CN112512305B - 玉米转基因事件mon 95379及其检测方法和用途 - Google Patents
玉米转基因事件mon 95379及其检测方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112512305B CN112512305B CN201980049875.1A CN201980049875A CN112512305B CN 112512305 B CN112512305 B CN 112512305B CN 201980049875 A CN201980049875 A CN 201980049875A CN 112512305 B CN112512305 B CN 112512305B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- corn
- dna
- event
- maize
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 title claims abstract description 434
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 title claims abstract description 375
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 120
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 title claims description 246
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 title claims description 246
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 27
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 220
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 130
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims abstract description 129
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims abstract description 129
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 331
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 325
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 227
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 150
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 150
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 120
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 73
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims description 57
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 55
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 52
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 47
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 claims description 44
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 38
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 27
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 claims description 26
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 25
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 25
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 claims description 23
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 22
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 21
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 claims description 16
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 16
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 14
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 14
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 11
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 9
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000037213 diet Effects 0.000 claims description 5
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 4
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 claims description 4
- 239000000446 fuel Substances 0.000 claims description 4
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 138
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 62
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 55
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 25
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 24
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 20
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 19
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 19
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 17
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 17
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 17
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 16
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 16
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 13
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 13
- 239000002919 insect venom Substances 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical group [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000013264 metal-organic assembly Substances 0.000 description 5
- 206010073131 oligoastrocytoma Diseases 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 4
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 4
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 4
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AILDTIZEPVHXBF-UHFFFAOYSA-N Argentine Natural products C1C(C2)C3=CC=CC(=O)N3CC1CN2C(=O)N1CC(C=2N(C(=O)C=CC=2)C2)CC2C1 AILDTIZEPVHXBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 108010060231 Insect Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 244000308495 Potentilla anserina Species 0.000 description 2
- 235000016594 Potentilla anserina Nutrition 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000483758 Amphipoea oculea Species 0.000 description 1
- 241001600407 Aphis <genus> Species 0.000 description 1
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 1
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000879145 Diatraea grandiosella Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000400698 Elasmopalpus lignosellus Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009683 detection of insect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035040 seed growth Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal protein (delta-endotoxin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel
Abstract
本发明提供了一种转基因玉米事件MON 95379，包含事件MON 95379的植物、植物细胞、种子、植物部分、后代植物和商品产品。本发明还提供了对事件MON 95379具有特异性的多核苷酸，及使用和检测事件MON 95379的方法以及包含事件MON 95379的植物、植物细胞、种子、植物部分、后代植物和商品产品。
Description
相关申请的引用
本申请要求于2018年7月30日提交的美国临时申请号62/711,810的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
名称为MONS463WO_ST25的文件中所含有的序列表为75千字节(在Microsoft中测得)，创建于2019年7月26日，以电子方式一起提交并且以引用的方式并入。
技术领域
本发明涉及存在于玉米事件MON 95379中和/或从中分离的重组DNA分子。本发明还涉及含有玉米事件MON 95379的转基因玉米植物、植物部分和种子、细胞和农产品，以及使用它们并检测玉米事件MON 95379的存在的方法。含有玉米事件MON 95379 DNA的转基因玉米植物、部分、种子和细胞表现出对鳞翅目家族的昆虫侵染的抗性。
背景技术
玉米(玉蜀黍)是重要的农作物，并且是世界许多地区的主要食物来源。生物技术方法已应用于玉米，用来改善农艺性状和产品质量。一种这样的农艺性状是昆虫抗性，其通过插入玉米植物基因组中的异源昆虫毒素(也称为转基因)的表达来实现。
这种转基因在转基因植物、植物部分、种子或细胞中的表达可能受许多不同因素的影响，这些因素包括驱动转基因表达的盒中所用的元件以及盒中那些元件之间的相互作用。对于包含两个或更多个表达盒的转基因插入，这进一步复杂化，其中每个表达盒具有赋予单独性状的转基因，这也称为多基因转基因事件。商业上有用的多基因转基因事件要求转基因插入中的每个转基因以对每种性状必需的方式表达。为此，首先在植物中设计并测试单个表达盒，然后针对每种性状选择表现出最佳昆虫活性而不会由于表达而导致阴性表型的表达盒。接下来，将针对一种性状的所选表达盒与针对另一种性状的所选表达盒组合成单个构建体。使用不同取向设计多个构建体，以提供最佳抗性并防止出现阴性表型或负面农艺学，诸如降低产量。测试构建体以确保所有表达盒一起良好发挥功能，并且正确表达每个转基因。然后，将表达盒的选定组合和取向用作单个转基因插入物以产生数百个转基因事件，每个事件是在不同基因组位置随机插入构建体的结果。
每个转基因事件在其分子谱和染色体插入点方面都是独特的。由于事件创建中涉及的可变性，每个独特的事件都必须经过多代植物来分析-在每个步骤中评估分子特征、蛋白质表达功效和农艺学-以便选出用于商业用途的优良事件。事件在转基因植物、植物部分、种子或细胞中的表现及其有效性可能受到转基因插入的基因组位置的影响。具体地，相对于整合位点或染色质结构，顺式和/或反式因素会影响事件的有效性。事件可以具有相同的转基因插入，但是在各种种质中或在特定的生长条件下，跨组织和发育阶段具有不同的转基因表达水平和表现。在一些事件之间也可能存在不希望有的表型或农艺差异。因此，有必要产生和分析大量的单个植物转化事件，以便选择相对于所需性状具有优良特性的事件，以及使其适于商业目的所需的最佳表型和农业特征。此外，要创建用于商业用途的多基因事件，需要经过多年来在多个地点和多种条件下的严格的分子表征、温室测试和田间试验，因此可以收集广泛的农艺、表型和分子数据。科学家和农艺师随后必须对所生成的数据进行分析，以选出用于商业目的事件。一旦被选出，则可以使用植物育种方法将这种事件作为具有多个昆虫抗性性状的单个基因座渗入适于特定局部生长条件的新种质中，并通过与赋予与本发明的事件所赋予的性状不同的性状的其他不同的事件进行育种而堆叠/组合。
发明内容
本发明提供了一种新型转基因玉米事件-MON 95379，其提供对玉米鳞翅目害虫的杀虫控制。本发明还提供了包含事件MON 95379的转基因植物、植物细胞、种子、植物部分和商品产品。在另一个实施方案中，本发明提供了对事件MON 95379具有特异性的多核苷酸以及包含事件MON 95379的植物、植物细胞、种子、植物部分、后代植物和商品产品。在又一个实施方案中，提供了与事件MON 95379有关的方法。
因此，一方面，本发明提供了一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及其完整互补序列。
在一个实施方案中，重组DNA分子源自种子样品中的玉米事件MON 95379，所述种子样品包含已以ATCC登录号PTA-125027寄存的所述事件。
本发明的另一方面提供了一种DNA分子，其包含足够长的多核苷酸区段以用作DNA探针，该DNA探针在严格的杂交条件下与样品中的玉米事件MON 95379 DNA特异性杂交，其中检测到在所述严格的杂交条件下所述DNA分子的杂交可诊断所述样品中玉米事件MON95379 DNA的存在。在某些实施方案中，样品包括玉米植物、玉米植物细胞、玉米种子、玉米植物部分、玉米后代植物、经过加工的玉米种子、包含玉米的动物饲料、玉米油、玉米面、玉米粉、玉米片、玉米糠、由玉米制成的面食、玉米生物质以及使用玉米和玉米部分生产的燃料产品。
本发明的又一方面提供了一种DNA分子对，其包含第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，当与包含玉米事件MON 95379模板DNA的样品一起用于扩增反应中时，这对DNA分子充当DNA引物，以产生可诊断所述样品中所述玉米事件MON95379 DNA的存在的扩增子，其中所述扩增子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
本发明的另一个实施方案是一种检测样品中可诊断玉米事件MON 95379 DNA的DNA区段的存在的方法，所述方法包括：a)使样品与充当探针并在严格的条件下与玉米事件MON 95379特异性杂交的DNA分子接触；b)使所述样品和所述DNA分子经受严格的杂交条件；及c)检测所述样品中所述DNA分子与所述DNA的杂交，其中所述检测可诊断所述玉米事件MON 95379 DNA在所述样品中的存在。
本发明的又一个实施方案是一种检测样品中可诊断玉米事件MON 95379 DNA的DNA区段的存在的方法，所述方法包括：a)使所述样品与本发明的DNA分子对接触；b)进行足以产生DNA扩增子的扩增反应；及c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在，其中所述DNA扩增子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10。
本发明的另一个实施方案是一种玉米植物、玉米植物部分、玉米细胞或其部分，其包含重组多核苷酸分子，所述重组多核苷酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。当在鳞翅目昆虫害虫的饮食中提供时，此玉米植物、玉米植物部分、玉米细胞或其部分是杀虫的。鳞翅目害虫可包括秋夜蛾(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))、玉米穗蛾(棉铃虫(Helicoverpa zea))、西南玉米蛀虫(西南玉米螟(Diatraea grandiosella))、甘蔗蛀虫(蔗螟(Diatraea saccharalis))和小玉米秆蛀虫(小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus))。另外，玉米植物可以进一步被限定为包含玉米事件MON 95379的玉米植物的任何一代的后代。
本发明的又一个实施方案是一种保护玉米植物免受昆虫侵染的方法，其中所述方法包括在鳞翅目昆虫害虫的饮食中提供杀虫有效量的包含玉米事件MON 95379的玉米植物的细胞或组织。同样，预期的鳞翅目昆虫害虫包括秋夜蛾(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(棉铃虫)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)、甘蔗蛀虫(蔗螟)和小玉米秆蛀虫(小玉米螟)。
本发明的另一个实施方案是一种产生昆虫抗性玉米植物的方法，其包括：a)使两种不同的玉米植物进行有性杂交，其中所述两种不同的玉米植物中的至少一种包含转基因玉米事件MON 95379 DNA；b)从步骤(a)的后代对种子或组织取样；c)检测来自步骤(b)的所述样品中包含玉米事件MON 95379 DNA的后代；及d)选择包含玉米事件MON95379 DNA的所述后代。
本发明的又一个实施方案是一种玉米种子、无生命的玉米植物材料或微生物，其包含可检测量的选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10或其完整互补序列。
