus hesperus,respectivamente. Los conteos de insectos se dividieron en varios grupos basándose en la madurez del lygus: ninfas pequeñas (definidas como ninfas hasta el 3er estadio), ninfas grandes (definidas como que se encuentran en el 4to estadio o el 5to estadio) y adultos. Las Tablas 4 y 5 muestran la cantidad promedio de lygus para MON 88702 y el control negativo DP393 para cada ensayo, donde “SEM” es el error estándar del promedio.
Tabla 4. Conteos de insectos de la siguiente generación promedio para el evento MON 88702 de algodón y el control negativo DP393 infestados con Lygus lineolaris.
Tabla 5. Conteos de insectos de la siguiente generación promedio para el evento MON 88702 de algodón y el control negativo DP393 infestados con Lygus hesperus.
Tal como se demostró en las Tablas 4 y 5, el evento MON 88702 de algodón transgénico proporciona protección contra ambosLygus lineolarisyLygus hesperus.Los conteos de insecto promedio para las ninfas pequeñas, ninfas grandes y adultas fueron mucho más bajas en las plantas enjauladas MON 88702 que las plantas de control DP393.
EJEMPLO 3
El evento MON 88702 de algodón proporciona resistencia a Lygus lineolaris y Lygus hesperus en el campo bajo presión de Lygus natural
Este Ejemplo demuestra la capacidad del evento MON 88702 de algodón transgénico para proporcionar resistencia a la especie de plaga HemipteraLygus hesperus(chinche lygus) yLygus lineolaris(chinche opaca de las plantas). Se llevaron a cabo ensayos de campo durante 3 años: año 1, año 2 y año 3 en varias ubicaciones que experimentaron diferentes niveles de presión de Lygus natural tal como se definió por un umbral económico determinado a través de dos (2) procedimientos de investigación. Para los campos en la región Delta de los Estados Unidos (Arkansas (AR), Louisiana (LA), Mississippi (MS) y Tennessee (TN)), se utilizó el procedimiento de tela protectora para investigar las especies Lygus predominantes,Lygus lineolaris(chinche opaca de las plantas). El procedimiento de tela protectora consiste esencialmente en colocar una tela protectora entre dos filas de algodón y agitar vigorosamente las plantas de ambas filas sobre la tela protectora. Los insectos se separan por etapa y se cuentan. Para campos en la región del sur de los Estados Unidos (Arizona (AZ) y California (CA)), se empleó el procedimiento de barrido con una malla y se utilizó para investigar la especie Lygus predominante,Lygus hesperus(chinche lygus). El procedimiento de investigación con barrido con una malla consiste esencialmente en barrer una malla a través de la parte superior del dosel vegetal durante una cantidad especificada de barridos y luego contar la cantidad de insectos luego de separarlos en etapas.
Parcelas de ocho (8) filas de algodón se cultivaron utilizando 120 semillas tratadas con Acceleron® (que contenía fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb) por fila de treinta (30) pies de largo para cada evento evaluado. Cada parcela se duplicó cuatro (4) veces en el campo. La variedad de algodón sin transformar DP393 se utilizó como un control negativo y se plantó en cuatro (4) duplicados de parcelas de ocho (8) filas tal como los eventos transgénicos. Las ninfas de Lygus muestreadas se dividieron en dos grupos, ninfas pequeñas (definidas como ninfas hasta el 3er estadio) y ninfas grandes (definidas como que se encuentran en el 4to estadio o el 5to estadio). La cantidad de ninfas detectadas se expresó como la cantidad de ninfas por cinco (5) pies de fila (5 pies fila).
La Tabla 6 muestra la cantidad de ninfas detectadas por cada 5 pies de fila para el evento MON 88702 de algodón transgénico y el control negativo DP393, donde “SEM” es el error estándar del promedio y “N” es la cantidad de plantas enjauladas y muestreadas. La presión de Lygus mostrada en la Tabla 6 es determinada respecto al umbral económico para aplicar insecticida en el campo de algodón. El umbral económico para aplicar insecticida en algodón para el control de Lygus se define de forma diferente dependiendo del tipo de procedimiento de investigación utilizado. El umbral económico convencional utilizando el procedimiento de tela protectora paraLygus lineolarises un total de tres (3) Lygus (cualquier etapa) por filas de 5 pies. El umbral económico para pulverizar insecticida en algodón para el control deLygus hesperusutilizando el procedimiento de barrido es un total de quince (15) Lygus (que incluyen 4-8 ninfas) por cada cien barridos. Debido a la variación natural en la presión de Lygus en los ensayos, las ubicaciones fueron categorizadas como sitios de presión bajos, medios o altos. La presión de Lygus baja se define como que se encuentra debajo del umbral económico a través de la temporada. La presión de Lygus media se define como que es igual o mayor que una vez el umbral económico, o menos que tres veces el umbral económico en cualquier momento en la temporada. La presión de Lygus alta se define como que es igual o mayor que tres veces el umbral económico, en cualquier momento en la temporada.
Para la evaluación de eficacia de rasgo transgénico, no se puede asumir que la cantidad total de ninfas como adultos atrapados durante el muestreo se han desarrollado en esa parcela particular. Tal como se puede ver en la Tabla 6, la cantidad total de ninfas detectadas en las filas del evento MON 88702 transgénico fue consistentemente menor que la cantidad total de ninfas en las filas de control sin transformar. Esta observación fue consistente sin importar la presión de Lygus natural en cada campo a través de tres (3) años. Esto demuestra que el evento MON 88702 de algodón transgénico proporciona resistencia superior a ambosLygus lineolarisyLygus hesperusen experimentos de campo de algodón relativos al algodón sin trasformar.
EJEMPLO 4
El evento MON 88702 de algodón proporciona rendimiento superior en el campo bajo presión de Lygus natural baja, media y elevada
Este Ejemplo demuestra la capacidad del evento MON 88702 de algodón transgénico de proporcionar rendimiento superior en los campos infestados con las especies de plaga Hemiptera Lygus hesperus (chinche lygus) y Lygus lineolaris (chinche opaca de las plantas) relativa a las plantas de algodón sin transformar.
Se llevaron a cabo ensayos de campo en tres años consecutivos en varias ubicaciones que experimentaron diferentes niveles de presión de Lygus natural tal como se describe en el Ejemplo 3. Las dos filas centrales de cada parcela de ocho filas se cultivaron y el rendimiento se midión y expresó en libras de semilla de algodón por acre (lbs/acre). La Tabla 7 demuestra el rendimiento de la semilla de algodón por acre para cada una de las ubicaciones de campo y se divide basándose en la presión de Lygus natural experimentada en cada campo. El cambio de porcentaje de columna versus el control muestra el porcentaje aumentado de rendimiento en el evento MON 88702 respecto al control negativo DP393 sin transformar.
Tabla 7. Rendimiento de semillas de algodón para el evento MON 88702 y DP393 sin transformar en campos bajo presión de Lygis variante.
Tal como se demostró en la Tabla 7, el evento MON 88702 transgénico de algodón proporcionó de forma consistente rendimientos más altos de algodón bajo diferentes grados de presión de Lygus natural con la excepción del ensayo de LA del año 1 de baja presión. El siguiente año, una mejora en el rendimiento de 11 % se observó para esta misma ubicación bajo presión baja de Lygus. La mejora en el rendimiento visto con el evento MON 88702 fue mayor en campos que experimentan presión de Lygus media y alta. Bajo presión media de Lygus, el evento MON 88702 proporcionó aumentos de rendimiento de treinta y tres (33) a sesenta y ocho (68) por ciento, dependiendo de la ubicación en que cultivada. Bajo presión alta de Lygus, el evento MON 88702 proporcionó aumentos de rendimiento de cincuenta y tres (53) a ciento cincuenta y siete (157) por ciento, dependiendo de la ubicación en que cultivada.
