BR122020001550B1 - Moléculas de dna recombinantes detectáveis em uma amostra contendo dna de soja, par de moléculas de dna, micro-organismo, bem como métodos para detecção da presença de um diagnóstico de segmento de dna para o evento de soja mon87751 dna em uma amostra, para proteção de uma planta de soja de pragas de insetos, para produção de uma planta de soja resistente a insetos e para determinação da zigosidade de uma planta de soja ou de semente de soja - Google Patents
Moléculas de dna recombinantes detectáveis em uma amostra contendo dna de soja, par de moléculas de dna, micro-organismo, bem como métodos para detecção da presença de um diagnóstico de segmento de dna para o evento de soja mon87751 dna em uma amostra, para proteção de uma planta de soja de pragas de insetos, para produção de uma planta de soja resistente a insetos e para determinação da zigosidade de uma planta de soja ou de semente de soja Download PDFInfo
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Abstract
A invenção proporciona um evento transgênico MON87751 Glycine max , plantas, células de plantas, sementes, partes de plantas, progênie de plantas e produtos de base compreendendo o evento MON87751. A invenção também proporciona polinucleotídeos específicos para o evento MON87751, plantas, células de plantas, sementes, partes de plantas e produtos de base compreendendo polinucleotídeos para o evento MON87751. A invenção também fornece métodos relacionados ao evento MON87751.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório N° de Série US 61/834,899 depositado em 14 de junho de 2013, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[002] A listagem de sequências contida no arquivo nomeado MONS357WO_ST25.txt, que é de 43 kilobytes (tamanho medido em Microsoft Windows®), e foi criada em 12 de junho, 2014, é depositada em anexo aqui por via eletrônica e é incorporada por referência.
[003] A invenção refere-se a um evento transgênico de Glycine max (soja) denominado MON87751. O evento oferece dois diferentes modos de ação de resistência de infestações de lepidópteros de soja, proporcionando uma combinação única de proteínas de toxinas inseticidas não disponíveis anteriormente em plantas de soja. A combinação destas proteínas de toxina inseticidas é altamente eficaz para o controle de infestações de espécies dos Lepidópteros característicos de plantas de soja. A invenção também diz respeito a plantas de soja, partes de plantas, sementes de plantas, células vegetais, plantas de progênie, produtos agrícolas, e métodos relacionados com evento MON87751, e fornece moléculas de nucleotídeos que são únicas para o evento, criadas em conexão com a inserção de DNA transgênico no genoma de uma célula de Glycine max (soja), e útil para detectar a presença deste evento em amostras biológicas contendo ácidos nucleicos de soja.
[004] Soja (Glycine max) é uma cultura importante em muitas áreas do mundo, e métodos de biotecnologia foram aplicadas a esta cultura, a fim de produzir variedades de soja com características desejáveis. Uma tal característica é desejável resistência a insetos. A expressão de um transgene de resistência a insetos de uma planta pode conferir a característica desejável de resistência aos insetos na planta, mas a expressão do transgene pode ser influenciada por muitos fatores diferentes, incluindo a orientação e a composição dos cassetes de condução de expressão dos genes individuais transferidos para o cromossoma da planta, a localização cromossómica, e o resultado genômico de inserção do transgene. Por exemplo, foi observado em plantas que não há variação no nível e padrão de expressão do transgene entre os eventos individuais que diferem no local de inserção cromossómica do transgene, mas são de outra forma idênticos. Há também diferenças fenotípicas ou agronômicas indesejáveis e/ou desejáveis entre eventos. Por conseguinte, é frequentemente necessário produzir e analisar um grande número de eventos de transformação de células de plantas individuais, a fim de selecionar um evento que tem tanto a característica desejável e as melhores características agrícolas e fenotípicas adequadas para o sucesso comercial. Seleção do evento transgênico preferencial requer extensa caracterização molecular, bem como ensaios de estufa e de campo com muitos eventos ao longo de vários anos, em vários locais, e sob uma variedade de condições. Uma quantidade significativa de dados de eficácia, fenotípicos e moleculares é colhida, e os dados e observações resultantes são então analisados por grupos de cientistas e agrónomos com o objetivo de selecionar um ou mais eventos comercialmente adequados. Tal evento, uma vez selecionado, é então utilizado para introgressão do traço transgênico desejável em outras origens genéticas, usando métodos de melhoramento de plantas, produzindo assim um número de diferentes variedades de culturas que contêm a característica desejável e são adequadamente adaptadas às condições agronómicas locais específicas.
[005] As sojas transgênicas que dependem de expressão de uma única toxina para o controle inseticida de infestação de insetos podem estar em risco de durabilidade limitada devido ao aumento da probabilidade de desenvolvimento de resistência à toxina pelas pragas de insetos. Da mesma forma, a soja transgênica contendo agentes tóxicos que não fornecem múltiplos modos singulares de ação também pode estar em risco de durabilidade limitada. A primeira soja disponível que produz uma proteína tóxica para lepidópteros contém uma única proteína de toxina, Cry1Ac. Um evento transgênico recente de soja foi divulgado que contém proteínas de toxina Cry1Ac e Cry1F. Se ocorre resistência à Cry1Ac, o evento transgênico Cry1Ac e Cry1F iria ficar com apenas com a toxina Cry1F como a sua fonte de eficácia. É, portanto, necessário fornecer uma planta de soja que tem dois ou mais agentes tóxicos que controlam as pragas controladas por Cry1Ac em que nenhum dos agentes tóxicos se ligam aos mesmos ou substancialmente os mesmos receptores no alvo do intestino médio de insetos que são ligados por Cry1Ac. A invenção aqui descrita proporciona um evento MON87751 de soja transgênica que ultrapassa o problema de durabilidade descrito anteriormente para os eventos transgênicos de soja descritos na técnica anterior, por proporcionar dois ou mais agentes tóxicos para as espécies de pragas de lepidópteros, em que nenhum agente tóxico foi previamente incluído em qualquer planta de soja com o objetivo de direcionamento para o controle das pragas de lepidópteros de soja.
[006] Para fazer uma planta transgênica que contém um único evento de transformação, uma porção de um construto de DNA recombinante é transferida para o genoma de uma célula de soja, e a célula de soja é subsequentemente crescida numa planta. Uma célula de soja em que o evento é inicialmente transferido é regenerada para produzir a geração R0. As plantas R0 e plantas da progênie da planta R0 podem ser testadas para qualquer característica desejada, mas a eficácia do evento pode ser influenciada por fatores cis e/ou trans relativos ao sítio de integração do evento de transformação. O fenótipo conferido pelo evento pode também ser influenciado pelo tamanho e pela concepção da estrutura de DNA, que pode variar de acordo com a combinação dos elementos genéticos em um cassete de expressão, o número de transgenes, número de cassetes de expressão, e a configuração de tais elementos e cassetes. Identificar um evento com características desejáveis pode ser ainda mais complicado por fatores como o desenvolvimento da planta, padrões espaciais, diurnos ou temporais de expressão de transgene; ou por fatores extrínsecos, por exemplo, condições de crescimento da planta ambientais, disponibilidade de água, disponibilidade de nitrogênio, calor ou estresse. Assim, a capacidade para obter um evento que confere um conjunto desejado de características fenotípicas não é facilmente previsível.
[007] A invenção proporciona plantas de soja transgênicas compreendendo evento MON87751 exibindo propriedades e desempenho superiores em comparação com plantas de soja transgênica existentes e novos eventos construídos em paralelo. O evento MON87751 de soja contém, num único lócus de inserção no genoma de soja, dois cassetes de expressão relacionados, que conferem independentemente a característica de resistência às pragas de insetos lepidópteros. Combinados os dois cassetes de expressão ligados em evento de soja MON87751 fornecem dois modos de ação contra espécies de pragas de insetos da ordem Lepidoptera, incluindo Chrysodeixis spp., Spodoptera spp., Helicoverpa spp., Crocidosema spp., Rachiplusia spp., Anticarsia spp., Elasmopalpus spp., e Plathypena spp. Os modos de ação dupla fornecem redundância de controle inseticida contra espécies de pragas de lepidópteros, e reduz significativamente a probabilidade de desenvolvimento de resistência às características de controle de pragas.
[008] O evento MON87751 é caracterizado por segmentos de DNA únicos específicos, que são úteis na detecção da presença do evento numa amostra. Uma amostra destina-se a referir-se a uma composição que é tanto de DNA de soja substancialmente puro ou uma composição que contém DNA de soja. Em ambos os casos, a amostra é uma amostra biológica, ou seja, que contém materiais biológicos, incluindo, mas não se limitando a DNA obtido ou derivada, direta ou indiretamente, a partir do genoma da soja que compreende evento MON87751. "Diretamente" refere-se à capacidade daquele versado na técnica de obter diretamente a partir de DNA do genoma da soja mediante o seu fraccionamento células de soja (ou mediante a obtenção de amostras de soja que contêm fraturado células de soja) e expor o DNA genômico para efeitos de detecção. "Indiretamente" refere-se à capacidade de um especialista na matéria de obter o alvo de DNA ou de referência específico, ou seja, um novo e único segmento de junção aqui descrito como sendo diagnóstico para a presença do evento MON87751 numa amostra em particular, por meios outros que por fratura direta através de células de soja ou a obtenção de uma amostra de soja que contém células fraturadas de soja. Tais meios indiretos incluem, mas não estão limitados à amplificação de um segmento de DNA que contém a sequência de DNA alvo de uma sonda particular, concebida para se ligar com especificidade para a sequência alvo, ou à amplificação de um segmento de DNA que pode ser medido e caracterizado, ou seja, medido por separação de outros segmentos de DNA por meio de alguma matriz eficiente, tal como um de gel de acrilamida ou agarose ou similares, ou caracterizados por análise de sequência direta do produto de amplificação ou a clonagem do fragmento amplificado num vector e sequenciação direta do amplicon presente inserido dentro de tal vetor. Alternativamente, um segmento de DNA que corresponde à posição dentro do cromossoma de soja em que o DNA transgênico foi inserido no cromossoma de soja e que pode ser utilizado para definir o evento MON87751 pode ser clonado por diversos meios e, em seguida, identificado e caracterizado pela sua presença numa amostra particular ou num genoma de soja particular. Tais segmentos de DNA são referidos como segmentos ou sequências de junção, e podem ser de qualquer comprimento do DNA inserido e DNA de cromossoma de soja adjacente (de flanqueamento), desde que o ponto de junção entre o DNA inserido e o genoma da soja esteja incluído no segmento. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 10 e o complemento inverso de cada uma destas são representativas de tais segmentos.
[009] As sequências específicas aqui identificadas podem estar presentes exclusivamente no evento MON87751, ou o construto aí compreendido, e a identificação dessas sequências, quer por análise de sequência direta, através da detecção de sondas ligadas a estas sequências, ou através da observação do tamanho e, talvez, a composição de amplicons específicos aqui descritos, quando presentes numa germoplasma de soja particular ou do genoma e/ou presente em uma amostra contendo DNA de soja biológico particular, são diagnóstico para a presença do evento MON87751, ou o construto aí compreendido de tal amostra. Sabe-se que os segmentos genômicos flanqueando (ou seja, os segmentos do genoma de soja de sequência de DNA adjacente ao DNA transgênico inserido) estão sujeitos a variabilidade ligeira e, como tal, a limitação de pelo menos, 99% ou mais de identidade é com referência a essas anomalias ou polimorfismos do genoma da soja para genoma da soja. Segmentos de nucleotídeos que são completamente complementares em todo o seu comprimento em comparação com as sequências de diagnóstico determinadas aqui mencionadas destinam-se a estar dentro do âmbito da presente invenção.
[0010] A posição dos segmentos de nucleotídeos da presente invenção em relação um ao outro e no interior do genoma da soja é ilustrada na Figura 1 e a sequência de nucleotídeos de cada um está ilustrada como estabelecida em SEQ ID NO: 10. Segmentos de nucleotídeos que caracterizam o evento MON87751 e que são de diagnóstico para a presença de evento MON87751, ou o construto aí compreendido, numa amostra incluem SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26. A presença de uma, ou duas, ou mais destas sequências de nucleotídeos numa amostra, em que tal amostra inclui tecido de soja e, portanto, o DNA de soja, são diagnóstico para a presença do evento MON87751, ou o construto aí compreendido.
[0011] Pretende-se significar por uso do termo "derivado" uma molécula de DNA que é específica no genoma da planta de soja, ou é capaz de ser detectada em DNA de planta de soja. "Capaz de ser detectado" se refere à capacidade de um determinado segmento de DNA a ser amplificado e o seu tamanho e ou sequência caracterizado ou elucidado por análise da sequência de DNA, e também se pode referir-se à capacidade de uma sonda de se ligar especificamente ao segmento específico de DNA, ou seja, o segmento de DNA alvo, e a subsequente capacidade de detectar a ligação da sonda ao alvo. O segmento de DNA ou segmento de DNA alvo particular da presente invenção está presente dentro de soja que contém o evento MON87751 de inserção.
[0012] Por referência à soja quer-se dizer que as células de soja, semente de soja, partes de plantas de soja e plantas de soja estão dentro do âmbito da presente invenção, desde que cada forma de realização contenha uma quantidade detectável de DNA correspondente a qualquer um, dois, ou mais segmentos que são aqui descritos como sendo diagnóstico para a presença de DNA do evento de soja MON87751. Partes das plantas de soja incluem células; pólen; óvulos; flores; vagens; semente; tecido de raiz; tecido do caule; e tecido de folha. Produtos de base que são feitos a partir de soja em que uma quantidade detectável dos segmentos de DNA aqui descritos como sendo diagnóstico para a presença do evento MON87751 estão dentro do âmbito da invenção. Tais produtos de base podem incluir semente integral ou processada de soja, óleo de soja, proteína de soja, refeição de soja, farinha de soja, flocos de soja, farelo de soja, leite de soja, queijo de soja, vinho de soja, alimentos para animais compreendendo soja, papel compreendendo soja, creme compreendendo soja, biomassa de soja, e produtos combustíveis produzidos utilizando plantas de soja e partes de plantas de soja.
[0013] O DNA do evento MON87751 de soja pode estar presente em cada célula e em cada genoma num cromossoma da planta de soja, semente de soja, e tecidos de soja contendo o evento. Como o genoma da soja é transmitido à progênie de forma mendeliana, se uma planta de soja fosse homozigota para a inserção do evento MON87751, cada progênie de planta de soja e célula conteria o DNA de evento em cada alelo do cromossomo parental contendo a inserção de evento MON87751 e herdado pela progênie do(s) pai(s). No entanto, se o genoma da soja que contém o DNA de evento MON87751 é um pai heterozigoto ou híbrido, então cerca de cinquenta por cento do pólen e cerca de cinquenta por cento dos óvulos envolvidos no acasalamento dos pais híbridos irá conter o DNA de evento de soja MON87751, resultando em um misto de população de progênie que contêm o DNA de evento MON87751, e a percentagem de tais progênies decorrentes desses cruzamentos com os híbridos pode variar de cerca de cinquenta a cerca de setenta e cinco por cento tendo o DNA de evento MON87751 transmitido a tal progênie.
[0014] As moléculas de DNA da presente invenção podem ser únicas para as duas junções separadas em cada extremidade do DNA de evento transgênico MON87751 inserido e o genoma de DNA de soja que é adjacente a, ou seja, flanqueando, cada extremidade do DNA de MON87751 inserido, ou única para o DNA de evento de soja MON87751 inserido. Estas moléculas, quando presentes numa amostra particular analisada pelos métodos aqui descritos utilizando os iniciadores e sondas e, em alguns casos, usando a análise de sequência de DNA, pode ser de diagnóstico para a presença de uma quantidade de evento MON87751 de soja naquela amostra. Tais moléculas de DNA únicas para o DNA de evento de soja MON87751 podem ser identificadas e caracterizadas em uma variedade de maneiras, incluindo através da uso de moléculas de ácido nucleico de sonda concebidas para se ligarem especificamente às moléculas de DNA únicas seguido de detecção da ligação de tais sondas para o DNA único, e por métodos de amplificação térmica que usam, pelo menos, duas moléculas de DNA diferentes que atuam como sondas, mas a sequência de tais moléculas pode ser um pouco menos específica do que as sondas descritas acima. Aqueles versados na técnica entenderão que o contato de um DNA alvo particular com uma sonda ou iniciador sob condições de hibridação adequadas irá resultar na ligação da sonda ou iniciador para o segmento de DNA alvo.
[0015] As moléculas de DNA da presente invenção podem ser segmentos alvo de DNA que podem ser capazes de amplificação e, quando detectadas como um ou mais produtos de amplificação do comprimento representado obtido por métodos de amplificação de uma amostra particular, podem ser diagnósticos para a presença de evento MON87751, ou o construto aí compreendido, em tal amostra. Tais moléculas de DNA ou segmentos de polinucleotídeo podem ter sequências de nucleotídeos como apresentadas em cada uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26, e são adicionalmente aqui e nos exemplos abaixo definidas. Moléculas e/ou sondas de iniciador podem ser fornecidas na forma de kit, juntamente com os reagentes necessários, incluindo os controles, e embalados em conjunto com instruções de uso.
[0016] Moléculas de DNA recombinante do presente invenção podem estar presentes dentro de ou derivadas de um microrganismo. Um microrganismo destina-se a incluir qualquer célula microscópica, quer procariota ou eucariota ou que de outra forma contenha DNA dentro de um genoma ou cromossoma ou uma estrutura de DNA extra- cromossomal mais comumente referida como um plasmídeo ou vector. Numa forma de realização, organismos microscópicos podem incluir bactérias (procariotos) e células correspondentes às formas superiores de vida (eucariotas) que estão abaixo da gama visual do ser humano médio, tipicamente abaixo de cinquenta mícrones cúbicos e mais geralmente abaixo de dez mícrones cúbicos. As bactérias são microrganismos comuns microscópicos que podem conter um vector ou plasmídeo que contém um ou mais ou todos os novos segmentos de DNA do presente invenção, incluindo cada um dos respectivos cassetes de expressão presentes como estabelecido em SEQ ID NO: 9. As células de planta e em particular células de planta de soja da presente invenção pode conter qualquer um, dois, ou mais ou todos os novos segmentos de DNA do presente invenção.
[0017] As sondas para serem aqui utilizadas podem compreender moléculas de DNA ou segmentos de polinucleotídeos de comprimento suficiente para funcionar sob condições de hibridação rigorosas, tal como aqui definido, para se ligar com um segmento de DNA alvo particular, ou seja, um segmento único de DNA presente dentro e de diagnóstico para detectar a presença de DNA de evento MON87751 numa amostra. Tal sonda pode ser concebida para se ligar apenas a uma única junção ou outra nova sequência presente apenas em DNA de evento de soja MON87751, ou dois ou mais de tais segmentos de junção simples. A detecção da ligação de uma tal sonda a uma molécula de DNA numa amostra particular de que se suspeita conter DNA de soja é de diagnóstico para a presença de evento de soja MON87751 na amostra.
[0018] Os iniciadores podem compreender pares de diferentes oligonucleotídeos ou segmentos de polinucleotídeos para uso numa reação de amplificação térmica que amplifica um segmento alvo de DNA específico. Cada iniciador do par é concebido para se ligar a um segmento específico de DNA, em vez de dentro ou perto de um segmento de DNA de interesse para a amplificação. Os iniciadores se ligam de tal maneira que, em seguida, estes atuam como regiões localizadas de polimerização de sequência de ácido nucleico, resultando na produção de um ou mais amplicons (segmentos alvo de DNA amplificados). Na presente invenção, o uso de iniciadores concebidos para se ligarem a segmentos únicos de DNA de evento MON87751 de soja em uma amostra biológica particular e que amplificam os amplicons específicos que contêm um ou mais dos segmentos de junção aqui descritos, e a detecção e/ou caracterização de tais amplicons após a conclusão ou término da reação da polimerase, é diagnóstico para a presença do evento MON87751 de soja na amostra particular. Aquele versado na técnica está bem familiarizado com este método de amplificação e recitação das especificidades de amplificação não é necessária aqui.
[0019] Plantas de soja, células de planta de soja, tecidos de planta de soja e sementes de soja da presente invenção podem ser resistentes à infestação por pragas de lepidópteros, incluindo mas não limitado a Chrysodeixis spp., Spodoptera spp., Helicoverpa spp., Crocidosema spp., Rachiplusia spp., Anticarsia spp., Elasmopalpus spp. e Plathypena spp. A resistência à infestação por espécies de lepidópteros surge em conexão com a expressão de dois segmentos de DNA diferentes, codificação duas diferentes proteínas inseticidas, operável e covalentemente ligadas dentro do DNA transgênico inserido: uma proteína Cry2Ab expressada desde o cassete de expressão na extremidade proximal 5' do DNA transgênico inserido, conforme estabelecido na SEQ ID NO:10 e ilustrado na Figura 2; e uma proteína Cry1A.105 expressada desde o cassete de expressão na extremidade 3' do DNA transgênico inserido como estabelecido em SEQ ID NO:10 e ilustrado na Figura 2. A proteína Cry2Ab é expressa a partir de um promotor At.Act2, enquanto que a proteína Cry1A.105 é expressa a partir de um promotor At.RbcS4. As proteínas Cry1A.105 e Cry2Ab são agentes tóxicos para espécies de pragas de insetos lepidópteros.