本发明的仍又一个实施方案是一种商品产品，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10或其完整互补序列。预期的商品产品包括完整或经过加工的玉米种子、包含玉米的动物饲料、玉米油、玉米面、玉米粉、玉米片、玉米糠、玉米生物质以及使用玉米和玉米部分生产的燃料产品。
本发明的另一个实施方案是一种玉米植物、玉米植物部分或其玉米种子，所述玉米植物、玉米植物部分或其玉米种子包含当在DNA扩增方法中测试时充当模板的DNA，所述扩增方法产生可诊断对事件MON 95379 DNA的存在的扩增子。
本发明的仍又一个实施方案是一种确定包含事件MON 95379的玉米植物或玉米种子的接合性的方法，所述方法包括：a)使包含玉米DNA的样品与能够产生编码Cry1B.868或Cry1Da_7的毒素编码序列之一的扩增子的引物对接触；b)使包含玉米DNA的所述样品与能够产生在玉米植物中已知为单拷贝且纯合的内部标准的扩增子的引物对接触；c)使DNA样品与探针组接触，所述探针组含有与编码Cry1B.868或Cry1Da_7的毒素编码序列之一进行特异性杂交的至少第一探针，和与在玉米植物中已知为单拷贝且纯合的内部标准基因组DNA特异性杂交的第二探针；d)使用实时PCR进行DNA扩增反应，并确定对应于毒素编码序列和单拷贝、纯合内部标准的扩增子的循环阈值(Ct值)；e)计算单拷贝、纯合内部标准扩增子的Ct值与毒素编码序列扩增子的Ct值之间的差值(ΔCt)；以及f)确定接合性，其中约零(0)的ΔCt指示事件MON 95739的插入T-DNA的纯合性，而约一(1)的ΔCt指示事件MON 95379的插入T-DNA的杂合性。在此方法的某些实施方案中，引物对选自由以下组成的组：SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19的组合和SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的组合；并且探针为SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:23。在另一个实施方案中，引物对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的组合和SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的组合；并且探针为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26。在本发明的仍另一个实施方案中，指示事件MON 95379的插入T-DNA的杂合性的约一(1)的ΔCt在0.75至1.25的范围内。
本发明的又一个实施方案是一种确定包含事件MON 95379的玉米植物或玉米种子的接合性的方法，所述方法包括：a)使包含玉米DNA的样品与引物对组接触，所述引物对组包含至少两个不同的引物对，所述引物对能够产生可诊断事件MON 95379的第一扩增子和可诊断不包含事件MON 95379的天然玉米基因组DNA的第二扩增子；i)用样品和引物对组进行核酸扩增反应；ii)在核酸扩增反应中检测可诊断事件MON 95379的第一扩增子或可诊断不包含事件MON95379的天然玉米基因组DNA的第二扩增子，其中仅第一扩增子的存在可诊断对于事件MON 95379为纯合的玉米植物或玉米种子，并且第一扩增子和第二扩增子两者都存在可诊断对于事件MON 95379为杂合的玉米植物或玉米种子；或b)使包含玉米DNA的样品与探针组接触，所述探针组含有与事件MON 95379 DNA特异性杂交的至少第一探针和与被事件MON 95379的异源DNA的插入而中断的玉米基因组DNA特异性杂交而不与事件MON95379 DNA杂交的至少第二探针；i)在严格的杂交条件下使探针组与样品杂交，其中检测到仅第一探针在杂交条件下的杂交可诊断对于事件MON 95379为纯合的玉米植物或玉米种子，且其中检测到第一探针和第二种探针两者在杂交条件下的杂交可诊断对于事件MON95379为杂合的玉米植物或玉米种子。在此方法的一个实施方案中，引物对组包括SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16的组合和SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27的组合。在此方法的另一个实施方案中，探针组包括SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:28。
本发明的上述和其它方面根据以下具体实施方式将变得更加显而易见。
附图说明
图1表示玉米事件MON 95379的序列。水平线和框对应于SEQ ID NO:1([1])、SEQID NO:2([2])、SEQ ID NO:3([3])、SEQ ID NO:4([4])、SEQ ID NO:5([5])、SEQ ID NO:6([6])、SEQ ID NO:7([7])、SEQ ID NO:8([8])、SEQ ID NO:9([9])、SEQ ID NO:11([11])和SEQ ID NO:12([12])相对于SEQ ID NO:10([10])的位置。标记为SQ51219(SEQ ID NO:15)([15])、SQ21524(SEQ ID NO:16)([16])、SQ50998(SEQ ID NO:21)([21])、SQ50997(SEQ IDNO:22)([22])、SQ50485(SEQ ID NO:24)([24])和SQ50484(SEQ ID NO:25)([25])的水平箭头表示可用于检测玉米事件MON 95379的引物子组的大致位置。标记为PB10269(SEQ IDNO:17)([17])、PB50340(SEQ ID NO:23)([23])、PB50138(SEQ ID NO:26)([26])的水平箭头表示可用于检测玉米事件MON 95379的DNA探针的大致位置。“E”代表增强子元件，“P”代表启动子元件，“L”代表前导(5′UTR)元件，“I”代表内含子元件，“T”代表3′UTR，“Cry1B.868”代表Cry1B.868编码序列元件，“Cry1Da_7”代表Cry1Da_7编码序列元件，“LoxP”代表发生Cre-重组酶标记切除的位点，在标记切除后留下两个LoxP位点之一，而“LB”代表左T-DNA边界。
图2是在整合以形成事件MON 95379之前、整合之后以及在Cre-切除之后的T-DNA盒的示意图。顶部水平框表示用于转化事件MON95379的质粒载体中的T-DNA盒，呈现为SEQID NO:13([13])(“整合前的T-DNA”)。下方的水平箭头[13]表示两个转基因盒中包含的单独遗传元件。“LB”代表T-DNA左边界元件，“E”代表增强子元件，“P”代表启动子元件，“L”代表前导(5′UTR)元件，“I”代表内含子元件，“T”代表3′UTR，“Cry1B.868”代表Cry1B.868编码序列元件，“Cry1Da_7”代表Cry1Da_7编码序列元件，“CP4”代表CP4可选标记，“TS”代表靶向序列，“LoxP”代表发生Cre重组酶标记切除的位点，而“RB”代表T-DNA右边界元件。中间水平框“整合后的插入T-DNA”表示转化后整合到玉米基因组中的T-DNA盒，其中整合过程中丢失了右T-DNA边界(RB)。底部水平框“Cre切除后的插入T-DNA”表示切除CP4可选标记盒后的整合T-DNA盒，留下两个LoxP位点之一和LB区。
图3是产生无标记的玉米事件MON 95379的育种过程的示意图。R0代事件(“转化体”)是使用用于生成玉米事件MON 95379的二元转化载体从初始转化中得到的事件。后续的“R”代(R1和R2)表示通过植物自花授粉产生的连续世代，这些植物由产生玉米事件MON95379的初始R0转化体得到。将对于T-DNA插入为纯合的R2转化体用包含用于表达Cre重组酶的转基因盒的优良转基因玉米品系进行异花授粉，从而产生F1代，其中许多后代由于Cre重组酶切除而失去了CP4可选标记盒。选择半合子T-DNA阳性、CP4阴性植物并自花授粉，产生F2代。选择对于插入的T-DNA等位基因为纯合而不含CP4标记且缺少Cre重组酶转基因盒的F2植物，并自花授粉，产生F3代。F3代植物是自花授粉的，产生F4黄金标准种子(Gold StandardSeed)的纯系。
序列简述
SEQ ID NO:1是50个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'连接区。SEQ ID NO:1见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置838-887处。
SEQ ID NO:2是50个核苷酸的序列，代表整合的转基因表达盒和玉米基因组DNA的3′连接区。SEQ ID NO:2见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置14,156-14,205处。
SEQ ID NO:3是100个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'连接区。SEQ ID NO:3见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置813-912处。
SEQ ID NO:4是100个核苷酸的序列，代表整合的转基因表达盒和玉米基因组DNA的3′连接区。SEQ ID NO:4见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置14,131-14,230处。
SEQ ID NO:5是200个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'连接区。SEQ ID NO:5见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置763-962处。
SEQ ID NO:6是200个核苷酸的序列，代表整合的转基因表达盒和玉米基因组DNA的3′连接区。SEQ ID NO:6见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置14,081-14,280处。
SEQ ID NO:7是1,160个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'连接区。SEQ ID NO:7见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置1-1,160处。
SEQ ID NO:8是1,178个核苷酸的序列，代表整合的转基因表达盒和玉米基因组DNA的3′连接区。SEQ ID NO:8见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置14,039-15,216处。
SEQ ID NO:9是13,318个核苷酸的序列，对应于玉米事件MON95379的转基因插入的T-DNA。
SEQ ID NO:10是15,216个核苷酸的序列，对应于5′基因组侧翼DNA核苷酸序列的重叠群核苷酸序列、事件MON 95379中插入的T-DNA核苷酸序列和3′基因组侧翼DNA核苷酸序列；并且包括SEQ ID NO:11(核苷酸1-862)、SEQ ID NO:9(核苷酸863-14,180)和SEQ IDNO:12(核苷酸14,181-15,216)。
SEQ ID NO:11是862个核苷酸的序列，代表5'侧翼玉米基因组DNA直至插入的T-DNA。SEQ ID NO:11见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置1-862处。
SEQ ID NO:12是1,036个核苷酸的序列，代表插入的T-DNA后的3'侧翼玉米基因组DNA。SEQ ID NO:12见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置14,181-15,216处。
SEQ ID NO:13是18,376个核苷酸的序列，代表包含在用于转化玉米以产生玉米事件MON 95379的二元质粒转化载体内的转基因盒。
SEQ ID NO:14是35个核苷酸的序列，代表用于Cre介导的切除和重组的LoxP位点。标记切除后的剩余LoxP位点可见于SEQ ID NO:10内的核苷酸位置1,080-1,114处。
SEQ ID NO:15是20个核苷酸的序列，对应于称为SQ51219的热扩增引物，它用于鉴定样品中的玉米事件MON 95379 DNA，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置833-852的核苷酸序列同一。
SEQ ID NO:16是30个核苷酸的序列，对应于称为SQ21524的热扩增引物，它用于鉴定样品中的玉米事件MON 95379 DNA，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置905-934的核苷酸序列的反向互补序列同一。
SEQ ID NO:17是16个核苷酸的序列，对应于称为PB10269的探针，它用于鉴定样品中的玉米事件MON 95379 DNA，并且与对应于SEQ ID NO:10的位置886-901的核苷酸序列的反向互补序列同一。
SEQ ID NO:18是24个核苷酸的序列，对应于称为SQ20222的热扩增引物，它用作MON 95379的事件和接合性测定的内部对照并与玉米基因组的区域杂交。
SEQ ID NO:19是28个核苷酸的序列，对应于称为SQ20221的热扩增引物，它用作MON 95379的事件和接合性测定的内部对照并与玉米基因组的区域杂交。
SEQ ID NO:20是29个核苷酸的序列，对应于称为PB50237的探针，它用作MON95379的事件和接合性测定的内部对照并与玉米基因组的区域杂交。
SEQ ID NO:21是20个核苷酸的序列，对应于称为SQ50998的热扩增引物，它在事件MON 95379的接合性测定中使用并与SEQ ID NO:10内的Cry1B.868的编码序列杂交；并且与对应于SEQ ID NO:10的位置2,809-2,828的核苷酸序列同一。
SEQ ID NO:22是20个核苷酸的序列，对应于称为SQ50997的热扩增引物，它在事件MON 95379的接合性测定中使用并与SEQ ID NO:10内的Cry1B.868的编码序列杂交；并且与对应于SEQ ID NO:10的位置2,852-2,871的核苷酸序列的反向互补序列同一。
SEQ ID NO:23是18个核苷酸的序列，对应于称为PB50340的探针，它在事件MON95379的接合性测定中使用并与SEQ ID NO:10内的Cry1B.868的编码序列杂交；并且与对应于SEQ ID NO:10的位置2,833-2,850的核苷酸序列的反向互补序列同一。
SEQ ID NO:24是19个核苷酸的序列，对应于称为SQ50485的热扩增引物，它在事件MON 95379的接合性测定中使用并与SEQ ID NO:10内的Cry1Da_7的编码序列杂交；并且与对应于SEQ ID NO:10的位置12,820-12,838的核苷酸序列同一。
SEQ ID NO:25是18个核苷酸的序列，对应于称为SQ50484的热扩增引物，它在事件MON 95379的接合性测定中使用并与SEQ ID NO:10内的Cry1Da_7的编码序列杂交；并且与对应于SEQ ID NO:10的位置12,855-12,872的核苷酸序列的反向互补序列同一。
SEQ ID NO:26是14个核苷酸的序列，对应于称为PB50138的探针，它在事件MON95379的接合性测定中使用并与SEQ ID NO:10内的Cry1Da_7的编码序列杂交；并且与对应于SEQ ID NO:10的位置12,840-12,853的核苷酸序列的反向互补序列同一。
SEQ ID NO:27是21个核苷酸的序列，对应于称为PNEGDNA的热扩增引物，它在事件MON 95379的接合性测定中使用并与玉米基因组DNA的区域杂交，该区域在用于产生事件MON 95379的T-DNA插入玉米基因组中时缺失。源自引物SQ51219与PNEGDNA的组合的扩增子可诊断缺少事件MON 95379插入的T-DNA的野生型等位基因。
SEQ ID NO:28是14个核苷酸的序列，对应于称为PRBNEGDNA的探针，它在事件MON95379的接合性测定中使用并与玉米基因组DNA的区域杂交，该区域在用于产生事件MON95379的T-DNA插入玉米基因组中时缺失。
具体实施方式
本发明提供了一种转基因玉米事件-MON 95379，其通过表达Cry1B.868和Cry1Da_7实现对玉米鳞翅目害虫的杀虫控制。具体而言，在玉米事件MON 95379中Cry1B.868和Cry1Da_7昆虫抑制蛋白的表达提供了对以下鳞翅目昆虫害虫的抗性：秋夜蛾(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(棉铃虫)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)、甘蔗蛀虫(蔗螟)和小玉米秆蛀虫(小玉米螟)。事件MON 95379将满足玉米市场上对这些昆虫的控制的巨大需求，因为化学杀虫剂通常无法对这些昆虫提供足够的控制，或者在生长季节需要多次施用，从而增加了环境中化学杀虫剂的投入并增加了玉米生产成本。
应当理解，对事件MON 95379的提及等效于对事件MON95379的提及；它们是可互换的且代表相同的转基因玉米事件。
植物转化技术用于将外来DNA(也称为转基因DNA)随机插入细胞基因组的染色体中，以产生基因工程化细胞，也称为“转基因”或“重组”细胞。使用此项技术转化了许多个别细胞，由于外来DNA随机插入基因组中，故每个细胞都产生独特的“转基因事件”或“事件”。然后从每个个别转基因细胞再生出转基因植物。由此产生的转基因植物的每个细胞都含有独特插入的转基因事件作为其基因组的稳定部分。随后可以将此转基因植物用于产生后代植物，每个后代植物都含有独特的转基因事件。
玉米事件MON 95379是由具有单个T-DNA二元系统的玉米未成熟胚的农杆菌介导的转化过程产生。在此系统中，利用农杆菌菌株，该菌株采用具有单个T-DNA的一个二元质粒载体。T-DNA构建体包含两个用于表达编码Cry1B.868和Cry1Da_7的昆虫毒素编码序列的转基因盒，及用于通过草甘膦选择(CP4)来选择转化的玉米细胞的转基因盒。T-DNA构建体为SEQ ID NO:13，并在图2中示出(“整合前的T-DNA”)。在整合过程中，右T-DNA边界丢失，如图2所示(“整合后的插入T-DNA”)。草甘膦选择盒的两侧侧接有LoxP识别位点，这些位点被Cre-重组酶识别，该重组酶来源于肠杆菌噬菌体P1(Larry Gilbertson(2003)Cre-loxrecombination:Cre-active tools for plant biotechnology.TRENDS inBiotechnology,21:12,550-555)。
如本文具体所述，玉米事件MON 95379通过复杂的研发过程产生，在该过程中：(1)开发了数百种质粒载体构建体–它们在杀虫蛋白的编码序列、转录调控元件的编码序列以及构建体内盒的数量和取向方面有所不同-并将这些构建体转化到玉米细胞中，以创建数千个经过测试和分析的事件，从而选择用于生成事件MON 95379的构建体；(2)利用用于产生事件MON 95379的构建体转化数百个玉米细胞，生成转基因植物群，其中每个植物都包含经过再生和测试的独特转基因事件；(3)最终事件MON 95379是经过严格的多年事件选择过程后选择的，该过程涉及在多种遗传背景下测试和分析分子特征、功效、蛋白质表达和农艺特性；及(4)通过体内Cre切除来移除玉米事件MON 95379中的草甘膦选择盒，以创建“无标记”的最终事件MON 95379。玉米事件MON 95379由此产生并被选作独特的优良事件，该优良事件适用于大规模农艺目的。
通过详细的分子分析对插入玉米事件MON 95379的基因组中的质粒DNA进行表征。此项分析包括：插入数量(玉米基因组内整合位点的数量)、基因组插入位置(玉米基因组中发生插入的特定位点)、拷贝数量(一个基因座内T-DNA拷贝的数量)以及转基因插入的DNA的完整性。详细的分子分析表明，包含Cry1B.868和Cry1Da_7表达盒的整合T-DNA在草甘膦(CP4)选择盒的整合和Cre切除后保持完整。如本文所用，“表达盒”或“盒”是重组DNA分子，其包含将由转化细胞表达的不同元件的组合。表1提供SEQ ID NO:10中包含的元件的列表，DNA序列对应于玉米事件MON 95379。
表1.玉米事件MON 95379的描述
玉米事件MON 95379的特征是插入玉米基因组的单个基因座中，从而产生跨越一部分插入的DNA和玉米基因组DNA的两个新的基因座或连接序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8中列出的序列)，所述基因座或连接序列并非已知天然地存在于玉米基因组或其他转基因玉米事件中-它们是事件MON 95379所特有的。这些连接序列可用于检测玉米细胞、玉米组织、玉米种子和玉米植物或玉米植物产品(诸如玉米商品产品)中事件MON 95379的存在。本文描述了DNA分子探针和引物对，这些分子探针和引物对已被开发用于鉴定含有或疑似含有具有事件MON 95379的玉米细胞、玉米种子、玉米植物部分或玉米植物组织的生物样品中这些不同连接区段的存在。