EJEMPLO 5
El evento MON 88702 de algodón proporciona rendimiento superior en el campo bajo presión de Lygus natural media y elevada con o sin aplicaciones de insecticidas
Este Ejemplo ilustra el rendimiento superior del evento MON 88702 de algodón transgénico bajo presión de Lygus medio y alto con o sin aplicación de insecticidas cuando se compara con algodón sin transformar de la misma variedad.
El rendimiento de algodón en ensayos de pulverización de insecticida se evaluó en seis ubicaciones en una sola temporada de cultivo. Parcelas de ocho (8) filas de algodón se cultivaron utilizando ciento veinte (120) semillas tratadas con Acceleron® (que contenía fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb) por cada fila de treinta (30) pies de largo para el evento MON 88702. La variedad de algodón sin transformar DP393 se plantó y utilizó como un control negativo. Cada parcela se duplicó tres (3) veces en el campo. Se diseñaron tres (3) bloques de tratamiento para evaluar el rendimiento de algodón en condiciones cuando las parcelas no se trataron con insecticida para controlar el Lygus o fueron tratados con insecticida para controlar el Lygus. El bloque de tratamiento donde no se aplicó ningún insecticida para controlar el Lygus durante la temporada se refiere como el “bloque sin pulverizar”. Dos bloques de tratamiento en los que se aplicó insecticida para controlar el Lygus son referidos como “pulverización por entrada” y “pulverización por bloque”. Por pulverización por entrada, la entrada individual que contiene MON 88702 o DP393 sin transformar se pulveriza con insecticida cuando el promedio de las tres (3) repeticiones de esa entrada particular está en un umbral económico convencional paraLygus lineolariso quince (15) Lygus por cien (100) barridos paraLygus hesperus.Por pulverización por bloque, la totalidad del bloque que contiene ambos eventos MON 88702 y DP393 sin transformar se pulveriza con insecticida cuando el promedio de las tres (3) repeticiones del DP393 en ese bloque está en un umbral económico paraLygus lineolariso quince (15) Lygus por cien barridos paraLygus hesperus.La Tabla 8 muestra el rendimiento expresado en lbs/acre para los tres (3) bloques en cada ubicación evaluada, junto con la presión de Lygus natural experimentada en cada ubicación.
Tal como se demostró en la Tabla 8, el evento MON 88702 no tratado con insecticida y tratado con insecticida proporcionó mayor rendimiento respecto al control sin transformar DP393 correspondiente. Sin tratamiento insecticida, el porcentaje de aumento en el rendimiento varió de 21 % a 188 %, dependiendo de la ubicación. Con pulverización por entrada, el porcentaje de aumento en el rendimiento varió de 5 % a 72 %, dependiendo de la ubicación. Con pulverización por bloque, el porcentaje de aumento en el rendimiento varió de 8 % a 47 %, dependiendo de la ubicación. En todas las ubicaciones, estén o no tratadas con insecticidas, el evento MON 88702 de algodón transgénico proporcionó rendimiento aumentado relativo al control sin transformar.
��EJEMPLO 6
El evento MON 88702 de algodón proporciona resistencia en el campo bajo presión de trips natural media y elevada
Este Ejemplo ilustra la capacidad del evento MON 88702 de algodón transgénico de proporcionar resistencia excelente a trips en presión de trips natural media y elevada cuando se compara con plantas de algodón sin transformar en el campo durante una sola temporada de plantación en múltiples ubicaciones de campo.
Parcelas de ocho (8) filas de algodón se cultivaron utilizando ciento veinte (120) semillas para el evento MON 88702 o la variedad DP393 de algodón sin transformar por filas de treinta (30) pies de largo (cuatro semillas por pie de fila) tratada con Acceleron® (que contiene fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb). Cada parcela se duplicó cuatro (4) veces en el campo.
El daño a las plantas de algodón causado por las trips se evaluó durante la etapa de hoja verdadera 2-4 utilizando una escala de evaluación de daños de 0-5. Una calificación de evaluación de daño de cero (0) equivale a ningún daño y ningún trips observados. Una calificación de daño de uno (1) corresponde a una indicación de que hay trips presentes. Una calificación de daños de dos (2) corresponde a un daño menor al brote terminal y las hojas. Una calificación de daños de tres (3) corresponde a un daño moderado al brote terminal y las hojas. Una calificación de daños de cuatro (4) corresponde a daño grave al brote terminal y hojas con algunas plantas muertas y brotes terminales abortados. Una calificación de daños de cinco (5) corresponde a la muerte de la planta, debilitamiento grave, internodos apilados, área de hoja reducida y aborto de brote terminal de la mayoría de las plantas. Debido a la variación natural en la presión de trips en los ensayos, las ubicaciones fueron categorizadas como sitios de presión bajos, medios o altos. La presión de trips natural baja, media y alta se define mediante la puntuación de calificación de daño más alta registrada para la variedad no transformada en cualquier tiempo de calificación en esa ubicación particular. La presión de trips baja corresponde a una calificación de daños debajo de dos (2). La presión de trips media corresponde a una calificación de daño igual o mayor que dos (2) y menos que cuatro (4). La presión de trips alta corresponde a una calificación de daño igual o mayor que cuatro (4). La Tabla 9 demuestra las calificaciones de daño de trips promedio para tres ubicaciones cultivadas en una sola temporada de plantación.
Tabla 9. Calificaciones de daño de trips promedio para MON 88702 y el control negativo DP393 en 2014.
Tal como se demostró en la Tabla 9, el evento MON 88702 de algodón proporciona resistencia contra los trips(Frankliniellaspp). El evento MON 88702 de algodón transgénico tuvo de forma consistente puntuaciones de calificación de daño considerablemente menores respecto al control negativo DP393, sin importar la presión de trips natural.
EJEMPLO 7
El evento MON 88702 de algodón proporciona resistencia a trips en el campo con o sin aplicación de insecticida, y con o sin tratamiento de semillas
Este Ejemplo ilustra la capacidad del evento MON 88702 de algodón transgénico de proporcionar resistencia a trips superior a múltiples especies de trips, que incluyenFrankliniella fusca(trips de tabaco),Frankliniella tritici(trips de las flores),Frankliniella occidentalis(trips occidental de las flores), ySericothrips variabilis(trips de soja), con o sin aplicación de insecticida y con o sin tratamiento de semilla cuando se compara con el control DP393 sin transformar en campos durante una sola temporada de cultivo.
Parcelas de cuatro (4) filas de algodón se cultivaron utilizando ciento veinte (120) semillas del evento MON 88702 de algodón transgénico o el DP393 sin transformar por fila de treinta (30) pies de largo (cuatro semillas por pie de fila). Las semillas fueron tratadas con Acceleron® (que contiene fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb), o solo fungicidas. Además, las parcelas fueron o no pulverizadas con insecticida. El diseño experimental se muestra en la Tabla 10. Para aquellas parcelas en las que un insecticida fue pulverizado, una aplicación foliar profiláctica de Orthene (acefato) se aplicó en la etapa una (1) a dos (2) de hoja verdadera. El daño a las plantas de algodón causado por trips se evaluó en dos momentos temporales diferentes (primero en la etapa una a dos de hoja verdadera y segundo en la etapa tres a cuatro de hoja verdadera) utilizando una escala de calificación de daño de 0 5 tal como se describe previamente en el Ejemplo 6. Dos calificaciones de daño fueron realizadas en cada ubicación, con la excepción de los ensayos TN en los que cuatro calificaciones de daño fueron realizados para el ensayo 1 y tres calificaciones de daños fueron realizados para el ensayo 2.
Tabla 10. Diseño experimental de ensayo de campo de resistencia a trips.
Las calificaciones de daño por trips fueron obtenidas de múltiples sitios: VA, sitio MS 1, sitio MS 2, GA, sitio MS 3, sitio LA 1, sitio LA 2, SC y TN. Se realizaron dos ensayos en V<a>, sitio MS 3 y TN. Las Tablas 11 a 22 muestran las calificaciones de daño por trips media para el evento MON 88702 de algodón transgénico y el control no transformado, DP393 para cada ensayo de sitio de campo, donde “SEM” es el error estándar de la media.