[0020] O construto utilizado para gerar evento de soja MON87751 tem os promotores de expressão das proteínas Cry2Ab e Cry1A.105 posicionados com uma orientação em tandem relativa de transcrição de modo que a expressão a partir do promotor de cada uma das respectivas proteínas Cry siga no mesmo sentido, mas cada uma de seus respectivos promotores separados (ver Figura 2). Outros construtos que foram avaliados variaram na combinação da uso de elementos de expressão, ou seja, potenciador (E), promotor (P), líder (G), íntrons (I), peptídeo com direcionamento a cloroplasto (CTP), e 3'UTR (T). Além disso, os construtos continham uma pilha vetor de ambas as proteínas Cry (Cry2Ab e Cry1A.105), ou contidas numa única proteína Cry, ou seja, Cry2Ab ou Cry1A.105. Uma outra variação nos construtos de expressão foi a orientação relativa dos dois cassetes para as proteínas Cry nos construtos da pilha vetor. Especificamente, os dois cassetes estavam quer numa orientação em tandem de transcrição ou os dois cassetes estavam numa orientação divergente de modo a que a expressão do promotor de cada uma das duas proteínas Cry seja afastada de um ponto centrado entre os dois promotores, ou seja, a transcrição de cada cassete de expressão prossegue em sentidos opostos e não converge. A sequência de DNA que codifica Cry1A.105 foi sequência-diversificada em alguns construtos em relação à sequência no transgene inserido no evento MON87751. Finalmente, em dois dos construtos com dois cassetes de expressão Cry orientados na orientação inversa da transcrição, potenciadores da transcrição foram posicionados entre os promotores divergentes (ver Figura 2).
[0021] O evento MON87751 foi selecionado com base em comparações com milhares de eventos transgênicos independentes diferentes, cada um transformado com um dos construtos que contêm um segmento de T-DNA, tal como ilustrado na Figura 2, e para um ou outro evento MON87701 e/ou evento GM_A19478 (gerado ao mesmo tempo como MON87701, e ambos expressando Cry1Ac); para um evento transgênico 40-3-2 (que confere tolerância ao herbicida glifosato); e para a soja não transgênica de controle (A3555, ou A5547). Os resultados, conforme ilustrado abaixo nos exemplos, mostram que o evento MON87751 exibiu propriedades superiores devido à expressão das proteínas Cry2Ab e Cry1A.105. A pluralidade de eventos transgênicos produzidos usando o construto utilizado para gerar o evento MON87751 foram cada um mais prováveis do que outros eventos produzidos com outros construtos de exibir controle eficaz de pragas de insetos lepidópteros.
[0022] As plantas de soja e suas partes, incluindo sementes, cada uma contendo o DNA correspondente ao evento MON87751, estão dentro do âmbito da presente invenção. Tais plantas e partes das mesmas, incluindo sementes, são resistentes à infestação de lepidópteros. Em certas formas de realização, tais plantas e sementes incluem híbridos e congênitas, e plantas e sementes que contêm apenas um alelo de evento MON87751, ou seja, um genoma caracterizado como heterozigótico com referência ao lócus correspondente ao DNA de evento MON87751. Esses híbridos podem ser produzidos por meio de cruzamento de plantas que compreendem evento MON87751 com germoplasma desejável como parte do processo de desenvolvimento de variedades comerciais e outras propriedades desejáveis agricolamente de soja. Os híbridos podem ser produzidos por qualquer número de métodos, mas um método preferencial tira vantagem de um primeiro pai congênito (homozigoto) que contém o alelo específico de evento MON87751 em ambos os cromossomas no lócus no qual se insere o DNA de evento MON87751, e gerando o primeiro congênito em conjunto com um segundo congênito que não contêm o DNA MON87751. Ambas as variedades congênitas parentais terão uma ou mais vantajosas propriedades desejáveis na progênie de sementes, ou seja, a semente híbrida, e estas sementes híbridas são heterozigóticas ao alelo de evento MON87751.
[0023] Uma propriedade transgênica ou alelo que confere alguma característica adicional a uma planta contendo o DNA de evento MON87751 pode ser desejável. Outros tais alelos transgênicos que conferem características desejáveis podem incluir tolerância a herbicidas: GTS 40-3-2, MON87708, MON89788, A2704-12, A2704- 21, A5547-35, A5547-127, BPS-CV127-9, DP356043, GU262, W62, W98, DAS-44406-6, DAS-68416 -4, FG72, BPS-CV127-9, SYHT04R, SYHT0H2, 3560.4.3.5, EE-GM3, pDAB4472-1606, pDAB4468-0416,pDAB8291.45.36, 127, AAD-12; resistência a insetos: MON87701,DAS-81419-2; aumento da composição de óleo reforçada: PD-305423, G94-1, G94-19, G168, OT96-15, MON87705, MON87769; aumento do rendimento: MON 87712, ou traços de fixação de nitrogênio, traços modulando a uso de água, resistência à infestação fúngica, resistência à infestação de nemátodos, e semelhantes. Uma propriedade não transgênica (por exemplo, QTL ou grupo de maturação) pode também conferir um traço desejável e aquele versado na técnica saberia como produzir soja para conter tal traço não transgênico e tal DNA de evento MON87751.
[0024] Os aspectos precedentes e outros da invenção se tornarão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada.
[0025] A Figura 1 é uma representação esquemática das posições relativas, ilustradas por cada linha horizontal, dos segmentos do DNA transgênico heterólogo, o DNA genômico de flanqueamento, as junções arbitrariamente designadas 5' e 3' de DNA genômico/inserido e as posições relativas da sequência única para o evento MON87751 dentro do DNA transgênico heterólogo, que pode ser usado para identificar o evento de soja MON87751; as linhagens horizontais rotuladas [1] , [2], [3] [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] e [26] correspondem a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26, respectivamente; a linha horizontal com barra grossa representa o composto do ADN transgênico heterólogo inserido no evento MON87751 (SEQ ID NO: 9) e ambas as extremidades 5 'e 3' que flanqueiam o ADN genômico e é uma representação da SEQ ID NO: 10 contendo a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 8; as setas horizontais grossas designadas SQ26901, SQ20267, SQ25826, e SQ27115 correspondem a SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 14, respectivamente; as setas horizontais finas representam a organização relativa dos dois cassetes de expressão separados do ADN transgênico heterólogo inserido de evento MON87751, P representa um elemento promotor, L representa um líder, PL representa um promotor e líder, I representa um íntron, CTP representa um peptídeo de trânsito de cloroplasto, Cry2Ab representa a região de codificação para a proteína Cry2Ab, T=3 'a terminação da transcrição e elemento de poliadenilação (3' UTR), e Cry1A.105 representa a região de codificação para a proteína Cry1A.105.
[0026] A Figura 2 ilustra o segmento de T-DNA que codifica o cassete de expressão da proteína Cry nos onze construtos de transformação utilizado para gerar eventos de soja transgênicos avaliados durante a seleção de evento de soja MON87751, e a composição de cada cassete de expressão da proteína Cry no interior de cada constructo.
[0027] A Figura 3 é uma representação gráfica dos resultados da análise por ELISA da expressão da proteína Cry em eventos gerados com um construto 1, construto 2 e construto 3, em comparação com uma linhagem de soja não transgênica (A3555). Painel A. mostra os níveis de proteína Cry2Ab em tecido foliar recolhido em fase R1 e R3 de crescimento da planta. Painel B. mostra os níveis de proteína Cry1A.105 em tecido foliar recolhido em fase de crescimento R1 e R3 da planta.
[0028] A Figura 4 é uma representação gráfica dos resultados da análise por ELISA da expressão da proteína Cry em eventos gerados com construto 2, construto 5, construto 6, construto 4, em comparação com uma linhagem de soja não transgênica (A3555). Painel A. mostra os níveis de proteína Cry2Ab em tecido foliar coletada na fase R3 do crescimento de plantas de plantas cultivadas em dois ensaios separados de telado. Painel B. mostra os níveis de proteína Cry1A.105 em tecido foliar coletada na fase R3 do crescimento de planta de plantas cultivadas em dois ensaios separados de telado.
[0029] A Figura 5 é uma representação gráfica dos resultados da análise por ELISA da expressão da proteína Cry2Ab em eventos gerados com construto 1, construto 2, construto 3, construto, 4, construto 5, construto 6, construto 9, construto 7, e construto 11 para amostras de folhas recolhidas na fase R3 e R5 de crescimento da planta.
[0030] A Figura 6 é uma representação gráfica dos resultados da análise por ELISA da expressão da proteína Cry21A.105 em eventos gerados com construto 1, construto 2, construto 3, construto 4, construto 5, construto 6, construto 9, construto 7, e construto 11 para amostras de folha coletadas na fase R3 e R5 do crescimento das plantas. Painel A Y-eixo traçado a 0 - 5000 ppm de peso seco e Painel B Y-eixo traçado a 0-500 ppm em peso seco para ilustrar melhor no painel B os dados para a fase R3.
[0031] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de vinte nucleotídeos representando a região 5 ' da junção de DNA genômico de soja e o cassete de expressão transgênica integrada. SEQ ID NO: 1 é posicionada na ID SEQ NO: 10 em posição de nucleotídeo 1325-1344.
[0032] SEQ ID NO: 2 é uma sequência de vinte nucleotídeos representando a região 3 ' da junção de DNA genômico de soja e o cassete de expressão transgênica integrada. SEQ ID NO:2 é posicionado na SEQ ID NO:10 na posição nucleotídica 11444-11463.
[0033] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de vinte nucleotídeos representando a região 5' da junção de DNA genômico de soja e o cassete de expressão transgênica integrada. SEQ ID NO: 3 é posicionada na ID SEQ NO:10 em posição de nucleotídeo 1305-1364.
[0034] SEQ ID NO:4 é uma sequência de vinte nucleotídeos representando a região 3' da junção de DNA genômico de soja e o cassete de expressão transgênica integrada. SEQ ID NO: 4 é posicionada na ID SEQ NO: 10 na posição nucleotídica 11424-11483.
[0035] SEQ ID NO: 5 é uma sequência de cem nucleotídeos representando a região 5' da junção de DNA genômico de soja e o cassete de expressão transgênica integrada. SEQ ID NO: 5 é posicionada na ID SEQ NO: 10 em posição de nucleotídeo 1285-1384.
[0036] SEQ ID NO: 6 é uma sequência de cem nucleotídeos representando a região 3 'da junção de DNA genômico de soja e o cassete de expressão transgênica integrada. SEQ ID NO:6 é posicionada na SEQ ID NO:10 na posição nucleotídica 11404-11503.
[0037] SEQ ID NO:7 é uma sequência de 1626 nucleotídeos representando a sequência genômica soja flanqueando 5' até e incluindo a junção do DNA genômico e DNA transgênico inserido, e inclui (5' para 3') 1334 do DNA genômico de flanqueamento e 292 nucleotídeos da extremidade arbitrariamente designada 5 'do DNA transgênico inserido.
[0038] SEQ ID NO: 8 é uma sequência de 1452 nucleotídeos que representa a sequência genômica flanqueadora de soja até e incluindo a junção do DNA genômico e DNA transgênico inserido, e inclui (5 'para 3') 265 nucleotídeos da arbitrariamente designada extremidade do DNA transgênico inserido 3 e 1187 nucleotídeos do DNA genômico que flanqueia a 3'.
[0039] SEQ ID NO: 9 é uma sequência de 10119 nucleotídeos correspondente ao DNA transgênico inserido no genoma do evento MON87751 de soja.
[0040] SEQ ID NO:10 é uma sequência de 12640 nucleotídeos correspondendo à sequência compósita de nucleotídeos do DNA genômico transgênico inserido no evento MON87751 e as sequências de nucleotídeos flanqueando a 5' do DNA genômico e a sequência de nucleotídeos do DNA genômico flanqueando a 3' e inclui a SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:8.
[0041] SEQ ID NO: 11 é uma sequência de 27 nucleotídeos correspondendo a um iniciador de amplificação térmica referido como SQ20267 utilizado para identificar DNA de evento de soja MON87751 numa amostra, e é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11400 a 11426 de SEQ ID NO: 10.
[0042] SEQ ID NO: 12 é uma sequência de 26 nucleotídeos correspondendo a um iniciador de amplificação térmica referido como SQ25826 usado para identificar DNA de evento MON87751 de soja em uma amostra, e é idêntico ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11454 a 11479 de SEQ ID NO: 10.
[0043] SEQ ID NO: 13 é uma sequência de 19 nucleotídeos correspondente a uma sonda referida como PB10263 utilizada para identificar DNA de evento de soja MON87751 numa amostra, e é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11428 a 11446 de SEQ ID NO: 10.
[0044] SEQ ID NO: 14 é uma sequência de 24 nucleotídeos correspondendo a um iniciador de amplificação térmica referido como SQ27115 usado para identificar a presença de alelo de DNA soja de tipo selvagem e/ou DNA de evento MON87751 de soja em uma amostra, e é idêntico ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo a posições 11458 a 11481 de SEQ ID NO: 10.
[0045] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de 30 nucleotídeos correspondendo a um iniciador de amplificação térmica referido como SQ26901 utilizado num ensaio de zigosidade para identificar a presença de DNA do alelo de tipo selvagem em uma amostra derivada de soja, e é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 1288 a 1317 de SEQ ID NO: 10.
[0046] SEQ ID NO: 16 é uma sequência de 18 nucleotídeos correspondente a uma sonda referida como PB11254 e é usada num ensaio de zigosidade para identificar a presença de um alelo de DNA de tipo selvagem em uma amostra derivada de soja.
[0047] SEQ ID NO: 17 é uma sequência de 112 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo único no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserido no evento de soja MON87751, e é idêntica às posições 36-147 na SEQ ID NO: 9, e as posições 1370- 1481 em SEQ ID NO: 10.
[0048] SEQ ID NO: 18 é uma sequência de 52 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo única no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserido no evento de soja MON87751, e é idêntica às posições 1305-1356 na SEQ ID NO: 9, e as posições 1639-1690 em SEQ ID NO: 10.
[0049] SEQ ID NO: 19 é uma sequência de 283 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo única no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserida no evento de soja MON87751, e é idêntica às posições 1561 -1843 na SEQ ID NO: 9, e as posições 2895-3177 em SEQ ID NO: 10.
[0050] SEQ ID NO: 20 é uma sequência de 486 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo única no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserido no evento de soja MON87751, e é idêntica às posições 2340-2825 na SEQ ID NO: 9, e as posições 3674-4159 em SEQ ID NO: 10.
[0051] SEQ ID NO: 21 é uma sequência de 179 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo única no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserido no evento de soja MON87751, e é idêntica às posições 3326-3504 na SEQ ID NO: 9, e as posições 4660-4838 em SEQ ID NO: 10.
[0052] SEQ ID NO: 22 é uma sequência de 106 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo única no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserido no evento de soja MON87751, e é útil para identificar DNA de evento MON87751 numa amostra, e é idêntica às posições 3749-3854 na SEQ ID NO: 9, e para posições 5083-5188 na SEQ ID NO: 10.
[0053] SEQ ID NO: 23 é uma sequência de 60 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo única no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserido na soja evento MON87751, e é útil para identificar DNA de evento MON87751 numa amostra, e é idêntica às posições 9320 - 9379 na SEQ ID NO: 9, e a posições 10654 - 10713 de SEQ ID NO: 10.
[0054] SEQ ID NO: 24 é uma sequência de 66 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo única no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserido na soja evento MON87751, e é útil para identificar DNA de evento MON87751 numa amostra, e é idêntica às posições 9620 - 9685 na SEQ ID NO: 9, e a posições 10954 - 11019 de SEQ ID NO: 10.
[0055] SEQ ID NO: 25 é uma sequência de 156 nucleotídeos correspondendo a uma sequência de nucleotídeo única no DNA transgênico (SEQ ID NO: 9) inserido no evento de soja MON87751, e é útil para identificar DNA de evento MON87751 numa amostra, e é idêntica às posições 9720-9875 na SEQ ID NO: 9, e a posições 1105411209 em SEQ ID NO: 10.
[0056] SEQ ID NO: 26 é uma sequência de 1905 nucleotídeos correspondente ao quadro de leitura aberta que codifica a proteína Cry2Ab expressa em evento de soja MON87751.
[0057] Os inventores identificaram um evento de soja transgênica MON87751 que apresenta resistência comercialmente aceitável para pragas de inseto agriculturalmente importantes da ordem Lepidoptera como Spodoptera frugiperda (lagarta-do-cartucho, FAW), Spodoptera eridania (lagarta das folhas, SAW), Spodoptera exigua (lagarta militar da beterraba, BAW,) Spodoptera ornithogalli (lagarta de listras amarelas, YSAW), Crocidosema aporema (lagarta do broto de feijão, BSM), Rachiplusia nu (lagarta falsa medideira, SFL), Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja, VBC), Chrysodeixis includens (lagarta falsa medideira, SBL), Helicoverpa zea (lagarta-da-espiga, SPW), Helicoverpa gelotopoeon (lagarta-do-algodão), Elasmopalpus lignosellus, (lagarta elasmo), Estigmene acrea (sapal) e Plathypena scabra (larva do trevo), entre outros. O evento oferece dois cassetes de expressão diferentes ligados operacionalmente, um codificando Cry2Ab, e o outro codificando as proteínas inseticidas Cry1A.105, e oferece dois modos de ação diferentes para resistência a soja de infestações de lepidópteros. Outros eventos de soja transgênica são conhecidos na técnica, ou seja, MON 88701, que expressa uma proteína de toxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis (Bt) (MacRae et al. 2005, Fischhoff & Perlak, 1995). MON 88701 fornece um único modo de ação para a resistência às principais pragas de insetos lepidópteros de soja, embora a eficácia contra Spodoptera spp. não seja significativa. Seria preferível fornecer soja transgênica expressando duas ou mais diferentes proteínas inseticidas exibindo eficácia às principais pragas da soja e incluindo o controle dos Spodoptera spp. Os inventores proporcionam pelo menos uma solução para este problema sob a forma do evento MON87751 de soja, que combinam dois cassetes de expressão ligados covalentemente em um lócus no genoma da soja, estes cassetes conferindo as características de resistência das espécies de lepidópteros expandida, e, adicionalmente, proporciona às células de soja, tecidos de soja, folhas de soja, vagens de soja, sementes de soja e plantas de soja mais do que um modo de ação para prevenir ou retardar o desenvolvimento de resistência entre as espécies de Lepidoptera.
[0058] O evento MON87751 de soja foi produzida por um processo de transformação mediado por Agrobacterium de tecido do meristema de soja com o construto de plasmídeo 1. Este construto de plasmídeo contém duas regiões, cada uma delimitada por segmentos de borda de Agrobacterium (segmento de T-DNA). O primeiro segmento de T-DNA contém dois cassetes de expressão de planta ligados, um cassete de expressão que codifica um marcador selecionável e um cassete de expressão que codifica um marcador pontuável. O segundo segmento de T-DNA contém dois cassetes de expressão de plantas com ligações com os elementos genéticos reguladores necessários para a expressão em células de plantas de soja de duas proteínas inseticidas diferentes, e Cry2Ab Cry1A.105. Devido aos dois segmentos de T- DNA no construto de plasmídeo 1, o segmento de T-DNA contendo os genes marcadores de seleção/pontuáveis aleatoriamente inseridos no genoma da soja e em um local de separado do local de integração do segmento de T-DNA contendo os cassetes de expressão de Cry2Ab e Cry1A.105, permitindo, assim, a segregação dos dois segmentos de T- DNA dentro do genoma das plantas de soja transformadas durante o processo de autopolinização e/ou retrocruzamento, por exemplo triagem R1 e maior geração de plantas transgênicas. As células de soja transformadas foram regeneradas em plantas de soja e plantas intactas individuais foram selecionadas a partir da população de plantas que mostraram a integridade do segundo segmento de T-DNA que codifica as proteínas Cry2Ab e Cry1A.105. Em R1 e gerações subsequentes, os eventos foram selecionados com base na integridade do segundo segmento de T-DNA que codifica as proteínas Cry1A.105 e Cry2Ab, e na ausência (ou seja, segregação) do primeiro segmento de T-DNA que codifica os cassetes marcadores selecionáveis / pontuáveis, e para plantas que não contenham qualquer sequência de estrutura principal de plasmídeo. A expressão das proteínas tóxicas inseticidas e Cry2Ab Cry1A.105 nas células do evento MON87751 de soja confere resistência a pragas de insetos lepidópteros quando as células de soja de evento MON87751 são fornecidas na dieta dos insetos.