样品旨在指代大体上纯的玉米DNA的组合物或包含玉米DNA的组合物。在任一种情况下，样品都是生物样品，即，其包含生物材料，包括但不限于直接或间接地从玉米事件MON95379的基因组获得或得到的DNA。“直接”是指本领域技术人员通过破碎玉米细胞(或通过获取含有破裂的玉米细胞的玉米样品)并暴露基因组DNA以用于检测目的而直接从玉米基因组中获得DNA的能力。“间接”是指本领域技术人员通过不同于经由玉米细胞破碎直接获得或获得包含破碎的玉米细胞的玉米样品的手段获得靶DNA或特定参照DNA(即本文所述的新颖且独特的连接区段)的能力，这些靶DNA或特定参照DNA可诊断特定样品中事件MON95379的存在。此类间接手段包括但不限于扩增包含DNA序列(由被设计成与靶序列特异性结合的特定探针所靶向)的DNA区段；或扩增可被测量和表征的DNA区段，即，通过经由诸如琼脂糖或丙烯酰胺凝胶等一些有效矩阵从DNA的其它区段分离来测量；或者通过对扩增子的直接序列分析，或将扩增子克隆到载体中并且对此类载体内存在的插入扩增子的直接测序来表征。
详细的分子分析表明，事件MON 95379包含单个T-DNA插入，其中每个Cry1B.868和Cry1Da_7表达盒都有一个拷贝。在事件MON95379中，除了用于从植物转化质粒转移转基因DNA到玉米基因组的根癌农杆菌左边界区以外，没有鉴定到来自转化构建体的另外元件。最后，进行产生可诊断事件MON 95379的存在的特异性扩增子的热扩增和DNA序列分析，以确定任意分配的5'和3'插入到植物(insert-to-plant)的基因组连接，确认插入物内元件的组织，并确定插入的转基因DNA的完整DNA序列(SEQ ID NO:9)。SEQ ID NO:11是代表以下的序列：八百六十二(862)个碱基对(bp)的5′LH244玉米基因组DNA序列，侧接表示为SEQ IDNO:9的插入的T-DNA序列。SEQ ID NO:12是代表以下的序列：一千零三十六个(1,036)个bp的3′LH244玉米基因组DNA序列，侧接表示为SEQ ID NO:9的插入的T-DNA序列。SEQ ID NO:7是代表以下的序列：侧接插入的T-DNA序列的八百六十二(862)个碱基对(bp)的5′LH244玉米基因组DNA序列，该序列与两百九十八(298)个bp的表示为SEQ ID NO:9的插入的T-DNA序列组合。SEQ ID NO:8是代表以下的序列：一百四十二(142)个bp的插入的T-DNA序列，以及侧接表示为SEQ ID NO:9的插入的T-DNA序列的一千零三十六(1,036)个bp的3′LH244玉米基因组DNA序列。SEQ ID NO:10对应于玉米事件MON 95379，并含有连续序列(重叠群)，该连续序列包含5′LH244侧翼序列、事件MON 95379的转基因插入物和3′LH244侧翼序列，且由此含有插入到植物的基因组连接序列。
除非本文另外指出，否则相关领域的普通技术人员应根据常规用法来理解术语。分子生物学中常用术语的定义可见于Rieger等人.,Glossary of Genetics:Classicaland Molecular,第5版,Springer-Verlag:New York,1991及Lewin,Genes V,OxfordUniversity Press:New York,1994以及本领域普通技术人员已知的其他来源中。如本文所用，术语“玉米”是指属于玉蜀黍属的种，优选是玉米，并且包括可与含有事件MON 95379的玉米植物育种的所有植物品种，包括野生玉米种以及属于允许物种间育种的玉蜀黍属的那些植物。
本发明提供了用DNA构建体转化的转基因植物，所述DNA构建体含有表达毒性量的杀虫蛋白Cry1B.868和Cry1Da_7的表达盒。毒性量是指有效量、杀虫量、杀虫有效量、目标昆虫抑制量、有效杀虫量、鳞翅目昆虫饮食中的杀虫量以及相关领域的普通技术人员根据常规用法应理解的其他类似术语。根据本文公开的方法和用本文公开的DNA构建体转化的玉米植物对鳞翅目昆虫害虫具有抗性。
通过以下操作产生转基因“植物”：用异源DNA(即，包括许多有效目标特征的多核酸构建体)转化植物细胞；将转基因插入植物细胞基因组中实现植物再生；以及选择特征为插入到特定基因组位置和再生的转基因植物的有效特征数量的特定植物。术语“事件”是指来自原始转化体的DNA，其包含插入的DNA以及与插入的DNA紧邻的侧翼基因组序列。这样的DNA是独特的，并且由于包含插入的DNA的亲本系(例如，原始转化体和自交所产生的后代)与不包含插入的DNA的亲本系的有性杂交的结果，这种DNA预期被转移到接受包含目标转基因的插入的DNA的后代中。本发明还提供了包含异源DNA的原始转化体植物和该转化体的后代。这种后代可以通过包含该事件的植物与另一植物(其中后代包括异源DNA)之间的有性异型杂交产生。即使在与轮回亲本的反复回交后，该事件也存在于同一染色体位置的杂交后代中。
如本文所用，术语“重组”是指通常不会在自然界中发现并由人为干预产生的非天然DNA、蛋白质或生物体。“重组DNA分子”是这样的DNA分子，其包含不会天然地一起出现并且是人为干预的结果的DNA分子的组合。例如，由至少两个彼此异源的DNA分子的组合构成的DNA分子是重组DNA分子，所述至少两个DNA分子是诸如包含转基因和与该转基因相邻的植物基因组DNA的DNA分子。
本文所指的术语“DNA”与“DNA分子”是指脱氧核糖核酸(DNA)分子。DNA分子可以是基因组或合成来源的，并且按照惯例是从5'(上游)端到3'(下游)端。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。按照惯例，本发明的DNA序列及其片段根据两条互补DNA序列链中的仅一条链来公开。通过暗示和意图，此处提供的序列的互补序列(互补链的序列)在本领域中也称为反向互补序列，它们在本发明的范围内，并且明确地意在要求保护的主题的范围内。
如本文所用，术语“片段”是指整体的较小部分。例如，SEQ ID NO:10的片段将包括以下序列，这些序列是SEQ ID NO:10的完整序列中的至少约12个连续核苷酸、至少约13个连续核苷酸、至少约14个连续核苷酸、至少约15个连续核苷酸、至少约16个连续核苷酸的序列、至少约17个连续核苷酸、至少约18个连续核苷酸、至少约19个连续核苷酸、至少约20个连续核苷酸、至少约25个连续核苷酸、至少约30个连续核苷酸、至少约35个连续核苷酸至少约40个连续核苷酸、至少约45个连续核苷酸、至少约50个连续核苷酸、至少约60个连续核苷酸、至少约70个连续核苷酸、至少约80个连续核苷酸、至少约90个连续核苷酸或至少约100个连续核苷酸。
在本申请中提及“分离的DNA分子”或等效术语或短语旨在表示该DNA分子是单独存在或与其他组合物组合存在但不在其天然环境中的一者。例如，只要在生物体的基因组DNA内天然发现的核酸元件，诸如编码序列、内含子序列、未翻译的前导序列、启动子序列、转录终止序列等在生物体的基因组内以及在其自然存在的基因组内的位置处，该元件不被认为是“分离的”。然而，只要这些元件中的每个以及这些元件的子部分不在生物体的基因组之内并且不在其天然存在的基因组内的位置处，该元件在本公开的范围内将是“分离的”。类似地，只要编码杀虫蛋白或该蛋白的任何天然存在的杀虫变体的核苷酸序列不在天然发现编码该蛋白的序列的细菌的DNA内，该核苷酸序列将是分离的核苷酸序列。对于本公开的目的，认为编码天然存在的杀虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列是分离的。对于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即，插入植物或细菌的细胞基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，不管它是存在于植物或细菌基因组内的质粒或用于转化细胞的类似结构中，或以可检测的量存在于源自植物或细菌的组织、后代、生物样品或商品产品中。在任何情况下，分离的DNA分子都是化学分子，无论其是被称为核酸、核酸序列、多核苷酸序列等。它是一种新颖的发明分子，当存在于植物细胞或植物基因组中时以及当存在于植物细胞外时均展现工业实用性，因此无论该分子位于何处都展现并意在展现这种实用性。
跨越通过转基因插入物的一端与侧翼玉米基因组DNA的磷酸二酯键的连接的区域的DNA序列被称为“连接”。连接是转基因插入物和作为一个连续分子的侧翼DNA的连接点。在转基因插入物的5'端发现一个连接，而在转基因插入物的3'端发现另一个连接，在本文中分别称为5’连接和3’连接。“连接序列”是指跨越事件的5'或3'连接的任何长度的DNA序列。使用SEQ ID NO:10，玉米事件MON 95379的连接序列对本领域技术人员是显而易见的。事件MON 95379的连接序列的实例提供为SEQ ID NO:1-8。图1示出了相对于SEQ ID NO:10从5'至3'排列的连接序列的物理排列。事件MON 95379的连接序列可以作为含有事件MON95379的植物、种子或细胞的基因组的一部分存在。对来自植物、植物部分、种子或细胞的样品中的任何一个或多个连接序列的鉴定表明，该DNA是从含有事件MON 95379的玉米中获得的，并且可诊断事件MON 95379的存在。
事件MON 95379的连接序列可以由选自由以下组成的组的序列表示：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8和SEQ ID NO:10。例如，连接序列可以由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2提供的核苷酸序列任意表示。或者，连接序列可以由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4提供的核苷酸序列任意表示。或者，连接序列可以由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6提供的核苷酸序列任意表示。或者，连接序列可以由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8提供的核苷酸序列任意表示。这些核苷酸通过磷酸二酯键连接，并且在玉米中，事件MON 95379作为重组植物细胞基因组的一部分存在。
在来源于玉米植物、玉米种子或玉米植物部分的样品中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10中的一个或多个的鉴定可诊断出：DNA是从玉米事件MON 95379获得的。因此，本发明提供了一种DNA分子，其包含提供为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10的核苷酸序列中的至少一个。足以包含提供为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列中的至少一个的来源于转基因玉米事件MON 95379的DNA的任何区段在本发明的范围内。另外，包含与本段中描述的任何序列互补的序列的任何多核苷酸都在本发明的范围内。
本发明提供了示例性DNA分子，其可以用作用于检测样品中包含事件MON 95379DNA的源自玉米植物的DNA的存在的引物或探针。这样的引物或探针对于靶核酸序列有特异性，且因此适用于通过本文所述的本发明方法鉴定玉米事件MON 95379核酸序列。
“探针”是与靶核酸链互补并且适用于杂交方法中的核酸分子。探针可以连接常规的可检测标记或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。此类探针与靶核酸链互补，并且在本发明的情况下，与来自事件MON 95379的DNA链互补，无论是来自含有事件MON 95379的植物还是来自包括事件MON 95379 DNA的样品。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括聚酰胺和其他与靶DNA序列特异性结合并且可用于检测该靶DNA序列的存在的探针材料。适用作检测玉米事件MON 95379的探针的示例性DNA序列提供为：SEQ ID NO:17(PB10269)、SEQ ID NO:23(PB50340)、SEQ ID NO:26(PB50138)。
“引物”通常是设计用于涉及热扩增的特定退火或杂交方法中的DNA分子。一对引物可与模板DNA(诸如玉米基因组DNA样品)一起用于热扩增(诸如聚合酶链式反应(PCR))中，以产生扩增子，其中由该反应产生的扩增子将具有对应于位于引物与模板杂交的两个位点之间的模板DNA序列的DNA序列。
引物通常被设计成与互补的靶DNA链杂交以在引物与靶DNA链之间形成杂交体，并且引物的存在是聚合酶的识别点，从而使用靶DNA链作为模板开始引物的延伸(即，将另外的核苷酸聚合成延长的核苷酸分子)。引物对是指通常在热扩增反应或其他常规的核酸扩增方法中，使用结合双链核苷酸区段的相反链的两个引物，来线性扩增引物对的个别成员所靶向结合的位置之间的多核苷酸区段。适用作引物的示例性DNA分子提供为SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
引物对SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16适用作第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，并且两者均具有足够长的SEQ ID NO:10的连续核苷酸用作DNA引物，当它们与来源于玉米事件MON 95379的模板DNA一起用于热扩增反应时，可产生可诊断样品中的玉米事件MON 95379 DNA的扩增子。引物对SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22适用作第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，并且两者均具有足够长的SEQ ID NO:10的连续核苷酸用作DNA引物，当它们与来源于玉米事件MON 95379的模板DNA一起用于热扩增反应时，可产生可诊断样品中的玉米事件MON 95379 DNA的接合性的扩增子。引物对SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25适用作第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，并且两者均具有足够长的SEQ ID NO:10的连续核苷酸以用作DNA引物，当它们与来源于玉米事件MON95379的模板DNA一起用于热扩增反应时，可产生可诊断样品中的玉米事件MON 95379 DNA的接合性的扩增子。引物对SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19适用作第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，并且两者均具有足够长的在玉米基因组内的基因座的连续核苷酸以用作DNA引物，当它们与来源于玉米事件MON 95379的模板DNA一起用于热扩增反应时，可产生充当内部对照的扩增子，既用于诊断玉米事件MON 95379，也用于诊断样品中的玉米事件MON 95379 DNA的接合性。
DNA探针和DNA引物的长度通常是十一(11)或更多个多核苷酸，经常是十八(18)或更多个多核苷酸、二十四(24)或更多个多核苷酸、或三十(30)或更多个多核苷酸。选择此类探针和引物，使其具有足够的长度以在高严格的杂交条件下特异性地与靶序列杂交。优选地，尽管可以通过常规方法设计与靶序列不同的保留与靶序列杂交的能力的探针，但是根据本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列相似性。
本发明的核酸探针和引物在严格的条件下与靶DNA分子杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可用于鉴定样品中来自转基因植物的DNA的存在。多核酸分子也称为其核酸区段或片段，在某些情况下，能够与其他核酸分子特异性杂交。
如本文所用，如果两个多核酸分子能够形成反平行的双链核酸结构，则这两个分子被称为能够彼此特异性地杂交。一个核酸分子被称为与另一个核酸分子“互补”，如果它们展现出完全的互补性的话。如本文所用，当一个分子的每个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则这些分子被称为展现“完全互补性”。如果两个分子能够以足够的稳定性彼此杂交以允许它们在至少常规的“低严格性”条件下保持彼此退火，则这些分子被称为是“最小互补的”。类似地，如果分子能够以足够的稳定性彼此杂交以允许它们在常规的“高严格性”条件下保持彼此退火，则这些分子被称为是“互补的”。常规的严格条件由Sambrook等人,1989和由Haymes等人在Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRLPress,Washington,DC(1985)中描述。因此，允许偏离完全互补，只要这样的偏离不完全排除分子形成双链结构的能力即可。为了使核酸分子用作引物或探针，仅需在序列上足够互补以便能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
如本文所用，大体上同源的序列是在高严格性条件下将与同其比较的核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。促进DNA杂交的适当严格条件，例如，在约45℃下6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在50℃下2.0×SSC洗涤，对于本领域技术人员是已知的或可见于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自50℃下约2.0×SSC的低严格性至50℃下约0.2×SSC的高严格性。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温约22℃下的低严格条件升至约65℃下的高严格条件。温度和盐都可以改变，或者温度或盐浓度中的任一个可以保持恒定，而另一个变量可以改变。在一个优选的实施方案中，本发明的多核酸将与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中列出的核酸分子中的一个或多个或其互补序列或其片段在中等严格的条件下，例如在约2.0x SSC和约65℃下特异性杂交。在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸将与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中列出的核酸分子中的一个或多个或其互补序列或片段在高严格的条件下特异性杂交。在本发明的一个方面，本发明的优选标记核酸分子具有SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10中列出的核酸序列或其互补序列或其片段。可以通过本领域技术人员已知的许多方法来检测探针与靶DNA分子的杂交，这些方法可以包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
关于使用特定扩增引物对的靶核酸序列的扩增(例如通过PCR)，“严格的条件”是允许引物对仅与结合了具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物的靶核酸序列杂交并且优选在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物(即扩增子)的条件。
术语“对(靶序列)具有特异性”指示探针或引物在严格的杂交条件下仅与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。
如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”是指针对作为多核酸模板的一部分的靶多核酸分子的多核酸扩增方法的产物。例如，为了确定由有性杂交产生的玉米植物是否含有来自包含本发明的事件MON95379的玉米植物的转基因植物基因组DNA，可以使用引物对将从玉米植物组织样品中提取的DNA进行多核酸扩增方法，该引物对在侧接事件MON 95379的异源插入DNA的区域中包括第一引物，该第一引物源自基因组DNA序列并在插入DNA的方向上被聚合酶5′至3′延伸。第二引物源自异源插入的DNA分子，并在第一引物所源自的侧翼基因组DNA的方向上被聚合酶5’至3'延伸。扩增子的长度可以在以下范围内：引物对的总长度加上一个核苷酸碱基对、或者加上约五十个核苷酸碱基对、或者加上约二百五十个核苷酸碱基对、或者加上约四百五十个核苷酸碱基对或者更多。或者，引物对可以源自插入的异源DNA两侧的基因组序列，以产生包含整个插入多核苷酸序列的扩增子(例如，从SEQ ID NO:10的5'端的基因组部分中分离的正向引物和从SEQ ID NO:10的3′端的基因组部分中分离的反向引物，这些引物扩增包含本文在事件MON 95379基因组中所鉴定的插入的DNA序列(SEQ ID NO:9)的DNA分子)。源自与插入的转基因DNA相邻的植物基因组序列的引物对的成员与插入的DNA序列相距一定距离，此距离的范围可在一个核苷酸碱基对至约两万个核苷酸碱基对内。术语“扩增子”的使用特别排除了可能在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