T l 11. lifi i n ñ r ri m i A n 1.
Tabla 12. Calificaciones de daño por trips media de CA, ensa o 2.
Tabla 13. Calificaciones de daño por trips media de sitio MS 1.
Tabla 14. Calificaciones de daño por trips media de sitio MS 2.
Tabla 15. Calificaciones de daño por trips media de GA.
Tabla 16. Calificaciones de daño por trips media de sitio MS 3, ensayo 1.
Tabla 17. Calificaciones de daño por trips media de sitio MS 3, ensa o 2.
Tabla 18. Calificaciones de daño por trips media de sitio LA 1.
Tabla 19. Calificaciones de daño por trips media de LA sitio 2.
Tabla 20. Calificaciones de daño por trips media de SC.
Tabla 21. Calificaciones de daño por trips media de TN, ensa o 1.
Table 22. Mean thrips damage ratings from TN, trial 2.
Tal como se demostró en las Tablas 11 a 22, el evento MON 88702 de algodón transgénico proporciona resistencia a trips en condiciones de campo relativo a la misma variedad no transformada. El evento MON 88702 transgénico proporcionó resistencia a trips en cada ubicación decantidad de campo cuando se comparó con el DP393 sin transformar. La resistencia a trips se observó en el evento MON 88702 transgénico sin tratamiento de semilla insecticida así como sin aplicación de insecticida foliar profiláctico. Las clasificaciones de daño por trips para las plantas MON 88702 sin pulverizar cultivadas a partir de semillas solo tratadas con fungicida fue menor que las de DP393 sin transformar que fue cultivada a partir de semillas tratadas con insecticida y pulverizadas con insecticida foliar. Esto se destaca particularmente en los dos ensayos realizados en VA (Tablas 10 y 11). En muchas ubicaciones tal como VA, sitio MS 2, y GA, las clasificaciones de daño para MON 88702 disminuyeron desde el primer punto temporal de datos al siguiente, mientras que la tendencia opuesta se observó para el DP393 sin transformar, sin importar el tratamiento de semilla y pulverización profiláctica. Los trips adultos se recolectaron e identificaron para evaluar la composición de las especies en cada ubicación. La composición de las especies observadas se muestra en la Tabla 23.
Tabla 23: Composición de trips a través de ensayos de trips en ubicaciones diferentes.
EJEMPLO 8
El evento MON 88702 de algodón proporciona resistencia a la pulga saltona del algodón (Pseudatomoscelis seriatus) tal como se demostró en ensayos en jaula y en campo abierto en dos años consecutivos
Este ejemplo ilustra que el evento MON 88702 de algodón transgénico proporciona resistencia contra la plaga de insecto Hemiptera,Pseudatomoscelis seriatus(pulga saltona del algodón, CFH) cuando se comparó con el control negativo no transformado, DP393.
Los ensayos en jaula se realizaron en el campo en TX durante la temporada de cultivo de algodón del año 1 y se evaluó su resistencia contra la pulga saltona del algodón. Parcelas de dos (2) filas de algodón se cultivaron utilizando ciento veinte (120) semillas del evento MON 88702 de algodón transgénico o el control negativo de DP393 sin transformar por fila de treinta (30) pies de largo (cuatro semillas por pie de fila). Las semillas fueron tratadas con Acceleron® (que contiene fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb.
En la segunda semana de encuadramiento, que ocurre alrededor de treinta y cinco (35) a cuarenta (40) días luego de la plantación, diez (10) plantas seleccionadas de forma aleatoria (cinco (5) de cada fila) se encerraron en una jaula (150 X 228 centímetros) hecha de gasa sólida blanca (JoAnne Fabrics, Item Number 8139875). La manga de gasa inferior se aseguró al tallo de la planta principal justo sobre la superficie del suelo y la manga superior se ató utilizando un amarre de Velcro®. Se colocaron postes de metal al final de cada fila y la parte superior de cada jaula se unió a una cuerda para mantener las jaulas en una posición erguida.
Cada planta se infectó con dos pares de adultos masculino y femenino de la pulga saltona del algodón. Los adultos se liberaron en cada jaula individual y luego la jaula se cerró de forma segura para que los insectos no se escapasen. Se dejó que los insectos se reprodujeran y las plantas se mantuvieron en la jaula por treinta (30) días. Luego de treinta días, las plantas se cortaron debajo de las jaulas y se mudaron a un laboratorio donde los insectos se recolectaron para cada planta y se contaron. Antes de abrir la jaula, las plantas se agitaron de forma vigorosa para asegurar que todos los insectos cayeran de sus sitios de alimentación a la base de la jaula. Luego se abrió la base de la jaula. La planta luego se inspeccionó minuciosamente para recuperar cualquier insecto restante. Las cantidades de insectos y su etapa de desarrollo se registró para cada planta. Los números medio de la próxima generación de las ninfas pequeñas (antes del 3er estadio), las ninfas grandes (4to y 5to estadio) y adultas se presentan en la Tabla 24, donde “SEM” es el error estándar de la media y “N” es la cantidad de las plantas enjauladas y muestreadas.
Tabla 24. Conteos de insectos de la siguiente generación promedio para el evento MON 88702 de algodón y el control negativo DP393 infestados con CFH en TX, ensayo de enjaulado en campo de año 1.
Tal como se puede ver en la Tabla 24, la cantidad total de insectos de pulga saltona del algodón recuperada de las jaulas para el evento MON 88702 de algodón fue aproximadamente la mitad de la cantidad encontrada en el control DP393 sin transformar. De importancia particular es la cantidad de adultos de la siguiente generación registrados. El DP393 sin transformar tuvo aproximadamente 4 veces más adultos en comparación con el evento MON 88702, lo que sugiere que durante el desarrollo, menos ninfas alcanzaron la adultez debido a la toxina de insecto expresada, TIC834_16 en MON 88702. Las pulgas saltonas del algodón pasan el invierno en la etapa de huevo en varias malezas hospedadores que incluyen croton, onagra, trompillo y hierba de pajarito. Los huevos eclosionan en la primavera con pulgas saltonas del algodón infestando malezas hospedadoras disponibles. Una vez que el algodón comienza a cuadrarse, las pulgas saltonas del algodón pueden mudarse hacia esos campos, y generalmente los hacen. Generalmente le toma una generación en los campos de algodón más tempranos producir cantidades que dañen económicamente. Reducir la cantidad de pulgas saltonas del algodón adultas en esta generación más temprana puede reducir potencialmente el rendimiento y el impacto económico causado por la pulga saltona del algodón de la próxima generación.
En el año 2, los ensayos de pulgas saltonas del algodón se llevaron a cabo en un invernadero. Doce (12) plantas del evento MON 88702 de algodón transgénico y el DP393 sin transformar se cultivaron en el invernadero y se enjaularon en una manera similar tal como se describe anteriormente. La infestación de la pulga saltona del algodón y los conteos de ninfas pequeñas, ninfas grandes y adultas también se realizaron tal como previamente se describió excepto que tres pares de adultos se liberaron en cada jaula. La Tabla 25 muestra la cantidad media de ninfas pequeñas de siguiente generación, ninfas grandes y adultas encontradas para MON 88702 y DP393, donde “SEM” es el error estándar del promedio y “N” es la cantidad de plantas enjauladas y muestreadas.
Tabla 25. Conteos de insectos de la siguiente generación promedio para el evento MON 88702 de algodón y el control ne ativo DP393 infestados con CFH en TX, ensa o de en aulado en invernadero de año 2.
Tal como se demostró en la Tabla 25, la cantidad total de pulgas saltonas del algodón presentes en MON 88702 fue menor que aquella del control negativo, DP393. De forma consistente con los ensayos en jaula de campo del año anterior, la cantidad de pulgas saltonas del algodón adultas asociadas con el control negativo fue mucho más alto (aproximadamente 3 veces) que aquella de MON 88702.