[0059] O DNA de plasmídeo inserido no genoma do evento MON87751 de soja foi caracterizado por análises moleculares detalhadas. Estas análises incluíram: o número de inserção (número de sítios de integração dentro do genoma da soja), o local de inserção genômico (o local específico no genoma da soja onde a inserção ocorreu), o número de cópias (o número de cópias de T-DNA dentro de um lócus), e a integridade do DNA transgênico inserido. O construto de plasmídeo contendo os dois cassetes de expressão ligados inseridos no genoma da soja levando ao evento MON87751 contém vários segmentos (sequências de junção entre os elementos utilizados para construir ou fazer os vários cassetes de expressão) que não são conhecidos por aparecer naturalmente no genoma da soja nem em outros vectores ou acontecimentos transgênicos de soja ou de outro modo (por exemplo, sequências como apresentado em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26). Além disso, a acção de transformação que deu origem ao DNA transgênico inserido no evento MON87751 é aqui caracterizada como uma inserção dentro de um único lócus no genoma da soja, resultando em duas novas sequências de junção ou loci entre o DNA introduzido e o DNA do genoma de soja. Também aqui são caracterizadas sequências únicas adicionais dentro do DNA heterólogo inserido no genoma de soja do evento MON87751 e que são de comprimento suficiente para ser únicas apenas para um genoma de soja que compreende o DNA de evento MON87751. Estas sequências de junção são úteis para detectar a presença do DNA de evento MON87751 em células de soja, tecido de soja, semente de soja e plantas de soja ou produtos de plantas de soja (produtos de base de soja). Sondas moleculares de DNA e os pares de iniciadores são aqui descritos que foram desenvolvidos para uso na identificação da presença destes vários segmentos de junção em amostras biológicas contendo ou que se suspeita conterem células de soja, semente de soja, partes de plantas de soja ou de tecidos de plantas de soja que contêm o DNA de evento MON87751. Os dados mostram que evento MON87751 contém uma única inserção de T-DNA com uma cópia do DNA transgênico inserido. Nenhum elemento adicional do construto 1 de transformação que não seja partes das regiões de fronteira esquerda e direita de Agrobacterium tumefaciens utilizadas para a transferência de DNA transgênico do plasmídeo de transformação de planta para o genoma da soja foi identificado no DNA de evento MON87751. Por fim, a amplificação térmica produzindo amplicons específicos de diagnóstico para a presença de tal DNA de evento MON87751 em uma amostra, e análises de sequência de DNA As foram realizadas para determinar as arbitrariamente atribuídas junções de genoma inseridas-em-planta 5 'e 3', confirmar a organização dos elementos no interior da inserção, e determinar a sequência completa de DNA do DNA de transgene inserido (SEQ ID NO: 9) em evento de soja MON87751.
[0060] Dezenas de eventos transgênicos foram produzidos utilizando o construto de transformação 1 utilizado para produzir o evento de soja transgênico MON87751, e dez construtos de transformação adicionais foram gerados e utilizados para a produção de muitas dezenas de outros acontecimentos de soja transgênicos que foram comparados com o evento de soja MON87751 e eventos de soja semelhantes. Estes eventos foram testados pelo ensaio de ELISA para a expressão em tecido de folha das duas proteínas inseticidas, Cry2Ab e Cry1A.105. Um subconjunto dos eventos produzidos a partir de cada transformação, e a maior parte dos construtos, foram testados quanto à eficácia para o controle de pragas de insetos lepidópteros em ensaios de telado em pequenas parcelas. Determinou-se que os elementos de expressão de plantas, e orientação relativa dos cassetes de expressão e Cry2Ab Cry1A.105 no construto 1 de transformação, forneceram os eventos com a melhor eficácia contra o mais amplo espectro de pragas de insetos lepidópteros testados.
[0061] A menos que indicado em contrário, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados ordinariamente na técnica relevante. As definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Tal como aqui utilizado, o termo "soja" significa Glycine max e inclui todas as variedades de plantas que podem ser cruzadas com plantas de soja contendo o DNA de evento MON87751, incluindo as espécies selvagens de soja, bem como as plantas que pertencem ao género Glycine que permitem reprodução entre as espécies. Tal como aqui utilizado, o termo "compreendendo" significa “incluindo, mas não limitado a".
[0062] A presente invenção proporciona plantas transgênicas que foram transformadas com um construto de DNA que contém, pelo menos, dois cassetes de expressão; um primeiro cassete de expressão que expressa quantidades tóxicas de proteína inseticida Cry2Ab, e um segundo cassete de expressão que expressa quantidades tóxicas de proteína inseticida Cry1A.105. O que se entende por uma quantidade tóxica é uma quantidade eficaz, uma quantidade inseticida, uma quantidade inseticida eficaz, uma quantidade eficaz como inseticida, uma quantidade alvo supressora de insetos, uma quantidade pesticida eficaz, uma quantidade na dieta de insetos da ordem Lepidoptera que é inseticida, e outros termos semelhantes para serem compreendidos de acordo com a uso convencional por aqueles versados na técnica relevante. As plantas de soja transformadas de acordo com os métodos e com o construto de DNA aqui divulgados são resistentes a pragas de insetos lepidópteros. As características agronómicas ligadas proporcionam facilidade em manter essas características em conjunto numa população de reprodução, e apresentam uma resistência a um espectro mais largo de pragas de insetos lepidópteros do que as plantas que contêm apenas um único gene que confere resistência às pragas de insetos lepidópteros (ou seja, Cry1Ac).
[0063] Uma "planta" transgênica é produzida pela transformação de uma célula de planta com DNA heterólogo, ou seja, um construto de ácido polinucleico que inclui um número de características eficazes de interesse; regeneração de uma planta resultante da inserção do transgene no genoma da célula vegetal, e a seleção de uma planta em particular caracterizada por inserção num local particular de genoma e o número de características eficazes da planta transgênica regenerada. O termo "evento" refere-se ao DNA do transformante original que compreende o DNA inserido, e a sequência genômica que flanqueia imediatamente adjacente ao DNA inserido. Tal DNA é único e seria de esperar ser transferido para uma progênie que recebe o DNA inserido, incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultante de endocruzamento) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido. A presente invenção também fornece a planta transformante original e progênie do transformante que inclui o DNA heterólogo. Tal progênie pode ser produzida por um cruzamento sexual entre plantas que compreendem o evento e outra planta na qual a progênie inclui o DNA heterólogo. Mesmo após o retrocruzamento repetido a um pai recorrente, o evento está presente na progênie do cruzamento na mesma localização genômica. A presente invenção está relacionada com o evento transgênico, plantas de soja que compreendem MON87751, progênie respectiva, e composições de DNA ali contidas.
[0064] Uma "sonda" é um ácido nucleico isolado ao qual pode estar anexada uma molécula repórter ou marcadora detectável convencional, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente, ou enzima. Tal sonda é complementar a uma cadeia de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, com uma cadeia de DNA de MON87751, caso a partir de uma planta contendo MON87751 ou a partir de uma amostra que inclui DNA de MON87751. Sondas de acordo com o presente invenção incluem não só os ácidos ribonucleicos ou desoxirribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sondas que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser utilizados para detectar a presença da referida sequência de DNA alvo.
[0065] Iniciadores de DNA são ácidos polinucleicos isolados que são emparelhados com uma cadeia complementar de DNA alvo por hibridação de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e a cadeia de DNA alvo, depois estendidos ao longo da cadeia de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA. Um par de iniciador de DNA, ou um conjunto de iniciadores de DNA da presente invenção referem-se a dois iniciadores de DNA úteis para a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido polinucleico convencionais.
[0066] As sondas de DNA e iniciadores de DNA pode ter 11 polinucleotídeos ou mais de comprimento, ou podem ser de 18 ou mais polinucleotídeos, 24 polinucleotídeos ou mais, ou 30 ou mais polinucleotídeos. Tais sondas e sequências iniciadoras são selecionadas para serem de comprimento suficiente para hibridizar especificamente com uma sequência alvo em condições de hibridação de elevado rigor. De preferência, as sondas e os iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade de sequência completa com a sequência alvo, embora as sondas que diferem da sequência alvo que retêm a capacidade para hibridar com sequências alvo possam ser concebidas por meio de métodos convencionais.
[0067] Os iniciadores e sondas baseados no DNA genômico de flanqueamento e sequências de inserção aqui descritas podem ser usados para confirmar (e, se necessário, para corrigir) as sequências de DNA descritas por métodos convencionais, por exemplo, por re- clonagem e sequenciação de tais moléculas de DNA.
[0068] As sondas e iniciadores de ácido nucleico da presente invenção hibridizam sob condições rigorosas para uma sequência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou de amplificação de ácido nucleico convencional pode ser usado para identificar a presença de DNA de uma planta transgênica em uma amostra. As moléculas de ácido polinucleico também referidas como os segmentos de ácido nucleico ou os seus fragmentos são capazes de hibridar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico, sob determinadas circunstâncias. Como usadas aqui, duas moléculas de ácido polinucleico são ditas como sendo capazes de hibridizar especificamente uma à outra se as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura anti-paralela de cadeia dupla do ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucléico é dita como sendo o "complemento" de outra molécula de ácido nucléico, se elas apresentam complementaridade completa. Como usado aqui, as moléculas são ditas como exibindo "complementaridade completa" quando todos os nucleotídeos de uma das moléculas são complementares de um nucleotídeo do outro. Duas moléculas são ditas ser "minimamente complementares" se elas puderem cruzar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir-lhes permanecer aneladas uma com a outra sob pelo menos condições "de baixo-rigor" convencionais. De forma similar, as moléculas são ditas ser "complementares", se elas puderem cruzar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir-lhes permanecer aneladas uma com a outra sob condições de "alto-rigor" convencionais. Condições de rigor são descritas por Sambrook et al., 1989, e by Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Desvios da complementaridade completa, portanto, são admissíveis contanto que esses desvios não excluam completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de cadeia dupla. Para uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou sonda ela precisa apenas ser suficientemente complementar na sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla sob as concentrações de solvente e sal específicas empregadas.
[0069] Como usado neste documento, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácido nucleico que cruzará especificamente para o complemento da sequência de ácido nucleico ao qual está sendo comparado sob condições de alto rigor. Condições de rigor adequadas que promovem a hibridização do DNA, por exemplo, 6,0 x citrato de sódio/cloreto de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50°C, são conhecidas por aqueles versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50°C, a um alto rigor de cerca de 0,2 x SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir de condições de baixo rigor à temperatura ambiente, de cerca de 22°C, a condições de alto rigor a cerca de 65°C. A temperatura e o sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é alterada. Em uma modalidade preferencial, um ácido polinucleico da presente invenção especificamente hibridizará a uma ou mais das moléculas de ácido nucleico estabelecidas em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24, ou os seus complementos ou fragmentos sob condições moderadamente rigorosas, por exemplo a cerca de 2,0 x SSC, e cerca de 65 ° C. Numa forma de realização particularmente preferida, um ácido nucleico da presente invenção irá hibridar especificamente com uma ou mais das moléculas de ácido nucleico apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 ou complementos ou fragmentos de qualquer uma sob condições de elevado rigor. Num aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferida da presente invenção tem a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou SEQ ID NO: 10; ou SEQ ID NO: 17, ou SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, ou SEQ ID NO: 22, ou SEQ ID NO: 23, ou os seus complementos ou fragmentos de cada uma. A hibridação da sonda à molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer número de métodos conhecidos dos versados na técnica, estes podem incluir, mas não estão limitados a marcadores fluorescentes, etiquetas radioativas, as etiquetas com base em anticorpo e as etiquetas quimioluminescentes.
[0070] Sobre a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (e.g., por PCR) usando um par de iniciadores de amplificação específico, "condições rigorosas" são condições que permitem que o par de iniciadores hibridize apenas para a sequência de ácido nucleico alvo à qual um iniciador tendo a sequência de tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria e preferencialmente produza um produto de amplificação exclusivo, o amplicon, em uma reação de amplificação de DNA térmico.
[0071] O termo "específica para (uma sequência alvo)" indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização rigorosas somente para a sequência alvo em uma amostra compreendendo a sequência alvo.
[0072] Tal como aqui usado, "DNA amplificado" ou "amplicon" refere-se ao produto do método de amplificação de ácido polinucleico dirigido para uma molécula de ácido polinucleico que é alvo de uma parte do modelo de ácido polinucleico. Por exemplo, para determinar se uma planta de soja que resulta de um cruzamento sexual contém DNA genômico de planta transgênica de uma planta de soja que compreende evento MON87751 da presente invenção, o DNA que é extraído de uma amostra de tecido de planta de soja pode ser submetido a um método de amplificação de ácido polinucleico utilizando um par de iniciadores que inclui um primeiro iniciador derivado de uma sequência de DNA genômico da região que flanqueia o DNA heterólogo inserido de evento MON87751 e é alongada por polimerase de 5 'para 3' na direção do DNA inserido. O segundo iniciador é derivado da molécula de DNA heteróloga inserida e é alongado pela polimerase 5' para 3' na direção do DNA genômico de flanqueamento do qual o primeiro iniciador é derivado. O amplicon pode variar em comprimento do comprimento combinado do par de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeos ou mais cerca de cinquenta pares de bases de nucleotídeos ou mais cerca de duzentos e cinquenta pares de bases de nucleotídeos ou mais cerca de 400-50 pares de bases de nucleotídeos ou mais. Em alternativa, um par de iniciadores pode ser derivado da sequência genômica de ambos os lados do DNA heterólogo inserido, de modo a produzir um amplicon que inclui toda a sequência de polinucleotídeo de inserção (por exemplo, um iniciador direto isolado da porção genômica na extremidade 5 'da SEQ ID NO: 10 e um iniciador inverso isolado da porção genômica na extremidade 3' da SEQ ID NO: 10 que amplifica uma molécula de DNA compreendendo a sequência de DNA heteróloga inserida (SEQ ID NO: 9) aqui identificados no evento MON87751 contendo genoma). Um membro de um par de iniciadores derivados da sequência genômica da planta adjacente ao DNA transgênico inserido está localizado a uma distância a partir da sequência de DNA inserida, esta distância pode variar de um par de bases de nucleotídeos até cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeos. O uso do termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciador que podem ser formados na reação de amplificação do DNA térmica.
[0073] Para fins práticos, deve-se conceber iniciadores que produzem produtos de amplificação de um intervalo de tamanho limitado, por exemplo, entre 100 e 1000 bases. Amplicons menores (menor comprimento de polinucleotídeo) de tamanho, em geral, são produzidos de forma mais fiável em reações de amplificação térmica, para permitir tempos de ciclo mais curtos, e podem ser facilmente separados e visualizados em géis de agarose ou adaptados para uso em ensaios de ponto final Taqman® semelhantes. Amplicons menores podem ser produzidos e detectados por métodos conhecidos na técnica da detecção de amplicon de DNA. Além disso, os amplicons produzidos utilizando os pares de iniciadores podem ser clonados em vectores, propagados, isolados e sequenciados ou podem ser sequenciados diretamente com métodos bem estabelecidos na técnica. Qualquer par de iniciadores derivados a partir da combinação de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9 ou a combinação de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9 que são úteis num método de amplificação de DNA para produzir um amplicon de diagnóstico para plantas compreendendo MON87751 ou sua progênie é um aspecto da invenção. Qualquer molécula de iniciador de polinucleotídeo de DNA isolada única compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 7, ou o seu complemento, que é útil num método de amplificação de DNA para produzir um amplicon de diagnóstico para plantas compreendendo MON87751 ou sua progênie é um aspecto da invenção. Qualquer molécula de iniciador de polinucleotídeo de DNA isolada única compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 8, ou o seu complemento, que é útil num método de amplificação de DNA para produzir um amplicon de diagnóstico para plantas compreendendo MON87751 ou sua progênie é um aspecto da invenção. Qualquer molécula de iniciador de polinucleotídeo de DNA isolada única compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 9, ou o seu complemento, que é útil num método de amplificação de DNA para produzir um amplicon de diagnóstico para plantas compreendendo MON87751 ou sua progênie é um aspecto da invenção.
[0074] Amplificação de ácido polinucleico pode ser conseguida por qualquer dos vários métodos de amplificação de ácido polinucleico conhecidos na técnica, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR). Os métodos de amplificação são conhecidos na técnica e são descritos, inter alia, nas Patentes US Nos. 4,683,195 e 4,683,202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Os métodos de amplificação de PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 quilobases (kb) de DNA genômico e até 42 kb de DNA de bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:5695-5699, 1994). Estes métodos, bem como outros métodos conhecidos na técnica da amplificação de DNA podem ser usados na prática da presente invenção. A sequência da inserção de DNA heterólogo ou sequência flanqueadora de DNA genômico de eventos de soja MON87751 pode ser verificada (e corrigida, se necessário) por amplificação de tais moléculas de DNA a partir de sementes de soja contendo plantas de DNA de evento MON87751 ou soja cultivadas a partir das sementes de soja contendo o DNA de evento MON87751 depositado com o ATCC tendo no. de adesão PTA-120166, utilizando iniciadores derivados das sequências aqui proporcionadas, seguido por sequenciação de DNA convencional de amplicon de PCR ou fragmentos de DNA clonados respectivos.
[0075] O amplicon de diagnóstico produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Um desses métodos é a Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994), onde um oligonucleotídeo de DNA é projetado se sobrepondo tanto à sequência do DNA genômico flanqueadora adjacente e à sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em poços de uma placa de microtítulos. Após PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanqueadora adjacente), um produto de PCR de fita única pode ser hibridizado para o imobilizado do oligonucleotídeo imobilizado e servir como um modelo para uma reação de extensão de base única, usando uma DNA polimerase e trifosfatos de didesoxinucleotídeo rotulado (ddNTPs) específicos marcados para a base seguinte esperada. A leitura pode ser fluorescente ou com base em ELISA. Um sinal indica a presença da sequência genômica/do transgene devido à amplificação bem- sucedida, hibridação e extensão de uma única base.
[0076] Outro método é a técnica de Pirossequenciamento, conforme descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método, um oligonucleotídeo é projetado se sobrepondo ao DNA genômico adjacente e à junção do DNA de inserção. O oligonucleotídeo é hibridizado para um produto de PCR de fita única da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfosulfato e luciferina. Os ddNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da sequência genômica/do transgene devido à amplificação, hibridização e extensão de múltiplas bases bem-sucedidas.
[0077] A Polarização de Fluorescência, conforme descrita por Chen, et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999), é um método que pode ser usado para detectar o amplicon da presente invenção. Ao usar este método, um oligonucleotídeo é projetado que se sobrepõe à junção do DNA genômico flanqueador e inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado para um produto de PCR de fita única da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência flanqueadora de DNA genômico) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP marcado com fluorescência. A extensão de base única resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização, usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença da sequência de transgene/genômica devido à amplificação, hibridização e extensão de base única bem-sucedidas.
[0078] Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é descrito como um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA e é totalmente compreendido nas instruções fornecidas pelo fabricante. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada que se sobrepõe à junção do DNA genômico flanqueador e de inserção. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência flanqueadora genômica) são um ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem e liberação da fração fluorescente para longe da fração de arrefecimento na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica /do transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas.
[0079] Balizas Moleculares foram descritas para uso na detecção de sequência, conforme descrito em Tyangi, et al. (Nature Biotech.14:303-308, 1996). Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada se sobrepondo à junção do DNA genômico flanqueador e de inserção. A estrutura exclusiva da sonda FRET resulta nela contendo a estrutura secundária que mantém as frações fluorescente e de arrefecimento em estreita proximidade. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência flanqueadora genômica) são um ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após PCR bem-sucedido, a hibridização da sonda FRET para a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial das frações fluorescente e de arrefecimento. Um sinal fluorescente resulta. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção flanqueadora/do transgene devido à amplificação e hibridização bem-sucedidas.
[0080] Kits de detecção de DNA que se baseiam em métodos de amplificação de DNA contêm as moléculas de DNA de iniciador que hibridizam especificamente com um DNA alvo e amplificam um amplicon de diagnóstico de acordo com as condições de reação apropriadas. O kit pode proporcionar um método de detecção com base em gel de agarose ou de qualquer variedade de métodos de detecção do amplicon de diagnóstico que são conhecidos na técnica. Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos utilizando as composições aqui divulgadas e que são úteis para a identificação de DNA de evento MON87751 de soja numa amostra e podem ser aplicados a métodos para a criação de plantas de soja contendo o DNA de evento MON87751. Um kit que contém os iniciadores de DNA que são homólogos ou complementares a qualquer porção da região genômica de soja como descrito em SEQ ID NO: 10 e com qualquer porção do DNA transgênico inserido como estabelecido em SEQ ID NO: 10 é um objetivo da invenção. As moléculas de DNA podem ser utilizadas em métodos de amplificação de DNA (PCR) ou como sondas em métodos de hibridização de ácido polinucleico, ou seja, análise Southern, análise Northern.
[0081] Sequências de junção podem ser representadas por uma sequência do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26. Por exemplo, as sequências de junção podem ser arbitrariamente representadas pelas sequências de nucleotídeos fornecidas como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Alternativamente, as sequências de junção podem ser arbitrariamente representadas pelas sequências de nucleotídeos fornecidas como SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. Alternativamente, as sequências de junção podem ser arbitrariamente representadas pelas sequências de nucleotídeos fornecidas como SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6. Estes nucleotídeos estão ligados por fosfodiéster e em caso de evento de soja MON87751 estão presentes como parte do genoma da célula vegetal recombinante. A identificação de um ou mais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26 em uma amostra derivada de uma planta de soja, semente de soja, ou parte de planta de soja é determinante de que o DNA foi obtido a partir de eventos de soja MON87751 e é diagnóstico da presença de uma amostra contendo DNA de evento de soja MON87751. A invenção proporciona assim uma molécula de DNA que contém, pelo menos, uma das sequências de nucleotídeos fornecidas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26. Qualquer segmento de DNA derivado de evento de soja transgênica MON87751 que é suficiente para incluir pelo menos uma das sequências proporcionadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26 está dentro do âmbito da invenção. Além disso, qualquer molécula de polinucleotídeo compreendendo uma sequência complementar a qualquer uma das sequências descritas neste parágrafo está no escopo da invenção.