出于实用目的，应该设计引物，以产生有限大小范围(例如100至1000个碱基)的扩增子。通常，尺寸较小的(较短的多核苷酸长度)的扩增子可以在热扩增反应中更可靠地产生，允许较短的循环时间，并且可以轻易地在琼脂糖凝胶上分离和观察，或适用于终点样测定。较小的扩增子可以通过DNA扩增子检测领域中已知的方法来产生和检测。另外，使用引物对产生的扩增子可以被克隆到载体中，繁殖，分离和测序，或者可以直接用本领域中充分确定的方法进行测序。本发明的一方面是源自SEQ ID NO:11与SEQ IDNO:9的组合或SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:9的组合的任何引物对，其适用于DNA扩增方法中以产生可诊断事件MON 95379或其后代的扩增子。本发明的一方面是包含SEQ ID NO:11的至少15个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子，其适用于DNA扩增方法中以产生可诊断事件MON 95379或其后代的扩增子。本发明的一方面是包含SEQID NO:12的至少15个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子，其适用于DNA扩增方法中以产生可诊断包含事件MON 95379或其后代的植物的扩增子。本发明的一方面是包含SEQ ID NO:9的至少15个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子，其适用于DNA扩增方法中以产生可诊断事件MON 95379或其后代的扩增子。
多核酸扩增可以通过本领域已知的各种多核酸扩增方法中的任一种来完成，包括聚合酶链式反应(PCR)。扩增方法是本领域已知的且尤其描述于美国专利第4,683,195号和第4,683,202号以及PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,编者Innis等人,Academic Press,San Diego,1990中。已经开发了PCR扩增方法以扩增高达22kb(千碱基)的基因组DNA和高达42kb的噬菌体DNA(Cheng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5695-5699,1994)。这些方法以及DNA扩增领域中已知的其他方法可用于实施本发明。来自玉米事件MON 95379的异源DNA插入序列或侧翼基因组DNA序列可以通过以下方法来验证(并在必要时进行校正)：使用源自本文提供的序列的引物扩增含有事件MON 95379 DNA的玉米种子或由含有事件MON 95379 DNA的玉米种子生长的玉米植物中的此类DNA分子，该事件MON95379 DNA以登录号PTA-125027寄存于ATCC；接着进行PCR扩增子或其克隆的DNA片段的标准DNA测序。
通过这些方法产生的诊断性扩增子可以通过多种技术来检测。一种这样的方法是Genetic Bit Analysis(Nikiforov,等人.Nucleic Acid Res.22:4167-4175,1994)，其中设计了DNA寡核苷酸，该寡核苷酸与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列都重叠。寡核苷酸被固定在微量滴定板的孔中。在对目标区域进行PCR(使用插入序列中的一个引物和相邻侧翼基因组序列中的一个引物)之后，单链PCR产物可以与固定的寡核苷酸杂交，并用作使用DNA聚合酶和对预期的下一个碱基有特异性的标记双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)进行的单碱基延伸反应的模板。读数可以是基于荧光的或基于ELISA的。信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，转基因/基因组序列存在。
另一种方法是由Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所述的焦磷酸测序技术。在这种方法中，设计了一种寡核苷酸，该寡核苷酸与相邻的基因组DNA和插入的DNA连接重叠。寡核苷酸与来自目标区域(插入序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)的单链PCR产物杂交，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷酰硫酸和荧光素的存在下孵育。单独添加DNTP，且掺入产生被测量的光信号。光信号表明由于成功的扩增、杂交以及单碱基或多碱基延伸，转基因/基因组序列的存在。
Chen等人(Genome Res.9：492-498，1999)描述的荧光偏振是一种可用于检测本发明的扩增子的方法。使用这种方法，设计了一种寡核苷酸，该寡核苷酸与基因组侧翼和插入的DNA连接重叠。寡核苷酸与来自目标区域(插入的DNA中的一个引物和侧翼基因组DNA序列中的一个引物)的单链PCR产物杂交，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。掺入可以使用荧光计测量为极化的变化。极化的变化表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，转基因/基因组序列的存在。
实时聚合酶链式反应(PCR)是在PCR发生时(即实时)监测其进程的能力。在整个PCR过程中而不是在PCR结束时收集数据。在实时PCR中，反应的特征在于循环期间首次检测到靶标扩增时的时间点，而不是经过固定次数的循环后积累的靶标量。在实时PCR测定中，通过荧光信号的积累检测到阳性反应。核酸靶标的起始拷贝数越高，观察到的荧光明显增加越早。循环阈值(Ct值)被定义为荧光信号越过阈值(即超过背景水平)所需的循环数。Ct水平与样品中的靶核酸的量成反比(即，Ct值越低，样品中的靶核酸的量越大)。
(PE Applied Biosystems,Foster City,CA)被描述为一种使用实时PCR检测和定量DNA序列的存在的方法，并且在制造商提供的说明书中得到充分理解。简而言之，设计了一种FRET寡核苷酸探针，该探针与基因组侧翼和插入的DNA连接重叠。FRET探针和PCR引物(插入的DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环。FRET探针的杂交导致荧光部分的裂解和释放，使其远离FRET探针上的淬灭部分。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，转基因/基因组序列的存在。
已经描述了分子信标用于序列检测中，如Tyangi,等人.。(Nature Biotech.14:303-308,1996)中所述。简而言之，设计了一种FRET寡核苷酸探针，该探针与侧翼基因组和插入的DNA连接重叠。FRET探针的独特结构导致其包含二级结构，该二级结构使荧光和猝灭部分保持紧密相邻。FRET探针和PCR引物(插入的DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环。成功进行PCR扩增后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的去除以及荧光部分与淬灭部分的空间分离。产生荧光信号。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交，侧翼/转基因插入序列的存在。
基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒包含与靶DNA特异性杂交并在适当的反应条件下扩增诊断性扩增子的DNA引物分子。试剂盒可以提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或本领域已知的检测诊断性扩增子的许多方法。DNA检测试剂盒可以使用本文公开的组合物开发并且适用于鉴定样品中的玉米事件MON 95379 DNA，并且可以应用于对含有事件MON 95379DNA的玉米植物育种的方法。本发明的一个目标是一种试剂盒，其包含与SEQ ID NO:10中所列的玉米基因组区的任何部分和SEQ ID NO:10中所列的插入的转基因DNA的任何部分同源或互补的DNA引物。DNA分子可以用于DNA扩增方法(PCR)中或用作多核酸杂交方法(即，southern分析、northern分析)中的探针。本发明的试剂盒还可任选地包含用于进行本文所述的检测或诊断反应的试剂或说明书。
根据本发明的探针和引物可以与靶序列具有完全的序列同一性，尽管可以通过常规方法设计与靶序列不同的保留优先与靶序列杂交的能力的引物和探针。为了使核酸分子用作引物或探针，仅需在序列上足够互补以便能够在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可用于鉴定样品中来自玉米事件MON95379的转基因DNA的存在。探针和引物的长度通常为至少约11个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约24个核苷酸或至少约30个核苷酸或更长。此类探针和引物在严格的杂交条件下与靶DNA序列特异性杂交。常规的严格的条件由Sambrook等人.,1989和由Haymes等人.,在Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,DC(1985)中描述。
可以使用本领域技术人员众所周知的许多方法来分离和操纵本发明中公开的DNA分子或其片段，包括热扩增方法。DNA分子或其片段也可以通过其他技术获得，诸如通过化学方法直接合成片段，如通常通过使用自动寡核苷酸合成仪所实践的。
因此，本文提供的DNA分子和相应的核苷酸序列尤其适用于鉴定玉米事件MON95379，检测样品中源自转基因玉米事件MON 95379的DNA的存在，以及监测样品中玉米事件MON 95379或源自包含事件MON 95379的玉米植物的植物部分的存在和/或不存在。
本发明提供了玉米植物、玉米植物细胞、玉米种子、玉米植物部分(诸如花粉、胚珠、穗丝、穗、花药、穗轴、根组织、秆组织、叶组织)、玉米后代植物和玉米商品产品。这些玉米植物、玉米植物细胞、玉米种子、玉米植物部分、玉米后代植物和玉米商品产品含有可检测量的本发明的多核苷酸，例如，诸如具有提供为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列中的至少一个的多核苷酸。本发明的玉米植物、植物细胞、种子、植物部分和后代植物还可以含有一种或多种另外的转基因。这种另外的转基因可以是编码赋予所需性状的蛋白质或RNA分子的任何核苷酸序列，这些性状包括但不限于抗虫性提高、水分利用效率提高、产量表现提高、抗旱性提高、种子质量提高和/或除草剂耐受性提高。
本发明提供了玉米植物、玉米植物细胞、玉米种子、玉米植物部分(诸如花粉、胚珠、穗丝、穗、花药、穗轴、根组织、秆组织、叶组织)、玉米后代植物，它们源自含有事件MON95379 DNA的转基因玉米植物。含有事件MON 95379 DNA的玉米种子的代表性样品已根据布达佩斯条约寄存在美国菌种保藏中心ATCC信息库已将专利寄存名称PTA-125027分配给含有事件MON 95379 DNA的种子。
本发明提供了一种包含DNA分子的微生物，所述DNA分子具有至少一个选自在其基因组中存在的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列。这种微生物的一个实例是转基因植物细胞。微生物(诸如本发明的植物细胞)在许多工业应用中有用，这些应用包括但不限于：(i)用作科学探究或工业研究的研究工具；(ii)在培养中用于产生可用于后续科学研究或用作工业产品的内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质产品或小分子；及(iii)与现代植物组织培养技术结合使用，以产生可用于农业研究或生产的转基因植物或植物组织培养物。微生物(诸如转基因植物细胞)的生产和使用利用了现代微生物技术和人为干预，以产生人造的独特微生物。在此过程中，将重组DNA插入植物细胞的基因组中，以创建与天然存在的植物细胞分离且独特的转基因植物细胞。这种转基因植物细胞然后可以使用现代微生物技术像细菌和酵母细胞一样培养，并且可以未分化的单细胞状态存在。转基因植物细胞的新遗传组成和表型是将异源DNA整合到细胞基因组中而产生的技术效果。本发明的另一方面是一种使用本发明的微生物的方法。使用本发明的微生物诸如转基因植物细胞的方法包括：(i)通过将重组DNA整合到细胞基因组中，然后利用该细胞衍生出具有相同异源DNA的另外的细胞来产生转基因细胞的方法；(ii)使用现代微生物技术培养含有重组DNA的细胞的方法；(iii)从培养的细胞中产生和纯化内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质产物的方法；及(iv)将现代植物组织培养技术与转基因植物细胞一起使用以产生转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。
本发明的植物可以将事件MON 95379 DNA(包括玉米事件MON95379中插入的转基因)传给后代。如本文所用，“后代”包括任何植物、植物细胞、种子和/或可再生植物部分，其含有源自祖先植物的事件MON 95379 DNA和/或包含具有至少一个选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列的DNA分子。植物、后代和种子对于事件MON95379的转基因可为纯合的或杂合的。后代可以从含有玉米事件MON 95379的植物产生的种子和/或由用含有玉米事件MON 95379的植物的花粉受精的植物产生的种子生长。
后代植物可以是自花传粉的(也称为“自交”)，以产生真正的植物育种系，即对于转基因为纯合的植物。合适的后代的自交可以产生对于两个添加的外源基因都为纯合的植物。
或者，后代植物可以与另一种不相关的植物异型杂交，例如与之育种，以产生变种或杂交种子或植物。其他不相关的植物可以是转基因或非转基因的。因此，本发明的变种或杂交种子或植物可以通过以下方式获得：将缺乏玉米事件MON 95379的特异性和独特DNA的第一亲本与包含玉米事件MON 95379的第二亲本进行有性杂交，得到包含玉米事件MON95379的特异性和独特DNA的杂交种。每个亲本可以是杂交种或自交系/变种，只要杂交或育种产生本发明的植物或种子，即具有至少一个等位基因的种子，该等位基因含有玉米事件MON 95379的DNA和/或具有至少一个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列的DNA分子。因此，可以使两种不同的转基因植物杂交以产生杂交后代，该杂交后代包含两个独立分离的、添加的外源基因。例如，包含赋予玉米昆虫抗性的Cry1B.868和Cry1Da_7的事件MON 95379可以与其他转基因玉米植物杂交以产生具有两个转基因亲本的特征的植物。这方面的一个例子是使含有赋予玉米鳞翅目抗性的Cry1B.868和Cry1Da_7的事件MON 95379与具有一种或多种另外性状(诸如除草剂耐受性、昆虫抗性或干旱耐受性)的植物杂交，产生对鳞翅目昆虫害虫具有抗性并具有至少一种或多种另外性状的后代植物或种子。如同营养繁殖一样，还涵盖亲本植物的回交以及与非转基因植物的异型杂交。常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述可见于以下若干参考文献的一者中，例如，Fehr,Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.编著，American Society ofAgronomy,Madison WI(1987)。
本发明的植物、后代、种子、细胞和植物部分还可以包含一种或多种另外的玉米性状或转基因事件，特别是通过使包含玉米事件MON 95379的玉米植物与含有另外的性状或转基因事件的另一种玉米植物杂交而引入的那些。这样的性状或转基因事件包括但不限于昆虫抗性的提高、除草剂耐受性、水分利用效率提高、产量表现提高、抗旱性增加、种子质量提高、营养质量提高、杂交种子产生、或疾病或真菌抗性。玉米转基因事件是本领域技术人员已知的。例如，此类性状的列表由美国农业部(USDA)动植物健康检查服务(APHIS)提供，并且可以在其网站上找到：www.aphis.usda.gov。因此，可以通过使各自包含一个或多个转基因事件的两个亲本植物杂交，收集后代种子及选择包含两个或更多个转基因事件的后代种子或植物来在后代种子或植物中组合两个或更多个转基因事件。可以重复这些步骤，直到在后代中获得转基因事件的所需组合。如同营养繁殖一样，还涵盖亲本植物的回交以及与非转基因植物的异型杂交。
本发明提供了一种源自包含事件MON 95379的玉米植物的植物部分。如本文所用，“植物部分”是指植物的任何部分，其是由源自包含事件MON 95379的玉米植物的材料构成。植物部分包括但不限于花粉、胚珠、穗丝、穗、花药、穗轴、根组织、秆组织和叶组织。植物部分可以是存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。
本发明提供了一种商品产品，其源自包含事件MON 95379的玉米植物并且含有可检测量的对事件MON 95379有特异性的核酸。如本文所用，“商品产品”是指由源自含有玉米事件MON 95379 DNA的以下各物的材料构成的任何组合物或产品：玉米植物、完整或经过加工的玉米种子、或一个或多个植物细胞和/或植物部分。不能存活的商品产品包括但不限于不能存活的种子、完整或经过加工的种子、种子部分和植物部分；包含玉米的动物饲料、玉米油，玉米面、玉米粉、玉米片、玉米糠、用玉米制成的面食、玉米生物质以及使用玉米和玉米部分产生的燃料产品。存活的商品产品包括但不限于种子、植物和植物细胞。因此，包含事件MON 95379的玉米植物可用于制造通常从玉米中获取的任何商品产品。源自包含事件MON 95379的玉米植物的任何此类商品产品可含有至少可检测量的对应于玉米事件MON95379的特异性和独特DNA，并且具体来说可含有可检测量的多核苷酸，该多核苷酸包含具有至少一个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列的DNA分子。可以使用任何标准的核苷酸分子检测方法，包括本文公开的检测方法。如果在商品产品中存在任何可检测量的具有至少一个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列的DNA分子，则该商品产品在本发明的范围内。
本发明的玉米植物、玉米植物细胞、玉米种子、玉米植物部分(诸如花粉、胚珠、穗丝、穗、花药、穗轴、根组织、秆组织、叶组织)、玉米后代植物和商品产品因此尤其适用于种植植物，以产生用于农业目的包含玉米事件MON 95379的种子和/或植物部分，产生用于植物育种和研究目的包含玉米事件MON 95379的后代，与微生物技术一起用于工业和研究应用以及销售给消费者。
提供了用于产生抗虫玉米植物的方法，所述抗虫玉米植物包含对本发明的事件MON 95379特异且独特的DNA序列。这些方法中使用的转基因植物对于转基因可为纯合的或杂合的。通过这些方法产生的后代植物可以是变种或杂交种植物；可以由含有玉米事件MON95379的植物产生的种子和/或由含有玉米事件MON 95379的植物的花粉受精的植物产生的种子生长；并且对于转基因可为纯合的或杂合的。后代植物可随后进行自花授粉，以产生真正的植物育种系，即对于转基因为纯合的植物，或者可以与另一种不相关的植物异型杂交，例如育种，以产生变种或杂交种子或植物。