En la temporada de cultivo del año 2, los ensayos de campo también fueron llevados a cabo contra la pulga saltona del algodón en AZ y TX. Parcelas de ocho (8) filas de algodón se cultivaron utilizando ciento veinte (120) semillas del evento MON 88702 de algodón transgénico o el DP393 sin transformar por fila de treinta (30) pies de largo (cuatro semillas por pie de fila). Las semillas fueron tratadas con Acceleron® (que contiene fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb). Hay cuatro (4) repeticiones de cada entrada en ambas ubicaciones.
Las pulgas saltonas del algodón se recolectaron utilizando la malla de barrido en la ubicación AZ y el balde en la ubicación TX. El procedimiento con barrido con una malla consiste esencialmente en barrer a través de la parte superior del dosel vegetal durante una cantidad especificada de barridos y luego contar la cantidad de insectos luego de separarlos en etapas. Un total de veinte (20) barridos se llevaron a cabo para cada parcela. Los barridos se llevaron a cabo en dos (2) series de diez (10) barridas cada una. La primera serie se realizó entre las filas dos y tres. La segunda serie se realizó entre las filas seis y siete. Los insectos atrapados en las mallas se colocaron en las mallas y se trajeron de regreso al laboratorio para su conteo. El número medio de ninfas de pulgas saltonas del algodón para MON 88702 y el control no transformado DP393 se determinó para cada sitio. En el procedimiento del balde, las plantas se agitaron en un balde de 5 galones asegurándose que todas las ninfas salieran de la planta y se colocase todo el contenido del balde en bolsas con cierre hermético previamente etiquetado. Tres (3) series de diez (10) plantas sometiendo a cada una a muestreo con un total de treinta (30) plantas muestreadas por parcela por vez.
Además de los conteos de las pulgas saltonas del algodón, se evaluó el rendimiento de cada parcela. Se cosecharon las cápsulas de las filas cuatro (4) y cinco (5) y el rendimiento de la semilla algodón promedio se determinó y expresó como rendimiento/acre de semilla de algodón. La Tabla 26 muestra la cantidad media de ninfas de pulgas saltonas del algodón y el rendimiento medio para MON 88702 y el control sin transformar DP393 para cada sitio donde “SEM” es el error estándar del promedio y “N” es la cantidad de plantas enjauladas y muestreadas.
Tabla 26. Cantidad media de ninfas CFH y rendimiento de semillas de algodón medio en los ensayos en campo abierto del año 2.
La Tabla 26 muestra que la cantidad media de ninfas de pulga saltona del algodón fue menor para MON 88702 que el DP393 sin transformar. Además, el rendimiento de algodón medio fue mayor en MON 88702 que en el DP393 sin transformar.
Tal como se demostró en las Tablas 24-26, el evento MON 88702 de algodón proporciona resistencia a la pulga saltona del algodón en ambos ensayos en jaula y en el campo y proporciona un aumento en el rendimiento del algodón.
EJEMPLO 9
El evento MON 88702 de algodón proporciona resistencia a la chinche verde
(Creontiades signatus) tal como se demostró en los ensayos en jaula
Este Ejemplo ilustra que el evento MON 88702 de algodón transgénico proporciona resistencia contra la plaga de insecto Hemiptera,Creontiades signatusDistant (chinche verde) en ensayos en jaula realizados en TX cuando se comparó con el control negativo no transformado, DP393.
Las ninfas de la chinche verde se recolectaron de plantas en el campo y se trajeron de regreso al laboratorio para ser criadas. Una vez que los adultos alcanzaron la madurez reproductiva (aproximadamente diez (10) días luego de la emergencia), fueron utilizados para infestar el evento MON 88702 de algodón o el control sin transformar DP393 en plantas de algodón enjauladas.
Parcelas de ocho (8) filas de algodón se cultivaron utilizando ciento veinte (120) semillas del evento MON 88702 de algodón transgénico o el DP393 sin transformar por fila de treinta (30) pies de largo (cuatro (4) semillas por pie de fila). Las semillas fueron tratadas con Acceleron® (que contiene fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb). Cuatro (4) parcelas duplicadas se cultivaron por evento. Doce (12) plantas por cada evento se seleccionaron de forma aleatoria para el enjaulado. Se quitó todo insecto en las plantas seleccionadas antes del enjaulado. Las plantas se enjaularon al menos una semana antes del florecimiento pico tal como se describe previamente en el Ejemplo 2. Cada planta se infectó con dos pares de chinche verde masculino y femenino. Se dejó que los insectos ovopositen y se desarrollen en cada planta durante cuatro (4) semanas luego de la infestación. Ocho (8) a diez (10) cápsulas fueron cosechadas de cada planta y examinadas para ver el daño a los lóculos, así como las punciones del interior y exterior hechas por las chinches verdes.
La Tabla 27 muestra la media de lóculos dañados de las cápsulas cosechadas, donde “SEM” es el error estándar del promedio y “N” es la cantidad de plantas enjauladas y muestreadas. Tal como se puede ver en la Tabla 27, hubo menos lóculos dañados en las plantas del evento MON 88702 que en el control sin transformar DP393.
Tabla 27. Media de lóculos dañados por cápsula por planta de plantas infestadas con la chinche verde.
La Tabla 28 muestra la media de punciones exteriores e interiores donde “SEM” es el error estándar del promedio y “N” es la cantidad de plantas enjauladas y muestreadas. Tal como se puede ver en la Tabla 28, la cantidad media de punciones exteriores e interiores en las cápsulas fue menor para el evento MON 88702 que en el control sin transformar DP393.
Tabla 28. Media de punción exterior e interior por cápsula de plantas infestadas con la chinche verde.
Tal como se demostró en las Tablas 27 y 28, el evento MON 88702 de algodón demuestra resistencia contra la chinche verde tal como lo evidencia en la cantidad menor de daño al lóculo así como menos punciones exteriores e interiores cuando se comparó con el control negativo sin transformar DP393.
EJEMPLO 10
El evento MON 88702 de algodón proporciona rendimiento consistente, agronomía similar, y calidad de fibra similar en el campo cuando se compara con DP393 sin transformar.
Este Ejemplo demuestra que el evento MON 88702 de algodón transgénico proporciona rendimientos consistentes en el campo.
El evento MON 88702 de algodón se comparó con el DP393 sin transformar en el campo durante dos años de evaluación en dos años consecutivos para evaluar cualquier diferencia en rendimiento en condiciones en los que la infestación de insectos se controló utilizando pulverizadores insecticidas contra plagas no Lygus y Lygus. Parcelas de dos (2) filas de algodón se cultivaron utilizando ciento sesenta (160) semillas del evento MON 88702 de algodón transgénico o el control negativo de DP393 sin transformar por fila de cuarenta (40) pies de largo (cuatro (4) semillas por pie de fila). Las semillas fueron tratadas con Acceleron® (que contiene fungicidas, el insecticida Imidacloprid, y el nematicida Thiodicarb. Cada parcela se duplicó cuatro (4) veces. Pulverizadores insecticidas se aplicaron según fue necesario para controlar plagas de insectos Lygus y no Lygus para minimizar cualquier daño potencial a las parcelas.
Al final de la temporada, el crecimiento se terminó al utilizar defoliantes comercialmente disponibles y abridores de cápsulas. Los defoliantes utilizados de esta manera frecuentemente se denominan “ayudas al cultivo”. Quitar las hojas antes de cultivar proporciona varias ventajas. Por ejemplo, quitar las hojas antes de cultivar aumenta el movimiento de aire a través del dosel vegetal del cultivo que facilita un secado más rápido y evita la putrefacción de la cápsula. Este proceso también permite que el recolector comience más temprano en el día y proporciona una operación del recolector más rápida y eficiente. Al reducir la humedad más eficazmente, el almacenamiento de las cápsulas en los módulos mejora de gran manera. Quitar las hojas también elimina una fuente principal de manchas y basura que proporciona un mejor grado de pelusa. Los abridores de cápsulas facilitan la abertura de las cápsulas maduras que permite que las operaciones de cultivo comiencen varios días antes, aumentando el porcentaje del cultivo cosechado durante la primera recolección y hace de la recolección una operación superficial en muchos campos. Los defoliantes y abridores de cápsulas se aplicaron cuando sesenta (60) por ciento de las cápsulas estaban abiertas en el campo.