[0082] A presente invenção fornece moléculas de DNA exemplificativas que podem ser utilizadas quer como iniciadores ou sondas para a detecção da presença de DNA derivado de uma planta de soja que compreende DNA de evento MON87751 numa amostra. Esses iniciadores ou sondas são específicos para uma sequência de ácido nucleico alvo e como tal são úteis para a identificação da sequência de ácido nucleico do evento MON87751 de soja pelos métodos da invenção descritos neste documento.
[0083] Um "iniciador" pode ser um polinucleotídeo isolado altamente purificado que é projetado para uso em métodos de hibridização ou anelamento específicos que envolvem amplificação térmica. Um par de iniciadores pode ser usado com modelo de DNA, tal como uma amostra de DNA genômico de soja, em uma amplificação térmica, tal como a reação em cadeia da polimerase (PCR), para produzir um amplicon, onde o amplicon produzido a partir de tal reação teria uma sequência de DNA correspondente à sequência de DNA localizada entre os dois sítios onde os iniciadores hibridizaram para o modelo. Tal como aqui utilizado, um "amplicon" é uma réplica de uma parte ou fragmento de DNA que foi sintetizada utilizando as técnicas de amplificação. Um amplicon da invenção pode compreender pelo menos uma das sequências proporcionadas como fornecida como SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Um iniciador é tipicamente projetado para hibridizar com uma fita de DNA alvo complementar para formar um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, e a presença do iniciador é um ponto de reconhecimento por uma polimerase para iniciar a extensão do iniciador (ou seja, a polimerização de nucleotídeos adicionais em uma molécula de nucleotídeos que se alonga), utilizando como modelo a fita de DNA alvo. Os pares de iniciador, conforme usados na presente invenção, são destinados a se referir ao uso de duas fitas de iniciadores opostas de um segmento de nucleotídeo de fita dupla para efeitos de amplificação linear do segmento de polinucleotídeo entre as posições direcionadas para a ligação dos membros individuais do par de iniciador, normalmente em uma reação de amplificação térmica ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais. Exemplos de moléculas de DNA úteis como iniciadores são fornecidas como SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15. O par de iniciadores fornecido como SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 é útil como uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA que é diferente da primeira molécula de DNA, e ambos são cada de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 10 para funcionar como iniciadores de DNA que, quando usados em conjunto numa reação de amplificação térmica com modelo de DNA derivado de evento de soja MON87751, para produzir um amplicon de diagnóstico para o evento de soja MON87751 DNA numa amostra.
[0084] Uma "sonda" é um ácido nucleico isolado que é complementar a uma fita de um ácido nucleico alvo. Sondas de acordo com a invenção incluem não só ácidos desoxirribonucleicos ou ribonucleicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência do DNA alvo e a detecção de tal ligação pode ser útil para diagnosticar/determinar/confirmar a presença de que a sequência de DNA alvo em uma amostra específica. Uma sonda pode ser ligada a uma molécula marcadora ou repórter convencional detectável, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente de quimioluminescência ou enzima. Uma molécula de DNA exemplar útil como uma sonda é fornecida como SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 16.
[0085] Sondas e iniciadores de acordo com a invenção podem ter uma identidade de sequência completa para a sequência alvo, embora os iniciadores e as sondas difiram da sequência alvo que mantém a capacidade de hibridizar preferencialmente para sequências alvo, podem ser projetados por métodos convencionais. Para uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou sonda ela precisa apenas ser suficientemente complementar na sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla sob as concentrações de solvente e sal específicas empregadas. Qualquer hibridação de ácidos nucleicos ou a método de amplificação convencional pode ser usada para identificar a presença do DNA transgênico de eventos de soja MON87751 numa amostra. Sondas e iniciadores são geralmente de pelo menos cerca de 11 nucleotídeos, pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 30 nucleotídeos ou mais de comprimento. Tais sondas e iniciadores hibridizam especificamente para uma sequência de DNA alvo sob condições de hibridização de alto rigor. Condições de rigor são descritas por Sambrook et al., 1989, e by Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
[0086] Qualquer número de métodos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica pode ser usado para isolar e manipular uma molécula de DNA, ou fragmento da mesma, divulgada na presente invenção, incluindo métodos de amplificação térmicos. Moléculas de DNA ou fragmentos das mesmas, também podem ser obtidas por outras técnicas tais como sintetizando diretamente o fragmento por meios químicos, como é comumente praticado usando um sintetizador do oligonucleotídeo automatizado.
[0087] As moléculas de DNA e as correspondentes sequências de nucleotídeos aqui proporcionadas são, portanto, úteis para, entre outras coisas, para identificar o evento de soja MON87751, selecionar variedades de plantas ou híbridos compreendendo evento de soja MON87751, na detecção da presença de DNA derivado de evento transgênico MON87751 de soja em uma amostra, e monitorização de amostras para detectar a presença e/ou ausência de eventos de soja MON87751 ou partes de plantas derivadas de plantas de soja que compreendem evento MON87751.
[0088] A invenção proporciona plantas de soja, células de plantas de soja, sementes de soja, partes de plantas de soja (tal como o pólen, óvulos, vagem, tecido flor, tecido da raiz, tecido do caule e tecido foliar), plantas de progênie de soja, óleo de soja, vinho de soja, leite de soja, proteína de soja, e de produtos de base de soja. Estas plantas de soja, as células de plantas de soja, sementes de soja, partes de plantas de soja, plantas de progênie de soja, óleo de soja, vinho de soja, leite de soja, produtos de base de, proteína de soja, e farelo de soja contêm uma quantidade detectável de um polinucleotídeo da invenção, ou seja,, tal como um polinucleotídeo tendo pelo menos uma das sequências proporcionadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26. As plantas de soja, células de planta, sementes, partes de plantas, e plantas da progênie da invenção também podem conter um ou mais transgenes adicionais. Tal transgene adicional pode ser qualquer sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de proteína ou RNA que confere uma característica desejável, incluindo mas não se limitando ao aumento da resistência aos insetos, o aumento da eficiência de uso de água, aumento da performance de rendimento, aumento da resistência à seca, o aumento da qualidade da semente, a melhoria da qualidade nutricional e/ou aumento da tolerância a herbicidas, em que o traço desejável é medido em relação a uma planta de soja em falta de tal transgene adicional.
[0089] A invenção proporciona plantas de soja, células de plantas de soja, sementes de soja, partes de plantas de soja (como o pólen, óvulo, vagem, tecido de flor, tecido de raiz, tecido de caule e tecido foliar), plantas descendentes de soja derivadas de uma planta de soja transgênica contendo DNA de evento MON87751. Uma amostra representativa de semente de soja contendo o DNA de evento MON87751 foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC®). O repositório ATCC atribuiu a Designação de Patente de Depósito PTA-120166 para a semente contendo DNA de evento MON87751.
[0090] A presente invenção fornece um microrganismo que compreende uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26 presente no seu genoma. Um exemplo de tal micro-organismo é uma célula de vegetal transgênico. Os micro-organismos, tal como uma célula de vegetal da invenção, são úteis em muitas aplicações industriais, incluindo mas não limitado a: (i) usar como ferramenta de pesquisa para a investigação científica ou pesquisa industrial; (ii) usar em cultura para a produção de carboidrato endógeno ou recombinante, lipídios, ácido nucleico, ou produtos proteicos ou pequenas moléculas que podem ser usadas para a pesquisa científica subsequente ou como produtos industriais; e (iii) usar com técnicas de cultura de tecidos de vegetal modernas para produzir vegetais transgênicos ou culturas de tecido de vegetal que podem então ser usados para pesquisa ou produção agrícola. A produção e o uso de micro-organismos tais como as células de vegetal transgênico utilizam técnicas microbiológicas modernas e a intervenção humana para produzir um micro-organismo sintético, exclusivo. Neste processo, o DNA recombinante é inserido em um genoma da célula de vegetal para criar uma célula de vegetal transgênico que é separada e exclusiva de células de vegetais de ocorrência natural. Esta célula de vegetal transgênico pode então ser cultivada como células de bactérias e leveduras usando técnicas de microbiologia modernas e podem existir em um estado unicelular não diferenciado. A nova composição genética da célula de planta transgênica e o fenótipo são um efeito técnico criado pela integração do DNA heterólogo no genoma da célula. Outro aspecto da invenção é um método de usar um micro-organismo da invenção. Métodos de usar micro-organismos da invenção, tais como as células de vegetal transgênico, incluem (i) métodos de produção de células transgênicas integrando DNA recombinante no genoma da célula e em seguida, usando esta célula para derivar células adicionais, possuindo o mesmo DNA heterólogo; (ii) métodos de cultivo de células que contêm o DNA recombinante, usando técnicas de microbiologia modernas; (iii) métodos de produção e purificação do carboidrato endógeno ou recombinante, lipídio, ácido nucleico, ou produtos proteicos de células cultivadas; e (iv) métodos de uso das técnicas de cultura de tecido de vegetal modernas com células de vegetal transgênico para produzir vegetais transgênicos ou culturas de tecido de vegetal transgênico.
[0091] As plantas da invenção podem passar ao longo do DNA de evento MON87751, incluindo o transgene inserido no evento de soja MON87751, à progênie. Tal como aqui utilizado, "progênie" inclui qualquer planta, semente, célula de planta, e/ou parte de planta regenerável compreendendo o DNA de evento MON87751 derivado de uma planta ancestral e/ou compreendendo uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26. As plantas, progênie e sementes podem ser homozigóticas ou heterozigóticas para o transgene. Progênie pode ser cultivada a partir de sementes produzidas por um evento MON87751 de soja contendo vegetais e/ou a partir de sementes produzidas por plantas tratadas com o pólen de uma planta contendo evento MON87751 de soja.
[0092] Plantas de progênie podem ser autopolinizadas (também conhecido como "selfing") para gerar uma verdadeira linhagem de plantas, ou seja, plantas homozigóticas para o transgene. Autopolinização de progênie adequada pode produzir plantas que são homozigotos para os dois genes exógenos adicionados.
[0093] Alternativamente, plantas de progênie podem ser cruzadas, por exemplo, cultivadas com uma outra planta não relacionada, para produzir um varietal ou uma semente híbrida ou planta. A outra planta não relacionada pode ser transgênica ou não transgênica. Um varietal ou semente híbrida ou um vegetal da invenção, portanto, pode ser derivado pelo cruzamento de um primeiro pai que não tem o DNA específico e exclusivo do evento MON87751 de soja com um segundo pai compreendendo o evento MON87751 de soja, resultando em um híbrido compreendendo o DNA específico e exclusivo do evento MON87751 de soja. Cada um dos pais pode ser um híbrido ou uma congênita/varietal, conquanto o cruzamento ou cruza resulte numa planta ou semente da invenção, ou seja,, uma semente tendo pelo menos um alelo contendo o DNA de evento MON87751 de soja e/ou uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26. Duas plantas transgênicas diferentes podem assim ser cruzadas para produzir descendentes híbridos que contêm dois genes segregantes de forma independente, acrescentados, exógenos. Por exemplo, o MON87751 contendo Cry2Ab e Cry1A.105 conferindo duplo modo de resistência à ação de insetos para a soja pode ser cruzado com outras plantas de soja transgênica para produzir uma planta com características de ambos os pais transgênicos. Um exemplo disso seria uma cruza de MON87751 contendo Cry2Ab e Cry1A.105 conferindo duplo modo de resistência à ação de insetos com uma planta de soja que tem uma ou mais características adicionais, tais como tolerância a herbicidas (por exemplo evento MON89788 de soja ou MON 87708 evento de soja) e/ou controle de insetos (por exemplo evento de soja MON 88701), resultando em progênie de uma planta ou semente que tem duplo modo de ação de resistência a pragas de insetos lepidópteros e tem pelo menos uma ou mais características adicionais. O retro-cruzamento em uma planta progenitora e cruzamento com uma planta não transgênica são contemplados também, posto que é propagação vegetativa. As descrições de outros métodos de reprodução que são comumente usadas para culturas e traços diferentes podem ser encontradas em uma das várias referências, por exemplo, Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
[0094] A invenção fornece uma parte da planta que é derivada de plantas de soja que compreendem evento MON87751. Tal como aqui usado, uma "parte de planta" refere-se a qualquer parte de uma planta que é composta de material derivado de uma planta de soja que compreende evento MON87751. As partes de planta incluem, mas não estão limitadas a pólen, óvulo, vagem, flor, tecido da raiz ou tronco, fibras e folha. As partes de planta podem ser viáveis, não viáveis, regeneráveis, ou não regeneráveis.
[0095] A invenção proporciona um produto de base que é derivado de plantas de soja que compreendem evento MON87751 e que contenha uma quantidade detectável de um ácido nucleico específico para o evento MON87751. Tal como aqui utilizado, um "produto de base" refere-se a qualquer composição ou produto que é composto de material derivado de uma planta de soja, semente de soja inteira ou processada, uma ou mais células de plantas e/ou partes da planta que contêm o DNA de evento de soja MON87751. Os produtos de base podem ser vendidos aos consumidores e podem ser viáveis ou não viáveis. Produtos de base não viáveis incluem, mas não estão limitados a sementes não viáveis; sementes inteiras ou processadas, partes de sementes, e partes de plantas; óleo de soja, proteína de soja, farelo de soja, farinha de soja, flocos de soja, farelo de soja, leite de soja, queijo de soja, vinho de soja, ração animal compreendendo soja, papel que compreende soja, creme compreendendo soja, biomassa de soja, e produtos de combustível fabricados com plantas de soja e partes de plantas de soja. Produtos de base viáveis incluem, mas não estão limitados a sementes, plantas e células vegetais. As plantas de soja que compreendem evento MON87751 podem assim ser utilizadas para fabricar qualquer produto de base tipicamente adquirido a partir de soja. Qualquer produto de base que é derivado de plantas de soja que compreende evento MON87751 pode conter pelo menos uma quantidade detectável de DNA específica e única correspondente a evento de soja MON87751, e, especificamente, pode conter uma quantidade detectável de um polinucleotídeo compreendendo uma molécula de DNA possuindo pelo menos um sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26. Qualquer método de detecção padrão para moléculas de nucleotídeo pode ser usado, incluindo métodos de detecção divulgados neste documento. Um produto de base está dentro do âmbito da invenção se não houver qualquer quantidade detectável de uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26 no produto de base.
[0096] As plantas, progênie, sementes, células de plantas, partes de plantas (tais como pólen, óvulos, vagem, flor, raiz ou tecido do caule e folhas), e produtos de base da invenção são, portanto, úteis para, entre outras coisas, cultivar plantas para a finalidade de produzir sementes e/ou partes de plantas compreendendo evento de soja MON87751 para fins agrícolas, produzindo progênie compreendendo evento MON87751 de soja para fins de investigação e melhoramento de plantas, uso com técnicas microbiológicas para aplicações industriais e de pesquisa e venda aos consumidores.
[0097] Os métodos para produzir uma planta de soja resistente a insetos, compreendendo as sequências de DNA específicas e evento único para MON87751 da invenção são fornecidos. Plantas transgênicas usadas em um desses métodos podem ser heterozigotos para o transgene. Plantas de progênie produzidas por estes métodos podem ser plantas híbridas ou varietais; podem ser cultivadas a partir de sementes produzidas por um evento MON87751 de soja contendo planta e/ou de sementes produzidas por uma planta fertilizada com o pólen de uma planta contendo evento MON87751 de soja; e podem ser homozigóticas ou heterozigóticas para o transgene. Plantas de progênie podem ser subsequentemente autopolinizadas para gerar uma linhagem verdadeira de plantas, ou seja, plantas homozigóticas para o transgene, ou, alternativamente, podem ser cruzadas, por exemplo, cultivadas com uma outra planta não relacionada, para produzir um varietal ou uma semente híbrida ou planta.
[0098] Os métodos de detecção da presença de DNA derivado de uma célula de soja, tecido de soja, semente de soja, ou da planta de soja que compreende evento MON87751 de soja numa amostra são fornecidos. Um método consiste em (i) a extração de uma amostra de DNA de pelo menos uma célula de soja, tecido de soja, semente de soja, ou planta de soja, (ii) colocar em contato a amostra de DNA com pelo menos um iniciador que é capaz de produzir sequência de DNA específica para DNA de evento MON87751 sob condições adequadas para a sequenciação de DNA, (iii) realizar uma reação de sequenciação de DNA, e, em seguida, (iv), confirmar que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos específica para evento MON87751, ou o construto ali como compreendido, tal como um selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26. Outro método consiste em (i) extração de uma amostra de DNA de pelo menos uma célula de soja, tecido de soja, semente de soja, ou planta de soja, (ii) colocar em contato a amostra de DNA com um par de iniciadores que é capaz de produzir um amplicon de DNA de evento MON87751 em condições adequadas para amplificação de DNA, (iii) realizar uma reação de amplificação de DNA, e em seguida (iv) detectar a molécula de amplicon e/ou confirmar que a sequência de nucleotídeos do produto de amplificação compreende uma sequência de nucleotídeos específica para o evento MON87751, tal como um selecionado a partir de o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 6. O amplicon deve ser aquele que é específico para o evento MON87751, tal como um amplicon que compreende a SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. A detecção de uma sequência de nucleotídeos específica para evento MON87751 no amplicon é determinante e/ou de diagnóstico para a presença do DNA específico do evento MON87751 de soja na amostra. Um exemplo de um par de iniciadores que é capaz de produzir um amplicon de DNA de evento MON87751 em condições adequadas para amplificação de DNA é apresentado como SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 12. Outros pares de iniciadores pode ser facilmente concebidos por aqueles versados na técnica e iriam produzir um amplicon que compreende a SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que um tal par de iniciadores compreende pelo menos um iniciador na região genômica flanqueando a inserção e um segundo iniciador no interior da inserção. Outro método de detecção da presença de DNA derivado de uma célula de soja, tecido de soja, semente de soja, ou das plantas de soja que compreendem evento de soja MON87751 numa amostra consiste em (i) extração de uma amostra de DNA de pelo menos uma célula de soja, tecido de soja, semente de soja, ou planta de soja, (ii) colocar em contato a amostra de DNA com uma sonda de DNA específica para o DNA de evento MON87751, (iii) permitir que a sonda e a amostra de DNA se hibridizem sob condições rigorosas de hibridação, e, em seguida, (iv) detectar a hibridação entre a sonda e a amostra de DNA alvo. Um exemplo da sequência de uma sonda de DNA que é específica para o evento DNA de MON87751 é apresentada como SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 16. Outras sondas podem ser prontamente concebidas por aqueles versados na técnica e que compreenderiam pelo menos um fragmento de DNA genômico que flanqueia a inserção e pelo menos um fragmento de DNA inserido, tais como sequências proporcionadas em, mas não limitadas à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, e SEQ ID NO:10. A detecção de hibridação da sonda com a amostra de DNA é diagnóstico para a presença do DNA específico do evento MON87751 de soja na amostra. Ausência de hibridação é alternativamente diagnóstico da ausência de DNA específico de evento MON87751 de soja na amostra.
[0099] Kits de detecção de DNA são fornecidos que são úteis para a identificação de DNA de evento MON87751 de soja em uma amostra e também podem ser aplicados a métodos para o cultivo de plantas de soja contendo o DNA de evento apropriado. Tais kits contêm iniciadores de DNA e/ou sondas que compreendem fragmentos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26. Um exemplo de um tal kit compreende pelo menos uma molécula de DNA de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 10 para funcionar como uma sonda de DNA útil para a detecção da presença e/ou ausência de DNA derivado de plantas de soja transgênicas compreendendo evento MON87751 em uma amostra. O DNA derivado de plantas de soja transgênicas compreendendo evento MON87751 iria compreender uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26. Uma molécula de DNA suficiente para ser utilizada como uma sonda de DNA é fornecida que é útil para determinar, detectar ou fazer o diagnóstico da presença e/ou ausência de DNA de evento MON87751 de soja em uma amostra é fornecida como SEQ ID NO: 13. Outras sondas podem ser prontamente concebidas por aqueles versados na técnica e devem compreender pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29, pelo menos 30, pelo menos 31, pelo menos 32, pelo menos 33, pelo menos 34, pelo menos 35, pelo menos 36, pelo menos 37, pelo menos 38, pelo menos 39, ou pelo menos 40 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 10 e ser suficientemente únicas para DNA de evento MON87751 de soja, a fim de identificar o DNA derivado do evento. Outro tipo de kit compreende um par de iniciadores úteis para a produção de um amplicon útil para a detecção da presença e/ou ausência de DNA derivado de evento de soja transgênica MON87751 numa amostra. Um kit deste tipo empregaria um método compreendendo o contato de uma amostra de DNA alvo com um par de iniciadores tal como descrito aqui, em seguida, realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico suficiente para produzir um amplicon que compreende uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26, e, em seguida, a detecção da presença e/ou ausência de amplicon. Tal método pode também incluir sequenciar o fragmento amplificado ou um fragmento do mesmo, o que seria determinante, ou seja, diagnóstico, para a presença do DNA específico do evento MON87751 de soja na amostra de DNA alvo. Outros pares de iniciadores podem ser prontamente concebidos por aqueles versados na técnica e deveriam compreender pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29, ou pelo menos 30 nucleotídeos contíguos de sequências proporcionadas em, mas não se limitando a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26 e ser suficientemente únicos para DNA de evento MON87751 de soja, a fim de identificar o DNA derivado do evento.