提供了检测样品中源自包含玉米事件MON 95379的玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物的DNA的存在的方法。一种方法包括(i)从至少一种玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物中提取DNA样品；(ii)使DNA样品与至少一个能够在适合DNA测序的条件下产生对事件MON 95379 DNA特异性DNA序列的引物接触；(iii)进行DNA测序反应；然后(iv)确认该核苷酸序列包含其中所包含的构建体的对事件MON 95379具有特异性的核苷酸序列，诸如选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的组的核苷酸序列。另一种方法包括(i)从至少一种玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物中提取DNA样品；(ii)使DNA样品与能够在适合DNA扩增的条件下从事件MON 95379DNA产生扩增子的引物对接触；(iii)进行DNA扩增反应；然后(iv)检测扩增子分子和/或确认扩增子的核苷酸序列包含对事件MON95379具有特异性的核苷酸序列，诸如选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10组成的组的核苷酸序列。扩增子应为对事件MON 95379具有特异性的扩增子，诸如包含SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ IDNO:5、或SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10的扩增子。在扩增子中检测到对事件MON 95379具有特异性的核苷酸序列可确定和/或可诊断样品中玉米事件MON 95379特异性DNA的存在。能够在适合DNA扩增的条件下从事件MON95379 DNA产生扩增子的引物对的一个实例提供为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。其他引物对可以由本领域技术人员容易地设计，并且将产生包含SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7、或SEQ IDNO:8的扩增子，其中这样的引物对包含侧接插入物的基因组区内的至少一个引物和在插入物内的第二引物。检测样品中源自包含玉米事件MON 95379的玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物的DNA的存在的另一种方法包括：(i)从至少一种玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物中提取DNA样品；(ii)使DNA样品与对事件MON 95379 DNA具有特异性的DNA探针接触；(iii)使探针和DNA样品在严格的杂交条件下杂交；然后(iv)检测探针与靶DNA样品之间的杂交。对事件MON95379具有特异性的DNA探针的序列的一个实例提供为SEQ ID NO:17。其他探针可以由本领域技术人员容易地设计，并且将包含侧接插入物的基因组DNA的至少一个片段和插入物DNA的至少一个片段，诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10中提供的序列。探针与DNA样品杂交的检测可诊断样品中玉米事件MON 95379特异性DNA的存在。杂交的缺乏可替代地可诊断样品中玉米事件MON 95379特异性DNA的缺乏。
提供了DNA检测试剂盒，其适用于鉴定样品中的玉米事件MON95379 DNA，并且也可用于对含有适当事件DNA的玉米植物育种的方法。此类试剂盒包含DNA引物和/或探针，该引物和/或探针包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的片段。这种试剂盒的一个实例包括至少一个具有足够长度的SEQ ID NO:10的连续核苷酸的DNA分子，以用作DNA探针，该DNA探针适用于检测源自包含事件MON 95379的转基因玉米植物的DNA在样品中的存在和/或不存在。源自包含事件MON95379的转基因玉米植物的DNA将包含具有至少一个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列的DNA分子。提供了足以用作DNA探针的DNA分子，其适用于确定、检测或诊断样品中玉米事件MON 95379 DNA的存在和/或不存在，如SEQ ID NO:17所提供。其他探针可以由本领域技术人员容易地设计，并且将包含SEQ ID NO:10的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个或至少40个连续核苷酸，并且对于玉米事件MON95379 DNA而言足够独特，以便鉴定源自该事件的DNA。
另一类试剂盒包括用于产生扩增子的引物对，所述扩增子适用于检测样品中源自转基因玉米事件MON 95379的DNA的存在和/或不存在。这样的试剂盒将采用一种方法，该方法包括使靶DNA样品与本文所述的引物对接触，然后进行足以产生包含具有至少一个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列的DNA分子的扩增子的核酸扩增反应，然后检测扩增子的存在和/或不存在。这样一种方法还可以包括对扩增子或其片段进行测序，这将确定，即可诊断靶DNA样品中玉米事件MON 95379特异性DNA的存在。其他引物对可以由本领域技术人员容易地设计，并且应包含在但不限于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10中提供的序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个连续核苷酸序列，并且对于玉米事件MON 95379 DNA而言足够独特，以便鉴定来源于事件的DNA。
本发明的试剂盒和检测方法尤其适用于鉴定玉米事件MON 95379，选择包含玉米事件MON 95379的植物变种或杂交种，检测源自包含事件MON 95379的转基因玉米植物的DNA在样品中的存在，及监测样品中包含事件MON 95379的玉米植物或源自包含事件MON95379的玉米植物的植物部分的存在和/或不存在。
来自玉米事件MON 95379的异源DNA插入物、连接序列或侧翼序列可以通过以下方式进行验证(并在必要时校正)：使用源自本文提供的序列的引物从事件中扩增此类序列，然后对扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序。
提供了检测样品中源自包含玉米事件MON 95379的玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物的DNA的转基因等位基因的接合性的方法。一种方法包括(i)从至少一种玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物中提取DNA样品；(ii)使DNA样品与能够产生可诊断事件MON 95379的第一扩增子的引物对接触；(iii)使DNA样品与引物对接触，该引物对能够产生诊断不包含事件MON 95379的天然玉米基因组DNA的第二扩增子；(iv)进行DNA扩增反应；然后(v)检测扩增子，其中仅第一扩增子的存在可诊断样品中的纯合事件MON 95379 DNA，并且第一扩增子和第二扩增子两者的存在可诊断对于事件MON 95379等位基因为杂合的玉米植物。引物对的示例性组呈现为：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，其产生可诊断事件MON95379的扩增子；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27，其产生可诊断不包含事件MON 95379的非插入野生型玉米基因组DNA的扩增子。也可以将探针组掺入到这样一种扩增方法中，以待使用上述引物对组用于实时PCR形式中。探针的示例性组呈现为SEQ ID NO:17(可诊断事件MON 95379的扩增子)和SEQ ID NO:28(可诊断不包含事件MON 95379的野生型玉米基因组DNA的扩增子)。
用于确定接合性的另一种方法包括：(i)从至少一种玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物中提取DNA样品；(ii)使DNA样品与探针组接触，该探针组含有与事件MON95379 DNA特异性杂交的至少第一探针和与被事件MON 95379的异源DNA的插入而中断的玉米基因组DNA特异性杂交而不与事件MON 95379 DNA杂交的至少第二探针；(iii)在严格的杂交条件下使探针组与样品杂交，其中检测到仅第一探针在杂交条件下的杂交可诊断样品中事件MON 95379DNA的纯合等位基因；且其中检测到第一探针和第二探针两者在杂交条件下的杂交可诊断DNA样品中事件MON 95379的杂合等位基因。
用于确定接合性的又一种方法包括：(i)从至少一种玉米细胞、玉米组织、玉米种子或玉米植物中提取DNA样品；(ii)使DNA样品与能够产生编码Cry1B.868或Cry1Da_7的毒素编码序列之一的扩增子的引物对接触；(iii)使DNA样品与引物对接触，该引物对能够产生在玉米植物中已知为单拷贝且纯合的内部标准的扩增子；(iv)使DNA样品与探针组接触，该探针组包含与编码Cry1B.868或Cry1Da_7的毒素编码序列之一特异性杂交的至少第一探针和与在玉米植物中已知为单拷贝且纯合的内部标准基因组DNA特异性杂交的至少第二探针；(v)使用实时PCR进行DNA扩增反应，并确定对应于毒素编码序列和单拷贝、纯合内部标准的扩增子的循环阈值(Ct值)；(vi)计算单拷贝、纯合内部标准扩增子的Ct值与毒素编码序列扩增子的Ct值之间的差值(ΔCt)；以及(vii)确定接合性，其中约零(0)的ΔCt指示插入的T-DNA的纯合性，而约一(1)的ΔCt指示插入的T-DNA的杂合性。杂合与纯合事件由约一(1)的ΔCt值单位区分。鉴于实时PCR中观察到的正常变异性是由于多种因素诸如扩增效率和理想的退火温度，“约一(1)”的范围被定义为0.75至1.25的ΔCt。用于上述确定接合性的方法的引物对和探针可以从Cry1B.868编码序列和内部标准扩增和检测扩增子，或从Cry1Da_7编码序列和内部标准扩增和检测扩增子。用于检测与Cry1B.868编码序列和内部标准相对应的扩增子的示例性引物对呈现为SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19的组合(内部标准)和SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22的组合(Cry1B.868)。随附的示例性探针呈现为SEQ IDNO:20(内部标准)和SEQ ID NO:23(Cry1B.868)。用于检测与Cry1Da_7编码序列和内部标准相对应的扩增子的示例性引物对呈现为SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19的组合(内部标准)和SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:25的组合(Cry1Da_7)。随附的示例性探针呈现为SEQ ID NO:20(内部标准)和SEQ ID NO:26(Cry1Da_7)。
寄存信息
根据布达佩斯条约，包含事件MON 95379的代表性玉米种子样品于2018年4月20日寄存于美国菌种保藏中心(ATCC)，地址在10801University Boulevard,Manassas,Virginia USA,Zip Code 20110，并分配ATCC登录号PTA-125027。在申请待决期间，专利和商标局专员以及由该局专员确定有权应要求获得授权的人员可以使用所述寄存物。专利发布后，对公众可获得性的所有限制将不可撤销地解除。寄存物将保存在寄存所里，为期三十(30)年或最后一次要求后的五(5)年或者专利的有效期(以较长者为准)，并将在此期间根据需要进行更换。
实施例
包括以下实施例以便更全面地描述本发明。总结了一百二十五(125)个构建体的构建和测试，约一万零七百八十五(10,785)个事件的产生(概念验证和商业证明)以及六(6)年间对数十万个单株植物通过为创建和选择玉米事件MON 95379所需的严格分子、农艺和田间测试进行的分析。
实施例说明本发明的某些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的在本发明实践中发挥良好作用的技术，且因此可以被认为构成本发明实践的优选模式的实例。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。
实施例1
表达盒测试、构建体设计、植物测试和构建体选择
植物中的转基因表达受许多不同因素的影响。必须找到杀虫蛋白和驱动植物中的表达的不同表达元件的正确组合，同时又不会导致表型偏离。此外，除了表达元件本身及其在盒中的组合和取向以外，已知转基因在植物中的表达受染色体插入位置的影响，这可能是由于染色质结构(例如异染色质)或转录调控元件(例如，增强子)靠近整合位点(KurtWeising等人,(1988)Foreign genes in plants:transfer,structure,expression andapplications.Annu.Rev.Genet.22:421-77)。例如，已经观察到在植物和其他生物体中，在具有不同染色体插入位置的事件中，来自相同构建体的引入基因的表达水平可能存在很大差异。不同染色体插入位置也可能在表达的空间或时间模式上产生差异，这可能与由引入的基因构建物中存在的转录调控元件所期望的模式不符。
由于这些原因，通常有必要创建和筛选大量构建体和转化事件，以鉴定构建体，然后是一个事件，该事件证明所引入的目标基因的最佳表达，同时又不产生农艺或表型异型。
由于这些原因，包含杀虫蛋白的转基因玉米植物的开发需要广泛的研究、开发和分析，所述杀虫蛋白对鳞翅目有活性而对农艺学、产量或堆垛可行性没有任何负面影响。具体而言，在六(6)年的时间里，开发、测试和分析了大约一万零七百八十五(10,785)个概念验证和商业转基因事件，它们源自一百二十五(125)个不同的质粒载体构建体。
此实施例描述在玉米植物中设计和测试一百二十五(125)个不同的构建体，以鉴定用于事件创建的优选构建体。每个构建体在杀虫蛋白和转录调控元件的编码序列方面有所不同。已进行测试以选择用于在植物中表达杀虫蛋白的最佳构建体。每个构建体具有独特的构型，随表达盒组成(杀虫蛋白和表达元件两者)、取向以及蛋白质是否靶向叶绿体而变化。
在初步的概念验证和开发阶段，一百一十七(117)个构建体包含二十六个(26)个不同启动子、二十六个(26)个不同内含子和十(10)个不同昆虫毒素编码序列的不同组合，将这些构建体用于产生大约六千(6,000)个转化事件。在对转基因的存在进行初步分子表征后，选择了五千零五十二(5,052)个单拷贝和双拷贝转化的玉米事件用于进一步的表征和功效测试。关于以下方面对这些事件进行了评估：表型或农艺异型、昆虫毒素蛋白的表达水平以及对选定的鳞翅目昆虫害虫种的功效。将所得功效和蛋白质表达数据以及有关表型和农艺异型的任何信息用于消除无效蛋白质、表达元件和组合，并且用于设计较少量的二元商业转化质粒构建体以用于下一个开发阶段。
在下一个开发阶段中，创建了八(8)个新构建体。这些构建体包含不同取向(收敛或发散)的两(2)至四(4)种昆虫毒素转基因表达盒的组合。将这八(8)个构建体用于生成总共五千七百三十三(5,733)个转化事件(也称为“转化体”)。在培养物中形成芽后，根据视觉特征和早期分子分析选择转化事件的子集。总共选择了八百二十三(823)个转化事件，并将其移植到盆中并进行种植以供进一步研究。
关于以下方面对所得的R0代转化事件进行分析：针对选定鳞翅目物种的功效、毒素蛋白表达、植物健康、种子返回以及表型和农艺异型。还从分子上表征了R0代事件，以确保盒完整及在玉米基因组中的正确插入。由于未能通过农艺分析和分子表征测试，因此许多事件被从测试中删除。另外，在此R0阶段，八(8)个构建体中的一(1)个从进一步的研究中被删除，因为它产生了表型偏离的事件。除这些农艺学问题外，进行的后续作用模式(“MOA”)研究表明，此构建体中包含的昆虫毒素蛋白证明MOA与市售的蛋白质重叠。
作用模式研究是针对八(8)个构建体中的四(4)个所共有的一种昆虫蛋白进行的。这些研究表明，此昆虫蛋白与市售蛋白具有重叠的MOA。表现出与目前使用的商业杀虫蛋白相似或重叠的MOA的蛋白是不可取的，因为它会发展出抗性，这可能会使具有相似MOA的蛋白对昆虫群无效。这样，这四(4)个构建体以及由此产生的事件被删除。如前所述，四(4)个删除的构建体中的一(1)个在R0阶段也产生了表型偏离的事件。
在下一个开发阶段中，在F1(杂合杂交种)/R1(纯合自交系)和R2代中进一步评估了来源于剩余四(4)个构建体的一百五十(150)个事件的功效、种子返回和分离、表型和农艺异型以及进一步的分子表征。剩余的四(4)个构建体中的两(2)个构建体在此阶段由于无法满足一个或多个进展标准而从进一步的研究中删除，留下来源于(2)个构建体的事件以供进一步评估。
关于以下方面将七十七(77)个事件(四十一(41)个事件来源于用于产生事件MON95379的构建体(“构建体MON95”)，而三十六(36)个事件来源于另一个构建体(“构建体1”))作为R2自交系和F1杂交种进行评估：功效、种子返回和分离、表型和农艺异型以及进一步的分子表征。根据这些评估结果，将与构建体1相关的事件的优先级降低，搁置并存储。
因此，对各种构建体进行的多轮测试和比较揭示，提供为SEQ ID NO:13的转基因盒(即构建体MON95)是对抗鳞翅目害虫种秋夜蛾(FAW，草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(CEW，棉铃虫)、西南玉米蛀虫(SWCB，西南玉米螟)、甘蔗蛀虫(SCB，蔗螟)和小玉米秆蛀虫(LSCB，小玉米螟)的功效的最佳选择，具有最佳的分子表征和农艺学表现。
表2示出了衍生的(“插入的”)转化事件的数量、选择用于作为R0事件生长的(“移植的”)转化事件的数量以及在评估、研究和开发过程(这导致了构建体MON95的选择)中删除各个构建体的点。
表2.事件构建体选择
实施例2
田间试验、分子测试和事件选择
本实施例描述了在数年内在多个位置处用构建体MON95创建的事件的田间试验中的分子表征、分析和测试，由此导致最终事件MON95379的选择。
表3示出了用于选择最终事件MON 95379的过程。在商业转化R0筛选时，从构建体MON95衍生出两百一十(210)个R0转化事件，并选择其进行生长。在最初的两百一十(210)个选定R0转化事件中，一百四十七个事件(147)由于功效、蛋白质表达、种子返回和植物健康、或分子表征的问题而被删除。余下的六十三(63)个事件需要在下一个开发阶段(F1筛选和R1育苗阶段)进行分析和测试。在此阶段，由于温室测试中的功效问题，删除了十一(11)个事件。由于从育苗返回的种子不足和/或所得种子的分离分析，另外三(3)个事件被删除。最后，由于分子表征中发现的问题而去除了另外五(5)个事件，并且由于分子southern分析中发现的问题而去除了三(3)个事件，留下了四十一(41)个事件供下一代测定。在测试的R2/F1阶段，由于在进一步的分子southern表征中发现的问题，剩下的四十一(41)个事件中有两(2)个被删除，留下了三十九(39)个事件。
其余的三十九(39)个事件在两个不同的同时并行测试阶段进展：1)进一步的田间试验；2)选择盒的Cre切除和黄金标准种子的产生。在这些同时并行测试阶段的每个中都删除了事件。
在Cre切除期间，由于草甘膦选择盒的cre切除后在分子表征中发现的问题，因此删除了十一(11)个事件。此外，由于在黄金标准种子产生过程中在分子表征中发现的问题，另外六(6)个事件被删除。
在同时进行的田间测试期间，基于从2016US Field Trails收集的数据，由于功效问题而删除了另外四(4)个事件，并且由于农艺方面的考虑而删除了另外十二(12)个事件。然后，根据从Brazil田间试验收集的数据，由于功效问题而删除了另一个事件。接下来，在2017U.S.田间试验期间进行的生物信息学分析导致从进一步的测试中又除去了另外三(3)个事件，剩下两个事件：事件1和MON 95379。在对来自美国、巴西、阿根廷和波多黎各的多个田间试验的事件的农艺学进行进一步分析后，选择事件MON 95379作为商业化事件，因为当比较每个事件的分子表征、蛋白质表达、功效和农艺学的所有特征时，该事件的排名都高于事件1。
表3.MON 95379事件选择。
实施例3
玉米事件MON 95379中草甘膦选择盒的Cre切除
此实施例描述了通过体内Cre切除从玉米事件MON 95379中除去草甘膦选择盒。将草甘膦选择盒用于选择转化的事件。通过除去选择盒，创建了“无标记”事件，其中仅杀虫蛋白表达盒保留在最终事件中。
图3示出了用于生成无标记事件MON 95379玉米事件的育种过程。使用农杆菌介导的转化过程，用构建体MON95(呈现为SEQ ID NO:13，如图2所示)转化玉米品种LH244未成熟胚。构建体MON95包含三(3)个表达盒：两(2)个表达盒用于表达杀虫蛋白Cry1B.868和Cry1Da_7，而单个盒用于使用草甘膦选择来选择转化的植物细胞。选择盒的两侧均侧接LoxP Cre重组酶识别位点。
转化后，将R0转化体自花授粉两(2)代，在此期间，根据各种测定，诸如功效、蛋白质表达、种子返回和植物健康以及分子表征，除去了许多事件。到R2代，从最初的二百一十(210)个事件中保留三十九(39)个事件。将三十九(39)个纯合R2代事件与表达Cre重组酶的转化玉米植物的优良品系育种，该Cre重组酶来源于肠杆菌噬菌体P1。
使R2代事件与表达Cre重组酶的植物育种的这一阶段被鉴定为“Cre杂交”。具体而言，在此阶段中，将对于SEQ ID NO:13为纯合的去雄穗的(雌性)R2代植物与对用于表达Cre重组酶的转基因盒为纯合的转基因玉米植物(雄性)进行异花授粉。表达Cre重组酶的雄性供体花粉落在包含SEQ ID NO:13的雌性植物的穗丝组织上后发芽。花粉管进入胚囊后，花粉管破裂，释放表达Cre重组酶的雄性供体的两个精子。一个精子的核与卵核融合，形成合子。另一个精子核与两个极核之一融合，继而又与另一个极核融合，从而建立初生胚乳核。