Para evaluar el rendimiento, ambas filas de cada parcela de dos (2) filas fueron cultivadas y el rendimiento registrado como “semillas de algodón por acre”. Los resultados de rendimiento se presentan en la Tabla 29.
Tabla 29. Rendimiento de semillas de algodón en libras por acre de los cultivos en el campo del año 1 y el año 2.
Tal como se demostró en la Tabla 29 anteriormente, MON 88702 y DP393 sin transformar proporcionó rendimientos similares de algodón en el campo. Esto demostró que el evento MON 88702 de algodón al expresar la toxina del insecto TIC834_16 no experimenta un obstáculo al rendimiento debido a la expresión del transgén. De hecho, tal como se muestra en los Ejemplos 4 y 5, el evento MON 88702 de algodón proporciona una ventaja de rendimiento considerable con o sin la aplicación del insecticida en condiciones de presión de Lygus.
Las plantas también se evaluaron en busca de cualquier diferencia fenotípica en el año 1 y el año 2. Ejemplos de diferencias fenotípicas incluyen puntuación de vigor temprano (EVS, por sus siglas en inglés), cantidad de nodos, altura de la planta y madurez (cantidad de semanas). La puntuación de vigor temprano se determina a aproximadamente diez (10) a catorce (14) días luego de que las plantas han emergido. La puntuación es una calificación visual utilizada para determinar si la parcela tiene potencial de rendimiento completo basándose en la emergencia de las plantas en la parcela. Las parcelas están calificadas utilizando una escala de uno a cinco. Una calificación de cuatro o cinco indica bajo vigor, mientras que una calificación de uno corresponde a alto vigor. La tabla 30 muestra los valores fenotípicos entre MON88702 y el control negativo DP393 para el vigor temprano, cantidad de nodos, altura de la planta y madurez de la planta. Cada uno de los valores está expresado como un promedio. Las comparaciones se realizaron para cada temporada de cultivo. Esos valores indicados por “*” representan una diferencia considerabel (p=0.05) en comparación con el control dentro de la temporada de cultivo. ;Tabla 30. Características fenotípicas de MON 88702 y DP393 sin transformar en el campo en el año 1 y el año2.;;; ;;;
Tal como se puede ver en la Tabla 30, el evento MON 88702 de algodón transgénico demostró características fenotípicas similares como el DP393 sin transformar. Una pequeña diferencia se observó con respecto a la altura de la planta en 2013, sin embargo el siguiente año ambos MOB 88702 y DP393 estaban de casi la misma altura promedio. Con respecto a la postura de vigor temprano, la cantidad de nodos y madurez, ambos MON 88702 y DP393 no fueron considerablemente diferentes a través de las temporadas de cultivo. ;;Se recolectaron veinticinco (25) cápsulas por parcela se recolectaron antes de cultivar para evaluar la calidad de la fibra y otras características. Las cápsulas fueron recolectgadas de un punto representativo en la fila de plantación. Todas las cápsulas se cultivaron de las plantas seleccionadas para evitar la introducción de cualquier imparcialidad en la recolección debido al tamaño u otras características. Las características de la calidad de la fibra tal como la fuerza de la fibra, longitud de la fibra, uniformidad de la longitud y micronaire se determinaron de las cápsulas cultivadas. La longitud de la fibra se midió en pulgadas. ;;La medición de la longitud de la fibra se realiza al sujetar y romper un montón de fibras con un espaciado de 1/8 pulgadas entre las mordazas de sujeción. Los resultados se informan en términos de gramos por tex al decimal más próximo. Una unidad tex es igual al peso en gramos de mil metros de fibra. Por lo tanto, la fuerza informada es la fuerza en gramos requerida para romper un conjunto de fibras con un tamaño de una unidad tex. La Tabla 31 muestra una descripción general y correspondiente a las mediciones de fuerza en gramos por tex. ;;Tabla 31. Descripción de fuerza de fibra medida de fuerza correspondiente.;;; ;;;
Uniformidad de longitud es un número de tres dígitos que es una medida del grado de uniformidad de las fibras en una muestra al decimal más cercano. La Tabla 32 muestra la descripción de la uniformidad de la longitud y calificación de uniformidad de longitud correspondiente. ;;Tabla 32. Puntuación descripción de uniformidad de lon itud.;;; ;;;
Micronaire es una medida de madurez y finura de la fibra. Un instrumento de flujo de aire se utiliza para medir la permeabilidad del aire de una masa constante de fibras de algodón comprimidas a un volumen fijo. El volumen de flujo de aire a través de un espécimen de fibras de algodón se expresa como un micronaire. Los algodones con mediciones en micronaire entre 3.7 y 4.2 son considerados en el intervalo superior de micronaire. Los algodones dentro de los rangos de micronaire de 3.5-3.6 o 4.3-4.9 son considerados de calidad base, mientras que los algodones superiores a 4.9 o inferiores a 3.5 se encuentran en los rangos de descuento. Las mediciones en micronaire pueden estar influenciados durante el período de crecimiento en condiciones medioambientales tal como humedad, temperatura, luz solar, nutrientes de la planta y extremos en la población de plantas o cápsulas. Las condiciones de crecimiento favorables tienen como resultado fibras completamente maduras con lecturas de micronaire de intervalo superior. Las condiciones desfavorables, tales como la falta de humedad, heladas tempranas, o cualquier otra condición que interrumpa los procesos de la planta tendrán como resultado fibras inmaduras y mediciones de micronaire bajas. El algodón de micronaire elevado es causado por tales cosas como temperaturas anormalmente cálidas durante la maduración de la cápsula, o mala formación de cápsula que lleva a la disponibilidad excesiva de carbohidratos y sobremaduración de las fibras. La finura de la fibra afecta el rendimiento del proceso y la calidad del producto final en varias formas. En los procesos de abertura, limpieza y cardado, los algodones de micronaire bajo o de fibra más fina requieren velocidades de procesamiento más lentos para evitar daño a las fibras. Los hilos hechos de fibra más fina tiene como resultado más fibras por corte transversal, que a su vez produce hilos más fuertes. Las fibras ásperas o de micronaire elevado no son adecuadas para los hilos finos dado que el resultado sería menos fibras por corte transversal, que reduciría la fuerza del hilo. Micronaire y madurez están altamente correlacionadas dentro de una variedad de algodón. La absorbencia y retención varía con la madurez de las fibras. Las fibras de madurez baja tienen poca absorbencia de tinta y retención mientras que fibras de micronaire más altas tienen buena absorbencia y retención. ;;La Tabla 33 muestra la calidad de la fibra medida determinada para ambos MON 88702 y el control negativo no transformado DP393 para dos temporadas de cultivo consecutivas, año 1 y año 2. Esos valores indicados por “*” representan una diferencia considerable (p=0.05) en comparación con el control dentro de la temporada de cultivo.
Tabla 33. Calidad de la fibra de MON 88702 DP393.
Tal como se puede ver en la Tabla 33, ambos el evento MON 88702 y el DP393 sin transformar produjeron fibra de calidades muy similares en ambas temporadas de cultivo 2013 y 2014. El evento MON 88702 produjo fibra con una longitud similar como el control negativo. Ambos MON 88702 y DP393 produjeron fibra muy fuerte con uniformidad de alta a muy alta. Las medidas de micronaire no fueron considerablemente diferentes entre MON 88702 y DP393. Estos resultados demuestran que la calidad de la fibra no se ve adversamente afectada por la expresión del casete de transgén en MON 88702.