[00100] Os kits e métodos de detecção da invenção são úteis para, entre outras coisas, para identificar o evento de soja MON87751, selecionar variedades de plantas ou híbridos compreendendo evento de soja MON87751, na detecção da presença de DNA derivado de plantas transgênicas de soja em uma amostra, e monitorização de amostras para detectar a presença e/ou ausência de plantas de soja compreendendo evento MON87751 ou partes de plantas derivadas de plantas de soja que compreendem evento MON87751.
[00101] A sequência da inserção heteróloga de DNA, sequências de junção, ou sequências de flanqueamento de evento de soja MON87751 pode ser verificada (e corrigida, se necessário) através da amplificação de tais sequências a partir do evento utilizando iniciadores derivados das sequências aqui proporcionadas seguido por sequenciação de DNA convencional do amplicon ou do DNA clonado.
[00102] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar certos exemplos de modalidades preferenciais da invenção. Deve ser entendido por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam abordagens que os inventores encontraram função bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas para constituírem exemplos de modos preferenciais para a sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica de devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e o escopo da invenção.
[00103] Um depósito de uma amostra representativa de semente de Glycine max contendo DNA de evento MON87751 foi feito em 28 de fevereiro de 2013 de acordo com o Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC), que tem um endereço em 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia EUA, CEP 20110, e No. de Adesão atribuído ATCC PTA-120166. Os acessos aos depósitos estarão disponíveis durante a pendência do pedido ao Comissário de Patentes e Marcas e pessoas determinadas pelo Comissário tendo direito aos mesmos mediante pedido. Após a emissão da patente, todas as restrições à disponibilidade ao público serão irrevogavelmente removidas. O depósito será mantido no depósito por um período de 30 anos, ou 5 anos após a última requisição, ou para a vida efetiva da patente, consoante o que for maior e será substituído conforme o necessário durante esse período.
[00104] Este exemplo descreve a transformação e seleção de eventos de soja MON87751. A expressão de genes estrangeiros em plantas é conhecida por ser influenciada pela sua posição cromossómica, talvez devido à estrutura da cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou a proximidade de elementos de regulação transcricional (por exemplo, potenciadores) perto do local de integração (Weising, 1988). Por este motivo, muitas vezes é necessário triar um grande número de eventos, a fim de identificar um evento caracterizado pela expressão óptima de um gene introduzido de interesse. Por exemplo, foi observado em plantas e outros organismos em que pode haver uma grande variação nos níveis de expressão de um gene introduzido entre eventos. Também pode haver diferenças nos padrões espaciais e temporais da expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em diferentes tecidos de plantas, que podem não corresponder aos padrões esperados a partir de elementos reguladores da transcrição presentes no constructo do gene introduzido. Por estas razões, onze diferentes vectores de expressão foram gerados e testados em soja transformada durante a seleção de evento MON87751.
[00105] Onze diferentes construtos de expressão foram transformados e testados em plantas. Os construtos de expressão individual variaram na combinação da uso de elementos de expressão, ou seja, potenciador (E), promotor (P), líder (L), íntrons (I), peptídeo alvo de cloroplasto (CTP), e sinal 3 'de terminação e poliadenilação da transcrição (T). Além disso, os segmentos de T-DNA continham dois cassetes de expressão que codificam ambas as proteínas Cry (Cry2Ab e Cry1A.105), ou continham um cassete de expressão codificador de uma única proteína Cry, ou seja, Cry2Ab ou Cry1A.105. Uma outra variação nos construtos de expressão com os segmentos de T-DNA que contêm tanto cassetes de expressão de Cry2Ab e Cry1A.105 foi a orientação relativa dos dois cassetes que codificam as proteínas Cry.Especificamente, os dois cassetes de expressão da proteína Cry ou foram posicionados com uma orientação em tandem relativa de transcrição de modo que a expressão de cada promotor das respectivas proteínas Cry segue no mesmo sentido, mas cada um de seus respectivos promotores separados (ver Figura 2), ou os dois cassetes de expressão da proteína Cry estavam numa orientação inversa de modo que a expressão de cada promotor das duas proteínas Cry é afastado de um ponto centrado entre os dois promotores, ou seja,, a transcrição de cada cassete de expressão de proteína Cry segue em sentidos opostos e não converge (ver Figura 2). A sequência de DNA que codifica Cry1A.105 foi sequência- diversificada em construtos 4, 6, 7, 8 e 9, em comparação com construtos 1 e 3. Em uma outra variação, em dois dos construtos com dois cassetes de expressão Cry orientados na orientação inversa da transcrição, potenciadores da transcrição foram posicionados entre os promotores divergentes (ver Figura 2).
[00106] Os onze construtos de expressão foram transformados em três tempos separados, por transformação Agrobacterium-mediada de tecido de meristema de soja. O método foi descrito na Patente US No. 8.030.544, que permite a geração de plantas transformadas, sem uso de calo. Resumidamente, tecidos meristemáticos foram excisados dos embriões de sementes de soja A3555 germinadas (Asgrow, St Louis, MO). Construto 1, constituído por dois segmentos de T-DNA separados, cada um delimitado por sequências de fronteira de Agrobacterium (segmento de T-DNA). O primeiro segmento de T-DNA do construto de transformação continha dois cassetes de expressão com o primeiro cassete de expressão codificando uma região do gene de Tn7 adeniltransferase de Escherichia coli (que confere resistência a espectinomicina e estreptomicina; aadA-SPR) e é utilizado para seleção; e o segundo cassete de expressão que codifica uma região de gene de sacarose-fosforilase de Agrobacterium tumefaciens cepa C58 (que catalisa a conversão de sacarose em frutose e glucose-1- fosfato; STR OriRi) é usado como um marcador pontuável. O segundo segmento de T-DNA dos diferentes construtos de transformação continha qualquer cassete de expressão que codifica apenas Cry2Ab (construtos 2, 5, 10 ou 11) ou um cassete de expressão codificando apenas Cry1A.105 (construtos 3 ou 6); ou o segundo segmento de T- DNA dos diferentes construtos de transformação continha um cassete de expressão que codifica Cry2Ab e um cassete de expressão que codifica Cry1A.105 (construtos 1, 4, 7, 8, ou 9) (ilustrado na Figura 2). Uma vez que cada segmento de T-DNA dos construtos de transformação é delimitado por separado sequências de fronteira de Agrobacterium, o segmento de T-DNA que compreende a seleção e cassetes pontuáveis marcadores pode integrar-se no genoma da célula de soja num local que é diferente do local de integração do segmento de T-DNA que codifica cassetes de expressão de Cry2Ab e/ou Cry1A.105. Assim, os eventos podem ser triados para a segregação e a perda de seleção e sequências marcadoras pontuáveis. Todos os eventos foram selecionados relativamente à ausência de estrutura principal e ausência das sequências de cassete marcador de seleção/pontuável. Após a co-cultura com Agrobacterium transportar o construto de transformação, os meristemas foram colocados em meio de seleção contendo espectinomicina, sal dissódico de carbenicilina, sal de sódio de cefotaxima, e sal de ticarcilina dissódico/mistura de clavulanato de potássio para inibir o crescimento de células de plantas não transformadas e excesso de Agrobacterium. Os meristemas foram então colocados em meio propício para brotar e ter desenvolvimento radicular. Plantas enraizadas (R0) com características fenotípicas normais foram selecionadas e transferidas para o solo para o crescimento e uma avaliação mais aprofundada.
[00107] O construto de expressão 1, utilizado para gerar evento MON87751, continha um segmento de T-DNA de codificação de duas proteínas Cry diferentes, numa ordem 5' para 3' ordem relativa de elementos de expressão de planta (com ou sem sequências intervenientes): um promotor, líder e primeiro íntron derivado do Actina gene 2 de Arabidopsis thaliana (P-At.Act2), uma sequência de codificação quimérica composta pela sequência de codificação do peptídeo de trânsito do cloroplasto de N-terminal derivado da sintase de gene de Arabidopsis 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSPS) fundido em quadro com um gene que codifica Cry2Ab (que codifica uma proteína que confere resistência a insetos) de Bacillus thuringiensis (Bt) com nucleotídeos modificados para expressão de plantas (CTP2-Cry2Ab), um elemento iniciador de poliadenilação e terminação da transcrição 3' (UTR 3') a partir de um derivado de Oryza sativa de gene da proteína similar a metalotioneína (T.OsMth), uma sequência interveniente entre o primeiro cassete de expressão de proteína Cry e segundo cassete de expressão de proteína Cry; um promotor e líder derivado de subunidade 1A pequena do gene de Arabidopsis ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase (P-At.RbcS4), este promotor-líder está ligado a uma sequência de codificação quimérica composta de sequência de codificação do peptídeo de trânsito de cloroplasto derivada do gene da proteína da pequena subunidade 1A de 1,5-bisfosfato carboxilase de Arabidopsis ribulose (CTP1) que também continha a sequência de codificação que codifica uma repetição do local de clivagem do peptídeo de trânsito e 3 aminoácidos da proteína madura fundida em quadro com um gene que codifica Cry1A.105 (que codifica uma proteína que confere resistência a insetos), composto por segmentos de genes que codificam Cry1Ab1 (domínios I e II), Cry1Fa1 (domínio III), e Cry1Ac1 (domínio de protoxina) de Bacillus thuringiensis (Bt) com nucleotídeos modificados para expressão em plantas, uma UTR 3' (t-Mt.Pt1) derivada do gene 1 transportador de fosfato de Medicago truncatula. No cassete de expressão de construto 1, o cassete de T-DNA contendo os dois cassetes de expressão de Cry2Ab e Cry1A.105 separados tem uma fronteira direita de Agrobacterium arbitrariamente designada de extremidade 5’, que é a 5' do cassete de Cry2Ab; e uma fronteira esquerda de Agrobacterium arbitrariamente designada extremidade 3’, que é a 3' do cassete de Cry1A.105. O cassete de Cry2Ab (promotor até terminador) está em posições 123-3785 na SEQ ID NO: 9, e cassete Cry1A.105 (promotor através terminador) está nas posições 3831-9754 na SEQ ID NO: 9.
[00108] O cassete de DNA-T para o construto 2 (Cry2Ab) e para construto 3 (Cry1A.105) continha cassetes de codificação individuais de Cry-proteína com os mesmos elementos para os respectivos genes codificadores de proteína Cry usados no construto 1, ver Figura 2.
[00109] Construtos 4, 5, e 6 foram similares na orientação de elemento os construtos 1, 2, e 3, respectivamente, mas com diferentes promotor-íntron-líder e peptídeo de trânsito do cloroplasto para ambos os cassetes de Cry2Ab e Cry1A.105. Os terminadores para os cassetes de proteína Cry correspondentes (Cry2Ab com T-Os.Mth, ou Cry1A.105 com T-Mt.Pt1) eram idênticos em todos os construtos de expressão 1 a 11 (ver Figura 2).
[00110] O peptídeo de trânsito de cloroplasto e promotor-líder- íntron, sequência que codifica a Cry-proteína, e terminador utilizado tanto para cassetes de Cry2Ab e Cry1A.105 e em cada um dos construtos 7 - 11 foram idênticos aos utilizados em construtos 4, 5, e 6. No entanto, para construtos 7, 8 e 9, a orientação do cassete de Cry2Ab e cassete de Cry1A.105 foi invertida ou revertida uma em relação à outra e a orientação de transcrição foi em sentidos opostos,cada um dos respectivos promotores, ver Figura 2. Construtos 7, 8, e 9 diferem na ausência (construto 7) de um intensificador entre os dois cassetes, ou a presença de um intensificador; construto 8 com potenciador 1 (E1), ou construto 9 com potenciador 2 (E2), ver a Figura 2. Construto 10 e construto 11 eram cassetes de Cry2Ab solitários com qualquer E1 (construto 10) ou E2 (construto 11).
[00111] Após a transformação, e transferência de eventos (R0) a solo, análise molecular, agronômica, e fenotípica extensa foi feita para selecionar eventos para mais testes. Além disso, eventos eram auto- polinizados e a semente resultante dos eventos selecionados foi usada para testes de campo e molecular adicionais.
[00112] O teste molecular incluiu os seguintes: ensaios para determinar o número de cópia, ensaios para determinar a integridade de ambos os cassetes de expressão contendo Cry proteína (construtos 1, 4, 7, 8, e 9), a presença de cassete de T-DNA que codifica a proteína Cry (cassetes de expressão de proteína Cry únicos (construtos 2, 3, 6, 10, ou 11) ou dois cassetes de expressão de proteínas Cry (construtos 1, 4, 7, 8 ou 9)); os ensaios para determinar a expressão da proteína, conforme medido por ELISA, e ensaios para determinar a razão de segregação do cassete de expressão de T-DNA (1: 2: 1 ou 1: 3). Ensaios agronômicos incluíram (para eventos R0 gerados a partir de construtos 1, 2, e 3, eficácia de inseto por bioensaio de disco de folha de duas espécies de pragas (Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja, VBC) e Chrysodeixis includens (falsa medideira, SBL)). Plantas R0 foram cultivadas até à maturidade, os eventos foram auto-polinizados, e sementes configuradas para cada evento foram determinadas.
[00113] O número de eventos R0 gerados por transformação com os 11 construtos individuais e transferidos para o solo variou, e variavam de 420 eventos para mais que 5000 eventos (ver a Tabela 1). Para a transformação com o construto 1, a partir do qual foi gerado evento MON87751, houve um total de 1102 plantas R0 enraizadas no solo, das quais apenas 281 eventos passaram a análise molecular inicial. A análise molecular, agronómica e fenotípica adicional destes 281 eventos que foram gerados por transformação com construto 1 resultou em apenas 29 eventos R1 avaliados para análise adicional de estufa.Tabela 1. Eventos R0 produzidos a partir dos 11 construtos de transformação que mostram o número de eventos transferidos para o solo e o número de eventos que passam num ensaio de número de cópia.
[00114] Para os 29 eventos R1 gerados de transformação com construto 1 e avaliados para posterior análise, a semente foi plantada R1 em uma estufa para a análise dos eventos R1 com ensaios incluindo: (a) R1 germinação (100% de germinação); (b) a identificação das plantas homozigotas; (c) a confirmação de análise de PCR que as plantas homozigotas já não continham a sequência de seleção/pontuável marcadora (que tinha segregado de forma independente); (d) a eficácia de inseto, tal como determinado pelo bioensaio em disco de folha para C. includens (SBL); e (e), a eficácia de insetos, tal como determinada pelo bioensaio em disco de folha para Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho, FAW), (f) a expressão de proteína por análise de ELISA no tecido foliar fase V7, avançando eventos com níveis de proteína Cry2Ab e Cry1A.105 > 4 ppm. Além da análise molecular e insetos resultados de bioensaios de disco folha, observações de fenótipo agronômicas e conjuntos de sementes de quatro seleções/evento foram recolhidas. Com base no conjunto destes dados, semente R2 de 21 eventos R1 gerados por transformação com construto 1 foram avaliadas em ensaios de campo agronômico e ensaios de eficácia de telado.
[00115] Ensaios de campo agronômicos foram concebidos para avaliar as características fenotípicas e rendimento de eventos de soja expressando Cry2Ab e Cry1A.105 em relação ao controle, A3555 (fundo parental). Nestes ensaios de campo agronômicos, os controles e os eventos foram de variedade de soja A3555, com um grupo de maturidade relativa 3 (RM3). Os ensaios foram plantados sob um projeto em bloco completo randomizado (RCBD) ao longo de quatro estações e duas localizações geográficas. Em uma localização geográfica os ensaios de campo agronômicos foram realizados em 25 locais de campo em cada estação, e em uma segunda localização geográfica os ensaios de campo agronômicos foram realizados em 14 locais de campo em cada estação. Práticas agronômicas padrão foram seguidas na coleta e plantio de dados para todos os ensaios. Os dados coletados incluíram classificação de emergência, vigor de plântulas, data de floração, a observação da cor da flor, observação de fenótipo, cor de pubescência, maturidade, hospedagem, altura da planta, pontuação de quebra, data de colheita, peso/parcela de semente, umidade/parcela de semente, e rendimento em alqueires por acre (bu/ac).
[00116] Para análise dos dados, algumas localidades foram abandonadas devido a problemas de qualidade de pré-colheita (ou seja, água, umidade inadequada do solo, emergência pobre, quebra de casca de estação tardia devido a tempestade de granizo), ou alguns locais foram retirados devido a um coeficiente de variação (CV) superior a 15% e/ou um índice de qualidade elevada de localização (LQI).
[00117] Em todos os locais testados, as medidas tomadas de fenótipo indicaram que as avaliações agronômicas para os eventos estavam dentro da normalidade do controle, A3555. Nem todas as observações foram tomadas em todos os locais e alguns dados, por exemplo emergência, podem ter sido recolhidos, mas o rendimento não foi determinado porque o local foi abandonado por problemas ocorridos após a recolha dos dados de fenótipo iniciais.
[00118] Para os ensaios de campo agronômicos, o número de eventos gerados por construto 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 e testados em cada ensaio de campo em duas localizações geográficas, e a geração de eventos de soja testados (ou seja, R3, R4, R5, R6 ou R7) é mostrada na Tabela 2.Tabela 2. Número de eventos (e geração de evento de soja) testados por construto durante duas estações e duas localizações geográficas de ensaios de campo agronômicos (nt significa não testado).
[00119] Meta-análise de ensaios de campo agronômicos para eventos testados em cada estação, cada localização geográfica, e cada rendimento médio de teste de ensaio de campo (bu/acre) demonstrou que houve um aumento estatisticamente significativo no rendimento para o evento MON87751 em relação ao controle A3555 (Tabela 2). Os eventos que expressam apenas Cry2Ab não têm uma diferença estatisticamente significativa no rendimento em comparação com o controle A3555, consulte a Tabela 3. O evento expressando apenas Cry1A.105 teve uma diminuição estatisticamente significativa no rendimento em comparação com o controle A3555, consulte a Tabela 3. Tabela 3. Meta-análise de ensaios de campo agronômicos para eventos testados em cada estação, cada localização geográfica, e cada rendimento de campo de testes, quando comparados aos não transgênicos de soja linhagem A3555.
[00120] Os ensaios de eficácia de telado foram conduzidos para avaliar a eficácia de eventos experimentais de soja que expressam ambas as proteínas Cry de uma inserção de um segmento de T-DNA a partir de um único construto com dois cassetes de expressão (ou seja, Cry2Ab e Cry1A.105), ou proteínas Cry individuais (ou seja, Cry2Ab ou Cry1A.105 apenas) contra infestações artificiais de populações de pragas de lepidópteros contidas em caixas de telado. A comparação de eventos de gene duplo para único foi usada para determinar a contribuição relativa de cada uma única proteína Cry para a eficácia observada para eventos de construto de expressão de gene duplo. Os testes de telado foram realizados durante várias estações em duas localizações geográficas. Em uma localização geográfica, 5 espécies de pragas-alvo foram testadas: Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja, VBC), Includens Chrysodeixis (falsa medideira, SBL), Spodoptera eridania (lagarta do cartucho, SAW), Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho, FAW), e Helicoverpa zea (lagarta da espiga, SPW). Na segunda localização geográfica, 3 espécies de pragas-alvo foram testadas: Crocidosema aporema (lagarta do broto de feijão, BSM), Rachiplusia nu (lagarta falsa medideira, de SFL), e Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho, FAW).
[00121] Os eventos (ou seja, entradas) que foram testados nestes ensaios de telado foram gerados a partir de transformações com cada um dos construtos de transformação separados. Eventos de transformação gerados a partir de construto 1, 2, ou 3, foram avaliados na geração R2 em ensaios de telado e incluíram vinte eventos que expressam ambas as proteínas (eventos gerados a partir da transformação com o construto 1), seis eventos expressando apenas Cry2Ab (eventos gerados a partir da transformação com o construto 2), e seis eventos expressando apenas Cry1A.105 (eventos gerados a partir da transformação com o construto 3). Destes, 12 eventos com ambos Cry2Ab e Cry1A.105 (construto 1), dois eventos com Cry2Ab apenas (construto 2), e três eventos com Cry1A.105 somente (construto 3) foram avaliados na geração R3 em ensaios de telado. Onze dos eventos com tanto Cry2Ab e Cry1A.105 (construto 1) foram ainda avaliados nos ensaios de telado de geração R4. Três eventos com ambos Cry2Ab e Cry1A.105 (construto 1), um evento com Cry2Ab somente (construto 2), e um evento com Cry1A.105 somente (construto 3) foram avaliados nos ensaios de telado R5, R6 e R7. Dez eventos que expressam Cry2Ab e Cry1A.105 (eventos gerados a partir de transformação com o construto 4), três eventos somente de Cry2Ab (eventos gerados a partir da transformação com o construto 5), e três eventos Cry1A.105-somente (eventos gerados a partir da transformação com o construto 6) foram avaliados na produção de R3 a ensaios de telado. Dois eventos com tanto Cry2Ab e Cry1A.105, um evento com Cry2Ab apenas, e um evento com Cry1A.105 somente foram avaliados nos ensaios de telado R4, e um evento cada foi avaliado nos ensaios de telado R5. Três eventos que expressam tanto Cry2Ab e Cry1A.105 em orientação 5' a 3' oposta com um intensificador (eventos gerados a partir de transformação com o construto 8), 3 eventos empilhados que expressam tanto Cry2Ab e Cry1A.105 em orientação oposta 5 'para 3' sem um potenciador (eventos gerados a partir de transformação com construto 7), e 2 eventos de Cry2Ab somente (eventos gerados a partir de transformação com construto de 10) foram avaliados na geração R2 em testes de telado. Os controles positivos de soja transgênica incluíram MON87701 ou evento GM_A19478 (gerado ao mesmo tempo como MON87701), e ambos expressam Cry1Ac. Linhagens de soja não transgênica A3555 (fundo parental para eventos MON87751, maturidade relativa 3 (RM3)) e A5547 (fundo parental para MON87701 e GM_A19478, RM5) foram incluídos em todos os ensaios de telado e de campo como controles negativos. A linhagem de soja não transgênica AG3705 foi incluída como um controle de flor branca em alguns ensaios.
[00122] Práticas padrão foram seguidas no estabelecimento e realização dos ensaios de telado. As parcelas foram avaliadas uma vez após cada infestação no momento de máximo danos para os controles negativos (normalmente 3-4 semanas após pupas terem sido colocadas dentro do telado). Em cada avaliação, foram registradas as seguintes observações agronômicas: a data e o estágio de crescimento da planta. Além disso, para desfolhar insetos, uma porcentagem de desfolha estimada em cada parcela foi registrada.Para C. aporema, dez plantas foram selecionadas aleatoriamente em cada parcela e o número de plantas com danos foi registrado. Em alguns casos também foram registrados os números de larvas vivas.
[00123] Dados de desfolha foram submetidos a ANOVA para determinar uma fonte significativa de variabilidade entre linhagem e replicar para cada inseto em cada local no nível de 0,05 de probabilidade (P). As diferenças significativas entre as médias foram determinadas pelo teste de Tukey-Kramer (Kramer 1956) em P = 0,05.
[00124] Três ensaios de telado de parcela pequena foram realizados na segunda localização geográfica durante a primeira estação usando R. nu e C. aporema para infestação. O desenho do estudo incluiu blocos de teste Randomized Complete Block Design (RCBD) com três repetições por evento ou controle, com eventos testados apresentados na Tabela 4. Um teste foi infestado com C. aporema durante a fase meio-vegetativa de crescimento de soja e novamente na fase reprodutiva precoce de crescimento da soja. Dois ensaios foram infestados com R. nu durante a fase meio-vegetativa de crescimento da soja.
[00125] Para o teste de C. aporema, pressão muito pesada foi alcançada. Replicar não era uma fonte significativa de variabilidade em dano (F = 0,8794; df = 2, 69; P = 0,4196), mas evento foi altamente significativo (F = 11,9398; df = 23, 48; P <0,0001). A percentagem máxima de plantas danificadas (Tabela 4) atingiu em média 83-100% nos controles negativos, mas estava ausente no controle positivo Cry1Ac. Os eventos gerados a partir do construto de transformação e que expressam Cry2Ab e Cry1A.105 exibiram 0-13% de plantas danificadas, enquanto que aqueles que expressam Cry2Ab somente ou Cry1A.105 apenas exibiram 10-17% e 10-13%, respectivamente. O pequeno, embora significativo, número de plantas registrado como danificado neste teste pode ser devido aos critérios utilizados pelos indivíduos durante a gravação a classificação de danos.
[00126] Para os ensaios de R. nu a pressão pesada foi obtida em um estudo de telado. Replicar não era uma fonte significativa de variabilidade na desfoliação (F = 0,203; df = 2, 69; P = 0,8167), mas evento foi altamente significativo (F = 20,2461; df = 23, 48; P <0,0001). Desfoliação máxima (Tabela 4) atingiu em média 60-63% nos controles negativos, mas estava ausente no controle positivo Cry1Ac e eventos gerados do construto de transformação expressando Cry2Ab+Cry1A.105 ou eventos gerados a partir do construtor 2 de transformação expressando somente Cry2Ab. Os eventos gerados a partir do construto 3 de transformação expressando Cry1A.105 somente exibiram desfolha um pouco maior (4-10%). Moderadamente forte pressão foi alcançada no segundo ensaio clínico de telado avaliando R.nu. Replicar não era uma fonte significativa de variabilidade na desfoliação em qualquer ensaio (F = 0,2542; df = 2, 69; P = 0,7763), mas evento foi altamente significativo (F = 16,1793; df = 23, 48; P <0,0001). Desfoliação máxima (Tabela 4) foi em média 3840% nos controles negativos, mas era insignificante no controle positivo de Cry1Ac (4%) e ausente nos eventos gerados com um constructo 1 e expressando Cry2Ab+Cry1A.105 ou eventos gerados com o construto 2 e expressando somente Cry2Ab. Os eventos gerados com construto 3 e expressando-Cry1A.105 somente exibiram desfolhamento ligeiramente superior (2-7%).
[00127] Nestes ensaios de telado, evento de soja MON87751 não exibiu plantas danificadas devido à infestação das pragas de insetos, C. aporema ou R. nu, que foi significativo em comparação com o dano e/ou desfolha dos controles no mesmo ensaio (Tabela 4).Tabela 4. Danos por C. aporema e desfolhamento por larvas de R. nu a eventos gerados usando construtos 1, 2, ou 3 e avaliados em telados artificialmente infestadas.
[00128] Em uma estação subsequente de testes de telado de parcela pequena realizados na segunda localização geográfica, as populações locais de laboratório de R. nu, C. aporema e S. frugiperda foram usadas para infestação. Os protocolos para a realização dos ensaios foram essencialmente como acima descritos, e com eventos e controles testados mostrados na Tabela 5.
[00129] Para o ensaio infestado com C. aporema, uma forte pressão foi alcançada. Replicar não era uma fonte significativa de variabilidade em dano (F = 0,2742; df = 2, 33; P = 0,7619), mas evento foi altamente significativo (F = 8,2313; df = 11,24; P <0,0001). Dano máximo teve em média 4,2-5,5 pontos danificados por planta nos controles negativos, com 80-100% de plantas que apresentam danos, mas foi insignificante no controle positivo e todos os eventos-teste (Tabela 5).
[00130] Para a análise infestada com R. nu, pressão moderadamente pesada foi alcançada. Replicar não era uma fonte significativa de variabilidade em dano (F = 0,041; df = 2, 33; P = 0,9599), mas evento foi altamente significativo (F = 143,5526; df = 11, 24; P < 0,0001). Dano máximo teve em média 33,3-40,0% de desfolha nos controles negativos (bem acima do nível econômico), mas estava ausente ou insignificante no controle positivo e todos os eventos-teste, exceto os eventos gerados por transformação com construto 6 expressando apenas TIC105 (Tabela 5).
[00131] Para o ensaio infestado com S. frugiperda foi conseguida uma leve pressão. Replicar não era uma fonte significativa de variabilidade em dano (F = 0,1187; df = 2, 33; P = 0,8884), mas evento foi altamente significativo (F = 12,8602; df = 11, 24; P < 0,0001). Dano máximo em média teve 7,5-15,0% de desfolha nos controles negativos -- apenas atingindo o limiar econômico. Alguns danos também se observaram na expressão apenas de eventos Cry2Ab gerado por transformação com construto 2 ou construto 5, mas dano estava ausente ou insignificante no controle positivo e todos os outros eventos de teste (Tabela 5).
[00132] Nestes ensaios de telado, evento de soja MON87751 não apresentou plantas danificadas devido à infestação das pragas de insetos, C. aporema, R. nu, S. frugiperda, que foi significativo quando comparado com danos para os controles negativos no mesmo ensaio (Tabela 5). Evento de soja MON87751 tinha significativamente menos danos de R. nu quando em comparação com os eventos de soja transgênicas geradas por transformação com construto 6 expressando apenas Cry1A.105 (Tabela 5), no entanto, note-se que há expressão inferior da proteína Cry1A.105 nos eventos gerados por transformação com construto 6. Estes resultados também demonstram pela primeira vez o espectro expandido de controle de pragas de insetos de S. frugiperda.Tabela 5. Dano máximo por C. aporema e porcentagem média de desfolha por larvas de R. nu e S. frugiperda em telados artificialmente infestadas avaliando os eventos gerados com construtos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 e comparados com controles positivos e negativos.
[00133] Um Ensaio de telado de parcela pequena foi realizado na primeira localização geográfica utilizando infestação de uma população de laboratório de H. zea. O projeto do estudo incluiu blocos de teste Randomized Complete Block Design (RCBD) com três repetições por evento, com eventos testados apresentados na Tabela 6. Havia duas infestações de H. zea e desfolhação foi avaliada 19-27 dias pós-infestar (fase R2-R3 de crescimento de soja), para a primeira infestação, e 25-28 dias pós-infestar (fase de crescimento de soja R5) para a segunda infestação. Os resultados dos ensaios de telado testando a praga de inseto, H. zea, são como se segue: pressão moderadamente pesada foi alcançada. Replicar não era uma fonte significativa de variabilidade na desfoliação (F = 0,326; df = 2, 105; P = 0,7225), mas evento foi altamente significativo (F = 13,8864; df = 35, 72; P <0,0001). Desfoliação máxima (Tabela 6) teve em média 32-33% nos controles negativos, mas era insignificante no controle Cry1Ac positivo (1%) e eventos gerados com constructo 1 que expressa Cry2Ab e Cry1A.105 (2-4%). A desfolha um pouco mais elevada foi observada em eventos gerados com construto 4 expressando Cry2Ab+Cry1A.105 (5-12%), eventos gerados com construto 5 expressando apenas Cry2Ab (13-17%) ou eventos gerados com construto 6 expressando apenas Cry1A.105 (8-12%).
[00134] Evento de soja MON87751 exibiu significativamente menos danos por H. zea neste ensaio de telado, quando comparado aos danos aos controles negativos no mesmo ensaio. Este nível de controle por. zea está dentro do nível aceitável de controle comercial para a espécie de pragas da soja. Além disso, neste ensaio de telado, evento de soja MON87751 tinha significativamente menos danos quando em comparação com os eventos de soja transgênica gerados com o construto 5 expressando apenas Cry2Ab (Tabela 6), demonstrando expansão do nível de controle. No entanto, a expressão de Cry2Ab é inferior em eventos gerados com construto 5 que em eventos gerados com construto 2, e o desfolhamento significativo de eventos gerados com construto 5 expressando apenas Cry2Ab pode indicar que pode haver reduzida eficácia contra H. zea por Cry2Ab gerada com construto 5.Tabela 6. Desfolha máxima sazonal para eventos gerados com construtos 1, 4, 5 ou 6 por larvas de. zea no ensaio de telado artificialmente infestada quando comparado aos controles positivos e negativos.
[00135] Em mais uma estação de ensaios de telado de parcela pequena realizados na primeira localização geográfica, resistência à infestação de populações de laboratório dos insetos-pragas S. eridania (1o-instar ou 3o-instar), A. gemmatalis (1o-instar), e C. includens (1o- instar) foi testada. Os resultados destes ensaios são os seguintes: pressão extrema foi conseguida com 1o-instar S. eridaniae pressão moderada foi conseguida com A. gemmatalis. A porcentagem de desfolha máxima (média ± SE) por larvas de A. gemmatalis (1o-instar) e S. eridania (1o-instar) é apresentada na Tabela 7. Tabela 7. A porcentagem de desfolhamento máximo por larvas A. gemmatalis (1°-ínstar) e S. eridania (1°-ínstar) em telados artificialmente infestados avaliando os eventos gerados com construtos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 10 e comparados com controles positivos e negativos.
[00136] Para o teste de ensaios de C. includens (1o-instar) e S. eridania (3o-instar), extrema pressão foi alcançada para ambas as pragas de insetos. A porcentagem de desfolha máxima (média ± SE) por larvas de C. includens (1o-instar) larvas e S. eridania (3o-instar) nesses telados artificialmente infestadas é relatado na Tabela 8.Tabela 8. A porcentagem de desfolhamento máximo por larvas C. includens (1°-ínstar) e S. eridania (3°-ínstar) em telados artificialmente infestados avaliando os eventos gerados com construtos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 10 e comparados com controles positivos e negativos.
[00137] Os resultados para estes ensaios de telado mostram que evento de soja MON87751 exibiu significativamente menos danos por S. eridania (1°-ínstar ou 3°-ínstar), A. gemmatalis (1°-ínstar), ou C. includens (1°-ínstar), quando em comparação com os danos aos controles negativos no mesmo ensaio (Tabela 7 e Tabela 8). Além disso, nestes ensaios de telado, evento de soja MON87751 tinha significativamente menos danos por larvas S. eridania (1°-ínstar e 3°- ínstar), quando comparados a eventos de soja transgênicos expressando Cry1Ac (Tabela 7 e Tabela 8), demonstrando o desempenho expandido de evento MON87751 ao evento de soja transgênico atualmente disponível para o controle de pragas de lepidópteros. Além disso, nestes ensaios de telado, evento de soja MON87751 tinha significativamente menos danos por larvasS. eridania quando em comparação com [1] qualquer um dos eventos gerados com construtos 4, 5 ou 6 (lavras do 3°-ínstar), ou eventos gerados com construto 6 expressando apeans evento Cry1A.105 (larvas do 1°ínstar), ou eventos gerados com construto 3 expressando apenas evento Cry1A.105 (larvas do 1° ínstar e 3°-ínstar) e [2] quando em comparação com os eventos gerados com construto 7 expressando Cry2Ab e Cry1A.105 sem um potenciador (larvas do 1° ínstar e 3 °- ínstar), demonstrando o desempenho superior do evento MON87751 para os eventos gerados com construtos 4, 5, 6 ou 7 (Tabela 7 e Tabela 8).
[00138] Ensaios de eficácia de campo aberto foram conduzidos para avaliar a eficácia do evento de soja experimental MON87751 e eventos criados usando construtos de transformação diferente 1, 2, 3, 4, 5 e 6, contra infestações naturais de campo de populações de pragas de lepidópteros. A comparação dos eventos gerados com o construto 2 ou 5 (expressão de apenas Cry2Ab), e os eventos gerados com o construto 3 ou 6 (expressão de apenas Cry1A.105), para os eventos gerados com o construto 1 ou 4 (expressão de ambos Cry1Ab e Cry1A.105) foi utilizada para determinar a contribuição relativa de cada única proteína Cry (ou seja, apenas Cry2Ab, ou apenas Cry1A.105) para a eficácia observada em eventos expressando as duas proteínas Cry (ou seja,, Cry2Ab e Cry1A.105) a partir de um único construto. Os ensaios de campo de eficácia das populações nativas de pragas de soja endêmicas foram conduzidos ao longo de várias temporadas, em vários locais de ensaios de campo, e em três localizações geográficas.
[00139] Nos ensaios de campo de eficácia iniciais conduzidos em uma localização geográfica, os eventos (ou seja, entradas) avaliados incluíram doze eventos gerados por um construto e expressando ambas as proteínas Cry, Cry2Ab e Cry1A.105 (e incluindo evento MON87751), dois eventos gerados pelo construto 2 e expressando apenas Cry2Ab, e três eventos gerados pelo construto 3 expressando apenas Cry1A.105. Nos ensaios de campo de eficácia iniciais conduzidos em uma segunda localização geográfica, os eventos gerados por construtos 1, 2 e 3 foram avaliados e incluíram 11 eventos que expressam ambas as proteínas Cry, Cry2Ab e Cry1A.105 (geradas a partir da transformação com o construto 1 e incluindo evento MON87751 ), dois eventos expressando apenas Cry2Ab(eventos gerados a partir da transformação com o construto 2), e três eventos que expressam apenas Cry1A.105 (eventos gerados a partir da transformação com o construto 3). Em uma segunda temporada de ensaios de campo de eficácia realizados em 3 localizações geográficas, os eventos (ou seja,, entradas) avaliados incluíram três eventos que expressam ambas as proteínas Cry, Cry2Ab e Cry1A.105 (eventos gerados a partir da transformação com o construto 1 e incluindo evento MON87751), um evento expressando apenas Cry2Ab (eventos gerados a partir da transformação com o construto 2), e um evento expressando apenas Cry1A.105 (eventos gerados a partir da transformação com o construto 3). Os eventos avaliados nos ensaios de eficácia de campo aberto incluíram as gerações R3 a R7.
[00140] Para cada local de ensaio de campo de eficácia, blocos de teste foram plantados e a infestação natural por populações de pragas nativas de insetos lepidópteros alvo foi permitido para ocorrer. O bloco de teste permaneceu sem tratamento com inseticidas para as pragas alvo (Lepidoptera). No entanto, os blocos de teste podem ter sido pulverizados para impedir danos significativos por pragas de insetos não alvo. Todos os eventos experimentais estavam no segundo plano do germoplasma de soja A3555, do grupo de maturidade relativa 3 (RM3). As outras entradas nos ensaios incluíram o controle positivo MON87701 (que expressa Cry1Ac) ou GM_A19459 (RM5); a verificação parental negativa A3555 (flor roxa, RM3); e a verificação comercial negativa A5547 (flor branca, MG5) ou CMA5805 (flor branca, RM5).
[00141] Práticas padrão foram seguidas no estabelecimento e na realização dos ensaios de eficácia de campo aberto. Incidência de larvas de pragas de lepidópteros, desfolhamento, e fase de crescimento da planta foram registrados periodicamente (ou seja, a cada 5-14 dias), com início com a aparição da atividade de lepidópteros alvo e término com a atividade de lepidópteros alvo cessada ou plantas na fase R7 de crescimento. Dados sobre a incidência de pragas foram coletados apenas das linhas 1 e 4 para evitar danos às plantas nas linhas 2 e 3, que foram colhidas para dados de produtividade. Monitoramento e registro de dados de incidência de pragas ocorreu da seguinte forma: lepidópteros desfolhadores (ou seja, A. gemmatalis, C. includens, R. nu, Spodoptera spp.) foram monitorados usando um pano de queda ou rede de batedura vertical, com pelo menos dois panos de queda ou quatro amostras de redes de batedura verticais por representação gráfica. O número total de larvas para cada espécie alvo encontrada e o número de amostragens dentro de cada lote foram registrados como o número médio de larvas por m linha (número total de larvas + número de amostragens + comprimento de pano/lençol em metros) para cada espécie alvo encontrada. Amostragens subsequentes foram feitas de uma forma que evitou amostragem repetida na mesma área de cada lote. Nos ensaios de campo de eficácia realizados em uma localização geográfica, os dados também foram registrados em dois locais de ensaios para de forma oportunista para danos por H. zea por seleção aleatória de 20 ou 33 plantas/localizações, e o registro do número com danos de alimentação larval. Em uma segunda localização geográfica, um ensaio foi avaliado de forma oportunista para H. zea por meio de seleção aleatória de 10 plantas por lote e registro do número total de vagens e número de vagens danificadas por planta.
[00142] Dados para a infestação por Elasmopalpus lignosellus foram registrados pela contagem do número total de plantas em cada lote com danos (murchas, morrendo ou morta) devido à alimentação larvar. Dados do dano para este inseto foram realizados em um único ponto do tempo quando o dano máximo foi observado.
[00143] Além de direcionar pragas, pragas não alvos, principalmente aqueles com potencial para superar limites econômicos (por exemplo, percevejos), foram monitorados periodicamente pela rede de varredura, rede de varredura modificada, ou pano de chão em locais selecionados aleatoriamente dentro do bloco de teste, e analisadas para determinar se eles chegaram ou foram aproximando aos níveis de dano econômico
[00144] Na maturidade de ensaio, toda a extensão de linhas 2 e 3 de cada lote foram colhidas, e tanto o peso quanto percentual de umidade total de cada lote foi registrado. Durante a colheita, lacunas significativas (plantas que não se tocam) em fileiras colhidas foram anotadas e o comprimento total destas lacunas foi registrado. Os rendimentos foram calculados após a correção do peso das sementes para 13% de umidade. Incidência larval, desfolhamento, e dados de rendimento foram submetidos à Análise de Variância para determinar fontes significativas de variabilidade entre linha e replicar para cada local ao nível 0,05 de probabilidade (P). As diferenças significativas entre as médias foram determinadas pelo teste de Tukey-Kramer (Kramer 1956) em P = 0,05.
[00145] Nos ensaios realizados em campo aberto local de ensaio de campo 1, lagartas desfolhadoras foram encontradas pela primeira vez na fase R3 de crescimento, tendo aumentado para níveis moderadamente prejudiciais pela fase R6 de crescimento. Espécies encontradas incluíram A. gemmatalis (98%), R. nu (2%) e Spodoptera spp. (1%). Réplica não era uma fonte significativa de variabilidade na incidência larval (F = 0,0435; df = 2, 57; P = 0,9575), desfolhamento (F = 0,0807; df = 2, 57; P = 0,9226) ou rendimento (F = 0,0213; df = 2, 57; P = 0,979), mas o evento foi altamente significativo para todos os três (incidência larval: F = 69,6956; df = 19, 38; P <0,0001; desfolhamento: F = 25,9918; df = 19, 40; P <0,0001; rendimento: F = 3,357; df = 19, 38; P = 0,0007). Incidência cumulativa de larvas (Tabela 9) atingiu 139-189 larvas por m linha nas verificações negativas, não havendo praticamente nenhuma larva encontrada em qualquer uma das entradas transgênicas. Desfolhamento máximo (Tabela 9) em média 21-27% nos controles negativos e estava ausente em todas as entradas transgênicas. Os rendimentos (Tabela 9) foram reduzidos em ambas as verificações negativas em relação a todas as entradas transgênicas, embora a variabilidade no rendimento tenha reduzido a importância destas reduções.
[00146] Evento MON87751 teve uma incidência significativamente menor de larvas de lepidópteros desfolhadoras (estação cumulativa) e significativamente menor porcentagem de desfolhamento (estação máxima) quando comparados aos controles não transgênicos.Tabela 9. Incidência de larvas de lepidópteros desfolhadoras (estação cumulativa) e desfolhamento (estação máxima) de eventos gerados com construto 1, 2 ou 3 em ensaio de eficácia de campo aberto naturalmente infestado realizado no local de ensaio de campo 1.
[00147] Em outro ensaio de campo aberto, realizado no local de ensaio de campo 2, lagartas desfolhadoras foram encontradas pela primeira vez na fase final do crescimento vegetativo, e aumentou para níveis altamente prejudiciais pela fase R3 de crescimento. Espécies encontradas incluíram A. gemmatalis (53%), "loopers" (provavelmente C. includens, mas R. nu possível) (44%) e Spodoptera spp. (3%). Réplica não era uma fonte significativa de variabilidade na incidência de larvas (F = 0,0085; df = 2, 57; P = 0,9915) ou desfolhamento (F = 0,0027; df = 2, 57; P = 0,9973), enquanto o evento foi altamente significativo para ambos (incidência larval: F = 19,644; df = 19, 40; P <0,0001; desfolhamento: F = 671,3147; df = 19, 40; P <0,0001). Incidência larval cumulativa (Tabela 10) chegou a 43-50 larvas por m linha nas verificações negativas, enquanto que números insignificantes foram encontrados nas entradas transgênicas. Desfolhamento máximo (Tabela 10) em média de 87-90% nas verificações negativas, enquanto nada mais do que quantidades vestigiais foram observadas em todas as entradas transgênicas.
[00148] Evento MON87751 teve uma incidência significativamente menor de incidência de larvas de lepidópteros desfolhadoras (estação cumulativa) e uma significativamente menor porcentagem de desfolhamento (estação máxima) quando comparados aos controles não transgênicos.Tabela 10. Incidência de larvas de lepidópteros desfolhadoras (estação cumulativa) e desfolhamento (estação máxima) de eventos gerados com construto 1, 2 ou 3 em um ensaio de eficácia de campo aberto naturalmente infestadorealizado no local de ensaio de campo 2.
[00149] Em outro ensaio de campo aberto, realizado no local de ensaio de campo 3, a réplica não era uma fonte significativa de variabilidade no total (F = 0,312; df = 2, 24; P = 0,7349) ou danificado (F = 0,0438; df = 2, 24 ; P = 0,9572) vagens por planta ou o rendimento (F = 0,2221; df = 2, 24; P = 0,8025). Evento, no entanto, foi uma importante fonte de variabilidade no total (F = 4,3643; df = 8,18; P = 0,0045) e danificado (F = 34,5288; df = 8, 18; P <0,0001) vagens por planta, embora não rendimento (F = 0,6237, df = 8, 18, P = 0,7475). Controles negativos deram a média de 25,0-26,0 vagens por planta com 30,8-31,0% de vagens danificadas, enquanto os eventos de ensaio, incluindo evento MON87751, foram em média de 28,9-38,9 vagens por planta com <2% de vagens danificadas (Tabela 11). O número reduzido de vagens por planta nas verificações negativas é provavelmente um resultado de abscisão de vagens prematuras causada por danos de lagarta da espiga, como numerosas vagens danificadas foram observadas deitadas no chão debaixo das plantas nas verificações negativas (mas não os eventos de ensaio) (Tabela 11). Tabela 11. Total e vagens danificadas por planta no ensaio de eficácia de campo aberto infestado de lagarta da espiga, realizado no local de ensaio de campo 3, avaliando os eventos gerados com construto 1, 2 ou 3.
[00150] Nos ensaios em campo aberto realizados no local de ensaio de campo 4, lagartas desfolhadoras foram encontradas na fase R3 de crescimento, tendo aumentado para níveis altamente prejudiciais pela fase R6-R7 de crescimento. Espécies encontradas incluíram A. gemmatalis (77%), Plathypena scabra (Asopia costalis verde) (17%), e C. includens (6%). A réplica não era uma fonte significativa de variabilidade na incidência larval (F = 0,0219; df = 2, 69; P = 0,9783), desfolhamento (F = 0,0007; df = 2, 69; P = 0,9993), ou rendimento (F = 1,1477; df = 2, 69; P = 0,3233). Evento foi significativo, para altamente significativo, para todos os três (incidência larval: F = 96,9673; df = 23, 48; P <0,0001; desfolhamento: F = 363,8854; df = 23, 48; P <0,0001; rendimento: F = 1,7814; df = 23, 48; P = 0,046). Incidência larval cumulativa (Tabela 12) atingiu 117-123 larvas por m linha nas verificações negativas, não havendo praticamente nenhuma larva encontrada em qualquer uma das entradas transgênicas. Desfolhamento máximo (Tabela 12) em média 68-83% nos controles negativos e estava ausente em todas as entradas transgênicas, incluindo evento MON87751.Tabela 12. Incidência de larvas de lepidópteros desfolhadoras (estação cumulativa) e % de desfolhamento (estação máxima) dos eventos gerados com construto 1, 2 ou 3 em um ensaio de campo aberto naturalmente infestado realizado no local de ensaio de campo 4.
[00151] Em outro ensaio de campo aberto, realizado no local de ensaio de campo 5, lagartas desfolhadoras foram encontradas pela primeira vez na fase R2 de crescimento, e aumentou para níveis altamente prejudiciais durante a fase R5-R6 de crescimento. Espécies encontradas incluíram A. gemmatalis (93%), C. includens (5%), e Spodoptera ornithogalli (2%). A réplica não era uma fonte significativa de variabilidade na incidência larval (F = 0,0206; df = 2, 69; P = 0,9796), desfolhamento (F = 0,0054; df = 2, 69; P = 0,9946), ou rendimento (F = 0,2379; df = 2, 69; P = 0,7889). Evento foi altamente significativo para todos os três (incidência larval: F = 122,46; df = 23, 48; P <0,0001; desfolhamento: F = 623,0217; df = 23, 48; P <0,0001; rendimento: F = 2,9366; df = 23, 48; P = 0,0008). Incidência larval cumulativa (Tabela 13) atingiu 76-137 larvas por m linha nas verificações negativas, não havendo praticamente nenhuma larva encontrada em qualquer uma das entradas transgênicas. Desfolhamento máximo (Tabela 13) em média 82-88% nos controles negativos e estava ausente em todas as entradas transgênicas, incluindo evento MON87751.Tabela 13. Incidência de larvas de lepidópteros desfolhadoras (estação cumulativa) e desfolhamento (estação máxima), dos eventos gerados com construto 1, 2 ou 3 em um ensaio de campo aberto naturalmente infestado realizado no local de ensaio de campo 5.
[00152] Em outro ensaio de campo aberto, realizado no local de ensaio de campo 6, lagartas desfolhadoras (principalmente H. zea e C. includens) foram encontradas durante as fases de crescimento R6, mas nunca chegou a números altamente significativos. No entanto, danos substanciais às plantas por E. lignosellus em fronteiras, tampões, e verificações negativas ocorreram no início da estação, resultando em plantas murchas, morrendo, e mortas pela fase R5-R6 de crescimento, momento em que foram registrados dados de danos. A réplica não era uma fonte significativa de plantas danificadas por E. lignosellus (F = 0,3431; df = 2, 69; P = 0,71). Evento foi altamente significativo para as plantas danificadas por E. lignosellus: F = 16,7555; df = 23, 48; P <0,0001). A percentagem de plantasdanificadas por E. lignosellus (Tabela 14) deu uma média de 10-28% nas verificações negativas, enquanto nenhuma planta em qualquer uma das entradas transgênicas exibiu danos, incluindo evento MON87751.Tabela 14. A incidência de danos por desfolhamento por E. lignosellus (LCSB-ensaio de eficácia de campo aberto naturalmente infestado, realizado no local de ensaio de campo 6, avaliando os eventos gerados com construto 1, 2 ou 3.
[00153] Em outro ensaio de campo aberto, realizado no local de ensaio de campo 7, lagartas desfolhadoras foram encontradas pela primeira vez na fase R1-R2 de crescimento, e aumentou para níveis altamente prejudiciais pela fase R4-R6 de crescimento. Espécies encontradas incluíram C. includens (54%), Spodoptera exigua (43%), e Estigmene acrea (2%). A réplica não era uma fonte significativa de variabilidade na incidência larval (F = 0,0866; df = 2, 69; P = 0,9172), ou desfolhamento (F = 0,1129; df = 2, 69; P = 0,8934). Evento foi altamente significativo para os dois (incidência larval: F = 69,918; df = 23, 48; P <0,0001; desfolhamento: F = 21,6603; df = 23, 48; P <0,0001). Incidência larval cumulativa (Tabela 15) atingiu 152-166 larvas por m linha nas verificações negativas, não havendo praticamente nenhuma larva encontrada no controle positivo Cry1Ac, ou eventos gerados com construtos 1, 2 ou 3 que expressam Cry2Ab e/ou Cry1A.105. Desfolhamento máximo (Tabela 15) em média de 24% nas verificações negativas, mas não ultrapassou quantidades vestigiais em eventos gerados com construtos 1, 2 ou 3 que expressam Cry2Ab e/ou Cry1A.105, incluindo evento MON87751 ou o controle positivo Cry1Ac.Tabela 15. Incidência de larvas de lepidópteros desfolhadoras (estação cumulativa) desfolhamento (estação máxima), e rendimento dos eventos gerados com construto 1, 2 ou 3 em um ensaio de campo aberto naturalmente infestado realizado no local de ensaio de campo 7.
[00154] Em outro ensaio de campo aberto, realizado no local de ensaio de campo 8, pressão moderada pelas lagartas desfolhadoras C. includens (41%), A. gemmatalis (38%), S. frugiperda (13%) e S. ornithogalli (8%) ocorreu durante as fasees R4-R6 de crescimento. A réplica não era uma fonte significativa de variabilidade na incidência larval (F = 0,0924; df = 3, 52; P = 0,9639), ou desfolhamento (F = 0,372; df = 3, 52; P = 0,7735). Evento era uma fonte significativa de variabilidade na incidência larval (F = 40,008, df = 13, 42, P <0,0001) e desfolhamento (F = 11,9356, df = 13, 42, P <0,0001). Incidência cumulativa larval e desfolhamento máximo deu uma média de 9,1-13,9 larvas por m linhas e 31-35% (o último moderadamente acima do limite econômico), respectivamente, nas verificações negativas, mas não ultrapassou o traço no controle positivo e todos os eventos de ensaio, incluindo evento MON87751 (Tabela 16). Nenhuma ocorrência significativa de pragas não alvo no ensaio foi anotada.Tabela 16. A incidência cumulativa de larvas de lepidópteros desfolhadoras, a porcentagem de desfolhamento máximo e rendimento em ensaio de eficácia de campo aberto naturalmente infestado realizado no local de ensaio de campo 8.
[00155] Durante a segunda estação de ensaio em campo aberto realizados no local de ensaio de campo 6, pressão muito pesada por H. zea ocorreu durante as fases R3-R5 de crescimento. A réplica não era uma fonte significativa de variabilidade nas vagens danificadas (F = 0,0280; df = 3,52; P = 0,9936). Evento era uma fonte importante de variabilidade nas vagens danificadas (F = 15,4758, df = 13, 42, P <0,0001). Verificações negativas em média de 64-78% de vagens danificadas, enquanto praticamente nenhum dano ocorreu em qualquer um dos eventos de ensaio, incluindo evento MON87751 (Tabela 17). Tabela 17. A incidência cumulativa de larvas de lepidópteros desfolhadoras, a porcentagem máxima de desfolhamento, a produção de vagem, porcentagem de vagens danificadas por larvas heliotina e rendimento no ensaio de eficácia de campo aberto naturalmente infestado realizado durante uma segunda estação no local de ensaio de campo 6.
[00156] Os resultados dos vários ensaios em campo aberto descritos neste exemplo, combinadas com os resultados dos ensaios de telado múltiplos (descritos no Exemplo 3) confirmam ainda mais a supressão efetiva, de longa estação de populações de larvas de todas as pragas de soja de lepidópteros encontradas pelos eventos de soja transgênicos gerados por construtos 1, 2 ou 3 em cinco gerações de plantas (R2 a R7), sugerindo a expressão do transgene estável dentro e entre as gerações.
[00157] Os resultados combinados demonstram que, sob condições de pressão acima do limiar por todas as quatro pragas alvo primárias (Anticarsia gemmatalis e Chrysodeixis includens em uma localização geográfica, e as mesmas pragas alvo mais Rachiplusia nu e Crocidosema aporema em uma segunda localização geográfica), a eficácia por eventos transgênicos gerados com construtos 1, 2 ou 3, incluindo evento MON87751, era equivalente a um evento transgênico expressando Cry1Ac e previamente demonstrado para controlar pragas de insetos de lepidópteros de soja. Os eventos gerados com construtos 2 e 3 e expressando apenas a proteína Cry2Ab ou apenas a proteína Cry1A.105, respectivamente, também demonstrou uma eficácia equivalente ao evento transgênico expressando a proteína Cry1Ac, sugerindo que a expressão de ambas as proteínas Cry2Ab e Cry1A.105 em evento MON87751 terão durabilidade melhorada ao longo do evento transgênico Cry1Ac através de uma melhor gestão de resistência a insetos.
[00158] Eficácia equivalente entre os eventos gerados com o construto 1, incluindo evento MON87751, foi também demonstrada contra várias pragas alvo secundárias, incluindo três espécies de lagarta dos cereais (Spodoptera exigua, S. frugiperda e S. eridania), duas lagartas da espiga heliotina (Helicoverpa zea e H. gelotopeon), um inseto que perfura haste (Elasmopalpus lignosellus) e um desfolhador (Plathypena scabra).
[00159] Este exemplo descreve a caracterização molecular do evento MON87751, que inclui a expressão da proteína e caracterização extensa molecular. Esta caracterização molecular foi concluída simultaneamente em eventos que estavam sendo testados em ensaios de campo, ensaios agronômicos de telado de eficácia, e ensaios de campo de eficácia.
[00160] Para a caracterização molecular do evento MON87751, número de cópias da sequência de inserção do transgene (compreendendo cassetes Cry2Ab e Cry1A.105, SEQ ID NO: 9) foi determinada usando uma combinação da análise Southern e ensaio de ponto final TAQMAN®. A análise molecular confirmou que havia apenas uma única inserção (cassete de expressão T-DNA contendo os cassetes de expressão para as duas proteínas Cry1A.105 e Cry2Ab, e representada por SEQ ID NO: 9) sem detecção do esqueleto do vetor, e sem detecção do cassete de T-DNA contendo as sequências marcadoras contáveis/de seleção. A sequência completa da única inserção (SEQ ID NO: 9) em evento MON87751 DNA genômico confirmou que a sequência era idêntica à sequência do construto de transformação.
[00161] Para a expressão da proteína, as amostras de folha foram recolhidas a partir de plantas homozigóticas para o alelo do evento MON87751 e extratos preparados a partir de amostras liofilizadas, os testes ELISA foram realizados por protocolos convencionais medindo o nível de proteína de Cry2Ab ou Cry1A.105 com anticorpos específicos para Cry2Ab ou Cry1A.105, respectivamente, e os resultados foram expressos como partes por milhão (ppm) de peso seco. Amostras foliares foram coletadas na fase R1 e R3 do crescimento das plantas para eventos gerados por transformação com construtos 1, 2 ou 3 e o controle não transgênico A3555. Os resultados de ELISA indicaram que os níveis de Cry2Ab para eventos gerados de construto 1 e construto 2 variaram entre cerca de 20 ppm a cerca de 50 ppm de peso seco, com a excepção do evento 8 (que foi determinado para ter um promotor viral ligado, mas nenhuma outra sequência, a partir do T-DNA marcador contável/selecionável, e evento 8 não foi ainda avaliado), e nenhuma expressão de Cry2Ab dos eventos gerados com construto 3 (expressando apenas Cry1A.105) ou o controle não transgênico (Figura 3A). Além disso, os níveis de expressão de proteína Cry2Ab foram aproximadamente iguais para ambas as fases de crescimento, R1 e R3. Os resultados de ELISA indicaram que os níveis de Cry1A.105 para eventos gerados a partir de construto 1 e construto 3 variaram de cerca de 150 ppm a cerca de 800 ppm em peso seco, e nenhuma expressão de Cry1A.105 a partir de qualquer um dos eventos gerados com construto 2 (expressando apenas Cry2Ab) ou o controle não transgênico (Figura 3B). Além disso, os níveis de expressão de proteína Cry1A.105 variaram mais elevados para as amostras da folha na fase de crescimento R3 em comparação com a fase de crescimento R1.
[00162] Resultados adicionais de ELISA mostram que os níveis de proteína Cry2Ab a partir de eventos gerados com construto 1 foram mais elevados em relação a eventos gerados ou com construto 5 ou construto 4, e como esperado, não houve Cry2Ab detectado, quer para o controle não transgênico ou os eventos gerados com o construto 6 (que expressam Cry1A.105 apenas) (Figura 4A). No mesmo conjunto de amostras de folhas, os resultados de ELISA mostram que existe um nível de duas vezes ou mais elevado da expressão de Cry1A.105, para os eventos gerados com construto 1, com uma expressão de quatro vezes maior aproximado para MON87751, quando em comparação com os eventos gerados com qualquer construto 6 ou construto 4, e como esperado, não houve expressão de Cry1A.105 detectada, quer para o controle não transgênico ou os eventos gerados com construto 5 (expressando apenas Cry2Ab) (Figura 4B). Por estas ELISAs, amostras de folhas foram coletadas a partir da fase R3 de crescimento de plantas cultivadas em cada um dos dois locais separados do ensaio de telado de eficácia.
[00163] Outros resultados de ELISA mostram que os níveis de proteína de Cry2Ab em extratos a partir de um evento gerado com construto 1, e um evento gerado com construto 2 foram: a) maiores em relação aos eventos gerados ou com 4 construto, construto 5, ou construto 7; b) aproximadamente o mesmo ou um pouco mais baixo em relação aos eventos gerados ou com construto 9, ou construto 11; e c) como esperado, não houve Cry2Ab detectado, quer para o controle não transgênico (não mostrado) ou os eventos gerados ou com construto 3 ou construto 6 (que expressam Cry1A.105 apenas) (Figura 5). Por estas ELISAs, amostras de folhas foram coletadas na fase R3 e R5 do crescimento, e os níveis de Cry2Ab foram maiores na fase de crescimento R5 para eventos gerados com construto 1 e construto 2, e os níveis de Cry2Ab foram maiores em eventos gerados com construto 9, e construto 11 (Figura 5). No mesmo conjunto de amostras de folhas, os resultados de ELISA mostram que os níveis de proteína de Cry1A.105 em extratos dos eventos gerados com o construto 1 e construto 3 foram significativamente mais elevados em relação aos eventos gerados com construto 4, construto 6, construto 9 ou construto 7, e, como esperado, não houve Cry1A.105 detectado, quer para o controle não transgênico (não mostrado) ou os eventos gerados ou com construto 2 ou construto 5 (expressando Cry2Ab apenas) (Figura 6). Por estas ELISAs, amostras de folhas foram coletadas na fase R3 e R5 do crescimento, e os níveis de Cry1A.105 eram ordens de magnitude maior na fase de crescimento R5 para eventos gerados com construto 1 e construto 3, em comparação com os eventos gerados com construto 4, construto 6, construto 9 ou construto 7, consulte o eixo-Y da Figura 6A representado graficamente no 0-5000 ppm de peso seco e eixo-Y da Figura 6B representado graficamente em 0-500 ppm de peso seco. Os dados de ELISA indicam que existe uma maior expressão de ambos Cry2Ab e Cry1A.105 em eventos gerados com construto 1 em comparação com os eventos gerados com construto 4, construto 7 ou construto 9, todos contendo duas cassetes de expressão da proteína Cry - um cassete de expressão que codifica Cry2Ab e uma cassete de expressão que codifica Cry1A.105. Além disso, observou-se que a expressão da proteína relativamente elevada em eventos gerados com o construto 1 (incluindo evento MON87751), construto 2, e construto 3, foi estável durante pelo menos 4 gerações de soja (R0, R1, R2 e R3), e o nível de proteína Cry1A.105 aumentou nos tecidos de folha recolhidos a partir de eventos homozigóticos na fase R3 a R5 de crescimento.
[00164] Este exemplo descreve métodos úteis na identificação da presença de evento MON87751 DNA numa amostra de soja. Um par de iniciadores de PCR e uma sonda foram concebidos com a finalidade de identificar a única junção formada entre o DNA genômico e arbitrariamente atribuído a extremidade 3' do DNA inserido do evento MON87751 (ou seja, a junção 3 ') e englobado em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:6.
[00165] A sequência do iniciador direto de oligonucleotídeo SQ20267 (SEQ ID NO: 11) é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11400 até 11426 de SEQ ID NO: 10, e as posições 212 até 238 de SEQ ID NO: 8, e posições 10066 até 10092 de SEQ ID NO: 9. A sequência do iniciador inverso do oligonucleotídeo SQ25826 (SEQ ID NO: 12) é idêntica ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11454 até 11479 de SEQ ID NO: 10, e as posições 266 até 291 de SEQ ID NO: 8, e as posições 51 até 76 de SEQ ID NO: 6, e as posições 31 até 56 de SEQ ID NO: 4. A sequência da sonda oligonucleotídica PB10263 (SEQ ID NO: 13) é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11428 até 11446 de SEQ ID NO: 10, e posições 10094 até 10112 de SEQ ID NO: 9, e as posições 240 até 258 de SEQ ID NO: 8, e as posições 25 até 43 de SEQ ID NO: 6, e as posições 5 até 23 de SEQ ID NO: 4. Os iniciadores de PCR SQ20267 (SEQ ID NO: 11) e SQ25826 (SEQ ID NO: 12) amplificam um amplicon de 80 nucleotídeos do original do DNA genômico/inserção na junção direita do evento MON87751. Este mesmo par de iniciadores com sonda PB10263 (SEQ ID NO: 13), que pode ser marcado por fluorescência (por exemplo, um marcador fluorescente 6FAM™), pode ser utilizado num ensaio de PCR TaqMan® do ponto de extremidade para identificar a presença de DNA derivado do evento MON87751 numa amostra.
[00166] Além de SQ20267 (SEQ ID NO: 11), SQ25826 (SEQ ID NO: 12) e PB10263 (SEQ ID NO: 13), deve ser aparente para as pessoas versadas na técnica que outros iniciadores e/ou sondas podem ser concebidos quer para amplificar e/ou hibridar com sequências na SEQ ID NO: 10, que são únicas para, e úteis para, a detecção da presença de DNA derivado do evento MON87751 numa amostra.
[00167] Seguindo práticas de laboratório de biologia molecular padrão, ensaios de PCR para identificação de evento foram desenvolvidos para detecção de evento MON87751 DNA em uma amostra. Parâmetros ou de um ensaio de PCR padrão ou um ensaio de PCR TaqMan® foram otimizados com cada conjunto de pares de iniciadores e sondas (ou seja, sondas marcadas com um marcador fluorescente tal como 6FAM™) utilizado para detectar a presença de DNA derivado do evento MON87751 numa amostra SQ20267 (SEQ ID NO: 11), SQ25826 (SEQ ID NO: 12) e PB10263 (SEQ ID NO: 13 ). Um controle para a reação de PCR inclui iniciadores de controle interno e uma sonda de controle interno (por exemplo, marcado com VIC™), específico para um gene de cópia única no genoma da soja. Uma pessoa versada na técnica saberá como conceber iniciadores específicos para um gene de cópia única no genoma da soja. De um modo geral, os parâmetros que foram optimizados para a detecção de evento MON87751 DNA numa amostra incluiu a concentração de iniciador e sonda, a quantidade de DNA de modelo, e os parâmetros de ciclos de amplificação de PCR. As amostras de DNA de modelo e controles foram os seguintes: [1] DNA extraído ou a partir de uma amostra de folhas ou sementes de única amostra a ser analisadas; [2] controle negativo de DNA (DNA de soja não transgênica); [3] controle de água negativo (nenhum modelo); e [4] controle positivo de MON87751 DNA. Outros métodos conhecidos para aqueles versados na técnica que produzem produtos de amplificação que identificam o evento MON87751 DNA numa amostra está dentro da perícia da técnica.
[00168] Um ensaio de zigosidade é útil para determinar se uma planta compreendendo um evento é homozigótica para o evento de DNA; que é que compreende o DNA exógeno na mesma localização em cada cromossoma de um par cromossômico; ou heterozigótica para um evento de DNA, que é que compreende o DNA exógeno em apenas um cromossoma de um par cromossômico; ou é nulo para o evento de DNA, que é de tipo selvagem. Um método de amplificação térmica de ponto de extremidade Taqman® foi utilizado para desenvolver um ensaio de zigosidade para o evento MON87751. Para este ensaio, três iniciadores e duas sondas foram misturados em conjunto com a amostra para o ensaio. Os três iniciadores foram SQ20267 (SEQ ID NO: 11), que hibrida e especificamente se estende a partir da região 3' do DNA exógeno inserido; iniciador SQ27115 (SEQ ID NO: 14), que hibrida e especificamente se estende a partir do DNA genômico de soja flanqueando o lado 3' do DNA exógeno inserido; e iniciador SQ26901 (SEQ ID NO: 15), que hibrida e especificamente se estende a partir do DNA genômico de soja que flanqueia o lado 5' do DNA exógeno inserido. Os iniciadores SQ20267 e SQ27115 e a sonda PB10263 (SEQ ID NO: 13) (marcado com 6- FAM™) são de diagnóstico quando há uma cópia do DNA exógeno inserido presente no DNA de modelo, ou seja, para o evento MON87751. Os iniciadores SQ26901 e SQ27115 e a sonda PB11254 (SEQ ID NO: 16) (marcado com VIC™) são de diagnóstico, quando não há nenhuma cópia do DNA exógeno inserido presente no DNA genômico, ou seja, tipo selvagem. Quando os três iniciadores e duas sondas são misturados em conjunto numa reação de PCR com DNA extraído a partir de uma planta homozigótica para o evento MON87751, há um sinal fluorescente apenas a partir da sonda PB10263 marcada com 6-FAM™ que é indicativa de e diagnóstica para uma planta homozigótica para o evento MON87751. Quando os três iniciadores e duas sondas são misturados em conjunto numa reação de PCR com DNA extraído a partir de uma planta heterozigótica para o evento MON87751, há um sinal de fluorescência a partir da sonda PB10263 marcada com 6-FAM™ e sonda PB11254 marcada com VIC™ que é indicativa de e diagnóstica para uma planta heterozigótica para o evento MON87751. Quando os três iniciadores e duas sondas são misturados em conjunto numa reação de PCR com DNA extraído a partir de uma planta que é nula para o evento MON87751 (ou seja, tipo selvagem), há um sinal de fluorescência a partir de apenas a sonda PB11254 marcada com VIC™ que é indicativa de e diagnóstica para uma planta que para o evento MON87751, ou seja, tipo selvagem. As amostras de DNA de modelo e controles foram os seguintes: [1] DNA extraído a partir de qualquer amostra de folhas ou amostra de semente única a ser analisada; [2] DNA de controle negativo (DNA não transgênico); [3] controle de água negativo (nenhum modelo); [4] controle positivo MON87751 DNA genômico de amostra homozigótica conhecida; e [5] controle positivo MON87751 DNA genômico de amostra homozigótica conhecida.
[00169] O exemplo que se segue descreve como se pode identificar o evento MON87751 dentro de progênie de qualquer atividade de reprodução usando evento de soja MON87751.
[00170] Os pares de iniciadores do evento de DNA são usados para produzir um fragmento amplificado pela PCR diagnóstica para o evento de soja MON87751. Uma amplificação de diagnóstico para MON87751 compreende pelo menos uma sequência de junção, fornecida como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Os pares de iniciadores que irão produzir uma amplificação de diagnóstico para MON87751 incluem pares de iniciadores baseados nas sequências de flanqueamento e a cassete de expressão inserida (SEQ ID NO: 9). Para adquirir um amplificação de diagnóstico, em que SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 é encontrada, pode-se conceber uma molécula de iniciador dianteiro com base na SEQ ID NO: 7, a partir de bases de 1 até 1334 e uma molécula de iniciador reverso com base na sequência de DNA da cassete de expressão inserida (SEQ ID NO: 9 a partir de posições de 1 a 10119), no qual os iniciadores são moléculas de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos para hibridar especificamente com a SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9. Para adquirir uma amplificação de diagnóstico, em que SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 é encontrada, pode-se conceber uma molécula de iniciador dianteiro com base na expressão de sequência de DNA da cassete inserida (SEQ ID NO: 9 a partir de posições 1 a 10119) e uma molécula de iniciador inverso baseado na sequência flanqueadora 3' (ID SEQ NO: 8, a partir da posição 266 até 1452), em que as moléculas de iniciadores são de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos para hibridar especificamente com a SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.
[00171] Um exemplo das condições de amplificação para esta análise é ilustrado no Exemplo 4. No entanto, qualquer modificação destes métodos ou a uso de iniciadores de DNA homólogo ou complementar a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou sequências de DNA dos elementos genéticos contidos na inserção do transgene (SEQ ID NO: 9) de MON87751 que produzem uma amplificação de diagnóstico para MON87751 está dentro da técnica. Uma amplificação de diagnóstico compreende um homólogo da molécula de DNA ou complementar a pelo menos um transgene/DNA de junção genômica (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6), ou uma fração substancial da mesma. Alternativamente, uma amplificação de diagnóstico compreende um homólogo da molécula de DNA ou complementar a pelo menos uma sequência de transgene original (SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23).
[00172] Uma análise para a amostra de tecido de planta do evento MON87751 deve incluir um controle positivo de tecido do evento MON87751, um controle negativo a partir de uma planta de soja que não é o evento MON87751 (por exemplo, mas não limitado a A3555), e um controle negativo que não contém DNA genômico de soja. Um par de iniciadores que irão amplificar uma molécula de DNA de soja endógena irá servir como um controle interno para as condições de amplificação de DNA. Sequências adicionais de iniciadores podem ser selecionadas a partir de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, por aqueles versados na técnica de métodos de amplificação de DNA, e as condições selecionadas para a produção de uma amplificação pelos métodos mostrados no Exemplo 4 pode ser diferente, mas resultam em uma amplificação de diagnóstico para o DNA do evento MON87751. A uso destas sequências de iniciadores de DNA com modificações para os métodos do Exemplo 4 estão dentro do âmbito da invenção. A amplificação produzida por pelo menos uma sequência de iniciadores de DNA derivada a partir da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, que é diagnóstica para MON87751 é um aspecto da invenção.
[00173] Kits de detecção de DNA contêm pelo menos um iniciador de DNA de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos derivados da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, que, quando utilizada num método de amplificação de DNA produz uma amplificação de diagnóstico para MON87751 ou a sua progênie é um aspecto da invenção. Uma planta de soja MON87751, parte de planta, célula de planta, semente, ou produto de base que irão produzir uma amplificação de diagnóstico para MON87751 quando testado em um método de amplificação de DNA constitui um aspecto da invenção. O ensaio para a amplificação MON87751 pode ser realizado usando um Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700 (operado à velocidade máxima) ou termociclador MJ Research DNA Engine PTC- 225 ou qualquer outro sistema de amplificação que pode ser utilizado para produzir uma amplificação de diagnóstico de MON87751 como mostrado no Exemplo 4.
[00174] Para produzir plantas de soja ou partes de plantas das mesmas que compreendem melhoradas propriedades agronômicas, insecticidas, ou herbicidas, as plantas de soja contendo o evento MON87751 são cruzadas com plantas de soja contendo potencialmente qualquer outro evento de soja ou uma sua combinação e fenótipos são avaliados para determinar as propriedades resultants da progênie das plantas. Propriedades conferidas para plantas da progênie resultantes de tal melhoramento de plantas pode estender-se para além da resistência de lepidóptero do evento MON87751, incluindo, mas não limitado ao controle acima do solo de pragas, tolerância a herbicidas, as propriedades nematicidas, resistência à seca, resistência a vírus, controle antifúngico, a resistência das bactérias , a esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumento do rendimento, composição de óleo melhorada, maior teor de óleo, maior eficiência na uso de nutrientes ou teor de aminoácidos alterado. Exemplos de eventos transgênicos com melhores características agronômicas são bem conhecidos na técnica. A seguir é uma lista não limitativa de possíveis linhas de soja transgênicas que pode ser utilizada na reprodução com evento MON87751 para conferir propriedades melhoradas em plantas de soja, partes de plantas, sementes, ou produto de base. A reprodução pode incluir qualquer e todas as combinações do seguinte: tolerância à herbicida: soja GTS 40-3-2, MON87708, MON89788, A2704-12,A2704-21, A5547-35, A5547-127, BPS-CV127-9, DP356043 , GU262, W62, W98, DAS-44406-6, DAS-68416-4, FG72, BPS-CV127-9, SYHT04R, SYHT0H2, 3560.4.3.5, EE-GM3, pDAB4472-1606, pDAB4468-0416, pDAB8291.45.36 ., 127, AAD-12; resistência aos insetos: MON87701, DAS-81419-2; aumento da composição de óleo reforçada: PD-305423, G94-1, G94-19, G168, OT96-15, MON87705, MON87769; aumento do rendimento: MON 87712.
[00175] Todas as publicações e documentos de patentes publicados, citados nesta especificação, e que são relevantes para a invenção, são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente particular fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.
Claims (20)
1. Molécula de DNA recombinante detectável em uma amostra contendo DNA de soja, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos da referida molécula é: a) selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10; ou b) uma sequência de nucleotídeos que é o complemento reverso completo da sequência de nucleotídeos de (a), sendo que a presença de tal molécula de DNA é um diagnóstico para o evento de soja MON87751 de DNA na referida amostra, e sendo que uma amostra representativa de sementes compreendendo o evento de soja MON87751 foi depositada sob o n° de Acesso ATCC PTA-120166.
2. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é derivada do evento de soja MON87751.
3. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende um segmento de polinucleotídeos de comprimento suficiente para funcionar como uma sonda de DNA que sofre hibridação especificamente a um segmento de junção do DNA do evento de soja MON87751 em uma amostra, sendo que a referida molécula de DNA compreende a sequência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, sendo que uma amostra representativa de sementes compreendendo o evento de soja MON87751 foi depositada sob o n° de Acesso ATCC PTA-120166.
4. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida amostra compreende uma planta de soja, célula de planta de soja, semente de soja, parte da planta de soja, descendente de planta de soja, óleo de soja, proteína de soja ou produto de base de soja.
5. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos da referida molécula compreende a sequência de SEQ ID NO: 10.
6. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está inserida no genoma de uma planta de soja, célula vegetal de soja ou semente de soja.
7. Par de moléculas de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira molécula de DNA compreendendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 11 e uma segunda molécula de DNA compreendendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 12, sendo que a primeira molécula de DNA e a segunda molécula de DNA são iniciadores de DNA em uma reação de amplificação.
8. Método para detecção da presença de um diagnóstico de segmento de DNA para o evento de soja MON87751 DNA em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: a) o contato da referida amostra com a sonda de DNA como definida na reivindicação 3; b) a submissão da amostra de DNA e da referida sonda de polinucleotídeo a condições de hibridação; e c) detecção da hibridação da referida sonda de DNA para a referida amostra, sendo que a referida etapa de detecção é diagnóstico para a presença do referido DNA do evento de soja MON87751 na referida amostra, e sendo que uma amostra representativa de sementes compreendendo o evento de soja MON87751 foi depositada sob o n° de Acesso ATCC PTA-120166.
9. Método para detecção da presença de um diagnóstico de segmento de DNA para o evento de soja MON87751 DNA em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contato da referida amostra com o par de moléculas de DNA, como definido na reivindicação 7; b) realização de uma reação de amplificação suficiente para produzir uma amplificação de DNA; e c) detecção da presença da referida amplificação de DNA na referida reação, sendo que a referida amplificação de DNA compreende a sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26, e sendo que a referida detecção da presença da referida amplificação é diagnóstico para DNA de evento de soja MON87751 na referida amostra, e sendo que uma amostra representativa de sementes compreendendo o evento de soja MON87751 foi depositada sob o n° de Acesso ATCC PTA-120166.
10. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA recombinante está compreendida em uma planta de soja, parte da planta de soja ou células de soja desta.
11. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA recombinante está compreendida em uma planta de soja, parte da planta de soja ou célula de soja que é inseticida quando fornecida na dieta de uma praga de insetos lepidópteros.
12. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a referida praga de insetos lepidópteros é selecionada dentre o grupo que consiste em Chrysodeixis spp., Spodoptera spp., Helicoverpa spp., Crocidosema spp., Rachiplusia spp., Anticarsia spp., Elasmopalpus spp., e Plathypena spp.
13. Método para proteção de uma planta de soja de pragas de insetos, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende o fornecimento na dieta de uma peste de lepidóptero de soja uma quantidade eficaz de inseticida de células ou tecido de planta de soja compreendendo o evento MON87751, sendo que uma amostra representativa de sementes compreendendo o evento de soja MON87751 foi depositada sob o n° de Acesso ATCC PTA-120166.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida peste de insetos lepidópteros é selecionada a dentre o grupo que consiste em Chrysodeixis spp., Spodoptera spp., Helicoverpa spp., Crocidosema spp., Rachiplusia spp., Anticarsia spp., Elasmopalpus spp., e Plathypena spp.
15. Método para produção de uma planta de soja resistente a insetos, caracterizado pelo fato de que compreende: a) cruzamento sexual de duas plantas de soja diferentes com pelo menos uma das duas plantas de soja diferentes compreendendo o DNA de evento soja transgênica MON87751; b) semente de amostragem ou tecido de progênie do referido cruzamento; c) detecção da presença de um diagnóstico de segmento de DNA para evento de soja MON87751 na amostra da Etapa (b) para identificar progênie compreendendo o DNA de evento de soja MON87751; e d) seleção do referido DNA de evento de soja compreendendo progênie MON87751, sendo que a referida progênie é uma planta de soja resistente a insetos compreendendo o DNA do evento soja transgênica MON87751, sendo que uma amostra representativa de sementes compreendendo o evento de soja MON87751 foi depositada sob o n° de Acesso ATCC PTA-120166.
16. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA recombinante está compreendida em um material de planta de soja não vivo.
17. Micro-organismo, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade detectável de molécula de DNA recombinante como definida na reivindicação 1.
18. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA recombinante está compreendida em um produto de base de soja.
19. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o produto de base é selecionado dentre o grupo que consiste em sementes de soja inteiras ou processadas, óleo de soja, proteína de soja, farinha de soja, farinha de soja, flocos de soja, farelo de soja, leite de soja, queijo de soja, vinho de soja, ração animal compreendendo soja, papel compreendendo soja, creme compreendendo soja, biomassa de soja e produtos combustíveis produzidos com plantas de soja e partes de plantas de soja.
20. Método para determinação da zigosidade de uma planta de soja ou semente de soja compreendendo o evento MON87751, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contato de uma amostra compreendendo DNA de soja com um conjunto de iniciadores compreendendo SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:15, sendo que o referido conjunto de iniciadores é capaz de produzir um primeiro diagnóstico de amplificação para o evento MON87751 e um segundo diagnóstico de amplificação para o DNA genômico nativo de soja não compreendendo o evento MON87751; i) realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico com a referida amostra e o referido conjunto de iniciadores; e ii) detecção na referida reação de amplificação de ácidos nucleicos o referido primeiro diagnóstico de amplificação para o evento MON87751, ou o referido segundo diagnóstico de amplificação o para DNA genômico de soja nativa não compreendendo o evento MON87751; sendo que a presença de apenas a referida primeira amplificação é diagnóstico de um DNA de evento MON87751 homozigoto na amostra, e a presença de ambos as referidas primeira e segunda amplificações são diagnóstico de um heterozigoto de planta de soja para o alelo do evento MON87751; ou b) contato de uma amostra compreendendo DNA de soja com um conjunto de sondas compreendendo SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:16, sendo que o referido conjunto de sondas contém pelo menos uma primeira sonda que sofre hibridação especificamente a uma região de junção que foi criada pela inserção de um DNA heterólogo no DNA do evento MON87751 e pelo menos uma segunda sonda que sofre hibridação especificamente com o DNA genômico da soja que foi interrompido por inserção do DNA heterólogo do evento MON87751 e não sofre hibridação com o DNA do evento MON87751, i) hibridação do conjunto de sonda ao referido DNA de soja na referida amostra, e ii) detecção da hibridização; sendo que a detecção de hibridação de apenas a referida primeira sonda é de diagnóstico para um alelo homozigótico do DNA do evento MON87751 na referida amostra, e sendo que a detecção de hibridação da referida primeira sonda e da referida segunda sonda é diagnóstico de um alelo heterozigoto do DNA do evento MON87751 na referida amostra, e sendo que uma amostra representativa de sementes compreendendo o evento de soja MON87751 foi depositada sob o n° de Acesso ATCC PTA-120166.
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