因此，在使用表达Cre重组酶的植物作为雄性花粉供体时，随着细胞分裂并发育成为玉米粒(即，种子)，所得杂交的胚和胚乳都将表达Cre重组酶。Cre重组酶结合至LoxP位点中的反向重复序列，并催化侧接表达盒的两个LoxP位点的八碱基对间隔区中的交换，导致标记盒的切除，其中一个LoxP位点由于重组而保留在整合的T-DNA中(参见图2，“Cre切除后插入的T-DNA”)。
由于不存在CP4选择盒而选择了由Cre杂交产生的F1后代，并使其自花授粉。通过此过程，两个等位基因(Cre重组酶等位基因和用于生成事件MON 95379的T-DNA等位基因)在所得的F2群体中分离，产生对于一个或两个等位基因为纯合或杂合的后代。
选择显示出Cre重组酶等位基因的不存在和SEQ ID NO:9(Cre切除后的转基因插入的T-DNA)的纯合性的F2后代。这些选定的F2后代是自花授粉的，产生对于SEQ ID NO:9为纯合的F3代。
进一步的自花授粉产生F3后代种子(F4种子)，测定其纯度，并指定为“黄金标准种子”。F4是第一代黄金标准种子。
草甘膦选择标记盒的切除不影响Cry1B.868和Cry1Da_7的表达。通过Cre切除从玉米事件MON 95379中除去草甘膦选择盒提供了对鳞翅目害虫具有抗性的转基因玉米事件，而在最终事件中不会增加对草甘膦的耐受性。这种“无标记”事件确保在与其他玉米转基因事件一起构建玉米育种复合时提供灵活性，以提供并入了事件MON 95379的多种产品，并允许在最终育种复合中提供更多性状的多种选择。
实施例4
玉米事件MON 95379表现出对鳞翅目昆虫害虫秋夜蛾、玉米穗蛾、西南玉米蛀虫、甘蔗蛀虫的抗性
此实施例描述了MON 95379事件对鳞翅目昆虫害虫的活性。昆虫毒素蛋白Cry1B.868和Cry1Da_7在玉米事件MON 95379中一起表达时，可抵抗秋夜蛾(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(棉铃虫)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)和甘蔗蛀虫(蔗螟)。
转化并插入构建体MON95之后，选择了四十一(41)个R0事件来使用叶盘进行生物测定。使用植物叶盘的生物测定类似于美国专利第8,344,207号中所述的方法来进行。使用未转化的LH244玉米植物获得有待用作阴性对照的组织。将包含每孔中每个叶盘有一个昆虫的孔的平板孵育三(3)天。三(3)天后，检查平板。如果阴性对照中有至少百分之五十(50％)的叶盘被消耗，则对转基因事件叶盘进行测量。如果阴性对照中有小于百分之五十(50％)的叶盘尚未被消耗，则允许昆虫继续进食直至达到百分之五十(50％)的目标。测量了每个孔的叶损害(“叶损害等级”或“LDR”)和死亡率。确定每个量度的平均值。叶损害等级的范围在一(1)至十一(11)内，反映了已消耗的叶盘的百分比。表4显示了用于R0叶盘测定的叶损害等级量度。在此等级量度上，阴性对照的LDR始终为至少10。
表4.R0叶盘测定的叶损害等级(LDR)量度。
表5显示了用构建体MON95转化的四十一(41)个事件(包括MON 95379事件)的平均叶损害等级。从表5中可见，两种杀虫蛋白Cry1B.868和Cry1Da_7的表达提供了对秋夜蛾(FAW)、玉米穗蛾(CEW)和西南玉米蛀虫(SWCB)的抗性。阴性对照的LDR在10与11之间。与阴性对照相比，FAW和SWCB仅消耗大约百分之五(5％)的事件MON 95379叶盘，而阴性对照消耗至少百分之五十(50％)的叶盘。关于CEW，仅消耗了约6.25％的叶盘，相比之下，阴性对照消耗至少百分之五十(50％)的叶盘。此外，在消耗含有事件MON 95379的叶盘后，百分之一百(100％)的FAW和CEW被杀死。
表5.表达Cry1B.868和Cry1Da_7的R0植物的平均叶损害等级(LDR)得分和平均死亡率。
/>
使四十一(41)个事件与非转基因93IDI3品种植物进行杂交。选择了包含构建体MON95的F1杂合后代植物。在温室中，针对每个昆虫害虫种，分别就每个事件对约五(5)株F1植物进行人工侵染。关于FAW，大约有四十(40)个新生虫用于侵染处于V6至V8轮生阶段的每株F1植物。关于SWCB，大约有三十(30)个新生虫用于侵染处于V6至V10轮生阶段的F1植物。侵染后约十四(14)天就FAW和SWCB对叶损害进行测量。表6和表7显示了用于评估叶损害的损害等级量度。
表6.受FAW侵染的玉米植物的叶损害等级量度。
/>
表7.受SWCB侵染的玉米植物的叶损害等级量度。
还评估了SWCB侵染的F1植物对由SWCB造成的秆穿孔长度。为了确定秆穿孔的长度，将玉米植物的玉米秆在大致眼睛水平处折断，并将顶部用于检查穿孔损害。用双柄刀切开秆，并以厘米(cm)为单位测量由SWCB钻出的孔道长度。在这些实验中，孔道长度上限为十厘米(10cm)。
此外，还就每个事件用CEW侵染五(5)株F1植物，以测量CEW对玉米穗造成的损害程度。将大约四十(40)个CEW若虫用于侵染每株植物，并置于R1阶段植物的绿色穗丝上。侵染后二十一(21)天，检查了发育中的穗，并将损害记录为cm2穗损害。
表8显示了受FAW和SWCB侵染的F1事件的平均叶损害等级、由SWCB引起的秆穿孔长度和由CEW引起的穗损害，其中“NT”表示未测试。
表8.受FAW和SWCB侵染的F1转基因玉米植物的平均叶损害等级、由SWCB引起的秆穿孔长度和由CEW引起的穗损害。
/>
从表8中可见，与阴性对照相比，FAW和SWCB对玉米事件MON 95379的叶损害都最小。实质上，一旦昆虫开始以事件MON95379F1叶片为食，则含有事件MON 95379的玉米叶片中Cry1B.868和Cry1Da_7杀虫蛋白的表达导致昆虫停止进食叶片。在事件MON95379中未观察到SWCB钻孔，而阴性对照则显示广泛的钻孔。关于CEW穗损害，对穗的损害与阴性对照相比要少得多，并且与在几种市售转基因玉米事件中观察到的穗损害相当。F1测定中使用的侵染数量级比自然界中常见的高得多。F1测定显示，玉米事件MON 95379提供了对FAW、SWCB和CEW的出色控制。
在2016年夏季，使用人工侵染在田间实验中测定了实施例2/表3中所述的R2/F1后剩余的三十九(39)个事件的F1后代对FAW、CEW和SWCB的抗性。使用多个地点来测定抗性。
在以下三(3)个地点测定FAW抗性：Jerseyville,IL；Thomasboro,IL；和UnionCity,TN。在每个地点，每个事件在三(3)个田间地块中进行测定，每个地块使用一(1)行，每行三十(30)个种子。四十(40)个FAW新生虫用于在早期和中期轮生阶段(V4和V7营养阶段)对每株植物侵染两次。使用表6中提供的量度评估叶进食损害等级。
在三(3)个地点测定SWCB抗性：一(1)个在Jonesboro,AR，两(2)个在Union City,TN。在每个地点，每个事件在三(3)个田间地块中进行测定，每个地块使用一(1)行，每行三十(30)个种子。在中期轮生阶段(V7-V8)，将三十(30)个SWCB新生虫用于侵染每株植物。花粉脱落百分之五十(50％)之时，每株植物再次受到三十(30)个SWCB新生虫的侵染。如前所述评估秆钻孔损害。
在以下五(5)个地点测定CEW抗性：Jerseyville,IL；Jonesboro,AR；Monmouth,IL；Thomasboro,IL和Union City,TN。在每个地点，每个事件在三(3)个田间地块中进行测定，每个地块使用一(1)行，每行三十(30)个种子。当穗丝是新鲜和绿色之时，植物受到侵染，并且已经开始形成一些穗(R1至R3阶段)。使用CEW卵条进行侵染。每个条包含大约四十(40)个卵。在每株植物的穗与秆之间放置一(1)个条，使卵面向穗并靠近穗丝。侵染后二十一(21)至二十八(28)天确定穗损害的评估。到此时，昆虫已经从幼虫期发展到蛹期。如前所述测量对穗的损害。
对于FAW和SWCB，使用了来自所有三(3)个地点的数据。对于CEW，由于各种田间条件，只能使用来自Jonesboro,AR的数据。表9显示了每个测试事件和阴性对照的平均FAW叶损害等级、SWCB孔道长度和CEW穗损害测量值。
表9.2016田间功效试验的平均FAW叶损害等级、SWCB孔道长度和CEW穗损害。
/>
如表9所示，与阴性对照相比，玉米事件MON 95379提供了对FAW、SWCB和CEW的优异控制。这些测定中的侵染水平比自然条件下在田间经常遇到的要高得多，证明了在高昆虫压力下事件MON95379的优越性能。
在同时进行的田间试验和选择盒的Cre切除以及黄金标准种子的产生过程中，对事件进行进一步的表征。作为广泛的分子表征、功效、表达和农艺学研究的结果，事件从测试中被删除，留下两(2)个事件：事件1和MON 95379。根据在农艺学研究中观察到的产量阻力，将事件1的优先级降低，而将事件MON 95379升级。
在阿根廷2016年至2017年的生长季期间，在自然侵染条件下，在温带和亚热带地区，将事件MON 95379对FAW、CEW和SCB的抗性进行测定。使用表6中提供的量度，确定在阿根廷的亚热带地区生长的事件MON 95379的FAW叶损害等级。从阿根廷温带地区的两(2)个地点处获得了事件MON 95379的SCB孔道数据。从阿根廷温带地区的两(2)个地点和阿根廷亚热带地区的三(3)个地点处获得了事件MON 95379的CEW穗损害数据。表11显示了在2016-2017年阿根廷的生长季期间，事件MON 95379和阴性对照在自然侵染条件下的平均FAW叶损害等级、SCB孔道长度和CEW穗损害。
表10.2016-2017年阿根廷的田间功效试验的平均FAW叶损害等级、SCB孔道长度和CEW穗损害。
如从表10可见，在阿根廷的自然侵染条件下，与阴性对照相比，事件MON 95379提供了对FAW、SCB和CEW的抗性。
还在波多黎各的三(3)个生长季(2016年1月、2016年7月和2017年1月)期间，评估了事件MON 95379与市售玉米事件(MON89034，其表达Cry1a.105和Cry2Ab2)相比对FAW的抗性。表11显示了与事件MON89034和阴性对照相比，三(3)个生长季中每个季节的基于表6所示量度的平均叶损害等级。
表11.受到事件MON89034抗性的FAW自然侵染的事件MON95379和事件MON89034的平均叶损害等级。
如表11中可见，相对于阴性对照，玉米事件MON 95379表现出在高自然压力下对事件MON89034抗性的FAW的抗性。
在2017年夏季，采用类似于2016年夏季描述的方法，在美国评估了事件MON 95379对FAW、SWCB和CEW的抗性。在以下三(3)个地点测定FAW抗性：Jerseyville,IL；Thomasboro,IL；和Monmouth,IL。在每个地点，每个事件在三(3)个田间地块中进行测定，每个地块使用一(1)行，每行三十(30)个种子。四十(40)个FAW新生虫用于侵染每株植物两次。第一次侵染发生在V5阶段左右。在Monmouth,IL和Jerseyville,IL的第二次植物侵染发生在V8阶段左右。由于孵化率低和恶劣的天气，在Thomasboro,IL不可能再进行第二次侵染。使用表6中提供的量度评估了FAW叶进食损害等级。
在三(3)个地点测定了SWCB抗性：一(1)个在Jonesboro,AR，两(2)个在UnionCity,IL。在每个地点，每个事件在三(3)个田间地块中进行测定，每个地块使用一(1)行，每行三十(30)个种子。用三十(30)个SWCB新生虫侵染每株植物两次。在正常条件下，第一次侵染是在半数行的中期轮生阶段(V7-V8)进行，但侵扰被推迟了约一周。无论如何，建立了强大的昆虫压力。在百分之五十(50％)的花粉脱落时，每株植物中有三十(30)个SWCB新生虫侵染该行植物的后半部分。如前所述评估秆钻孔损害。
在以下六(6)个地点测定了CEW抗性：Jerseyville,IL；Jonesboro,AR；Paragould,AR；Monmouth,IL；和在Union City,TN的两个地点。在每个地点，每个事件在三(3)个田间地块中进行测定，每个地块使用一(1)行，每行三十(30)个种子。由于昆虫的不足，在Monmouth,IL和Jerseyville,IL的侵染要比穗丝新鲜和绿色时晚两(2)至三(3)周。在Monmouth，用大约二十二(22)个新生虫侵染每株植物。在Jerseyville,IL，用二十三(23)至二十四(24)个新生虫侵染部分张开的玉米穗。在Jonesboro,AR，三(3)行中的一(1)行里每株植物接受大约三十(30)个新生虫，而另两(2)行中每株植物接受十六(16)至(18)个新生虫。在Paragould,AR，所有三(3)行中每株植物接受大约三十(30)个新生虫。由于昆虫可用性，Union City,TN的两个地点的侵染被延迟。两个地点的每株植物都接受了十八(18)个新生虫。侵染后二十一(21)至二十八(28)天确定穗损害的评估。如前所述表示对穗的损害。对有标记和无标记的事件MON 95379植物均进行了人工侵染。另外，还使用自然昆虫压力，在含标记的事件MON 95379植物的地点进行测定。表12和表13显示了含标记和无标记的事件MON 95379植物的FAW叶损害等级、SWCB孔道长度和CEW穗损害。
表12.在人工和自然侵染条件下，选择标记的Cre切除之前，事件MON 95379植物的平均FAW叶损害等级、SWCB孔道长度和CEW穗损害。
表13.在人工侵染下，无标记事件MON 95379植物的平均FAW叶损害等级、SWCB孔道长度和CEW穗损害。
如表12和13中可见，事件MON 95379提供了在人工(有标记和无标记)和自然(无标记)侵染条件下对FAW、SWCB和CEW的抗性。
在2018年，在巴西田间试验中，在自然侵染条件下测定了事件MON 95379与事件MON89034的杂交杂种对FAW的抗性。田间试验在Santa Helena de Goiás,State of Goiás进行。在这个地点，有FAW群体对转基因玉米事件MON89034具有抗性。种植了与事件MON95379 x MON89034，事件MON89034的杂交对应的转基因玉米植物和常规玉米植物(阴性对照)。在V6阶段，使用表6中所示的量度来确定与事件MON 95379 x MON89034的杂交体相对应的六十(60)株植物、与事件MON89034相对应的三十(30)株植物和三十(30)个阴性对照的叶损害等级得分。此外，为每株植物记录FAW新生虫、大于两毫米(2mm)且小于或等于1.5厘米的幼虫和大于1.5厘米的幼虫的数量。表14显示了事件MON 95379 x MON89034的杂交体、事件MON89034和阴性对照的平均叶损害等级，以及在玉米植物上观察到的新生虫和幼虫的数量。
表14.在巴西2018田间试验中，事件MON 95379 x MON89034的杂交体、事件MON89034和阴性对照的的平均FAW叶损害等级以及新生虫和幼虫的数量。
如表14中可见，相对于阴性对照，事件MON 95379 x MON89034的杂交体提供了在自然侵染条件下对FAW的抗性。在事件MON89034抗性的FAW在FAW群体内的条件下，事件MON95379 x MON89034的杂交体也比事件MON89034表现更好。在与事件MON95379 x MON89034的杂交体相对应的植物上没有观察到新生虫和幼虫。在事件MON89034植物上观察到新生虫和介于两(2)毫米至一点五(1.5)厘米之间的幼虫。观察到阴性对照植物上的幼虫比事件MON89034植物上的还要多，并且具有长到大于1.5厘米的幼虫。
实施例5
玉米事件MON 95379对小玉米秆蛀虫的活性的测定
此实施例描述了转基因玉米事件MON 95379对鳞翅目昆虫害虫小玉米秆蛀虫(LSCB，小玉米螟)的活性的测定。
事件MON 95379与阴性对照植物一起在温室中生长，并用LSCB新生虫侵染。使十(10)株事件MON 95379植物和九(9)株阴性对照植物在单个盆中生长。种植后九(9)天，每株植物受十(10)个LSCB新生虫侵染。侵染后二十二(22)天，对植物进行检查，并使用如表15中所示的0-4损害等级量度对损害进行评级。
表15.LSCB植物损害等级量度。
表16列出了每株植物的所得LSCB损害等级。
表16.每株受侵染植物的LSCB植物损害。
如表16中可见，LSCB对阴性对照植物产生广泛的损害，其中四(4)个被评为“死亡”，四(4)个被评为“严重损害”，只有一(1)个被评为“平均损害”。相反，事件MON 95379LSCB侵染的植物没有显示出损害。
转基因玉米事件MON 95379提供对小玉米秆蛀虫(LSCB，小玉米螟)的抗性。
实施例6
玉米事件MON 95379提供与未转化的LH244玉米植物一致的产量和相似的农艺学
此实施例证实转基因玉米事件MON 95379在田间提供与未转化的LH244玉米植物一致的产量和相似的农艺学。
在草甘膦选择盒的Cre切除之前，对与事件MON 95379相对应的植物进行田间试验，以确定与对照植物相比的产量和农艺学的各个方面。计算出产量的测量值，并表示为蒲式耳/英亩(bu/acre)。植株高度和穗高度以英寸(in)为单位测量。百分之五十(50％)的花粉脱落和百分之五十(50％)的抽丝表示为种植后的天数(DAP)。测试重量是谷物的堆积密度或单位体积重量的量度，以磅/蒲式耳(lb/bu)表示。USDA基于15.5％水分含量将玉米蒲式耳的标准测试重量定为每蒲式耳五十六磅(56lb/bu)。玉米粒的水分百分比基于湿重表示。水分含量是种子中水的量，且通常以百分比表示。它可以基于湿重(以种子鲜重的百分比表示)或干重(以种子干重的百分比表示)来表示。水分百分比的测定对种子具有破坏性。水分百分比(湿基)可用以下简单的公式计算：
Mwb＝(Ww/Ww+Wd)x 100
其中Ww等于水的重量，且Wd等于干物质的重量。
在2016年美国的生长季中，确定草甘膦标记盒的Cre切除前事件MON 95379自交系和杂交种的产量和农艺学测量。表17和18分别显示了针对事件MON 95379自交系和杂交种测得的产量和农艺学特征。用于自交系比较的阴性对照植物是未转化的品种LH244。通过将自交系事件MON 95379与玉米品种93IDI3进行异花授粉，可以创建含有事件MON 95379的杂交种，而未转化的对照是LH244 x 93IDI3杂交体。
表17.事件MON 95379自交系相对于非转基因对照的产量和农艺学。
表18.事件MON 95379杂交种相对于非转基因对照的产量和农艺学。
如表17和表18中可见，自交系和杂交种在2016年美国田间试验中事件MON 95379的产量和其他农艺学测量值相对于对照都是相对相同的。自交系和杂交种与它们各自的对照之间的变异在可接受的限值内，并且表明对通过T-DNA插入事件MON 95379的玉米基因组中而得到的产量和其他农艺学特征不会产生负面影响。
在阿根廷2016年至2017年的生长季期间，还研究了草甘膦标记盒的Cre切除前事件MON 95379自交系和杂交种的产量和农艺学。表19和20显示了针对事件MON 95379自交系测得的产量和农艺学特征。用于自交系比较的阴性对照植物是未转化的品种LH244。通过异花授粉事件MON89034 x MON895379创建了包含事件MON 95379的杂交种。转基因对照是事件MON88017 x事件MON89034。非转基因对照是LH244×93IDI3杂交体。表21显示了针对事件MON 95379杂交种测量的产量和农艺学特征，其中“NC”表示未计算。
表19.事件MON 95379自交系相对于非转基因对照的产量和农艺学。
表20.事件MON 95379自交系相对于非转基因对照的产量和农艺学。
表21.事件MON 95379杂交种相对于转基因和非转基因对照的产量和农艺学。
如表19至21中可见，事件MON 95379自交系和杂交种相对于对照的产量和其他农艺学特征的测量值是相对相同的。
2017年，再次在美国的田间试验中草甘膦标记盒的Cre切除前对事件MON 95379自交系和杂交种的产量和农艺学进行了测量。自交系和杂交种对照与2016年美国田间试验中使用的相似。表22显示了事件MON 95379自交系相对于非转基因对照的产量和农艺学特征，表23和24显示了事件MON 95379杂交种相对于非转基因对照在2017年美国田间试验中测得的产量和农艺学特征。
表22.事件MON 95379自交系相对于非转基因对照的产量和农艺学。
表23.事件MON 95379杂交种相对于非转基因对照的产量和农艺学。
表24.事件MON 95379杂交种相对于非转基因对照的产量和农艺学。
如表22至表24中可见，2017年美国田间试验证明的事件MON95379的产量和其他农艺学特性与自交系和杂交系的未转化对照相似。
在2018年至2019年阿根廷的生长季期间，在田间试验中在草甘膦标记盒的Cre切除后对事件MON 95379自交系和杂交种的农艺学和产量进行了测量。自交系对照与2017年美国田间试验中使用的那些类似。杂交种通过与优良品种80IDM2杂交而产生。表25和26显示了事件MON 95379自交系相对于非转基因对照的产量和农艺学特征，并且表27显示了事件MON 95379杂交种相对于非转基因对照在2018年至2019年的阿根廷田间试验中测得的产量和农艺学特征。
表25.事件MON 95379自交系相对于非转基因对照的产量和农艺学。
表26.事件MON 95379自交系相对于非转基因对照的产量和农艺学。
表27.事件MON 95379杂交种相对于非转基因对照的产量和农艺学。
如表25至表27中可见，在2017年至2018年的阿根廷田间试验中证明的事件MON95379的产量和其他农艺学特性与自交系和杂交系的未转化对照相似。