EJEMPLO 11
Ensayos de cigosidad y criterio de valoración TAQMAN® específicos de evento del evento MON 88702 de algodón
El siguiente Ejemplo describe procedimientos útiles para identificar la presencia del evento MON 88702 en una muestra de algodón. Un par de cebadores de PCR y una sonda fueron diseñados con el fin de identificar la única unión formada entre el ADN genómico de algodón y el<a>D<n>insertado del evento MON 88702 en una PCR de TAQMAN® de criterio de valoración específico del evento. Ejemplos de condiciones utilizadas para identificar la presencia de MON 88702 en una muestra de algodón en una p Cr de TAQMAN® de criterio de valoración específico del evento se describen en la Tabla 34 y la Tabla 35.
La secuencia del cebador directo del oligonucleótido SQ21940 (SEQ ID NO:11) es idéntica a la secuencia de nucleótidos que corresponde a las posiciones 4720 a 4744 de la SEQ ID NO:10. La secuencia del cebador inverso del oligonucleótido SQ-50210 (SEQ iD NO:12) es idéntica al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos que corresponde a las posiciones 4803 a 4826 de la SEQ ID NO:10. La secuencia de la sonda del oligonucleótido PB10344 (SEQ ID NO:13) es idéntica a la secuencia de nucleótidos que corresponde a las posiciones 4745 a 4766 de la SEQ ID NO: 10. Los cebadores SQ21940 (SEQ ID NO:11) y SQ-50210 (SEQ ID NO:12) con la sonda PB10344 (SEQ ID NO:13), que pueden estar etiquetados de forma fluorescente (por ejemplo, una etiqueta fluorescente 6FAMTM), se pueden utilizar en un ensayo de PCR de TAQMAN® de criterio de valoración para identificar la presencia de ADN derivado del evento MON 88702 en una muestra.
Además de SQ21940 (SEQ ID NO:11), SQ-50210 (SEQ ID NO:12) y PB10344 (SEQ ID NO:13), será evidente para los expertos en la técnica que se puede diseñar otros cebadores y/o sondas ya sea para amplificarse y/o hibridarse a las secuencias dentro SEQ ID NO:10 que son únicas, y útiles, para detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 88702 en una muestra.
Siguiendo las prácticas de laboratorio convencionales de biología molecular, se desarrollaron ensayos PCR para identificación de eventos para la detección del evento MON 88702 en una muestra. Los parámetros de un ensayo de PCR estándar o un ensayo de PCR TAQMAN® se optimizaron con cada conjunto de sondas y pares de cebadores (por ejemplo, sondas etiquetadas con una etiqueta fluorescente tal como 6FAMTM ) utilizado para detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 88702 en una muestra. Un control para la reacción de PCR incluye los cebadores de control internos y una sonda de control interna (por ejemplo, etiquetada con VIC®) específica a un gen de proteína portador de acilo específico de la fibraGossypium hirsutum(ACP1) (registro en GenBank U48777), y son los cebadores SQ22496 (SEQ ID NO:14), SQ22497 (SEQ ID NO:15), y la sonda etiquetada con VIC® PB13032 (SEQ ID NO:17).
Generalmente, los parámetros que se optimizaban para la detección del ADN del evento MON 88702 en una muestra incluían parámetros de concentración de sonda y cebador, de cantidad de ADN molde y de ciclos de amplificación de por PCR. Los controles para este análisis incluyen un control positivo del ADN del evento MON 88702 que contiene algodón, un control negativo de algodón no transgénico, y un control negativo que no contenga ADN molde.
Tabla 34. Componentes de reacción de PCR de criterio de valoración de TAQMAN®específicos de evento del evento MON 88702 de al odón
Tabla 35. Condiciones del term ociclador TAQMAN® de criterios de valoración
Un ensayo de cigosidad es útil para determinar sin una planta que comprende un evento es homocigota para el ADN del evento (es decir, que comprende el ADN exógeno en la misma ubicación en cada cromosoma de un par de cromosomas), heterocigota para el ADN del evento (es decir, que comprende el ADN exógeno solamente en un cromosoma de un par de cromosomas), o de tipo salvaje (es decir, nula para el ADN del evento). Se utilizó un procedimiento de amplificación térmica de criterios de valoración TAQMAN® para desarrollar un ensayo de cigosidad para el evento MON 88702. Ejemplos de condiciones que se pueden utilizar en una PCR de TAQMAN® de cigosidad específica del evento se proporcionan en las Tablas 36 y 37 . Para este ensayo, se mezclaron tres cebadores y dos sondas junto con la muestra. Los cebadores de ADN utilizados en el ensayo de cigosidad fueron los cebadores SQ50844 (SEQ ID NO:17), SQ50843 (SEQ ID NO:19), y SQ50842 (SEQ ID NO:20). Las sondas utilizadas en el ensayo de cigosidad fueron la sonda etiquetada con 6FAMTM PB50279 (SEQ ID NO:18) y la sonda etiquetada con VIC® PB50278 (SEQ ID NO:21). Los cebadores SQ50844 (SEQ ID NO:17) y SQ50843 (SEQ ID NO:19) y la sonda PB50279 (SEQ ID NO:18) (etiquetado con 6FAMTM) son diagnóstico para el ADN del evento MON 88702. Los cebadores SQ50842 (SEQ ID NO:20) y SQ50843 (SEQ ID NO:19) y la sonda etiquetada con VIC® PB50278 (SEQ ID NO:21) son diagnóstico cuando no hay copia de MON 88702; es decir, el alelo de tipo salvaje.
Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción PCR con ADN extraído de una planta heterocigota para el evento MON 88702, hay una señal fluorescente desde la sonda PB50279 etiquetada con 6FAMTM (SEQ ID NO:18) y la sonda PB50278 etiquetada con VIC® (SEQ ID NO:21) que indica y es un diagnóstico para una planta heterocigota para el evento MON 88702. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción PCR con ADN extraído de una planta que es nula para el evento MON 88702 (es decir, el tipo salvaje), hay una señal fluorescente solamente desde la sonda PB50278 etiquetada con VIC® (SEQ ID NO:21) que indica y es diagnóstico para una planta nula para el evento MON 88702. Las muestras de ADN molde y los controles para este análisis fueron un control positivo del ADN del evento MON 88702 que contiene algodón (de ambas una muestra conocida homocigota y una heterocigota conocida), un control negativo de algodón no transgénico, y un control negativo que no contenga ADN molde.
Tabla 36. PCR de ci osidad de TAQMAN® del evento MON 88702 de al odón
Tabla 37. Condiciones del term ociclador TAQMAN® de cigosidad
EJEMPLO 12
Identificación del evento de algodón MON 88702 en cualquier evento de cu ltivo de MON 88702
El siguiente Ejemplo describe cómo se puede identificar el evento MON 88702 dentro de la progenie de cualquier ac tiv ida d de m e jo ra m ie n to u tiliza n d o e ve n to M O N 88702 de a lgodón .
Se utilizan pares de cebadores del ADN para producir un amplicón de diagnóstico para el evento MON 88702 de algodón. Un amplicón diagnóstico para MON 88702 comprende al menos una secuencia de unión, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, o SEQ ID NO:6 ([1], [2], [3], [4], [5], y[6], respectivamente en la Figura 1a). La SEQ ID NO:1 es una secuencia de veinte (20) nucleótidos que representa las regiones de unión 5' del ADN genómico de algodón y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:1 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1642-1661. La SEQ ID NO:2 es una secuencia de veinte (20) nucleótidos que representa las regiones de unión 3' del ADN genómico de algodón y el casete de expresión transgénico integrado.<s>E<q>ID NO:2 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 4785-4804. La SEQ ID NO:3 es una secuencia de sesenta (60) nucleótidos que representa las regiones de unión 5' del ADN genómico de algodón y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:3 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1622-1681. La SEQ ID NO:4 es una secuencia de sesenta (60) nucleótidos que representa las regiones de unión 3' del ADN genómico de algodón y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:4 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 4765-4824. La SEQ ID NO:5 es una secuencia de cien nucleótidos que representa las regiones de unión 5' del ADN genómico de algodón y el casete de expresión transgénico integrado. Se Q ID NO:5 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1602-1701. La SEQ ID NO:6 es una secuencia de cien nucleótidos que representa las regiones de unión 3' del ADN genómico de algodón y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:6 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1602 1701.
Los pares de cebadores que producirán un amplicón que es diagnóstico para el evento MON 88702 incluyen los pares de cebadores basados en las secuencias de flanqueo y el casete de expresión TIC834_16 insertado. Para adquirir un amplicón diagnóstico en el que se encuentran al menos once nucleótidos de la SEQ ID NO:1, se diseñaría un cebador directo basado en la SEQ ID NO:7 de las bases 1 a 1651 y un cebador inverso basado en la SEQ ID NO:9. Para adquirir un amplicón diagnóstico en el que se encuentran al menos once nucleótidos de la SEQ ID NO:2, se diseñaría un cebador directo basado en la SEQ ID NO:9 y un cebador inverso basado en la SEQ ID NO:8 desde las bases 1 a 2010. Para adquirir un amplicón diagnóstico en el que se encuentran al menos treinta y un nucleótidos de la SEQ ID NO:3, se diseñaría un cebador directo basado en la SEQ ID NO:7 de las bases 1 a 1651 y un cebador inverso basado en la SEQ ID NO:9. Para adquirir un amplicón diagnóstico en el que se encuentran al menos treinta y un nucleótidos de la SEQ ID NO:4, se diseñaría un cebador directo basado en la SEQ ID NO:9 y un cebador inverso basado en la SEQ ID NO:8 desde las bases 1 a 2010. Para adquirir un amplicón diagnóstico en el que se encuentran al menos cincuenta y uno nucleótidos de la SEQ ID NO:5, se diseñaría un cebador directo basado en la SEQ ID NO:7 de las bases 1 a 1651 y un cebador inverso basado en la SEQ ID NO:9. Para adquirir un amplicón diagnóstico en el que se encuentran al menos cincuenta y uno nucleótidos de la SEQ ID NO:6, se diseñaría un cebador directo basado en la SEQ ID NO:9 y un cebador inverso basado en la SEQ ID NO:8 desde las bases 1 a 2010.
A fines prácticos, se debería diseñar cebadores que producen amplicones dentro de un intervalo de tamaño limitado, preferentemente, entre 200 a 1000 bases. En general, los amplicones de tamaño más pequeño se producen de forma más confiable en las reacciones de PCR, permiten tiempos de ciclo más cortos y se pueden separar y visualizar fácilmente sobre los geles de agarosa o adaptar para el uso en ensayos de criterios de valoración tipo TAQMAN®. Además, los amplicones producidos con dichos pares de cebadores se pueden clonar en vectores, propagar, aislar y secuenciar o se pueden secuenciar directamente con los procedimientos conocidos en la técnica. Cualquier par de cebadores derivado de la combinación de la SEQ ID NO:7 y la SEQ ID NO:9 o la combinación de la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO:9 que son útiles en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para MON 88702 o su progenie es un aspecto de la presente invención. Cualquier molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única que comprende al menos once nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:7 o su complemento, que es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para MON 88702 o su progenie es un aspecto de la presente invención. Cualquier molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única que comprende al menos once nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:8 o su complemento, que es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para m On 88702 o su progenie es un aspecto de la presente invención. Cualquier molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única que comprende al menos once nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:9 o su complemento, que es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para MON 88702 o su progenie es un aspecto de la presente invención.
En las Tablas 34 y 35 del Ejemplo previo se ilustra un ejemplo de las condiciones de amplificación para este análisis. Sin embargo, cualquier modificación de estos procedimientos o el uso de los cebadores de ADN homólogos o complementarios a SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7 o las secuencias de ADN de los elementos genéticos contenidos en el inserto transgenético (SEQ ID NO:9) de MON 88702 que producen un amplicón de diagnóstico para MON 88702 se encuentra en la técnica. Un amplicón de diagnóstico comprende una molécula de ADN homólogo o complementario a al menos un ADN de unión genómica/transgén (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID No :4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6) o una porción sustancial de este.
Un análisis para una muestra de tejido de planta del evento MON 88702 debería incluir un control de tejido positivo del evento MON 88702, un control negativo de una planta de algodón que no sea evento MON 88702 (por ejemplo, entre otros, DP393) y un control negativo que no contenga ADN genómico de algodón. Un par de cebadores amplificará una molécula de ADN de algodón endógena y servirá como un control interno para las condiciones de amplificación de ADN. Los expertos en la técnica de procedimientos de amplificación de ADN pueden seleccionar secuencias de cebadores adicionales de la SEQ ID<n>O:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9, y las condiciones seleccionadas para la producción de un amplicón a través de los procedimientos que se muestran en el Tabla 34 y la Tabla 35 pueden diferir, pero producen un amplicón que es diagnóstico del ADN del evento MON 88702. El uso de estas secuencias de cebadores de ADN con modificaciones a los procedimientos de la Tabla 34 y la Tabla 35 se encuentran dentro del alcance de la invención. El amplicón producido por el menos una secuencia de cebadores de ADN derivada de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9 que es diagnóstico para MON 88702 es un aspecto de la invención.
Los kits de detección de ADN que contienen al menos un cebador de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos derivado de la SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9, que cuando se utiliza en un procedimiento de amplificación de ADN produce un amplicón de diagnóstico para MON 88702 o su progenie en un aspecto de la invención. Una planta o semilla de algodón, donde su genoma producirá un amplicón de diagnóstico para MON 88702 cuando se evalúa en un procedimiento de amplificación de a Dn es un aspecto de la invención. Se puede realizar el ensayo para el amplicón de MON 88702 utilizando un sistema 9700 de PCR de Applied Biosystems GeneAmp, Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient o cualquier otro sistema de amplificación que se pueda utilizar para producir un amplicón de diagnóstico de MON 87702 como se muestra en la Tabla 35.
EJEMPLO 13
Cruzamiento de plantas que contienen el evento MON 87702
Para producir plantas de algodón o partes de plantas de estas que comprendan propiedades agronómicas, insecticidas o herbicidas mejoradas, se cruzan plantas de algodón que contienen evento MON 87702 con plantas de algodón que contienen potencialmente cualquier otro evento de algodón o combinación de estos y se evalúan los fenotipos para determinar las propiedades resultantes de las plantas de la progenie. Las propiedades conferidas a las plantas de la progenie que resultan del fitomejoramiento de dicha planta pueden extenderse más allá de la resistencia a Hemiptera y Thysanoptera de MON 87702, que incluye, de modo no taxativo, al control de la plaga sobre el suelo, tolerancia al herbicida, propiedades nematicidas, resistencia a la sequía, resistencia al virus, control anti-hongos, resistencia a las bacterias, esterilidad masculina, tolerancia al frío, tolerancia a la sal, y mayor rendimiento. Los ejemplos de eventos transgénicos con rasgos agronómicos mejorados se conocen en la técnica. A continuación se presenta una lista no exhaustiva de posibles líneas de algodón transgénicas que se pueden utilizar en el fitomejoramiento con el evento MON 87702 para conferir propiedades mejoradas en plantas de algodón, partes de plantas, semillas o producto básico.
19-51A (DD-04951A-7), BXN, MON 1445 (MON-01445-2), MON 88701 (MON-88701-3), MON 88913 (MON-88913-8), GHB614 (BCS-GH002-5), DAS-81910-7 (DAS-81910-7), GHB119 (BCS-GH005-8), LLCotton25 (ACS-GH0013), EE-GH1, EE-GH3, pDAB4468.18.07.1, pDAB4468.19.10.3, 281-24-236 (DAS-24236-5), 3006-210-23 (DAS-21023-5), COT102 (SYN-IR102-7), COT67B (SYN-IR67B-1), Evento-1, MON 531 (MON-00531-6), MON15985 (MON-15985-7), EE-GH5, EE-GH6, COT202, COT203, A26-5, 31807, 31808, T303-3 (BCS-GH003-6), y T304-40 (BCS-GH004-7).