因此，总而言之，在美国和阿根廷，玉米事件MON 95379在四(4)个单独的生长季中表现出相似的产量和其他农艺学特性。与非转基因和转基因对照相比，事件MON 95379不会对产量产生负面影响，也不会导致其他农艺学特性发生变化。
实施例7
玉米事件MON 95379事件特异性终点测定
以下实施例描述了适用于鉴定玉米样品中事件MON 95379的存在的方法。设计一对PCR引物和探针用于在事件特异性终点PCR中鉴定玉米基因组DNA与事件MON 95379的插入的DNA之间所形成的独特连接。表28和表29中描述了用于在事件特异性终点/>PCR中鉴定事件MON 95379在玉米样品中的存在的条件的实例。
寡核苷酸正向引物SQ21529的序列(SEQ ID NO:15)与对应于SEQ ID NO:10的位置833-852的核苷酸序列同一。寡核苷酸反向引物SQ21524的序列(SEQ ID NO:16)与对应于SEQ ID NO:10的位置905-934的核苷酸序列的反向互补序列同一。寡核苷酸探针PB10269的序列(SEQ ID NO:17)与对应于SEQ ID NO:10的位置886-901的核苷酸序列的反向互补序列同一。可以在终点PCR测定中使用带有探针PB10269(SEQ ID NO:17)的引物SQ21529(SEQ ID NO:15)和SQ21524(SEQ ID NO:16)，该探针可被荧光标记(例如6-FAMTM荧光标记)，以鉴定样品中源自事件MON 95379的DNA的存在。
除了SQ21529(SEQ ID NO:15)、SQ21524(SEQ ID NO:16)和PB10269(SEQ ID NO:17)之外，对于本领域技术人员显而易见的是，其他引物和/或探针也可以被设计以扩增或杂交至SEQ ID NO:10内的序列，这些序列对于检测样品中源自事件MON 95379的DNA的存在是独特的，并且对该检测是有用的。
遵循标准分子生物学实验室惯例，开发了用于事件鉴定的PCR测定，以用于检测样品中的事件MON 95379。用引物对和探针(例如，标记有荧光标签(诸如6-FAMTM)的探针)的每个组对标准PCR测定或PCR测定的参数进行优化，以用于检测源自事件MON95379的DNA在样品中的存在。PCR反应的对照包括内部对照引物和对用作内部对照的玉米基因组内的区域有特异性的内部对照探针(例如，/>标记的)，并且是引物SQ20222(SEQ ID NO:18)、SQ20221(SEQ ID NO:19)和/>标记的探针PB50237(SEQ ID NO:20)。
通常，为检测样品中的事件MON 95379而优化的参数包括引物和探针浓度、模板化DNA的量以及PCR扩增循环参数。此分析的对照包括来自含有事件MON 95379的玉米的阳性对照、来自非转基因玉米的阴性对照和不含模板DNA的阴性对照。
表28.MON 95379事件特异性终点PCR反应组分。
/>
表29.终点热循环仪条件。
实施例8
使用确定事件MON 95379的接合性和检测昆虫毒素转基因的测定
以下实施例描述了适用于鉴定玉米样品中事件MON 95379的接合性和检测事件MON 95379中的昆虫毒素转基因的方法。设计PCR引物对和探针用来鉴定产生事件MON95379的对T-DNA插入呈阳性和阴性的等位基因的特定性质。
接合性测定适用于确定包含事件的植物是否对于事件DNA是纯合的(即，包括位于染色体对的每个染色体上的相同位置处的外源DNA)、对于事件DNA是杂合(即，包含仅在染色体对的一条染色体上的外源DNA)或野生型(即，事件DNA为空)。
将终点热扩增方法用于开发事件MON 95379的接合性测定。该测定使用引物对和探针来检测扩增子，所述扩增子对应于包含在用于产生玉米事件MON 95379的T-DNA中的编码Cry1B.868和Cry1Da_7的两个昆虫毒素编码序列之一。另外，将引物对和探针用于检测位于玉米基因组内并且已知作为纯合等位基因存在的单拷贝内部对照。
对于此测定，将两(2)个引物对和两(2)个探针与样品混合在一起。在检测Cry1B.868毒素编码序列的存在的接合性测定中使用的DNA引物是引物SQ50998(SEQ IDNO:21)和SQ50997(SEQ ID NO:22)。在检测Cry1B.868毒素编码序列的存在的接合性测定中使用的标记的DNA探针是PB54340(SEQ ID NO:23)。在检测Cry1Da_7毒素编码序列的存在的接合性测定中使用的DNA引物是引物SQ50485(SEQ ID NO:24)和SQ50484(SEQ IDNO:25)。在检测Cry1Da_7毒素编码序列的存在的接合性测定中使用的/>标记的DNA探针是PB50138(SEQ ID NO:26)。两种接合性检测测定都使用相同的内部对照。内部对照的引物是SQ20222(SEQ ID NO:18)和SQ20221(SEQ ID NO:19)，而内部对照的6FAMTM标记的探针是PB50237(SEQ ID NO:20)。如表30和31所示，将Cry1B.868或Cry1Da_7的DNA引物和探针与内部对照的引物和探针混合。
表30.用于检测Cry1B.868的玉米事件MON 95379接合性PCR。
/>
表31.用于检测Cry1Da_7的玉米事件MON 95379接合性PCR。
/>
根据使用哪种毒素编码序列进行检测，使用源自接合性未知的叶样品的DNA、源自未转化的玉米植物的DNA的阴性对照、缺少DNA的阴性对照和使用源自对于Cry1B.868或Cry1Da_7为纯合的转基因植物的DNA的阳性对照混合单独的反应。然后使反应经受表32所示的热循环。
表32.接合性热循环仪条件。/>
扩增后，确定对应于毒素编码序列和单拷贝纯合内部标准的扩增子的循环阈值(Ct值)。确定单拷贝纯合内部标准扩增子的Ct值与毒素编码序列扩增子的Ct值之间的差异(ΔCt)。关于接合性，约零(0)的ΔCt指示插入的事件MON 95379 T-DNA的纯合性，而约一(1)的ΔCt指示插入的事件MON 95379 T-DNA的杂合性。与昆虫毒素编码序列相对应的扩增子的缺乏指示样品关于所插入的事件MON 95379 T-DNA为空。由于多重因素诸如扩增效率和理想的退火温度，热扩增方法中的Ct值会有一些变化。因此，将“约一(1)”的范围定义为0.75至1.25的ΔCt。
对于源自与事件MON 95379的杂交体的每个后代，对两种毒素编码序列进行测定，以确保后代接合性测定的准确性。
实施例9
使用TAQMAN确定玉米事件MON 95379的接合性的
以下实施例描述了适用于鉴定玉米样品中事件MON 95379的接合性的方法。
设计PCR引物对和探针用来鉴定产生事件MON 95379的对T-DNA插入呈阳性和阴性的等位基因的特定性质。表33和34提供了事件特异性接合性PCR中可使用的条件的实例。对于此项测定，将三种引物和两个探针与样品混合在一起。接合性测定中使用的DNA引物是引物SQ50219(SEQ ID NO:15)、SQ21524(SEQ ID NO:16)和PWTDNA(SEQ ID NO:27)。接合性测定中使用的探针是6FAMTM标记的探针PB10269(SEQ ID NO:17)和/>标记的探针PRWTDNA(SEQ ID NO:28)。引物SQ50219(SEQ ID NO:15)和SQ21524(SEQ ID NO:16)和6FAMTM标记的探针PB10269(SEQ ID NO:17)可诊断事件MON 95379 DNA。当没有事件MON95379的拷贝时，SQ50219(SEQ ID NO:15)和PWTDNA(SEQ ID NO:27)和/>标记的探针PRWTDNA(SEQ ID NO:28)具有诊断意义；即，它们可诊断野生型等位基因。
当将三种引物和两个探针在PCR反应中与从对于事件MON 95379为杂合的植物中提取的DNA混合在一起时，既有来自6FAMTM标记的探针PB10269(SEQ ID NO:17)也有来自标记的探针PRWTDNA(SEQ ID NO:28)的荧光信号，其指示并可诊断对于事件MON95379为杂合的植物。当将三种引物和两个探针在PCR反应中与从对于事件MON 95379为纯合的植物中提取的DNA混合在一起时，只有来自6FAMTM标记的探针PB10269(SEQ ID NO:17)的荧光信号，而没有来自/>标记的探针PRWTDNA(SEQ ID NO:28)的荧光信号。当将三种引物和两个探针在PCR反应中与从对事件MON 95379(即，野生型)为空的植物中提取的DNA混合在一起时，只有来自/>标记的探针PRWTDNA(SEQ ID NO:28)的荧光信号。用于此分析的模板DNA样品和对照是来自包含事件MON 95379 DNA的玉米的阳性对照(来自已知的纯合和已知的杂合样品)、来自非转基因玉米的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
表33.事件MON 95379接合性PCR
表34.接合性热循环仪条件/>
实施例10
在任何MON 95379育种事件中鉴定玉米事件MON 95379
以下实施例描述了如何使用玉米事件MON 95379在任何育种活动的后代中鉴定MON 95379事件。
将DNA引物对用于产生可诊断玉米事件MON 95379的扩增子。可诊断事件MON95379的扩增子包含至少一个连接序列。事件MON 95379的连接序列为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8(在图1中分别为[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]和[8])。SEQ ID NO:1是五十(50)个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'连接区。SEQ ID NO:1位于SEQ IDNO:10的核苷酸位置838-887处。SEQ ID NO:2是五十(50)个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'连接区。SEQ ID NO:2位于SEQ ID NO:10的核苷酸位置14156-14205处。SEQ ID NO:3是一百(100)个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'连接区。SEQ ID NO:3位于SEQ ID NO:10的核苷酸位置813-912处。SEQID NO:4是一百(100)个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'连接区。SEQ ID NO:4位于SEQ ID NO:10的核苷酸位置14,131-14,230处。SEQ ID NO:5是两百(200)个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'连接区。SEQ IDNO:5位于SEQ ID NO:10的核苷酸位置763-962处。SEQ ID NO:6是两百(200)个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的3'连接区。SEQ ID NO:6位于SEQ ID NO:10的核苷酸位置14,081-14,280处。SEQ ID NO:7是一千一百六十(1,160)个核苷酸的序列，代表玉米基因组DNA和整合的转基因表达盒的5'连接区。SEQ ID NO:7位于SEQ ID NO:10的核苷酸位置1-1,160处。SEQ ID NO:8是一千一百七十八(1,178)个核苷酸的序列，代表整合的转基因表达盒和玉米基因组DNA的3′连接区。SEQ ID NO:8位于SEQ ID NO:10的核苷酸位置14,039-15,216处。
将产生可诊断事件MON 95379的扩增子的引物对包括基于侧翼序列(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)和插入的T-DNA(SEQ ID NO:9)的引物对。为了获得其中可见SEQ IDNO:1、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的诊断性扩增子，可以基于5'侧翼玉米基因组DNA(SEQ ID NO:11；来自SEQ ID NO:10的碱基1至862)设计正向引物分子并基于插入的T-DNA(SEQ ID NO:9；来自SEQ ID NO:10的位置863至14,180)设计反向引物分子，其中引物分子具有足够的与SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:9特异性杂交的连续核苷酸长度。为了获得其中可见SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的诊断性扩增子，可以基于插入的T-DNA(SEQ ID NO:9；来自SEQ ID NO:10的位置863至14,180)设计正向引物分子并基于3′侧翼玉米基因组DNA(SEQ ID NO:12；来自SEQ ID NO:10的位置14,181至15,216)设计反向引物分子，其中引物分子具有足够的与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12特异性杂交的连续核苷酸长度。
出于实用目的，应设计产生有限大小范围的扩增子的引物，所述扩增子优选在200至1000个碱基之间。通常，较小尺寸的扩增子在PCR反应中更可靠地产生，从而允许较短的循环时间，并且它们可以轻易在琼脂糖凝胶上分离和观察，或适用于终点样测定中。另外，使用所述引物对产生的扩增子可以被克隆到载体中，繁殖，分离和测序，或者可以使用本领域充分确立的方法直接测序。本发明的一个方面是来源于SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:9的组合或SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:9的组合的任何引物对，其适用于DNA扩增方法中以产生可诊断事件MON 95379或其后代的扩增子。本发明的一个方面是包含SEQID NO:11、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12或其互补序列的至少十一(11)个连续核苷酸的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子，其适用于DNA扩增方法中以产生可诊断事件MON95379或其后代的扩增子。
表28和29示出了此项分析的扩增条件的实例。这些方法的任何修改或与SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12同源或互补的DNA引物或事件MON 95379的转基因插入物(SEQ IDNO:9)中包含的遗传元件的DNA序列(产生可诊断事件MON 95379的扩增子)的使用都在本领域内。诊断性扩增子包含与至少一个转基因/基因组连接DNA或其实质部分同源或互补的DNA分子。
对包含事件MON 95379的植物组织样品的分析应包括来自包含事件MON 95379的植物的阳性组织对照、来自不含事件MON 95379的玉米植物的阴性对照(例如LH244)和不含玉米基因组DNA的阴性对照。引物对将扩增内源性玉米DNA分子，并将充当DNA扩增条件的内部对照。DNA扩增方法领域的技术人员可以从SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:9中选择另外的引物序列。通过表28和表29中所示的方法选择的用于产生扩增子的条件可能有所不同，但会产生可诊断事件MON 95379 DNA的扩增子。在表28和表29的方法内或对其进行修改的DNA引物序列的使用在本发明的范围内。本发明的一个方面是由至少一个源自SEQID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:9的DNA引物序列产生的扩增子，其可诊断事件MON95379。
本发明的一个方面是DNA检测试剂盒，其包含至少一种具有足够长度的源自SEQID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:9的连续核苷酸的DNA引物，当所述DNA引物用于DNA扩增方法中时，产生事件MON 95379或其后代的诊断性扩增子。本发明的一个方面是一种玉米植物或种子，其中当在DNA扩增方法中测试时，其基因组将产生可诊断事件MON 95379的扩增子。可以通过使用Applied Biosystems GeneAmp TM PCR System 9700、Stratagene Gradient热循环仪或如表29所示的任何其他可用于产生可诊断事件MON 95379的扩增子的扩增系统进行事件MON 95379扩增子的测定。
在本说明书中引用的所有出版物和公开的专利文件(其为本发明的材料)均以引用的方式并入本文，其程度如同各个单独的出版物或专利申请具体地和单独地表示为以引用的方式并入一般。
已经说明并描述了本发明的原理，对于本领域技术人员来说，显然可以在不脱离这些原理的情况下对本发明的布置和细节进行修改。这些修改也在所附权利要求的范围之内。
Claims (22)
1.一种重组DNA分子，其核苷酸序列如选自由以下组成的组的序列所示：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10及其完整互补序列，其中所述重组DNA分子源自玉米事件MON95379，所述玉米事件MON 95379已经以种子的形式以ATCC登录号PTA-125027保藏。
2.一种DNA分子，其包含足够长的多核苷酸区段以用作DNA探针，所述DNA探针在严格的杂交条件下与样品中的玉米事件MON95379DNA特异性杂交，其中检测到在所述严格的杂交条件下所述DNA分子的杂交可诊断所述样品中玉米事件MON 95379DNA的存在，其中所述DNA探针包含以下核苷酸序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其中所述样品包括玉米植物、玉米植物细胞、玉米种子、玉米植物部分、玉米后代植物、经过加工的玉米种子、包含玉米的动物饲料、玉米油、玉米面、玉米粉、玉米片、玉米糠、由玉米制成的面食、玉米生物质以及使用玉米和玉米部分生产的燃料产品。
4.一种DNA分子对，其包含两条引物，所述引物包含选自下组的序列：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组合；SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22组合；以及SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组合。
5.一种检测样品中可诊断玉米事件MON 95379DNA的DNA区段的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与如权利要求2所述的DNA分子接触；
b)使所述样品和所述DNA分子经受严格的杂交条件；及
c)检测所述DNA分子与所述样品中所述DNA的杂交，
其中所述检测可诊断所述样品中所述玉米事件MON 95379DNA的存在。
6.一种检测样品中可诊断玉米事件MON 95379DNA的DNA区段的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与如权利要求4所述的DNA分子对接触；
b)进行足以产生DNA扩增子的扩增反应；及
c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在，
其中所述DNA扩增子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10。
7.一种玉米植物部分，其包含权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述玉米植物部分是不可再生的，其中所述重组多核苷酸分子源自玉米事件MON 95379，所述玉米事件MON95379已经以种子的形式以ATCC登录号PTA-125027保藏。
8.如权利要求7所述的玉米植物部分，其中所述重组DNA分子包含在所述玉米植物部分的基因组中。
9.如权利要求7所述的玉米植物部分，其中当在鳞翅目昆虫害虫的饮食中提供时，所述玉米植物部分是杀虫的。
10.如权利要求9所述的玉米植物部分，其中所述鳞翅目昆虫害虫选自由以下组成的组：秋夜蛾(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(棉铃虫)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)、甘蔗蛀虫(蔗螟)和小玉米秆蛀虫(小玉米螟)。
11.如权利要求7所述的玉米植物部分，其中所述玉米植物进一步被限定为包含所述玉米事件MON95379的玉米植物任何一代的后代。
12.一种保护玉米植物免受昆虫侵染的方法，其中所述方法包括在鳞翅目昆虫害虫的饮食中提供杀虫有效量的包含玉米事件MON95379的玉米植物的细胞或组织，其中所述玉米事件MON 95379已经以种子的形式以ATCC登录号PTA-125027保藏。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述鳞翅目昆虫害虫选自由以下组成的组：秋夜蛾(草地贪夜蛾)、玉米穗蛾(棉铃虫)、西南玉米蛀虫(西南玉米螟)、甘蔗蛀虫(蔗螟)和小玉米秆蛀虫(小玉米螟)。