Claims (16)
1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y complemento completo de las mismas.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN recombinante proviene del evento de algodón MON 88702, habiéndose depositado una muestra representativa de semilla que comprende dicho evento con el número de acceso de la ATCC PTA-122520.
3. Una molécula de ADN que comprende un segmento de polinucleótido de longitud suficiente para funcionar como una sonda de ADN que se hibrida específicamente en condiciones de hibridación estrictas con una secuencia de unión del ADN del evento de algodón MON 88702 en una muestra, comprendiendo dicha secuencia de unión una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, S<e>Q ID NO: 10 y su complemento inverso, en la que detectar la hibridación de la molécula de ADN en condiciones de hibridación estrictas es un diagnóstico para el ADN del evento de algodón MON 88702 en una muestra, en la que una muestra representativa de semilla que comprende el evento de algodón MON 88702 se ha depositado con el número de acceso de la ATCC PTA-122520.
4. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 3, en la que dicha muestra comprende una planta de algodón, una célula de una planta de algodón, una semilla de algodón, una parte de una planta de algodón, una planta descendiente de algodón, aceite de algodón, proteína de algodón, harina de algodón, alimento para animales que comprende algodón, papel que comprende algodón, o producto básico de algodón.
5. Un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN que funcionan como cebadores de ADN cuando se usan juntas en una reacción de amplificación con una muestra que contiene ADN molde del evento MON 88702 de algodón para producir un diagnóstico de amplicón. para dicho<a>D<n>del evento de algodón MON 88702 en la muestra, en donde dicho amplicón comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25.
6. Un procedimiento para detectar la presencia de un diagnóstico de segmento de ADN para el ADN del evento MON 88702 del algodón en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento:
a) poner en contacto dicha muestra con la sonda de ADN de la reivindicación 3;
b) someter dicha muestra y dicha sonda de ADN a condiciones de hibridación estrictas; y
c) detectar la hibridación de dicha sonda de ADN con dicha muestra, en la que dicha etapa de detección es diagnóstica de la presencia de dicho ADN del evento del algodón MON 88702 en una muestra.
7. Un procedimiento para detectar la presencia de un diagnóstico de segmento de ADN para el ADN del evento de algodón MON 88702 en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento:
a) poner en contacto dicha muestra con el par de moléculas de ADN de la reivindicación 5;
b) realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN; y
c) detectar la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción, en la que dicho amplicón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25.
8. Una planta de algodón, semilla, parte de planta de algodón o célula de algodón de la misma que comprende una molécula de polinucleótido recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:10.
9. Una planta de algodón, semilla, parte de planta de algodón o célula de algodón de la misma de la reivindicación 8, en la que:
a) dicha planta de algodón, o parte de la planta de algodón, o célula de algodón es insecticida cuando se proporciona en la dieta de una plaga de insectos hemípteros o tisanópteros;
b) la planta de algodón, parte de la planta de algodón o semilla de algodón comprende ADN funcional como plantilla cuando se analiza en un procedimiento de amplificación de ADN que produce un diagnóstico de amplicón para la presencia del ADN del evento MON 88702; o
c) la planta de algodón se define además como una progenie de cualquier generación de una planta de algodón que comprende el evento de algodón MON 88702.
10. La planta de algodón, semilla, parte de planta de algodón o célula de algodón de la misma de la reivindicación 9, en la que:
a) la plaga de insectos hemípteros se selecciona del grupo que consiste en Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Creontiades signatus y Pseudatomoscelis seriatus;
b) la plaga de insectos tisanópteros se selecciona del grupo que consiste en Frankliniella spp y Sericothrips variabilis; o
c) la planta de algodón comprende además un evento transgénico seleccionado del grupo que consiste en 19-51A (DD-04951A-7), BXN, MON 1445 (MON-01445-2), MON 88701 (MON-88701-3), MON 88913 (MON-88913-8), GHB614 (BCS-GH0025), DAS-81910-7 (DAS-81910-7), GHB119 (BCS-GH005-8), LLCotton25 (ACSGH0013), EE-GH1, EE-GH3, pDAB4468.18.07.1, pDAB4468.19.10.3, 281-24236 (DAS-24236-5), 3006-210-23 (DAS-21023-5), COT102 (SYN-1R102-7), COT67B (SYN-1R67B-1), Event-1, MON 531 (MON-00531-6), MON15985 (MON-15985-7), EE-GH5, EE-GH6, COT202, COT203, A26-5, 31807, 31808, T303-3 (BCS-GH003-6), y T304-40 (BCS-GH004-7).
11. Un procedimiento para proteger una planta de algodón de una infestación de insectos, en el que dicho procedimiento comprende proporcionar en la dieta de una plaga de insectos hemípteros o plaga de insectos tisanópteros una cantidad insecticidamente eficaz de células o tejido de la planta de algodón que comprende el evento MON 88702, en el que una muestra representativa de semilla que comprende el evento de algodón MON 88702 se ha depositado con el número de acceso de la ATCC PTA-122520.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que:
a) dicha plaga de insectos hemípteros se selecciona del grupo que consiste en Lygus hesperus, Lygus lineolaris y Pseudatomoscelis seriatus; o
b) dicha plaga de insectos tisanópteros se selecciona del grupo que consiste en Frankliniella spp y Sericothrips variabilis.
13. Un microorganismo que comprende una cantidad detectable de una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: :5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 10, y complemento completo de las mismas.
14. El microorganismo de la reivindicación 13, en el que el microorganismo es una célula vegetal.
15. Un procedimiento para determinar la cigosidad de una planta de algodón o semilla de algodón que comprende el evento MON 88702 que comprende:
a) poner en contacto una muestra que comprende ADN de algodón con un conjunto de cebadores capaz de producir un primer diagnóstico de amplicón para el evento MON 88702 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25 y un segundo diagnóstico de amplicón para ADN genómico de algodón nativo que no comprende el evento MON 88702;
i) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con la muestra y el conjunto de cebadores; y
ii) detectar en la reacción de amplificación de ácido nucleico el primer diagnóstico de amplicón para el evento MON 88702, o el segundo diagnóstico de amplicón para el ADN genómico del algodón nativo que no comprende el evento MON 88702, en el que la presencia de sólo el primer amplicón es diagnóstica de una planta de algodón homocigótica para ADN del evento MON 88702 en la muestra, y la presencia tanto del primer amplicón como del segundo amplicón es diagnóstica de una planta de algodón heterocigota para el alelo del evento MON 88702; o
b) poner en contacto una muestra que comprende ADN de algodón con un conjunto de sondas que contiene al menos una primera sonda que se hibrida específicamente en condiciones de hibridación estrictas con una secuencia de unión del ADN del evento MON 88702, comprendiendo dicha secuencia de unión una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10 y complemento inverso de las mismas y al menos una segunda sonda que se hibrida específicamente con el ADN genómico del algodón que se alteró mediante la inserción del ADN heterólogo del evento MON 88702 y no se hibrida con el ADN del evento MON 88702,
i) hibridar el conjunto de sondas con la muestra en condiciones de hibridación estrictas, y
ii) detectar la hibridación de la primera sonda o la segunda sonda, en la que detectar la hibridación de solo la primera sonda en las condiciones de hibridación es diagnóstico para un alelo homocigótico del ADN del evento MON 88702 en la muestra, y en la que detectar la hibridación tanto de la primera sonda como la segunda sonda bajo las condiciones de hibridación es diagnóstica para un alelo heterocigoto del evento MON 88702 en una muestra de ADN; en la que una muestra representativa de semilla que comprende el evento de algodón MON 88702 se ha depositado con el número de acceso de la ATCC PTA-122520.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que:
a) el conjunto de cebadores comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20; o b) el conjunto de sondas comprende SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 21.
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