14.一种产生昆虫抗性玉米植物的方法，所述方法包括：
a)使两种不同的玉米植物进行有性杂交，其中所述两种不同的玉米植物中的至少一种包含转基因玉米事件MON 95379DNA；
b)从所述杂交的后代对种子或组织取样；
c)检测在来自步骤b)的所述样品中可诊断玉米事件MON 95379DNA的DNA区段的存在，以鉴定包含玉米事件MON 95379DNA的后代；及
d)选择包含玉米事件MON 95379DNA的所述后代；
其中所述玉米事件MON 95379已经以种子的形式以ATCC登录号PTA-125027保藏。
15.一种玉米种子，其包含可检测量的权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述玉米种子是不能存活的，其中所述核苷酸序列源自玉米事件MON 95379，所述玉米事件MON 95379已经以种子的形式以ATCC登录号PTA-125027保藏。
16.一种无生命的玉米植物材料，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
17.一种微生物，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
18.一种商品产品，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述商品产品选自玉米面和玉米粉，并且其中所述商品产品是不能存活的。
19.一种玉米植物部分或其玉米种子，所述玉米植物部分或其玉米种子包含当在DNA扩增方法中测试时充当模板的DNA，所述DNA扩增方法产生可诊断事件MON 95379DNA的存在的扩增子，其中所述玉米植物部分是不可再生的，所述玉米种子是不能存活的，其中所述事件MON 95379已经以种子的形式以ATCC登录号PTA-125027保藏。
20.一种确定包含事件MON 95379的玉米植物或玉米种子的接合性的方法，所述方法包括：
a)使包含玉米DNA的样品与能够产生编码Cry1B.868或Cry1Da_7的毒素编码序列之一的扩增子的引物对接触；
b)使所述包含玉米DNA的样品与能够产生在所述玉米植物中已知为单拷贝且纯合的内部标准的扩增子的引物对接触；
c)使所述DNA样品与探针组接触，所述探针组含有与编码Cry1B.868或Cry1Da_7的毒素编码序列之一特异性杂交的至少第一探针和与在所述玉米植物中已知为单拷贝且纯合的内部标准基因组DNA特异性杂交的第二探针；
d)使用实时PCR进行DNA扩增反应，并确定对应于所述毒素编码序列和所述单拷贝、纯合内部标准的扩增子的循环阈值(Ct值)；
e)计算所述单拷贝、纯合内部标准扩增子的Ct值与所述毒素编码序列扩增子的Ct值之间的差值(ΔCt)；以及
f)确定接合性，其中零(0)的ΔCt指示事件MON 95739的插入的T-DNA的纯合性，而一(1)的ΔCt指示事件MON 95379的所述插入的T-DNA的杂合性，
其中所述引物对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的组合和SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22的组合；并且其中所述探针是SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23；或
其中所述引物对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的组合和SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:25的组合；并且其中所述探针是SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26。
21.如权利要求20所述的方法，其中指示事件MON 95379的所述插入的T-DNA的杂合性的一(1)的ΔCt在0.75至1.25的范围内。
22.一种确定包含事件MON 95379的玉米植物或玉米种子的接合性的方法，所述方法包括：
a)使包含玉米DNA的样品与引物对组接触，所述引物对组包含至少两个不同的引物对，所述引物对能够产生可诊断事件MON95379的第一扩增子和可诊断不包含事件MON 95379的天然玉米基因组DNA的第二扩增子；
b)用所述样品和所述引物对组进行核酸扩增反应；及
c)在所述核酸扩增反应中检测可诊断事件MON 95379的第一扩增子或可诊断不包含事件MON 95379的天然玉米基因组DNA的第二扩增子，其中仅所述第一扩增子的存在可诊断对于事件MON95379为纯合的玉米植物或玉米种子，并且所述第一扩增子和所述第二扩增子两者皆存在可诊断对于事件MON 95379为杂合的玉米植物或玉米种子；或
i)使包含玉米DNA的样品与探针组接触，所述探针组含有与事件MON 95379DNA特异性杂交的至少第一探针和与被事件MON95379的异源DNA的插入而中断的玉米基因组DNA特异性杂交而不与事件MON 95379DNA杂交的至少第二探针；以及
ii)在严格的杂交条件下使所述探针组与所述样品杂交，其中检测到仅所述第一探针在所述杂交条件下的杂交可诊断对于事件MON95379为纯合的玉米植物或玉米种子，且其中检测到所述第一探针和所述第二个探针两者在所述杂交条件下的杂交可诊断对于事件MON95379为杂合的玉米植物或玉米种子，
其中所述引物对组包括SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的组合和SEQ ID NO:15和SEQID NO:27的组合；和
其中所述探针组包括SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:28。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862711810P | 2018-07-30 | 2018-07-30 | |
| US62/711,810 | 2018-07-30 | ||
| PCT/US2019/043666 WO2020028172A1 (en) | 2018-07-30 | 2019-07-26 | Corn transgenic event mon 95379 and methods for detection and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112512305A CN112512305A (zh) | 2021-03-16 |
| CN112512305B true CN112512305B (zh) | 2024-02-27 |
Family
ID=69179085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980049875.1A Active CN112512305B (zh) | 2018-07-30 | 2019-07-26 | 玉米转基因事件mon 95379及其检测方法和用途 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11198887B2 (zh) |
| EP (1) | EP3829286A4 (zh) |
| JP (1) | JP2021532744A (zh) |
| KR (1) | KR20210038439A (zh) |
| CN (1) | CN112512305B (zh) |
| AR (1) | AR115872A1 (zh) |
| AU (1) | AU2019314261B2 (zh) |
| BR (1) | BR112020025520A2 (zh) |
| CA (1) | CA3104156A1 (zh) |
| CL (1) | CL2021000209A1 (zh) |
| CO (1) | CO2020016680A2 (zh) |
| CR (1) | CR20210046A (zh) |
| EA (1) | EA202190095A1 (zh) |
| MX (1) | MX2021001075A (zh) |
| PH (1) | PH12021550142A1 (zh) |
| UY (1) | UY38320A (zh) |
| WO (1) | WO2020028172A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014509866A (ja) * | 2011-03-25 | 2014-04-24 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物調節要素およびその使用 |
| CN113913457B (zh) * | 2021-10-29 | 2023-09-19 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 一种抑制或杀灭桃蛀螟的方法及其应用 |
| US20230279508A1 (en) * | 2021-11-02 | 2023-09-07 | Monsanto Technology Llc | Transgenic corn event zm_bcs216090 and methods for detection and uses thereof |
| CN114507673A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-05-17 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 一种抑制或杀灭小地老虎的方法及应用 |
| WO2023164453A2 (en) * | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Multiple disease resistance genes and genomic stacks thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2782557A1 (en) * | 2009-12-16 | 2011-07-14 | Dow Agrosciences Llc | Use of cry1da in combination with cry1ca for management of resistant insects |
| WO2016061391A2 (en) * | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Monsanto Technology Llc | Novel chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests |
| WO2016061377A2 (en) * | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Monsanto Technology Llc | Lepidopteran-active cry1da1 amino acid sequence variant proteins |
| WO2017079266A1 (en) * | 2015-11-02 | 2017-05-11 | Monsanto Technology Llc | Cotton transgenic event mon 88702 and methods for detection and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6593273B2 (en) * | 2000-10-06 | 2003-07-15 | Monsanto Technology Llc | Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with pesticide |
| EP2021476B1 (en) | 2006-05-26 | 2014-07-09 | Monsanto Technology, LLC | Corn plant and seed corresponding to transgenic event mon89034 and methods for detection and use thereof |
| EP3502127B1 (en) * | 2013-10-09 | 2023-07-26 | Monsanto Technology LLC | Transgenic corn event mon87403 and methods for detection thereof |
-
2019
- 2019-07-26 AU AU2019314261A patent/AU2019314261B2/en active Active
- 2019-07-26 BR BR112020025520-3A patent/BR112020025520A2/pt unknown
- 2019-07-26 CN CN201980049875.1A patent/CN112512305B/zh active Active
- 2019-07-26 KR KR1020207037921A patent/KR20210038439A/ko active Search and Examination
- 2019-07-26 WO PCT/US2019/043666 patent/WO2020028172A1/en unknown
- 2019-07-26 EA EA202190095A patent/EA202190095A1/ru unknown
- 2019-07-26 CA CA3104156A patent/CA3104156A1/en active Pending
- 2019-07-26 MX MX2021001075A patent/MX2021001075A/es unknown
- 2019-07-26 EP EP19844946.4A patent/EP3829286A4/en active Pending
- 2019-07-26 CR CR20210046A patent/CR20210046A/es unknown
- 2019-07-26 JP JP2021504406A patent/JP2021532744A/ja active Pending
- 2019-07-29 US US16/525,278 patent/US11198887B2/en active Active
- 2019-07-30 UY UY0001038320A patent/UY38320A/es unknown
- 2019-07-30 AR ARP190102148A patent/AR115872A1/es unknown
-
2020
- 2020-12-30 CO CONC2020/0016680A patent/CO2020016680A2/es unknown
-
2021
- 2021-01-19 PH PH12021550142A patent/PH12021550142A1/en unknown
- 2021-01-26 CL CL2021000209A patent/CL2021000209A1/es unknown
- 2021-08-27 US US17/459,303 patent/US11845949B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2782557A1 (en) * | 2009-12-16 | 2011-07-14 | Dow Agrosciences Llc | Use of cry1da in combination with cry1ca for management of resistant insects |
| WO2016061391A2 (en) * | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Monsanto Technology Llc | Novel chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests |
| WO2016061377A2 (en) * | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Monsanto Technology Llc | Lepidopteran-active cry1da1 amino acid sequence variant proteins |
| WO2017079266A1 (en) * | 2015-11-02 | 2017-05-11 | Monsanto Technology Llc | Cotton transgenic event mon 88702 and methods for detection and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Comparative Analysis of Genomics and Proteomics in the New Isolated Bacillus thuringiensis X022 Revealed the Metabolic Regulation Mechanism of Carbon Flux Following Cu(2+) Treatment;Meifang Quan等;《Front Microbiol.》;20160527;第7卷(第792期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2019314261B2 (en) | 2023-03-30 |
| WO2020028172A1 (en) | 2020-02-06 |
| JP2021532744A (ja) | 2021-12-02 |
| KR20210038439A (ko) | 2021-04-07 |
| BR112020025520A2 (pt) | 2021-03-16 |
| EA202190095A1 (ru) | 2021-06-29 |
| MX2021001075A (es) | 2021-04-12 |
| EP3829286A1 (en) | 2021-06-09 |
| UY38320A (es) | 2020-02-28 |
| EP3829286A4 (en) | 2022-08-24 |
| US20220049268A1 (en) | 2022-02-17 |
| CA3104156A1 (en) | 2020-02-06 |
| PH12021550142A1 (en) | 2021-09-13 |
| WO2020028172A8 (en) | 2020-10-08 |
| US11198887B2 (en) | 2021-12-14 |
| CL2021000209A1 (es) | 2021-06-25 |
| CR20210046A (es) | 2021-06-10 |
| CN112512305A (zh) | 2021-03-16 |
| AR115872A1 (es) | 2021-03-10 |
| CO2020016680A2 (es) | 2021-01-18 |
| AU2019314261A1 (en) | 2020-12-17 |
| US11845949B2 (en) | 2023-12-19 |
| US20200032289A1 (en) | 2020-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11884986B2 (en) | Transgenic corn event MON87403 and methods for detection thereof | |
| US11767568B2 (en) | Soybean transgenic event MON87751 and methods for detection and use thereof | |
| CN112512305B (zh) | 玉米转基因事件mon 95379及其检测方法和用途 | |
| US11578339B2 (en) | Transgenic corn event MON95275 and methods for detection and uses thereof | |
| US20240035100A1 (en) | Soybean transgenic event gm_csm63770 and methods for detection and uses thereof | |
| US20230279508A1 (en) | Transgenic corn event zm_bcs216090 and methods for detection and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |