ES2869439T3 - Evento transgénico de soja MON87751 y procedimientos para su detección y uso - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN recombinante detectable en una muestra que contiene ADN de soja caracterizada por la secuencia de nucleótidos de dicha molécula es: a) SEQ ID NO:10; o b) una secuencia de nucleótidos totalmente complementaria a (a), caracterizada porque detectar la presencia de dicha molécula de ADN es un diagnóstico para el ADN del evento de soja MON87751 en dicha muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Evento transgénico de soja MON87751 y procedimientos para su detección y uso

Campo de la invención

La invención se refiere a un evento de Glycine max (soja) transgénico denominado MON87751. El evento proporciona dos modos de acción diferentes de la resistencia a las infestaciones de lepidópteros de la soja a través de una combinación única de proteínas de toxinas insecticidas no disponibles previamente en las plantas de soja. La combinación de estas proteínas de toxinas insecticidas es altamente eficaz para controlar las infestaciones de las especies de lepidópteros características de las plantas de soja. La invención también se refiere a plantas, partes de plantas, semillas de plantas, células vegetales, plantas de la progenie de soja, productos agrícolas y procedimientos relacionados con el evento MON87751 y proporciona moléculas de nucleótidos que son exclusivas del evento, que fueron creadas con relación a la inserción de ADN transgénico en el genoma de una célula de Glycine max (soja) y que son útiles para detectar la presencia de este evento en las muestras biológicas que contienen ácidos nucleicos de soja.

Antecedentes de la invención

La soja (Glycine max) es un cultivo importante en muchas partes del mundo y se han aplicado procedimientos biotecnológicos a este cultivo para producir variedades de soja con rasgos deseables. Uno de estos rasgos deseables es la resistencia a los insectos. La expresión de un transgén de resistencia a los insectos en una planta puede conferir el rasgo deseable de resistencia a los insectos en la planta, pero la expresión del transgén se puede ver afectada por muchos factores diferentes que incluyen la orientación y la composición de los casetes que activan la expresión de los genes individuales transferidos al cromosoma de la planta, la ubicación cromosómica y el resultado genómico de la inserción del transgén. Por ejemplo, se ha observado la existencia de una variación en el nivel y en el patrón de la expresión de un transgén en plantas entre los eventos individuales que difieren en el sitio de inserción cromosómica del transgén, pero que de otro modo son idénticos. También hay diferencias fenotípicas o agronómicas deseadas y/o no deseadas entre los eventos. Por lo tanto, suele ser necesario producir y analizar una gran cantidad de eventos individuales de transformación de células vegetales para seleccionar un evento que tenga tanto el rasgo deseable como las características fenotípicas y agrícolas óptimas adecuadas para el éxito a nivel comercial. La selección del evento transgénico preferido requiere caracterización molecular extensiva, así como ensayos de invernadero y de campo con muchos eventos durante varios años, en múltiples ubicaciones y en diversas condiciones. Se recolecta una cantidad significativa de datos sobre la eficacia, fenotípicos y moleculares, y los datos y las observaciones resultantes son analizados por equipos de científicos y agrónomos con el propósito de seleccionar uno o más eventos comercialmente adecuados. Una vez que ha sido seleccionado, se utiliza dicho evento para la introgresión del rasgo transgénico deseable en otras bases genéticas mediante procedimientos de fitomejoramiento, lo cual produce una cantidad de variedades de cultivos diferentes que contienen el rasgo deseable y que se adaptan en forma adecuada a las condiciones agronómicas locales específicas.

La soja transgénica que depende de la expresión de una toxina única para el control insecticida de la infestación de insectos puede correr el riesgo de presentar una durabilidad limitada debido a la mayor probabilidad de desarrollo de resistencia a la toxina por las plagas de insectos. Asimismo, la soja transgénica que contiene agentes tóxicos que no proporcionan múltiples modos de acción únicos también podría correr el riesgo de presentar una durabilidad limitada. La primera soja disponible que produce una proteína tóxica para los lepidópteros contiene una única proteína de toxina, Cry1Ac. Se ha divulgado un evento transgénico de soja reciente que contiene las proteínas de toxinas Cry1Ac y Cry1F. Si hubiera resistencia a Cry1Ac, la toxina Cry1F sería la única fuente de eficacia del evento transgénico de Cry1Ac y Cry1F. Por lo tanto, es necesario proporcionar una planta de soja que tenga dos o más agentes tóxicos que controlen las plagas controladas por Cry1Ac en la que ninguno de los agentes tóxicos se una a los mismos receptores o sustancialmente a los mismos receptores en el intestino medio del insecto diana que se unen a Cry1Ac. La invención descrita en la presente provee un evento de soja transgénico MON87751 que supera el problema de durabilidad descrito anteriormente para los eventos transgénicos de soja descritos en la técnica previa, al proporcionar dos o más agentes tóxicos para las especies de plagas de lepidópteros y en el cual ninguno de los agentes tóxicos se ha incluido anteriormente en ninguna planta de soja con el fin de controlar las plagas de lepidópteros de la soja.

Para producir una planta transgénica que contenga un único evento de transformación, se transfiere una parte de una construcción de a Dn recombinante en el genoma de una célula de soja y, posteriormente, se cultiva la célula de soja en una planta. Una célula de soja, a la cual se transfiere inicialmente el evento, se regenera para producir la generación R0. La planta R0 y las plantas de la progenie de la planta R0 pueden ser evaluadas para determinar cualquier rasgo deseado, pero la efectividad del evento se puede ver afectada por factores cis y/o trans con respecto al sitio de integración en el evento de transformación. El fenotipo conferido por el evento también se puede ver afectado por el tamaño y el diseño de la construcción de ADN, el cual puede variar por la combinación de elementos genéticos en un casete de expresión, la cantidad de transgenes, la cantidad de casetes de expresión y la configuración de dichos elementos y dichos casetes. La identificación de un evento con rasgos deseables puede verse adicionalmente complicada por factores como los patrones de desarrollo, diurnos, temporales o espaciales de expresión de un transgén de la planta, o por factores extrínsecos, por ejemplo, condiciones ambientales de crecimiento de las plantas, disponibilidad de agua, disponibilidad de nitrógeno, calor o presión. Por lo tanto, la capacidad para obtener un evento que confiere un conjunto deseado de rasgos fenotípicos no es predecible.

Compendio de la invención

La invención proporciona plantas de soja transgénicas que comprenden el evento MON87751 que presenta propiedades y un rendimiento superior en comparación con las plantas de soja transgénicas existentes y con los nuevos eventos construidos en forma paralela. El evento de soja MON87751 contiene dos casetes de expresión conectados en un único locus de inserción en el genoma de la soja que confieren independientemente el rasgo de resistencia a las plagas de insectos lepidópteros. Al combinarse, los dos casetes de expresión conectados en el evento de soja MON87751 proveen dos modos de acción contra especies de plagas de insectos del orden Lepidoptera que incluyen Chrysodeixis spp., Spodoptera spp., Helicoverpa spp., Crocidosema spp., Rachiplusia spp., Anticarsia spp., Elasmopalpus spp. y Plathypena spp. El modo de acción dual implica la redundancia de control insecticida contra especies de plagas lepidópteras y reduce en forma significativa la probabilidad de desarrollo de resistencia a los rasgos de control de plagas.

La invención proporciona una molécula de ADN recombinante detectable en una muestra que contiene ADN de soja, en la que la secuencia de nucleótidos de dicha molécula es la SEQ ID NO: 10; o una secuencia de nucleótidos completamente complementaria a la SEQ ID NO: 10, en la que la detección de la presencia de tal molécula de ADN es diagnóstica del a Dn del evento MON87751 de soja en dicha muestra. La invención proporciona además un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN que funcionan como cebadores de ADN cuando se usan juntas en una reacción de amplificación con una muestra que contiene ADN molde del evento de soja MON87751 para producir un amplicón. diagnóstico de dicho ADN del evento de soja MON87751 en dicha muestra, en el que dicho amplicón comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10.

También se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de un segmento de ADN diagnóstico para el ADN del evento de soja MON87751 en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento:

a) poner en contacto dicha muestra con un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN que funcionan como cebadores de ADN cuando se usan juntas en una reacción de amplificación con una muestra que contiene ADN de molde del evento MON87751 de soja para producir un diagnóstico de amplicón para dicho ADN del evento de soja MON87751 en dicha muestra en el que dicho amplicón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 10;

b) realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN; y

c) detectar la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción, en la que dicho amplicón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la s Eq ID NO:1, la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:7, la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO: 10, y en la que dicha detección de la presencia de dicho amplicón es diagnóstico del ADN del evento de soja MON87751.

Se proporciona además una planta de soja, parte de planta de soja o célula de soja de la misma que comprende una molécula de polinucleótido recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10, en la que la planta de soja, parte de planta de soja o célula de soja de la misma expresa una proteína Cry2Ab y una proteína Cry1A.105 de un casete de expresión transgénica y es insecticida cuando se proporciona en la dieta de una plaga de insectos lepidópteros. La planta de soja, parte de la planta de soja o la célula de soja puede ser insecticida para una plaga de insectos lepidópteros seleccionada del grupo que consiste en Chrysodeixis spp., Spodoptera spp., Helicoverpa spp., Crocidosema spp., Rachiplusia spp., Anticarsia spp., Elasmopalpus spp. Y Plathypena spp. La planta de soja, parte de la planta de soja o la célula de soja puede definirse además como una progenie de cualquier generación de una planta de soja que comprenda dicho evento de soja MON87751.

En otra realización más de la invención, se proporciona un procedimiento para proteger una planta de soja de la infestación de insectos, en el que dicho procedimiento comprende proporcionar en la dieta de una plaga de lepidópteros de la soja una cantidad insecticidamente eficaz de células o tejido de la planta de soja que comprende la SEQ ID NO: 10.

También se proporciona una semilla de soja que comprende una cantidad detectable de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10, en la que la planta de soja, parte de la planta de soja o la célula de soja de la misma que se puede obtener de la semilla expresa una proteína Cry2Ab y una proteína Cry1A.105 de un casete de expresión transgénica y es insecticida cuando se proporciona en la dieta de una plaga de insectos lepidópteros o una planta de soja, parte de planta de soja o semilla de soja de la misma que comprende ADN funcional como molde cuando se prueba en un procedimiento de amplificación de ADN que produce un diagnóstico de amplicón para la presencia de la SEQ ID NO: 10.

Es otra realización de la invención proporcionar un procedimiento para determinar la cigosidad de una planta de soja o semilla de soja que comprende la s Eq ID NO: 10 que comprende:

d) poner en contacto una muestra que comprende ADN de soja con un conjunto de cebadores capaz de producir un primer diagnóstico de amplicón para la SEQ ID NO: 10 y un segundo diagnóstico de amplicón para ADN genómico de soja natural que no comprende la SEQ ID NO: 10;

i) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico con dicha muestra y dicho conjunto de cebadores; y ii) detectar en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico dicho primer amplicón de diagnóstico para la SEQ ID NO: 10, o dicho segundo amplicón de diagnóstico para el ADN genómico de la soja natural que no comprende el evento MON87751;

en el que la presencia de solo dicho primer amplicón es diagnóstico de un ADN homocigótico de la SEQ ID NO: 10 en la muestra y la presencia tanto de dicho primer amplicón como de dicho segundo amplicón es diagnóstico de una planta heterocigótica de la soja para el alelo de la SEQ ID NO: 10; o

e) poner en contacto una muestra que comprende ADN de soja con un conjunto de sondas que contiene al menos una primera sonda que hibrida específicamente con el ADN de la SEQ ID NO: 10 y al menos una segunda sonda que se hibrida específicamente con el ADN genómico de soja que fue alterado por la inserción del ADN heterólogo de la SEQ ID NO: 10 y no hibrida con el ADN de la SEQ ID NO: 10,

i) hibridar el conjunto de sondas con dicha muestra en condiciones rigurosas de hibridación,

en la que detectar la hibridación de solo dicha primera sonda bajo dichas condiciones de hibridación es diagnóstico para un alelo homocigótico de ADN de la SEQ ID NO: 10 en dicha muestra, y en la que detectar la hibridación tanto de dicha primera sonda como de dicha segunda sonda bajo dichas condiciones de hibridación es diagnóstico de un alelo heterocigoto del ADN de la SEQ ID NO: 10 en dicha muestra.

En la Figura 1 se ilustra la posición de los segmentos de nucleótidos de la presente invención entre sí y dentro del genoma de soja, y la secuencia de nucleótidos de cada uno se ilustra tal como se presenta en la SEQ ID NO:10. Los segmentos de nucleótidos que caracterizan el evento MON87751 y que sirven como diagnóstico de la presencia del evento MON87751, o de la construcción comprendida en él, en una muestra incluyen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10.

La presencia de una, dos o más de estas secuencias de nucleótidos en una muestra, cuando dicha muestra contiene tejido de soja y, por lo tanto, ADN de soja, representa un diagnóstico de la presencia del evento MON87751.

El uso de la palabra “derivado” implica que una molécula de ADN específica se encuentra en el genoma de la planta de soja o que es capaz de ser detectada en el ADN de la planta de soja. “Capaz de ser detectada” se refiere a la capacidad de un segmento de ADN específico de ser amplificado y de que su tamaño o su secuencia sean caracterizados o elucidados mediante análisis de secuencia de ADN. Asimismo, la expresión se puede referir a la capacidad de una sonda de unirse específicamente al segmento de ADN específico, es decir, el segmento de ADN diana, y a la capacidad posterior de detectar la unión de la sonda a la diana. El segmento de ADN específico o el segmento de a Dn diana de la presente invención se encuentra presente dentro de la soja que contiene el evento de inserción MON87751.Al hacer referencia a la soja, se entiende que las células de soja, semillas de soja, partes de plantas de soja y plantas de soja se encuentran comprendidas por el alcance de la presente invención siempre que cada realización contenga una cantidad detectable de ADN correspondiente a uno, dos o más de los segmentos descritos en la presente como diagnósticos de la presencia del ADN del evento de soja MON87751. Las partes de las plantas de soja incluyen células, polen, óvulos, flores, vainas, semilla, tejido de la raíz, tejido del tallo y tejido de las hojas.

El ADN del evento de soja MON87751 puede estar presente en cada célula y en cada genoma en un cromosoma de la planta de soja, la semilla de soja y los tejidos de soja que contengan el evento. Como el genoma de soja se transmite a la progenie de forma mendeliana, si una planta de soja fuera homocigota para la inserción del evento MON87751, cada planta y célula de soja de la progenie contendría el ADN del evento en cada alelo del cromosoma parental con la inserción del evento MON87751 y heredado por la progenie de los padres. Sin embargo, si el genoma de soja que contiene el ADN del evento MON87751 es un padre heterocigoto o híbrido, entonces aproximadamente el cincuenta por ciento del polen y aproximadamente el cincuenta por ciento de los óvulos que participan en el apareamiento de los padres híbridos contendrá el ADN del evento de soja MON87751, lo que daría como resultado una población de progenie mezclada que contiene el ADN del evento MON87751 y el porcentaje de dicha progenie derivada de estos cruzamientos con híbridos que transmiten el ADN del evento MON87751 a dicha progenie puede oscilar entre aproximadamente el cincuenta y aproximadamente el setenta y cinco por ciento.

Las moléculas de ADN desveladas en el presente documento pueden ser exclusivas para las dos uniones separadas en cada extremo del ADN del evento transgénico MON87751 insertado y el ADN del genoma de soja que es adyacente, es decir, que flanquea, cada extremo del ADN insertado MON87751, o exclusivas para el ADN insertado del evento de soja MON87751. Estas moléculas, cuando están presentes en una muestra específica analizada por los procedimientos descritos en la presente que utilizan sondas, cebadores y, en algunos casos, análisis de las secuencias de ADN, pueden ser diagnósticos de la presencia de una cantidad de soja del evento MON87751 en esa muestra. Se pueden identificar y caracterizar estas moléculas de ADN exclusivas del ADN del evento de soja MON87751 de diversas maneras, incluso mediante el uso de moléculas de ácido nucleico de la sonda diseñadas para unirse específicamente a las moléculas de ADN exclusivas, seguido de la detección de la unión de dichas sondas al ADN exclusivo y mediante procedimientos de amplificación térmica que utilizan al menos dos moléculas de ADN diferentes que actúan como sondas, pero la secuencia de dichas moléculas puede ser algo menos específica que las sondas descritas anteriormente. Los expertos en la técnica comprenden que poner un ADN diana específico en contacto con una sonda o un cebador en condiciones de hibridación adecuadas dará como resultado la unión de la sonda o del cebador al segmento de ADN diana.

Las moléculas de ADN desveladas en el presente documento pueden ser segmentos diana de ADN que pueden ser capaces de amplificación y que, cuando se detectan como uno o más amplicones de la longitud representada obtenida por procedimientos de amplificación de una muestra específica, pueden ser diagnósticos de la presencia del evento MON87751 en dicha muestra. Dichas moléculas de ADN o segmentos de polinucleótidos pueden tener las secuencias de nucleótidos que se presentan en cada una de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10.

y se definen adicionalmente en la presente y en los ejemplos que se encuentran más adelante. Se pueden proporcionar moléculas de cebadores y/o sondas en forma de kit junto con los reactivos necesarios, e incluso los controles, y envasados junto con instrucciones de uso.

Las moléculas de ADN recombinante desveladas en el presente documento pueden estar presentes dentro de un microorganismo o derivar de él. Un microorganismo incluye cualquier célula microscópica, ya sea procariota o eucariota o que contiene ADN en otra forma dentro de un genoma o cromosoma o una estructura de ADN extracromosómica, denominada más comúnmente plásmido o vector. En una realización, los organismos microscópicos pueden incluir bacterias (procariotas) y células que corresponden a formas vivas superiores (eucariotas) que se encuentran debajo del rango visual del ser humano promedio, usualmente inferiores a cincuenta micrones cúbicos y más generalmente, inferiores a diez micrones cúbicos. Las bacterias son microorganismos microscópicos comunes que pueden contener un vector o plásmido que contiene uno o más o todos los segmentos de ADN novedosos desvelados en el presente documento.

Las células vegetales, y en particular las células de planta de la soja pueden comprender cualquiera de uno, dos o más o todos los segmentos de ADN novedosos.

Las sondas a ser utilizadas en la presente pueden comprender moléculas de ADN o segmentos de polinucleótidos de una longitud suficiente para funcionar en condiciones rigurosas de hibridación, según se define en la presente, para unirse a un segmento de ADN diana específico, es decir, un segmento exclusivo de ADN presente en y diagnóstico de la presencia del ADN del evento MON87751 en una muestra. Se puede diseñar esta sonda para unirse solo a una única unión o a otra secuencia novedosa presente únicamente en el ADN del evento de soja MON87751 o dos o más de estos segmentos de unión únicos. La detección de la unión de dicha sonda a una molécula de ADN en una muestra específica que se sospecha que contiene ADN de soja es diagnóstica de la presencia del evento de soja MON87751 en la muestra.

Los cebadores pueden comprender pares de oligonucleótidos o segmentos de polinucleótidos diferentes para utilizar en una reacción de amplificación térmica que amplifica un segmento diana de ADN específico. Cada cebador en el par está diseñado para unirse a un segmento de ADN bastante específico dentro o cerca de un segmento de ADN de interés para la amplificación. Los cebadores se unen de tal modo que estos después actúan como regiones localizadas de polimerización de secuencia de ácidos nucleicos que dan lugar a la producción de uno o más amplicones (segmentos de ADN diana amplificados). En la presente invención, el uso de cebadores diseñados para unirse a segmentos exclusivos del ADN del evento de soja MON87751 en una muestra biológica específica y que amplifican amplicones específicos que contienen uno o más de los segmentos de unión descritos en la presente y la detección y/o caracterización de dichos amplicones tras la finalización o terminación de la reacción de la polimerasa, sirve como diagnóstico de la presencia del evento de soja MON87751 en la muestra específica. Los expertos en la técnica conocen bien este procedimiento de amplificación y no es necesario describir los detalles específicos de la amplificación en la presente.

Las plantas de soja, las células de plantas de soja, los tejidos de plantas de soja y las semillas de soja de la presente invención pueden ser resistentes a la infestación por plagas de insectos lepidópteros que incluyen, entre otras, Chrysodeixis spp., Spodoptera spp., Helicoverpa spp., Crocidosema spp., Rachiplusia spp., Anticarsia spp., Elasmopalpus spp. y Plathypena spp. La resistencia a la infestación por las especies de lepidópteros surge con relación a la expresión de dos segmentos de ADN diferentes que codifican dos proteínas insecticidas diferentes, que están unidas operativa y covalentemente dentro del ADN transgénico insertado: una proteína Cry2Ab expresada a partir del casete de expresión en el extremo proximal 5' del ADN transgénico insertado como se presenta en la SEQ ID NO:10 y se ilustra en la figura 2; y una proteína Cry1A.105 expresada a partir del casete de expresión en el extremo 3'del ADN transgénico insertado como se presenta en la SEQ ID NO:10 y se ilustra en la figura 2. La proteína Cry2Ab se expresa a partir de un promotor de At.Act2, mientras que la proteína Cry1A.105 se expresa a partir de un promotor de At.RbcS4. Las proteínas Cry2Ab y Cry1A.105 son agentes tóxicos para las especies de plagas de insectos lepidópteros.

La construcción utilizada para generar el evento de soja MON87751 tiene los promotores que activan la expresión de las proteínas Cry2Ab y Cry1A.105 ubicados en una orientación de transcripción en tándem relativa de modo que la expresión de cada promotor de las proteínas Cry respectivas continúa en la misma dirección, pero cada uno a partir de sus promotores respectivos separados (véase la figura 2). Otras construcciones que se evaluaron variaron en la combinación del uso de elementos de expresión, es decir, potenciador (E), promotor (P), líder (L), intrones (I), péptido de direccionamiento de cloroplastos (CTP) y 3'UTR (T). Además, las construcciones contenían una pila de vectores de ambas proteínas Cry (Cry2Ab y Cry1A.105) o contenían una proteína Cry única, es decir, Cry2Ab o Cry1A.105. Otra variación en las construcciones de expresión fue la orientación relativa de los dos casetes para las proteínas Cry en las construcciones de la pila de vectores. Específicamente, los dos casetes se encontraban en una orientación de transcripción en tándem o los dos casetes se encontraban en una orientación divergente de modo que la expresión de cada promotor de las dos proteínas de Cry está lejos de un punto centrado entre los dos promotores, es decir, la transcripción de cada casete de expresión procede en direcciones opuestas y no converge. La secuencia de ADN codificante de Cry1A.105 tenía diversificación de la secuencia en algunas construcciones con relación a la secuencia en el transgén insertado en el evento MON87751. Finalmente, en dos de las construcciones con los dos casetes de expresión de Cry orientados en orientación inversa de transcripción, se ubicaron los potenciadores de trascripción entre los promotores divergentes (véase la figura 2).

Se seleccionó el evento MON87751 basándose en comparaciones con miles de eventos transgénicos independientes diferentes, cada uno transformado con una de las construcciones que contenía un segmento T-ADN como se ilustra en la figura 2 y con el evento MON87701 y/o el evento GM_A19478 (generado al mismo tiempo que MON87701 y que ambos expresan Cry1Ac); con un evento transgénico 40-3-2 (que confiere tolerancia al herbicida glifosato); y con la soja de control no transgénica (A3555 o A5547). Los resultados que se ilustran a continuación en los ejemplos muestran que el evento MON87751 presentó propiedades superiores debido a la expresión de las proteínas Cry2Ab y Cry1A.105. La pluralidad de eventos transgénicos producidos con la construcción utilizada para generar el evento MON87751 tenían, cada uno, más probabilidad de presentar un control eficaz de las plagas de insectos lepidópteros que otros eventos producidos con otras construcciones.

Las plantas de soja y sus partes, incluidas las semillas, que contienen el ADN correspondiente al evento MON87751 se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Estas plantas y sus partes, incluidas las semillas, son resistentes a la infestación de lepidópteros. En determinadas realizaciones, dichas plantas y semillas incluyen híbridos y plantas endogámicas, y plantas y semillas que contienen un solo alelo del evento MON87751, es decir, un genoma caracterizado como heterocigoto con referencia al locus correspondiente al ADN del evento MON87751. Se pueden producir estos híbridos mediante el fitomejoramiento de plantas que comprenden el evento MON87751 con un germoplasma deseable como parte del proceso de desarrollo de la variedad comercial y de otras propiedades deseables de la soja desde el punto de vista agrícola. Se pueden producir los híbridos mediante cualquier cantidad de procedimientos, pero un procedimiento preferido aprovecha un primer padre endogámico (homocigoto) que contiene el alelo específico del evento MON87751 en ambos cromosomas en el locus en el cual se inserta el ADN del evento MON87751 y se fitomejora la primera planta endogámica junto con una segunda planta endogámica que no contiene el ADN de MON87751. Ambas variedades endogámicas parentales tendrán una o más propiedades beneficiosas deseables en la semilla de la progenie, es decir, en la semilla híbrida, y estas semillas híbridas son heterocigotas para el alelo del evento MON87751

Una propiedad o alelo transgénico que confiere algún rasgo adicional a una planta que contiene el ADN del evento MON87751 puede ser deseable. Otros de estos alelos transgénicos que confieren rasgos deseables pueden incluir tolerancia al herbicida: GTS 40-3-2, MON87708, MON89788, A2704-12, A2704-21, A5547-35, A5547-127, BPS-CV127-9, DP356043, GU262, W62, W98, DAS-44406-6, DAS-68416-4, FG72, BPS-CV127-9, SYHT04R, SYHT0H2, 3560.4.3.5, EE-GM3, pDAB4472-1606, pDAB4468-0416, pDAB8291.45.36, 127, AAD-12; resistencia a insectos: MON87701, DAS-81419-2; composición oleica mejorada aumentada: DP-305423, G94-1, G94-19, G168, OT96-15, MON87705, MON87769; rendimiento aumentado: MON 87712, o rasgos de fijación de nitrógeno, rasgos que modulan el uso de agua, resistencia a la infestación fúngica, resistencia a la infestación por nemátodos y similares. Una propiedad no transgénica (por ejemplo, QTL o grupo de madurez) también puede conferir un rasgo deseable y el experto en la técnica sabrá cómo fitomejorar la soja para que contenga dicho rasgo no transgénico y el ADN del evento MON87751.

Los aspectos anteriores y otros aspectos de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación esquemática de las posiciones relativas, ilustradas por cada línea horizontal, de los segmentos del ADN transgénico heterólogo, el ADN genómico flanqueante, las uniones de ADN insertado/genómico 5' y 3' designadas arbitrariamente y las posiciones relativas de la secuencia exclusiva para el evento MON87751 dentro del ADN transgénico heterólogo que se pueden utilizar para identificar el evento de soja MON87751; las líneas horizontales marcadas [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] y [26] corresponden a la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26, respectivamente; la línea horizontal con una barra gruesa representa el compuesto del ADN transgénico heterólogo insertado en el evento MON87751 (SEQ ID NO:9) y el ADN genómico flanqueador 5' y 3' y es una representación de la SEQ ID NO:10 que contiene la SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:8; las flechas horizontales gruesas designadas SQ26901, SQ20267, SQ25826 y SQ27115, corresponden a la SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:14, respectivamente; las flechas horizontales finas representan la organización relativa de los dos casetes de expresión separados del ADN transgénico heterólogo insertado del evento MON87751, P representa un elemento promotor, L representa un líder, P-L representa un promotor y un líder, I representa un intrón, CTP representa un péptido de tránsito al cloroplasto, Cry2Ab representa la región codificante para la proteína Cry2Ab, T=3' terminación de transcripción y elemento de poliadenilación (3' UTR) y Cry1A.105 representa la región codificante para la proteína Cry1A.105.

La figura 2 ilustra el segmento T-ADN codificante del casete de expresión de la proteína Cry en las once construcciones de transformación utilizadas para generar los eventos de soja transgénicos evaluados durante la selección del evento de soja MON87751 y la composición de cada casete de expresión de la proteína Cry dentro de cada construcción.

La figura 3 es una representación gráfica de los resultados del análisis de ELISA de la expresión de la proteína Cry en los eventos generados con la construcción 1, la construcción 2 y la construcción 3, en comparación con una línea de soja no transgénica (A3555). El panel A. muestra los niveles de la proteína Cry2Ab en tejido de hojas recolectado en las etapas R1 y R3 del crecimiento de la planta. El panel B. muestra los niveles de la proteína Cry1A.105 en tejido de hojas recolectado en las etapas R1 y R3 del crecimiento de la planta.

La figura 4 es una representación gráfica de los resultados del análisis de ELISA de la expresión de la proteína Cry en los eventos generados con la construcción 1, la construcción 5, la construcción 6 y la construcción 4, en comparación con una línea de soja no transgénica (A3555). El panel A. muestra los niveles de la proteína Cry2Ab en tejido de hojas recolectado en la etapa R3 del crecimiento de la planta de las plantas cultivadas en dos ensayos con doseles separados. El panel B. muestra los niveles de la proteína Cry1A.105 en tejido de hojas recolectado en la etapa R3 del crecimiento de la planta de las plantas cultivadas en dos ensayos con doseles separados.

La figura 5 es una representación gráfica de los resultados del análisis de ELISA de la expresión de la proteína Cry2Ab en los eventos generados con la construcción 1, la construcción 2, la construcción 3, la construcción 4, la construcción 5, la construcción 6, la construcción 9, la construcción 7 y la construcción 11 para las muestras de hojas recolectadas en la etapa R3 y R5 del crecimiento de la planta.

La figura 6 es una representación gráfica de los resultados del análisis de ELISA de la expresión de la proteína Cry21A.105 en los eventos generados con la construcción 1, la construcción 2, la construcción 3, la construcción 4, la construcción 5, la construcción 6, la construcción 9, la construcción 7 y la construcción 11 para las muestras de hojas recolectadas en la etapa R3 y R5 del crecimiento de la planta. El eje Y del panel A graficado a 0 -5000 ppm de peso seco y el eje Y del panel B graficado a 0-500 ppm de peso seco para ilustrar mejor en el panel B los datos para la etapa R3.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO:1 es una secuencia de veinte nucleótidos que representa la región de unión 5' del ADN genómico de soja y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:1 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1325-1344.

SEQ ID NO:2 es una secuencia de veinte nucleótidos que representa la región de unión 3' del ADN genómico de soja y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:2 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 11444-11463.

SEQ ID NO:3 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la región de unión 5' del ADN genómico de soja y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:3 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1305-1364.

SEQ ID NO:4 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la región de unión 3' del ADN genómico de soja y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:4 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 11424-11483.

SEQ ID NO:5 es una secuencia de cien nucleótidos que representa la región de unión 5' del ADN genómico de soja y el casete de expresión transgénico integrado. s Eq ID NO:5 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 1285-1384.

SEQ ID NO:6 es una secuencia de cien nucleótidos que representa la región de unión 3' del ADN genómico de soja y el casete de expresión transgénico integrado. SEQ ID NO:6 está ubicada en la SEQ ID NO:10 en la posición de nucleótidos 11404-11503.

SEQ ID NO:7 es una secuencia de 1626 nucleótidos que representa la secuencia genómica de soja flanqueante 5' hasta e incluida la unión del ADN genómico y del a Dn transgénico insertado, e incluye (5' a 3') 1334 del ADN genómico flanqueante y 292 nucleótidos del extremo 5' designado arbitrariamente del ADN transgénico insertado. SEQ ID NO:8 es una secuencia de 1452 nucleótidos que representa la secuencia genómica de soja flanqueante hasta e incluida la unión del ADN genómico y del ADN transgénico insertado, e incluye (5' a 3') 265 nucleótidos del extremo 3' designado arbitrariamente del ADN transgénico insertado y 1187 nucleótidos del ADN genómico flanqueante 3'.

SEQ ID NO:9 es una secuencia de 10119 nucleótidos correspondiente al ADN transgénico insertado en el genoma del evento de soja MON87751.

SEQ ID NO:10 es una secuencia de 12640 nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos compuesta del ADN genómico transgénico insertado en el evento MON87751 y las secuencias de nucleótidos de ADN genómicas flanqueantes 5' y la secuencia de nucleótidos de ADN genómica flanqueante 3' e incluye la SEQ ID NO:7 y la SEQ ID NO:9 y la SEQ ID NO:8.

SEQ ID NO: 11 es una secuencia de 27 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ20267, que se utiliza para identificar el ADN del evento de soja MON87751 en una muestra, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 11400 a 11426 de la SEQ ID NO:10. SEQ ID NO:12 es una secuencia de 26 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ25826, que se utiliza para identificar el ADN del evento de soja MON87751 en una muestra, y es idéntica al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 11454 a 11479 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:13 es una secuencia de 19 nucleótidos correspondiente a una sonda denominada PB10263, que se utiliza para identificar el ADN del evento de soja MON87751 en una muestra, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 11428 a 11446 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:14 es una secuencia de 24 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ27115, que se utiliza para identificar la presencia del ADN del alelo natural de soja y/o el ADN del evento de soja MON87751 en una muestra, y es idéntica al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 11458 a 11481 de la SEQ iD NO:10.

SEQ ID NO:15 es una secuencia de 30 nucleótidos correspondiente a un cebador de amplificación térmica denominado SQ26901, que se utiliza en un ensayo de cigosidad para identificar la presencia del ADN del alelo natural en una muestra derivada de soja y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 1288 a 1317 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:16 es una secuencia de 18 nucleótidos correspondiente a una sonda denominada PB11254 y se utiliza en un ensayo de cigosidad para identificar la presencia del ADN del alelo natural en una muestra derivada de soja. SEQ ID NO:17 es una secuencia de 112 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es idéntica a las posiciones 36­ 147 en la SEQ ID n O:9 y a las posiciones 1370-1481 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:18 es una secuencia de 52 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es idéntica a las posiciones 1305­ 1356 en la SEQ ID No :9 y a las posiciones 1639-1690 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:19 es una secuencia de 283 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es idéntica a las posiciones 1561­ 1843 en la SEQ ID No :9 y a las posiciones 2895-3177 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:20 es una secuencia de 486 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es idéntica a las posiciones 2340­ 2825 en la SEQ ID No :9 y a las posiciones 3674-4159 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:21 es una secuencia de 179 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es idéntica a las posiciones 3326­ 3504 en la SEQ ID No :9 y a las posiciones 4660-4838 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:22 es una secuencia de 106 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es útil para identificar el ADN del evento MON87751 en una muestra y es idéntica a las posiciones 3749-3854 en la SEQ ID NO:9 y a las posiciones 5083-5188 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:23 es una secuencia de 60 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es útil para identificar el ADN del evento MON87751 en una muestra y es idéntica a las posiciones 9320-9379 en la SEQ ID NO:9 y a las posiciones 10654-10713 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:24 es una secuencia de 66 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es útil para identificar el ADN del evento MON87751 en una muestra y es idéntica a las posiciones 9620-9685 en la SEQ ID NO:9 y a las posiciones 10954-11019 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:25 es una secuencia de 156 nucleótidos correspondiente a una secuencia de nucleótidos exclusiva en el ADN transgénico (SEQ ID NO:9) insertado en el evento de soja MON87751 y es útil para identificar el ADN del evento MON87751 en una muestra y es idéntica a las posiciones 9720-9875 en la SEQ ID NO:9 y a las posiciones 11054-11209 en la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:26 es una secuencia de 1905 nucleótidos correspondiente al marco de lectura abierto codificante de la proteína Cry2Ab expresada en el evento de soja MON87751.

Descripción detallada

Los inventores han identificado un evento transgénico de soja MON87751 que presenta resistencia aceptable desde el punto de vista comercial a plagas de insectos importantes desde el punto de vista agrícola en el orden Lepidoptera como Spodoptera frugiperda (fall armyworm, FAW), Spodoptera eridania (southern armyworm, SAW), Spodoptera exigua (beet armyworm, BAW), Spodoptera ornithogalli (yellowstriped armyworm, YSAW), Crocidosema aporema (bean shoot moth, BSM), Rachiplusia nu (sunflower looper, SFL), Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar, VBC), Chrysodeixis includens (soybean looper, SBL), Helicoverpa zea (soybean podworm, SPW), Helicoverpa gelotopeon (South American bollworm), Elasmopalpus lignosellus, (lesser cornstalk borer), Estigmene acrea (saltmarsh caterpillar) y Plathypena scabra (green cloverworm) entre otros. El evento proporciona dos casetes de expresión diferentes, unidos funcionalmente, uno codificante de la proteína insecticida Cry2Ab y el otro de Cry1A.105, y proporciona dos modos de acción diferentes para la resistencia a la soja de las infestaciones de lepidópteros. Otros eventos de soja transgénicos se conocen en la técnica, es decir MON 88701, que expresa una proteína de toxina CrylAc Bacillus thuringiensis (Bt) (MacRae y col. 2005, Fischhoff y Perlak 1995). MON 88701 proporciona un único modo de acción para la resistencia a las plagas de insectos lepidópteros importantes de la soja, aunque la eficacia contra Spodoptera spp. no es significativa. Sería preferible proporcionar soja transgénica que exprese dos o más proteínas insecticidas diferentes que presenten eficacia contra las principales plagas de la soja e incluido el control de Spodoptera spp. Los inventores proporcionan al menos una solución a este problema en la forma del evento de soja MON87751, que combina dos casetes de expresión unidos por enlace covalente en un locus dentro del genoma de la soja, los cuales casetes confieren los rasgos de resistencia a las especies de lepidópteros expandidas, y adicionalmente, proporciona a las células de soja, tejidos de soja, hojas de soja, vainas de soja, semillas de soja y plantas de soja más de un modo de acción para prevenir o retrasar el desarrollo de la resistencia entre las especies de Lepidoptera.

El evento de soja MON87751 fue producido a través de un proceso de transformación mediado por Agrobacterium del tejido meristemático de la soja con la construcción del plásmido 1. La construcción del plásmido contiene dos regiones, cada una unida por segmentos fronterizos de Agrobacterium (segmento T-ADN). El primer segmento T-ADN contiene dos casetes de expresión de la planta unidos, un casete de expresión codificante de un marcador de selección y un casete de expresión codificante de un marcador calificable. El segundo segmento T-ADN contiene dos casetes de expresión de la planta unidos con los elementos genéticos reguladores necesarios para la expresión en células de plantas de soja de dos proteínas insecticidas diferentes, Cry2Ab y Cry1A.105. Debido a los dos segmentos T-ADN en la construcción del plásmido 1, el segmento T-ADN que contiene los genes del marcador de selección/calificable insertados aleatoriamente en el genoma de soja y en un sitio separado del sitio de integración del segmento T-ADN que contiene los casetes de expresión de Cry2Ab y de Cry1A.105, lo cual permite la segregación de los dos segmentos T-ADN dentro del genoma de las plantas de soja transformadas durante el proceso de autofertilización y/o retrocruzamiento, por ejemplo, la evaluación de R1 y la generación superior de plantas transgénicas. Se regeneraron las células de soja transformadas en plantas de soja intactas y se seleccionaron plantas individuales de la población de plantas que presentaron integridad del segundo segmento T-ADN codificante de las proteínas Cry2Ab y Cry1A.105. En R1 y en las generaciones posteriores, se seleccionaron eventos basándose en la integridad del segundo segmento T-ADN codificante de las proteínas Cry2Ab y Cry1A.105, y en la ausencia (es decir, segregación) del primer segmento T-ADN codificante de los casetes de marcadores de selección/calificables, y para las plantas que no contenían ninguna secuencia de la cadena principal del plásmido. La expresión de las proteínas tóxicas insecticidas Cry2Ab y Cry1A.105 en las células del evento de soja MON87751 confiere resistencia a las plagas de insectos lepidópteros cuando se proporcionan las células de soja del evento MON87751 en la dieta de los insectos.

Se caracterizó el ADN plasmídico insertado en el genoma del evento de soja MON87751 mediante análisis moleculares detallados. Estos análisis incluyeron: el número del inserto (número de los sitios de integración dentro del genoma de soja), la ubicación del inserto genómico (el sitio específico en el genoma de soja en donde se produjo la inserción), la cantidad de copias (la cantidad de copias del T-ADN dentro de un locus) y la integridad del ADN transgénico insertado. La construcción del plásmido que contiene los dos casetes de expresión unidos insertados en el genoma de soja que dan lugar al evento MON87751 contiene múltiples segmentos (secuencias de unión entre los elementos utilizados para construir los diversos casetes de expresión) que no se sabe que aparezcan naturalmente en el genoma de soja ni en otros vectores o eventos transgénicos de soja o de otro tipo (por ejemplo, secuencias como se presenta en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26). Además, el evento de transformación que dio lugar al ADN transgénico insertado en el evento MON87751 se caracteriza en la presente como una inserción en un único locus en el genoma de soja, lo que da como resultado dos nuevos loci o secuencias de unión entre el ADN insertado y el ADN del genoma de soja. También se caracterizan en la presente secuencias exclusivas adicionales dentro del ADN heterólogo insertado en el genoma de soja del evento MON87751 y que tienen una longitud suficiente para ser exclusivas solamente para un genoma de soja que comprende el ADN del evento MON87751. Estas secuencias de unión son útiles para detectar la presencia del ADN del evento MON87751 en las células de soja, tejidos de soja, semillas de soja y plantas de soja o productos derivados de plantas de soja (productos básicos de soja). En la presente, se describen pares de cebadores y sondas moleculares de ADN que se han desarrollado para utilizar en la identificación de la presencia de estos diversos segmentos de unión en las muestras biológicas que contenían o que se sospecha que contenían células de soja, semillas de soja, partes de plantas de soja o tejido de plantas de soja que contiene el ADN del evento MON87751. Los datos muestran que el evento MON87751 contiene una única inserción de T-ADN con una copia del ADN transgénico insertado. No se han identificado elementos adicionales de la construcción de transformación 1 más que las partes de las regiones del borde derecho e izquierdo de Agrobacterium tumefaciens utilizadas para la transferencia del ADN transgénico del plásmido de transformación de la planta al genoma de soja en el ADN del evento MON87751. Finalmente, se realizó la amplificación térmica que produjo amplicones específicos que son un diagnóstico para la presencia de dicho ADN del evento MON87751 en una muestra, y se realizaron análisis de las secuencias de ADN para determinar las uniones del genoma inserto a planta 5' y 3' designadas arbitrariamente, confirmar la organización de los elementos dentro del inserto y determinar la secuencia de ADN completa del ADN del transgén insertado (SEQ ID NO:9) en el evento de soja MON87751.

Se produjeron docenas de eventos transgénicos con la construcción de transformación 1 utilizada para producir el evento transgénico de soja MON87751 y se generaron diez construcciones de transformación adicionales y se utilizaron para producir muchas docenas de otros eventos transgénicos de soja que se compararon con el evento de soja MON87751 y con eventos de soja similares. Se evaluaron estos eventos por ensayo ELISA para la expresión en el tejido de las hojas de las dos proteínas insecticidas Cry2Ab y Cry1A.105. Se evaluaron un subconjunto de los eventos producidos a partir de cada transformación y la mayoría de las construcciones en cuanto a la eficacia para controlar las plagas de insectos lepidópteros en ensayos con doseles en parcelas pequeñas. Se determinó que los elementos de expresión de las plantas y la orientación relativa de los casetes de expresión Cry2Ab y Cry1A.105 en la construcción de transformación 1 proporcionaron los eventos con la mejor eficacia contra el espectro más amplio de plagas de insectos lepidópteros evaluado.

A menos que se indique lo contrario en la presente, los términos se entenderán de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica. Las definiciones de los términos comunes en la biología molecular también se pueden encontrar en Rieger y col., Glossary o f Genetics: Classical and Molecular, 5a edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1994. Según se emplea aquí, el término “soja” significa Glycine max e incluye todas las variedades de plantas que se pueden reproducir con las plantas de soja que contienen el ADN del evento MON87751, incluso especies silvestres de soja así como las plantas que pertenecen al género Glycine que permiten el fitomejoramiento entre especies. Tal como se usa en la presente, la expresión "que comprende" significa "que incluye de modo no taxativo".

La presente invención proporciona plantas transgénicas que comprenden la SEQ ID NO: 10, que se han transformado con una construcción de ADN que contiene al menos dos casetes de expresión; un primer casete de expresión que expresa cantidades tóxicas de la proteína insecticida Cry2Ab y un segundo casete de expresión que expresa cantidades tóxicas de la proteína insecticida Cry1A.105. Por cantidad tóxica se entiende una cantidad eficaz, una cantidad insecticida, una cantidad insecticida eficaz, una cantidad eficaz como insecticida, una cantidad supresora del insecto diana, una cantidad pesticida eficaz, una cantidad en la dieta de los insectos del orden Lepidoptera que sea insecticida y otros términos similares que se deberán entender de acuerdo al uso convencional por los expertos en la técnica pertinente. Las plantas de soja transformadas de acuerdo con los procedimientos y con la construcción de ADN divulgada en la presente son resistentes a las plagas de insectos lepidópteros. Los rasgos agronómicos vinculados proporcionan facilidad para mantener estos rasgos juntos en una población de cultivo y muestran resistencia a un espectro más amplio de plagas de insectos lepidópteros que las plantas que contienen solo un único gen que confiere resistencia a las plagas de insectos lepidópteros (es decir, Cry1Ac).

Una “planta” transgénica se produce por la transformación de una célula de la planta con ADN heterólogo, es decir, una construcción de ácido polinucleico que incluye diversas características de interés eficaces; la regeneración de una planta que resulta de la inserción del transgén en el genoma de la célula de la planta y la selección de una planta específica caracterizada por la inserción en una ubicación del genoma particular y la cantidad de características eficaces de la planta transgénica regenerada. El término “evento” se refiere al ADN del transformante original que comprende el ADN insertado y que flanquea la secuencia genómica inmediatamente adyacente al ADN insertado. Dicho ADN es exclusivo y se esperaría que se transfiera a una progenie que reciba el ADN insertado incluido el transgén de interés como resultado de un cruce sexual de una línea parental que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie resultantes de la autofertilización) y una línea parental que no contiene el a Dn insertado. La presente invención también proporciona la planta transformante original y la progenie del transformante que incluye el ADN heterólogo. Dicha progenie se puede producir por un cruzamiento sexual entre plantas que comprenden el evento y otra planta en la cual la progenie incluye el ADN heterólogo. Incluso después del retrocruzamiento repetido con un padre recurrente, el evento está presente en la progenie del cruce en la misma ubicación cromosómica. La presente invención se refiere a la planta de soja del evento transgénico que comprende MON87751, a su progenie y a las composiciones de ADN contenidas allí.

Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al cual se puede unir una molécula señalizadora o indicadora detectable convencional, por ejemplo, un isótopo radiactivo, un ligando, un agente quimioluminiscente o una enzima. Dicha sonda es complementaria a una cadena de un ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención, a una cadena de ADN de MON87751, ya sea de una planta que contiene MON87751 o de una muestra que incluye ADN de MON87751. Las sondas de acuerdo con la presente invención no incluyen solamente ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico, sino que también incluyen poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y que se pueden utilizar para detectar la presencia de esa secuencia de ADN diana.

Los cebadores de ADN son ácidos polinucleicos aislados que se aparean a una cadena de ADN diana complementaria mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, después se extienden a lo largo de la cadena de ADN diana por una polimerasa, por ejemplo, una polimerasa de ADN. Un par de cebadores de ADN o un conjunto de cebadores de ADN de la presente invención se refiere a dos cebadores de ADN útiles para la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos diana, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácidos polinucleicos convencionales.

Las sondas de ADN y los cebadores de ADN pueden tener 11 polinucleótidos o más, o pueden tener 18 polinucleótidos o más, 24 polinucleótidos o más o 30 polinucleótidos o más de longitud. Se seleccionan dichas sondas y cebadores de una longitud suficiente para hibridar específicamente con una secuencia diana en condiciones de hibridación de rigurosidad alta. Preferentemente, las sondas y los cebadores desvelados en el presente documento tienen similitud de secuencia completa con la secuencia diana, aunque se pueden diseñar, a través de procedimientos convencionales, sondas que difieren de la secuencia diana que mantiene la capacidad de hibridarse con secuencias diana.

Se pueden utilizar los cebadores y las sondas basados en el ADN genómico flanqueante y en las secuencias de insertos divulgadas en la presente para confirmar (y, de ser necesario, para corregir) las secuencias de ADN divulgadas mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante reclonación y secuenciación de dichas moléculas de ADN.

Las sondas y los cebadores de ácido nucleico desvelados en el presente documento hibridan en condiciones rigurosas con una molécula de ADN diana. Se puede utilizar cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico para identificar la presencia de ADN de una planta transgénica en una muestra. Las moléculas de ácidos polinucleicos también denominadas segmentos o fragmentos de ácidos nucleicos de estas son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácidos nucleicos en determinadas circunstancias. Según se emplea aquí, se dice que dos moléculas de ácido polinucleico pueden hibridarse específicamente entre sí si las dos moléculas pueden formar una estructura de ácido nucleico antiparalela, de doble cadena. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el “complemento” de otra molécula de ácido nucleico si presentan complementariedad completa. Según se emplea aquí, se dice que las moléculas presentan “complementariedad completa” cuando todos los nucleótidos de una de las moléculas son complementarios a un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son “mínimamente complementarias” si se pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan apareadas entre sí en al menos condiciones de rigor bajo convencionales. De forma similar, se dice que las moléculas son “complementarias” si se pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan apareadas entre sí en condiciones de rigor alto convencionales. Las condiciones de rigurosidad convencionales se describen por Sambrook y col., 1989 y por Haymes y col., en: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Por lo tanto, puede permitirse el alejamiento de la complementariedad completa, siempre que dicho alejamiento no impida completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble cadena. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, sólo es necesario que su secuencia sea lo suficientemente complementaria para poder formar una estructura estable de doble cadena en la concentración de sal y solvente particulares que se emplean.

Según se emplea aquí, una secuencia sustancialmente homóloga es una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridará específicamente con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos con la cual se está comparando en condiciones de rigurosidad alta. Las condiciones de rigurosidad adecuadas que promueven la hibridación del ADN, por ejemplo, 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50 °C, son conocidas para los expertos en la técnica o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede ser seleccionada de una baja rigurosidad de alrededor de 2,0 x SSC a 50 °C a una rigurosidad elevada de alrededor de 0,2 x SSC a 50 °C. De manera adicional, la temperatura de la etapa de lavado puede aumentar de las condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, alrededor de 22 °C, a condiciones de rigurosidad elevada a alrededor de 65 °C. Es posible variar tanto la temperatura como la sal, o ya sea la temperatura o la concentración de sal pueden mantenerse constantes al tiempo que se cambia la otra variable.

Se hibridará un ácido polinucleico descrito en el presente documento específicamente con una o más de las moléculas de ácidos nucleicos presentadas en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 10, o sus complementos o fragmentos, en condiciones de rigurosidad moderada, por ejemplo, a aproximadamente 2,0 x SSC y aproximadamente 65 °C.

Se hibridará un ácido nucleico descrito en el presente documento específicamente con una o más de las moléculas de ácidos nucleicos presentadas en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 10, o complementos o fragmentos de estas, en condiciones de rigurosidad alta. Una molécula de ácidos nucleicos marcadora preferida de la presente invención tiene la secuencia de ácidos nucleicos que se presenta en la SEQ ID NO:1, o SEQ ID NO:2, o SEQ ID NO:3, o SEQ ID NO:4, o SEQ ID NO:5, o SEQ ID NO:6, o SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 o sus complementos o fragmentos. Se puede detectar la hibridación de la sonda con la molécula de ADN diana mediante cualquier cantidad de procedimientos conocidos para los expertos en la técnica, estos pueden incluir, entre otros, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioactivas, etiquetas basadas en anticuerpos y etiquetas quimioluminiscentes.

Con relación a la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, por PCR) utilizando un par de cebadores de amplificación específicos, las "condiciones de rigurosidad" son condiciones que permiten que el par de cebadores se hibride únicamente con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se uniría un cebador que tuviera la secuencia natural correspondiente (o su complemento) y, preferentemente, para producir un producto de amplificación exclusivo, el amplicón, en una reacción de amplificación térmica de ADN.

El término "específico para (una secuencia diana)" indica que una sonda o un cebador se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas solo con la secuencia diana en una muestra que comprende la secuencia diana.

Según se emplea aquí, “ADN amplificado” o “amplicón” se refiere al producto del procedimiento de amplificación del ácido polinucleico dirigido a una molécula de ácidos polinucleicos diana que forma parte de una plantilla de ácidos polinucleicos. Por ejemplo, para determinar si una planta de soja derivada de un cruce sexual contiene ADN genómico de una planta transgénica de una planta de soja que comprende el evento MON87751 de la presente invención, el ADN que se extrae de una muestra de tejido de planta de soja se puede someter a un procedimiento de amplificación de ácidos polinucleicos utilizando un par de cebadores que incluye un primer cebador derivado de una secuencia de ADN genómica en la región flanqueante del ADN heterólogo insertado del evento MON87751 y se elonga por la polimerasa 5' a 3' en la dirección del ADN insertado. El segundo cebador, que se deriva de la molécula de ADN heterólogo insertado, se elonga por la polimerasa 5' a 3' en la dirección del ADN genómico flanqueante desde el cual se deriva el primer cebador. El amplicón puede oscilar en longitud desde la longitud combinada del par de cebadores más un par de bases de nucleótidos o más aproximadamente cincuenta pares de bases de nucleótidos, o más aproximadamente doscientos cincuenta pares de bases de nucleótidos, o más aproximadamente cuatrocientos cincuenta pares de bases de nucleótidos o más. Alternativamente, se puede derivar un par de cebadores de la secuencia genómica en ambos lados del ADN heterólogo insertado de modo de producir un amplicón que incluya la secuencia de polinucleótidos del inserto completa (por ejemplo, un cebador directo aislado de la porción genómica en el extremo 5' de la SEQ ID NO:10 y un cebador inverso aislado de la porción genómica en el extremo 3' de la SEQ ID NO:10 que amplifica una molécula de ADN que comprende la secuencia de ADN heterólogo insertado (SEQ ID NO:9) que se identifica en la presente en el genoma que contiene el evento MON87751). Un miembro de un par de cebadores derivado de la secuencia genómica de la planta adyacente al ADN transgénico insertado se ubica a una distancia de la secuencia de ADN insertada, esta distancia puede oscilar entre un par de bases de nucleótidos y aproximadamente veinte mil pares de bases de nucleótidos. El uso del término “amplicón” excluye específicamente los dímeros de cebadores que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica del ADN.

A los efectos prácticos, se deben diseñar cebadores que produzcan amplicones de un intervalo de tamaño limitado, por ejemplo, entre 100 y 1000 bases. En general, los amplicones de tamaño más pequeño (longitud de polinucleótidos más corta) se producen de forma más confiable en las reacciones de amplificación térmica, permiten tiempos de ciclo más cortos y se pueden separar y visualizar fácilmente sobre los geles de agarosa o adaptar para el uso en ensayos de criterios de valoración tipo TAQMAN®. Se pueden producir y detectar amplicones más pequeños a través de los procedimientos conocidos en la técnica de la detección de amplicones de ADN. Además, los amplicones producidos con los pares de cebadores se pueden clonar en vectores, propagar, aislar y secuenciar o se pueden secuenciar directamente con los procedimientos conocidos en la técnica. Un par de cebadores derivado de la combinación de la SEQ ID NO:7 y la Se Q ID NO:9 o la combinación de la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO:9 son útiles en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para las plantas que comprenden MON87751 o su progenie. Una molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:7 o su complemento, es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para las plantas que comprenden MON87751 o su progenie. Una molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:8 o su complemento, es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para las plantas que comprenden MON87751 o su progenie. Una molécula de cebadores de polinucleótidos de ADN aislada única que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:9 o su complemento, es útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico para las plantas que comprenden MON87751 o su progenie.

La amplificación de ácido polinucleico se puede lograr mediante cualquiera de los diversos procedimientos de amplificación de ácido polinucleico conocidos en la técnica, incluso la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los procedimientos de amplificación son conocidos en la técnica y se describen, entre otros, en las patentes estadounidenses N.° 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San Diego, 1990. Se han desarrollado procedimientos de amplificación por PCR para amplificar hasta 22 kb (kilobases) de ADN genómico y hasta 42 kb de ADN bacteriófago (Cheng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:5695-5699, 1994). Estos procedimientos, así como otros procedimientos conocidos en la técnica de la amplificación del ADN, se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. Se puede verificar la secuencia del inserto de ADN heterólogo o la secuencia de ADN genómico flanqueante del evento de soja MON87751 (y corregir si es necesario) mediante la amplificación de dichas moléculas de ADN de las semillas de soja que contienen ADN del evento MON87751 o de plantas de soja cultivadas a partir de la semillas de soja que contienen ADN del evento MON87751 depositado en la ATCC con el número de acceso PTA-120166, la utilización de cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en el presente, seguido del secuenciamiento del ADN estándar del amplicón de PCR o sus fragmentos de ADN clonados.

Se puede detectar el amplicón de diagnóstico producido por estos procedimientos a través de diversas técnicas. Uno de estos procedimientos es el "Genetic Bit Analysis" (Nikiforov, y col. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994) en donde se diseña un oligonucleótido de ADN que se superpone con la secuencia de ADN genómico flanqueante adyacente y la secuencia de ADN insertada. Se inmoviliza el oligonucleótido en los pocillos de una placa de microvaloración. Después de la PCR de la región de interés (utilizando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), se puede hibridar un producto de PCR de cadena única con el oligonucleótido inmovilizado y servir como una plantilla para una reacción de extensión de base única utilizando una polimerasa de ADN y trifosfatos de didesoxinucleótidos (ddNTP) marcados específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia genómica/transgén debido a la amplificación exitosa, hibridación y extensión de base única.

Otro procedimiento es la técnica de pirosecuenciación según la describió Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este procedimiento, se diseña un oligonucleótido que superpone el ADN genómico adyacente y la unión del ADN del inserto. Se híbrida el oligonucleótido con el producto de PCR de cadena única de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una polimerasa de ADN, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Se añaden los DNTP individualmente y la incorporación da como resultado una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia de la secuencia genómica/transgén debido a la amplificación exitosa, hibridación y extensión de base única o de varias bases.

La polarización de fluorescencia según la describe Chen y col., (Genome Res. 9:492-498, 1999) es un procedimiento que se puede utilizar para detectar el amplicón de la presente invención. Utilizando este procedimiento, se diseña un oligonucleótido que superpone la unión del ADN insertado y flanqueante genómico. Se hibrida el oligonucleótido con el producto de PCR de cadena única de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y uno en la secuencia de ADN genómico flanqueante) y se incuba en presencia de una polimerasa de ADN y un ddNTP marcado con fluorescencia. La extensión de base única da como resultado la incorporación del ddNTP. Se puede medir la incorporación como un cambio en la polarización con un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia genómica/transgén debido a la amplificación exitosa, hibridación y extensión de base única.

Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) se describe como un procedimiento para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN y se comprende completamente con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. En resumen, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que superpone la unión del ADN del inserto y flanqueante genómico. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia del ADN del inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se someten a ciclos en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET da como resultado la escisión y la liberación de la fracción fluorescente lejos de la fracción extintora en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia genómica/transgén debido a una amplificación e hibridación exitosas.

Las sondas fluorescibles se han descrito para el uso en la detección de secuencias como se describe en Tyangi, y col. (Nature Biotech.14:303-308, 1996). En resumen, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que superpone la unión del ADN del inserto y genómico flanqueante. La estructura exclusiva de la sonda FRET da como resultado en que contiene una estructura secundaria que mantiene muy cerca las fracciones fluorescente y extintora. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia del ADN del inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se someten a ciclos en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Después de la amplificación por PCR exitosa, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia diana da como resultado la remoción de la estructura secundaria de la sonda y de la separación espacial de las fracciones fluorescente y extintora. Se obtiene una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto flanqueante/transgenética debido a una amplificación e hibridación exitosas.

Los kits de detección de ADN que se basan en los procedimientos de amplificación del ADN contienen moléculas de cebadores de ADN que se hibridan específicamente con un ADN diana y amplifican un amplicón de diagnóstico en condiciones de reacción adecuadas. El kit puede proporcionar un procedimiento de detección basado en gel agarosa o cualquier cantidad de procedimientos para detectar el amplicón de diagnóstico que se conocen en la técnica. Se pueden desarrollar kits de detección de ADN mediante las composiciones divulgadas en la presente y son útiles para la identificación del ADN del evento de soja MON87751 en una muestra y se pueden aplicar a los procedimientos para el fitomejoramiento de las plantas de soja que contienen el ADN del evento MON87751.

Se pueden utilizar las moléculas de ADN en procedimientos de amplificación del ADN (PCR) o como sondas en los procedimientos de hibridación de ácidos polinucleicos, es decir, análisis "Southern", análisis "northern".

Se pueden representar las secuencias de unión por una secuencia del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10.

Por ejemplo, las secuencias de unión se pueden representar arbitrariamente por las secuencias de nucleótidos proporcionadas como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. Alternativamente, las secuencias de unión se pueden representar arbitrariamente por las secuencias de nucleótidos proporcionadas como SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. Alternativamente, las secuencias de unión se pueden representar arbitrariamente por las secuencias de nucleótidos proporcionadas como SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6. Estos nucleótidos se conectan mediante enlace fosfodiéster y están presentes en el evento de soja MON87751 como parte del genoma de una célula de una planta recombinante. La identificación de una o más de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10 en una muestra derivada de una planta de soja, semilla de soja o parte de una planta de soja es determinante que el ADN se haya obtenido del evento de soja MON87751 y es diagnóstico para la presencia en una muestra que contiene ADN del evento de soja MON87751. La invención proporciona una molécula de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos proporcionada como la SEQ ID NO: 10.

Adicionalmente, cualquier polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias descritas en este párrafo se encuentra comprendido por el alcance de la invención.

La invención proporciona moléculas de ADN ejemplares que se pueden utilizar ya sea como cebadores o como sondas para detectar la presencia de ADN derivado de una planta de soja que comprende ADN del evento MON87751 en una muestra. Dichos cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico diana y como tal son útiles para la identificación de la secuencia de ácido nucleico del evento de soja MON87751 a través de procedimientos de la invención descritos en la presente.

Un “cebador” puede ser un polinucleótido altamente purificado, aislado que está diseñado para su uso en procedimientos específicos de apareamiento o hibridación que comprenden amplificación térmica. Un par de cebadores se pueden utilizar con ADN molde, por ejemplo una muestra de a Dn genómico de soja, en una amplificación térmica, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, en donde el amplicón producido de dicha reacción puede tener una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia del ADN molde ubicada entre los dos sitios en donde los cebadores se hibridaron con el molde. Según se emplea aquí, un “amplicón” es una réplica de una pieza o fragmento de ADN que se ha sintetizado utilizando técnicas de amplificación.

Un cebador se diseña típicamente para hibridarse con una cadena de ADN diana complementaria para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana y la presencia del cebador es un punto de reconocimiento por parte de una polimerasa para iniciar la extensión del cebador (es decir, polimerización de nucleótidos adicionales en una molécula de alargamiento de nucleótido) con la cadena de ADN diana como molde. Los pares de cebadores, como se utilizan en la invención, se refieren al uso de dos cebadores que unen cadenas opuestas de un segmento de nucleótido de doble cadena a fin de amplificar linealmente el segmento de polinucleótido entre las posiciones diana para unir los miembros individuales del par de cebadores, típicamente en una reacción de amplificación térmica u otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico convencionales. Moléculas de ADN ejemplares útiles como cebadores se proporcionan como SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15. El par de cebadores proporcionado como SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12 son útiles como una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es diferente de la primera molécula de ADN y ambas son de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:10 para funcionar como cebadores de a Dn que, cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación térmica con el ADN molde derivado del evento de soja MON87751, producen un amplicón de diagnóstico para el ADN del evento de soja MON87751 en una muestra.

Una "sonda" es un ácido nucleico aislado complementario a una hebra del ácido nucleico diana. Las sondas de acuerdo con la invención no incluyen solamente ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico, sino que también incluye poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y la detección de dicha unión puede ser útil para diagnosticar, discriminar, determinar o confirmar la presencia de esa secuencia de ADN diana en una muestra particular. Una sonda puede estar unida a una molécula señalizadora o indicadora detectable convencional, por ejemplo, un isótopo radiactivo, un ligando, un agente quimioluminiscente o una enzima. Se provee una molécula de ADN de ejemplo útil como sonda como SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:16.

Las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invención pueden tener similitud de secuencia completa con la secuencia diana, aunque se pueden diseñar, a través de procedimientos convencionales, cebadores y sondas que difieren de la secuencia diana que mantienen la capacidad de hibridarse preferentemente con secuencias diana. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, sólo es necesario que su secuencia sea lo suficientemente complementaria para poder formar una estructura estable de doble cadena en la concentración de sal y solvente particulares que se emplean. Se puede utilizar cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico para identificar la presencia de ADN transgénico del evento de soja MON87751 en una muestra. Las sondas y los cebadores generalmente tienen al menos aproximadamente 11 nucleótidos, al menos aproximadamente 18 nucleótidos, al menos aproximadamente 24 nucleótidos o al menos aproximadamente 30 nucleótidos o más de longitud. Dichas sondas y cebadores se hibridan específicamente con una secuencia de ADN diana en condiciones rigurosas de hibridación. Las condiciones de rigurosidad convencionales se describen por Sambrook y col., 1989 y por Haymes y col., en: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).

Se puede utilizar cualquier cantidad de procedimientos conocidos para los expertos en la técnica para aislar y manipular una molécula de ADN, o fragmento de esta, divulgados en la invención, incluso procedimientos de amplificación térmica. También es posible obtener moléculas de ADN o fragmentos de ellas mediante otras técnicas tales como mediante la síntesis directa del fragmento por medios químicos, como es usual con un sintetizador de oligonucleótidos automatizado.

Por lo tanto, las moléculas de ADN y las secuencias de nucleótidos correspondientes proporcionadas en la presente son útiles, entre otras cosas, para identificar el evento de soja MON87751, seleccionar las variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento de soja MON87751, detectar la presencia de ADN derivado del evento de soja MON87751 transgénico en una muestra y monitorizar las muestras para reconocer la presencia y/o ausencia del evento de soja MON87751 o partes de una planta derivadas de las plantas de soja que comprenden el evento MON87751.

La invención proporciona plantas de soja, células de plantas de soja, semillas de soja, partes de plantas de soja (como polen, óvulo, vaina, tejido de flor, tejido de raíz, tejido de tallo y tejido de hoja), plantas de la progenie de soja.

Estas plantas de soja, células de plantas de soja, semillas de soja, partes de plantas de soja, plantas de la progenie de soja contienen una cantidad detectable de un polinucleótido de la invención, es decir, un polinucleótido que tiene la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO:10.

Las plantas de soja, las células de la progenie, las semillas, las partes de plantas y las plantas de la progenie de la invención también pueden contener uno o más transgenes adicionales. Dicho transgén adicional puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o molécula de ARN que confiere un rasgo deseable incluso, entre otros, mayor resistencia a los insectos, mayor eficacia del uso de agua, mayor rendimiento, mayor resistencia a la sequía, mayor calidad de semillas, calidad nutritiva mejorada y/o mayor tolerancia al herbicida, en donde el rasgo deseable se mide con respecto a una planta de soja que carece de dicho transgén adicional.

La invención proporciona plantas de soja, células de plantas de soja, semillas de soja, partes de plantas de soja (como polen, óvulo, vaina, tejido de flor, tejido de raíz, tejido de tallo y tejido de hoja), plantas de la progenie de soja derivadas de una planta de soja transgénica que contiene ADN del evento MON87751. Se ha depositado una muestra que representa una semilla de soja que contiene el ADN del evento MON87751 de acuerdo con el tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC®). El depósito de la ATCC ha cedido la Designación de depósito de patente PTA-120166 para la semilla que contiene el ADN del evento MON87751.

Las plantas de la invención pueden pasar a lo largo del ADN del evento MON87751, incluso el transgén insertado en el evento de soja MON87751, hacia la progenie. Según se emplea aquí, “progenie” incluye cualquier planta, semilla, célula de planta y/o parte de una planta que puede regenerarse que comprende el ADN del evento MON87751 derivado de una planta ancestro y/o que comprende una molécula de ADN que tiene Las secuencias de la SEQ ID NO:10.

Las plantas, la progenie y las semillas pueden ser homocigóticas o heterocigóticas para el transgén. La progenie se puede cultivar de las semillas producidas por una planta que contiene el evento de soja MON87751 y/o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contiene el evento de soja MON87751.

Las plantas de la progenie se pueden autopolinizar (también denominado “autofertilización”) para generar una verdadera línea de fitomejoramiento de las plantas, es decir, las plantas homocigotas para el transgén. La autopolinización de la progenie adecuada puede producir plantas homocigotas para genes exógenos, agregados.

De manera alternativa, las plantas de la progenie se pueden cruzar, por ejemplo, reproducir con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta híbrida o varietal. La otra planta no relacionada puede ser transgénica o no transgénica. Por lo tanto, una planta o semilla híbrida o varietal de la invención se puede derivar mediante el cruzamiento sexual de un primer padre que carece del ADN específico y único del evento de soja MON87751 con un segundo padre que comprende el evento de soja MON87751, que da como resultado un híbrido que comprende el ADN específico y único del evento de soja MON87751. Cada madre puede ser híbrida o endogámica/varietal, siempre que los resultados del cruzamiento o fitomejoramiento en una planta o semilla de la invención, es decir, una semilla que tiene al menos un alelo que contiene el ADN del evento de soja MON87751 y/o una molécula de ADN que tiene la secuencia de la SEQ ID n O:10.

Por ende, dos plantas transgénicas pueden cruzarse para producir crías híbridas que contienen dos genes exógenos agregados independientemente segregantes. Por ejemplo, el MON87751 que contiene Cry2Ab y Cry1A.105 que confieren resistencia a los insectos de modo de acción doble a la soja se puede cruzar con otras plantas de soja transgénicas para producir una planta que tenga las características de ambos padres transgénicos. Un ejemplo de esto sería un cruzamiento de MON87751 que contiene Cry2Ab y Cry1A.105, que confiere resistencia a los insectos de modo de acción doble a la soja con una planta que tiene uno o más rasgos adicionales, por ejemplo tolerancia al herbicida (por ejemplo, el evento de soja MON89788 o el evento de soja MON 87708) y/o control de insectos (por ejemplo, el evento de soja MON 88701), que da como resultado una planta o semilla de la progenie que tiene resistencia de modo de acción doble a las plagas de insectos lepidópteros y que tiene al menos uno o más rasgos adicionales. También se contemplan el retrocruzamiento con una planta padre y el cruzamiento con una planta no transgénica, así como la propagación vegetal. Las descripciones de otros procedimientos de fitomejoramiento que se utilizan comúnmente para obtener diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

La invención proporciona una parte de una planta que se deriva de plantas de soja que comprenden el evento MON87751. Según se emplea aquí, una “parte de una planta” se refiere a cualquier parte de una planta que comprende un material derivado de una planta de soja que comprende el evento MON87751. Las partes de una planta incluyen, entre otros, polen, óvulo, vaina, flor, raíz o tejido del tallo, fibras y hojas. Las partes de una planta pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables.

Las plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de una planta (por ejemplo polen, óvulo, vaina, flor, tejido de raíz o tallo y hojas) de la invención, por lo tanto, son útiles, entre otras cosas, para cultivar plantas a fin de producir semilla y/o partes de una planta que comprenden el evento de soja MON87751 para fines agrícolas, producir progenie que comprende el evento de soja MON87751 para fines de fitomejoramiento de plantas y de investigación, utilizar con técnicas microbiológicas de las aplicaciones industriales y de investigación y vender a los consumidores.

Se proporcionan los procedimientos para producir una planta de soja resistente a los insectos que comprende las secuencias de ADN específicas y únicas del evento MON87751 de la invención. Las plantas transgénicas utilizadas en estos procedimientos pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Las plantas de la progenie producidas a través de estos procedimientos pueden ser plantas híbridas o varietales; se pueden cultivar de las semillas producidas por una planta que contiene el evento de soja MON87751 o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contiene el evento de soja MON87751; y pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Posteriormente, las plantas de la progenie se pueden autopolinizar para generar una verdadera línea de fitomejoramiento de las plantas, es decir, las plantas homocigotas para el transgén, o se pueden cruzar alternativamente, por ejemplo, reproducir con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta híbrida o varietal.

Se proporcionan procedimientos para detectar la presencia de ADN derivado de una célula de soja, tejido de soja, semilla de soja o planta de soja que comprenden el evento de soja MON87751 en una muestra. Un procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de soja, tejido de soja, semilla de soja o planta de soja, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con al menos un cebador que puede producir una secuencia de ADN específica para el ADN del evento MON87751 en condiciones adecuadas para la secuenciación del ADN, (iii) realizar una reacción de secuenciación del ADN y luego (iv) confirmar que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON87751, o la construcción comprendida allí, por ejemplo una seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, Se Q ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10.

Otro procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de soja, tejido de soja, semilla de soja o planta de soja, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con un par de cebadores que puede producir un amplicón del ADN del evento MON87751 en condiciones adecuadas para la amplificación del ADN, (iii) realizar una reacción de amplificación del ADN y luego (iv) detectar el la molécula del amplicón y/o confirmar que la secuencia de nucleótidos del amplicón comprende una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON87751, por ejemplo una seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, Se Q ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ iD n O:5 y SEQ ID NO:6. El amplicón será uno que sea específico para el evento MON87751, por ejemplo un amplicón que comprende la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6. La detección de una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON87751 en el amplicón es determinante y/o de diagnóstico para la presencia de ADN específico del evento de soja MON87751 en la muestra. Un ejemplo de un par de cebadores que puede producir un amplicón del ADN del evento MON87751 en condiciones adecuadas para la amplificación del ADN se proporciona como SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12. Un experto en la técnica puede diseñar fácilmente otros pares de cebadores y produciría un amplicón que comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ iD NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6, en donde este par de cebadores comprende al menos un cebador dentro de la región genómica que flanquea el inserto y un segundo cebador dentro del inserto. Otro procedimiento para detectar la presencia de ADN derivado de una célula de soja, tejido de soja, semilla de soja o planta de soja que comprende el evento de soja MON87751 en una muestra consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de soja, tejido de soja, semilla de soja o planta de soja, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con una sonda de ADN específica para el ADN del evento MON87751, (iii) permitir que la sonda y la muestra de ADN se hibriden en condiciones estrictas de hibridación y luego (iv) detectar la hibridación entre la sonda y la muestra de ADN diana. Un ejemplo de la secuencia de una sonda de ADN que es específica para el ADN del evento MON87751 se proporciona como SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:16. Un experto en la técnica puede diseñar fácilmente otras sondas y comprenderían al menos un fragmento del ADN genómico que flanquea el inserto y al menos un fragmento del ADN del inserto, por ejemplo las secuencias proporcionadas, entre otros, en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10. La detección de la hibridación de la sonda para la muestra de ADN es de diagnóstico para la presencia del ADN específico del evento de soja MON87751 en la muestra. La ausencia de hibridación es alternativamente de diagnóstico de la ausencia del ADN específico del evento de soja MON87751 en la muestra.

Los procedimientos de detección de la invención son útiles, entre otras cosas, para identificar el evento de soja MON87751, seleccionar las variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento de soja MON87751, detectar la presencia de ADN derivado de plantas de soja transgénicas que comprenden el evento MON87751 en una muestra y monitorizar las muestras para reconocer la presencia y/o ausencia de plantas de soja que comprenden el evento MON87751 o partes de una planta derivadas de las plantas de soja que comprenden el evento MON87751.

La secuencia del inserto de ADN heterólogo, las secuencias de unión o las secuencias de flanqueo del evento de soja MON87751 se pueden verificar (y corregir, si fuera necesario) mediante la amplificación de dichas secuencias del evento con cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en la presente, seguida de la secuenciación del ADN estándar del amplicón o del ADN clonado.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de determinadas modalidades preferidas de la invención.

INFORMACIÓN SOBRE DEPÓSITO

Se ha realizado un depósito de una muestra que representa la semilla de Glycine max que contiene el ADN del evento MON87751 el 28 de febrero de 2013 de acuerdo con el tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) que tiene una dirección en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EUA, código postal 20110, y N.° de acceso ATCC asignado PTA-120166. Será posible acceder a los depósitos mientras que la solicitud presentada ante el Comisionado de patentes y marcas se encuentre pendiente, y será él quien determine quiénes tendrán derecho a tal acceso cuando se lo soliciten. Una vez que se otorgue la patente, se eliminarán en forma irrevocable todas las restricciones relativas a la disponibilidad al público. Se mantendrá el depósito durante un período de 30 años o 5 años luego de la última solicitud, o durante el plazo de vigencia de la patente, el que sea más largo, y será reemplazado las veces que sea necesario durante el trascurso de tal período de tiempo.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la transformación y la selección del evento de soja MON87751. Se sabe que la expresión de genes extraños en las plantas se ve afectada por su posición cromosómica, tal vez debido a la estructura cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o la proximidad de los elementos reguladores transcripcionales (por ejemplo, potenciadores) cercanos al sitio de integración (Weising, 1988). Por este motivo, suele ser necesario evaluar una gran cantidad de eventos para identificar un evento caracterizado por la expresión óptima de un gen de interés introducido. Por ejemplo, se ha observado en las plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre los eventos. También puede haber diferencias en los patrones de expresión espaciales o temporales, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos de plantas, que pueden no corresponder con los patrones esperados de los elementos reguladores transcripcionales presentes en la construcción del gen introducido. Por estas razones, se generaron y se evaluaron once vectores de expresión diferentes en la soja transformada durante la selección del evento MON87751.

Se transformaron y se evaluaron once construcciones de expresión diferentes en las plantas. Las construcciones de expresión individuales variaron en la combinación del uso de elementos de expresión, es decir, potenciador (E), promotor (P), líder (L), intrones (I), péptido de direccionamiento de cloroplastos (CTP) y terminación de transcripción 3' y señal de poliadenilación (T). Además, los segmentos T-ADN contenían dos casetes de expresión codificantes de ambas proteínas Cry (Cry2Ab y Cry1A.105) o contenían un casete de expresión codificante de una única proteína Cry, es decir, Cry2Ab o Cry1A.105. Otra variación en las construcciones de expresión con los segmentos T-ADN que contenían ambos casetes de expresión Cry2Ab y Cry1A.105 fue la orientación relativa de los dos casetes codificantes de las proteínas Cry. Específicamente, los dos casetes de expresión de proteínas Cry se encontraban ubicados en una orientación de transcripción en tándem relativa de modo que la expresión de cada promotor de las proteínas Cry respectivas continúa en la misma dirección, pero cada uno a partir de sus promotores respectivos separados (véase la figura 2) o los dos casetes de expresión de proteínas Cry se encontraban en una orientación inversa de modo que la expresión de cada promotor de las dos proteínas de Cry está lejos de un punto centrado entre los dos promotores, es decir, la transcripción de cada casete de expresión de proteínas Cry procede en direcciones opuestas y no converge (véase la figura 2). La secuencia de ADN codificante de Cry1A.l05 tenía diversificación de la secuencia en las construcciones 4, 6, 7, 8 y 9, en comparación con las construcciones 1 y 3. En otra variación, en dos de las construcciones con los dos casetes de expresión de Cry orientados en orientación inversa de transcripción, se ubicaron los potenciadores de trascripción entre los promotores divergentes (véase la figura 2).

Se transformaron las once construcciones de expresión en tres momentos separados, mediante transformación mediada por Agrobacterium de tejido meristemático de soja. Se describió el procedimiento en las patentes de Estados Unidos N.° 8.030.544, que permite la generación de plantas transformadas sin utilizar callos. En resumen, se escindió tejido meristemático de los embriones de la semilla de soja A3555 germinada (Asgrow, St Louis, MO). La construcción 1 comprendía dos segmentos T-ADN separados, cada uno unido por secuencias del borde de Agrobacterium (segmento T-ADN). El primer segmento T-ADN de la construcción de transformación contenía dos casetes de expresión con el primer casete de expresión codificante de una región del gen adenililtransferasa Tn7 de Escherichia coli (que confiere resistencia a la espectinomicina y estreptomicina; aadA-SPR) y se utilizó para la selección; y el segundo casete de expresión codificante de una región del gen de sacarosa fosforilasa de Agrobacterium tumefaciens cepa C58 (que cataliza la conversión de la sacarosa a fructosa y glucosa-1-fosfato; STR+OriRi) y se utilizó como un marcador calificable. El segundo segmento T-ADN de las construcciones de transformación diferentes contenía o un casete de expresión codificante de Cry2Ab solamente (construcciones 2, 5, 10 o 11) o un casete de expresión codificante de Cry1A.105 solamente (construcciones 3 o 6); o el segundo segmento T-ADN de las construcciones de transformación diferentes contenía un casete de expresión codificante de Cry2Ab y un casete de expresión codificante de Cry1A.105 (construcciones 1,4, 7, 8 o 9) (ilustrado en la figura 2). Como cada segmento T-ADN de la construcción de transformación está unido por secuencias del borde de Agrobacterium separadas, el segmento T-ADN que comprende los casetes de marcadores de selección y calificables se puede integrar en el genoma de la célula de soja en un sitio diferente del sitio de integración del segmento T-ADN codificante de los casetes de expresión de Cry2Ab y/o Cry1A.105. Por lo tanto, se pueden evaluar los eventos en cuanto a la segregación y la pérdida de las secuencias de los marcadores de selección y calificables. Se seleccionaron todos los eventos en cuanto a la ausencia de la cadena principal y la ausencia de las secuencias de los casetes de marcadores de selección/calificables. Después del cocultivo con Agrobacterium que posee la construcción de transformación, se colocaron los meristemas en medio de selección que contenía espectinomicina, sal disódica de carbenicilina, sal sódica de cefotaxima y mezcla de sal disódica de ticarcilina/clavulanato de potasio para inhibir el crecimiento de las células de plantas no transformadas y el Agrobacterium excedente. Después, se colocaron los meristemas en medio propicio para el desarrollo de las raíces y de los brotes. Se seleccionaron plantas con raíces (R0) con características fenotípicas normales y se transfirieron al suelo para el cultivo y la evaluación posterior.

La construcción de expresión 1, utilizada para generar el evento MON87751, contenía un segmento T-DNA codificante de dos proteínas Cry diferentes, en un orden relativo de 5' a 3' de los elementos de expresión de la planta (con o sin secuencias intervinientes): un promotor, un líder y un primer intrón derivado del gen de Actina 2 Arabidopsis thaliana (P-At.Act2), una secuencia codificante quimérica compuesta de la secuencia codificante del péptido de tránsito de cloroplasto del extremo amino terminal derivada del gen Arabidopsis 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) fusionado en marco con un gen codificante de Cry2Ab (que codifica una proteína que confiere resistencia a los insectos) de Bacillus thuringiensis (Bt) con los nucleótidos modificados para la expresión de la planta (CTP2-Cry2Ab), un elemento de terminación de transcripción 3' y poliadenilación (3' UTR) derivado de un gen de la proteína similar a metalotioneína Oryza sativa (T.OsMth), una secuencia interviniente entre el primer casete de expresión de proteína Cry y el segundo casete de expresión de proteína Cry; un promotor y un líder derivado del gen de la subunidad pequeña 1A de ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa Arabidopsis (P-At.RbcS4), este promotor-líder está unido a una secuencia codificante quimérica compuesta de la secuencia codificante del péptido de tránsito de cloroplasto derivada del gen de la proteína de la subunidad pequeña 1A de ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa Arabidopsis (CTP1) que también contenía la secuencia codificante que codifica una repetición del sitio de escisión del péptido de tránsito y 3 aminoácidos de la proteína madura fusionados en marco con un gen codificante de Cry1A.105 (que codifica una proteína que confiere resistencia a los insectos), compuesto de segmentos de genes codificantes de Cry1Ab1 (dominios I y II), Cry1Fa1 (dominio III) y Cry1Ac1 (dominio de protoxina) de Bacillus thuringiensis (Bt) con los nucleótidos modificados para la expresión de la planta, un 3' UTR (T-Mt.Pt1) derivado del gen transportador de fosfato 1 Medicago truncatula. En el casete de expresión de la construcción 1, el casete de T-ADN que contenía los dos casetes de expresión separados Cry2Ab y Cry1A.105 tiene un borde derecho de Agrobacterium en el extremo designado arbitrariamente 5', que es 5' para el casete Cry2Ab; y un borde izquierdo de Agrobacterium en el extremo designado arbitrariamente 3', que es 3' para el casete Cry1A.105. El casete Cry2Ab (promotor a terminador) se encuentra en las posiciones 123-3785 en la SEQ ID NO:9 y el casete Cry1A.105 (promotor a terminador) se encuentra en las posiciones 3831-9754 en la SEQ ID NO:9.

El casete de T-DNA para la construcción 2 (Cry2Ab) y para la construcción 3 (Cry1A.105) contenía casetes codificantes de una proteína Cry única con los mismos elementos para la proteína Cry respectiva codificante de los genes utilizados en la construcción 1, véase la figura 2.

Las construcciones 4, 5 y 6 eran similares en la orientación de los elementos a las construcciones 1, 2 y 3, respectivamente, pero con promotor-líder-intrón y péptido de tránsito de cloroplasto diferentes para los casetes Cry2Ab y Cry1A.105. Los terminadores para los casetes de proteínas Cry correspondientes (Cry2Ab con T-Os.Mth o Cry1A.105 con T-Mt.Pt1) fueron idénticos en todas las construcciones de expresión de 1 a 11 (véase la figura 2).

El promotor-líder-intrón y péptido de tránsito de cloroplasto, la secuencia codificante de la proteína Cry y el terminador utilizado para los casetes Cry2Ab y Cry1A.105 en cada una de las construcciones 7 - 11 fueron idénticos a los utilizados en las construcciones 4, 5 y 6. Sin embargo, para las construcciones 7, 8 y 9, la orientación del casete Cry2Ab y el casete Cry1A.105 estaba invertida con respecto a la otra y la orientación de la transcripción estaba en direcciones opuestas, cada una con respecto a sus respectivos promotores, véase la figura 2. Las construcción 7, 8 y 9 difieren en la ausencia (construcción 7) de un potenciador entre los dos casetes o la presencia de un potenciador; la construcción 8 con el potenciador 1 (E1) o la construcción 9 con el potenciador 2 (E2), véase la figura 2. La construcción 10 y la construcción 11 eran casetes Cry2Ab únicos con E1 (construcción 10) o E2 (construcción 11).

Después de la transformación, y la transferencia de (R0) eventos al suelo, se realizaron análisis moleculares agronómicos y fenotípicos amplios para seleccionar eventos para pruebas posteriores. Adicionalmente, se autopolinizaron los eventos y se utilizó la semilla resultante de los eventos seleccionados para pruebas de campo y moleculares adicionales.

Las pruebas moleculares incluyeron lo siguiente: ensayos para determinar el número de copias, ensayos para determinar la integridad de ambos casetes de expresión que contienen proteínas Cry (construcciones 1, 4, 7, 8 y 9), presencia de proteína Cry codificante del casete T-ADN (casetes de expresión de proteína Cry únicos (construcciones 2, 3, 6, 10 o 11) o dos casetes de expresión de proteína Cry (construcciones 1,4, 7, 8 o 9)); ensayos para determinar la expresión de la proteína medida por ELISA y ensayos para determinar la proporción de segregación del casete de expresión de T-ADn (1:2:1 o 1:3). Los ensayos agronómicos incluyeron (para eventos R0 generados a partir de las construcciones 1, 2 y 3, eficacia para los insectos mediante bioensayo de disco de hoja para dos especies de plagas (Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar, VBC) y Chrysodeixis includens (soybean looper, SBL)). Se cultivaron plantas R0 hasta la madurez, se autopolinizaron los eventos y se determinó la producción de semillas para cada evento.

La cantidad de eventos R0 generados por transformación con las 11 construcciones individuales y transferidos al suelo variaron y oscilaron entre 420 eventos y más de 5000 eventos (véase la tabla 1). Para la transformación con la construcción 1, a partir de la cual se generó el evento MON87751, hubo un total de 1102 plantas R0 con raíces en el suelo, de las cuales solo 281 eventos pasaron el análisis molecular inicial. Los análisis moleculares, agronómicos y fenotípicos adicionales de estos 281 eventos que se generaron por transformación con la construcción 1 dieron como resultado solo 29 eventos de R1 evaluados para análisis de invernadero adicionales.

Tabla 1. Eventos de R0 producidos a partir de las once construcciones de transformación, se muestra la cantidad de eventos transferidos al suelo y la cantidad de eventos que pasaron un ensayo de número de copias.

Para los 29 eventos R1 generados a partir de la transformación con la construcción 1 y evaluados para mayor análisis, se plantó la semilla de R1 en un invernadero para el análisis de los eventos R1 con ensayos incluido: (a) germinación de R1 (100 % de germinación); (b) identificación de plantas homocigotas; (c) análisis PCR de confirmación de que las plantas homocigotas ya no contenían la secuencia de los marcadores de selección/calificables (se habían segregado de forma independiente); (d) eficacia para los insectos determinada mediante bioensayo de disco de hoja para C. includens (SBL); y (e) eficacia para los insectos determinada mediante bioensayo de disco de hoja para Spodoptera frugiperda (fall armyworm, FAW), (f) expresión de proteína mediante análisis ELISA sobre tejido de hojas en etapa V7, con avance de los eventos con niveles de proteína Cry2Ab y Cry1A.105 superiores a >4 ppm. Además de los análisis moleculares y de los resultados de los bioensayos de disco de hoja para insectos, se recolectaron observaciones del fenotipo agronómico y la producción de semillas de cuatro selecciones/eventos. Basándose en la totalidad de estos datos, se evaluaron semillas R2 de 21 de los eventos R1 generados por transformación con la construcción 1 en ensayos de campo agronómicos y ensayos con doseles de eficacia.

Ejemplo 2

Se diseñaron ensayos de campo agronómicos para evaluar las características fenotípicas y el rendimiento de los eventos de soja que expresan Cry2Ab y Cry1A.105 en comparación con el control, A3555 (antecedentes parentales). En estos ensayos de campo agronómicos, los controles y los eventos eran de la variedad de soja A3555, con un grupo de madurez relativa 3 (RM3). Se plantaron los ensayos en un diseño de bloque completo al azar (RCBD) durante cuatro estaciones y dos ubicaciones geográficas. En una ubicación geográfica, se realizaron los ensayos de campo agronómicos en 25 sitios de campo en cada temporada y, en una segunda ubicación geográfica, se realizaron los ensayos de campo agronómicos en 14 sitios de campo en cada temporada. Se siguieron las prácticas agronómicas convencionales para la plantación y la recopilación de datos para todos los ensayos. Los datos recopilados incluyeron calificación del brote, vigor de la plántula, fecha de floración, observación del color de la flor, observación del fenotipo, color de la pubescencia, madurez, encamado, altura de la planta, puntaje del desgranado, fecha de cosecha, peso de semillas/parcela, humedad de semillas/parcela y rendimiento en bushels por acre (bu/ac).

Para el análisis de los datos, se descartaron algunas ubicaciones debido a problemas de calidad antes de la cosecha (es decir, agua estancada, insuficiencia de humedad del suelo, falta de brote, desgranado de vainas a fines de la temporada causado por tormenta de granizo) o algunas ubicaciones se descartaron debido a un coeficiente de variación (CV) superior al 15% y/o un índice de calidad de ubicación (LQI) alto.

Entre todas las ubicaciones evaluadas, las medidas del fenotipo obtenidas indicaron que las calificaciones agronómicas para los eventos se encontraban dentro del intervalo normal del control, A3555. No todas las observaciones se realizaron en todos los sitios y algunos datos, por ejemplo, el brote, se puede haber recopilado, pero no se determinó el rendimiento porque se descartó la ubicación por motivos que ocurrieron después de la recopilación de los primeros datos del fenotipo.

Para los ensayos de campo agronómicos, se muestran la cantidad de eventos generados por la construcción 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y evaluados en cada ensayo de campo en dos ubicaciones geográficas y la generación del evento de soja evaluado (es decir, R3, R4, R5, R6 o R7) en la tabla 2.

Tabla 2. Cantidad de eventos (y generación de eventos de soja) evaluados por construcción durante dos temporadas y dos ubicaciones geográficas de los ensayos de campo agronómicos ("n.t." significa no evaluado).

El meta análisis de los ensayos de campo agronómicos para los eventos evaluados a lo largo de cada temporada, cada ubicación geográfica y cada rendimiento promedio de las pruebas de los ensayos de campo (bu/acre) demostró que hubo un aumento estadísticamente significativo en el rendimiento para el evento MON87751 en comparación con el control A3555 (tabla 2). Los eventos que expresaron solo Cry2Ab no tuvieron una diferencia estadísticamente significativa en el rendimiento en comparación con el control A3555, véase la tabla 3. El evento que expresaron solo Cry1A.105 tuvo una disminución estadísticamente significativa en el rendimiento en comparación con el control A3555, véase la tabla 3.

Tabla 3. Meta análisis de los ensayos de campo agronómicos para los eventos evaluados a lo largo de cada temporada, cada ubicación geográfica y cada rendimiento promedio de las pruebas de los ensayos de campo en comparación con la línea de soja no transgénica A3555.

Ejemplo 3

Se realizaron ensayos con doseles de eficacia para evaluar la eficacia de los eventos de soja experimentales que expresan ambas proteínas Cry a partir de una inserción de un segmento T-ADN de una única construcción con dos casetes de expresión (es decir, Cry2Ab y Cry1A.105) o proteínas Cry únicas (es decir, Cry2Ab sola o Cry1A.105 sola) contra infestaciones artificiales de poblaciones de plagas de lepidópteros contenidas en recintos de doseles. Se utilizó la comparación de eventos de gen único con eventos de gen doble para determinar la contribución relativa de cada proteína Cry única con la eficacia observada en los eventos de construcción de expresión de gen doble. Se realizaron los ensayos con doseles durante varias temporadas en dos ubicaciones geográficas. En una ubicación geográfica, se evaluaron 5 especies de plagas diana: Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar, VBC), Chrysodeixis includens (soybean looper, SBL), Spodoptera eridania (southern armyworm, SAW), Spodoptera frugiperda (fall armyworm, FAW) y Helicoverpa zea (soybean podworm, SPW). En la segunda ubicación geográfica, se evaluaron 3 especies de plagas diana: Crocidosema aporema (bean shoot moth, BSM), Rachiplusia nu (sunflower looper, SFL) y Spodoptera frugiperda (fall armyworm, FAW).

Los eventos (es decir, las entradas) que se evaluaron en estos ensayos con doseles se generaron a partir de transformaciones con cada una de las construcciones de transformación separada. Los eventos de transformación generados a partir de la construcción 1,2 o 3, se evaluaron en la generación R2 en ensayos con doseles e incluyeron veinte eventos que expresan ambas proteínas (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 1), seis eventos que expresan solo Cry2Ab (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 2) y seis eventos que expresan solo Cry1A.105 (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 3). De estos, se evaluaron 12 eventos con Cry2Ab y Cry1A.105 (construcción 1), dos eventos con Cry2Ab solamente (construcción 2) y tres eventos con Cry1A.105 solamente (construcción 3) en la generación R3 en los ensayos con doseles. Once de los eventos con Cry2Ab y Cry1A.105 (construcción 1) se evaluaron adicionalmente en los ensayos con doseles de la generación R4. Se evaluaron tres eventos con Cry2Ab y Cry1A.105 (construcción 1), un evento con Cry2Ab solamente (construcción 2) y un evento con Cry1A.105 solamente (construcción 3) en los ensayos con doseles de R5, R6 y R7. Se evaluaron diez eventos que expresan Cry2Ab y Cry1A.105 (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 4), tres eventos de Cry2Ab solamente (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 5) y tres eventos de Cry1A.105 solamente (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 6) en la generación R3 para los ensayos con doseles. Se evaluaron dos eventos con Cry2Ab y Cry1A.105, un evento con Cry2Ab solamente y un evento con Cry1A.105 solamente en los ensayos con doseles de R4, y se evaluó un evento de cada uno en los ensayos con doseles de R5. Se evaluaron tres eventos que expresan Cry2Ab y Cry1A.105 en orientación opuesta 5' a 3' con un potenciador (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 8), 3 eventos apilados que expresan Cry2Ab y Cry1A.105 en orientación opuesta 5' a 3' sin un potenciador (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 7) y 2 eventos de Cry2Ab solamente (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 10) en la generación R2 en ensayos con doseles. Los controles de soja transgénica positivos incluyeron MON87701 o el evento GM_A19478 (generado al mismo tiempo que MON87701) y ambos expresan Cry1Ac. Se incluyeron las líneas de soja no transgénica A3555 (antecedente parental para los eventos MON87751, madurez relativa 3 (RM3)) y A5547 (antecedente parental para MON87701 y GM_A19478, RM5) en todos los ensayos de campo y con doseles como controles negativos. Se incluyó la línea de soja no transgénica AG3705 como un control de flor blanca en algunos ensayos.

Se siguieron las prácticas convencionales para establecer y realizar los ensayos con doseles. Se evaluaron las parcelas una vez después de cada infestación en el momento de daño máximo a los controles negativos (generalmente 3-4 semanas después de la colocación de las pupas dentro del dosel). En cada evaluación, se registraron las siguientes observaciones agronómicas: la fecha y la etapa del crecimiento de la planta. Adicionalmente, para los insectos defoliantes, se registró un estimativo de defoliación porcentual en cada parcela. Para C. aporema, se seleccionaron aleatoriamente diez plantas en cada parcela y se registró la cantidad de plantas con daño. En algunos casos, también se registraron las cantidades de larvas vivas.

Se sometieron los datos de defoliación a ANOVA para determinar fuentes significativas de variabilidad entre la línea y la réplica para cada insecto en cada ubicación en el nivel de probabilidad de 0,05 (P). Se determinaron diferencias significativas entre los promedios con la prueba de Tukey-Kramer (Kramer 1956) a P = 0,05.

Se realizaron tres ensayos con doseles de parcela pequeña en la segunda ubicación geográfica durante una temporada con R. nu y C. aporema para la infestación. El diseño del ensayo incluyó bloques de prueba de diseño de bloque completo al azar (RCBD) con tres réplicas por evento o control, los eventos evaluados se muestran en la tabla 4. Se infestó un ensayo con C. aporema durante la etapa vegetativa media del crecimiento de la soja y nuevamente en la etapa reproductiva temprana del crecimiento de la soja. Se infestaron dos ensayos con R. nu durante la etapa vegetativa media del crecimiento de la soja.

Para el ensayo con C. aporema, se logró una presión muy fuerte. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en el daño (F = 0,8794; df = 2, 69; P = 0,4196), pero el evento fue altamente significativo (F = 11,9398; df = 23, 48; P < 0,0001). El porcentaje máximo de plantas dañadas (tabla 4) promedió el 83-100% en los controles negativos, pero fue inexistente en el control positivo Cry1Ac. Los eventos generados a partir de la construcción de transformación 1 y que expresan Cry2Ab y Cry1A.105 presentaron el 0-13 % de plantas dañadas, mientras que los que expresan Cry2Ab solamente o Cry1A.105 solamente presentaron el 10-17 % y el 10-13 %, respectivamente. La pequeña, aunque significativa, cantidad de plantas registradas como dañadas en este ensayo puede deberse a los criterios utilizados por las personas al momento de registrar la calificación del daño.

Para los ensayos con R. nu, se logró una presión fuerte en un ensayo con dosel. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la defoliación (F = 0,203; df = 2, 69; P = 0,8167), pero el evento fue altamente significativo (F = 20,2461; df = 23, 48; P < 0,0001). La defoliación máxima (tabla 4) promedió el 60-63% en los controles negativos, pero fue inexistente en el control positivo Cry1Ac y los eventos generados a partir de la construcción de transformación 1 que expresan Cry2Ab+Cry1A.105 o los eventos generados a partir de la construcción de transformación 2 que expresan Cry2Ab solamente. Los eventos generados a partir de la construcción de transformación 3 que expresan Cry1A.105 solamente presentaron una defoliación levemente superior (4-10% ). Se logró una presión moderadamente fuerte en el segundo ensayo con dosel que evaluaba R.nu. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la defoliación en ningún ensayo (F = 0,2542; df = 2, 69; P = 0,7763), pero el evento fue altamente significativo (F = 16,1793; df = 23, 48; P < 0,0001). La defoliación máxima (tabla 4) promedió el 38-40% en los controles negativos, pero fue insignificante en el control positivo Cry1Ac (4 %) e inexistente en los eventos generados con la construcción 1 que expresan Cry2Ab+Cry1A.105 o los eventos generados con la construcción 2 que expresan Cry2Ab solamente. Los eventos generados con la construcción 3 que expresan Cry1A.105 solamente presentaron una defoliación levemente superior (2-7%).

En estos ensayos con doseles, el evento de soja MON87751 no presentó plantas dañadas debido a la infestación de las plagas de insectos, C. aporema o R. nu, lo que fue significativo en comparación con el daño y/o la defoliación de los controles en el mismo ensayo (tabla 4).

Tabla 4. Daño por C. aporema y defoliación por larvas R. nu a los eventos generados con las construcciones 1, 2 o 3 y evaluados en doseles infestados artificialmente.

En una temporada posterior de ensayos con doseles en parcelas pequeñas realizados en la segunda ubicación geográfica, se utilizaron poblaciones del laboratorio local de R. nu, C. aporema y S. frugiperda para la infestación. Los protocolos para realizar los ensayos fueron esencialmente como se describió anteriormente y con los eventos y los controles evaluados que se muestran en la tabla 5.

Para el ensayo infestado con C. aporema, se logró una presión fuerte. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en el daño (F = 0,2742; df = 2, 33; P = 0,7619), pero el evento fue altamente significativo (F = 8,2313; df = 11, 24; P < 0,0001). El daño máximo promedió 4,2-5,5 puntos dañados por planta en los controles negativos, con el 80-100 % de las plantas que presentaron daño, pero fue insignificante en el control positivo y todos los eventos de la prueba (tabla 5).

Para el ensayo infestado con R. nu, se logró una presión moderadamente fuerte. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en el daño (F = 0,041; df = 2, 33; P = 0,9599), pero el evento fue altamente significativo (F = 143,5526; df = 11, 24; P < 0,0001). El daño máximo promedió el 33,3-40,0% de defoliación en los controles negativos (muy por encima del umbral económico), pero fue inexistente o insignificante en el control positivo y en todos los eventos de la prueba excepto los eventos generados por transformación con la construcción 6 que expresa solo TIC105 (tabla 5).

Para el ensayo infestado con S. frugiperda, se logró una presión leve. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en el daño (F = 0,1187; df = 2, 33; P = 0,8884), pero el evento fue altamente significativo (F = 12,8602; df = 11, 24; P < 0,0001). El daño máximo promedió el 7,5-15,0 % de defoliación en los controles negativos, lo que apenas alcanza el umbral económico. También se advirtió algo de daño en los eventos que expresan solo Cry2Ab generados por transformación con la construcción 2 o con la construcción 5, pero el daño fue inexistente o insignificante en el control positivo y en todos los demás eventos de la prueba (tabla 5).

En estos ensayos con doseles, el evento de soja MON87751 no presentó plantas dañadas debido a la infestación de las plagas de insectos, C. aporema, R. nu, S. frugiperda, lo que fue significativo en comparación con el daño de los controles negativos en el mismo ensayo (tabla 5). El evento de soja MON87751 presentó un daño significativamente inferior con R. nu en comparación con los eventos de soja transgénica generados por transformación con la construcción 6 que expresa solo Cry1A.105 (tabla 5), aunque se advierte que hay una expresión inferior de la proteína Cry1A.105 en los eventos generados por transformación con la construcción 6. Estos resultados también demuestran por primera vez el espectro ampliado de control de la plaga de insectos S. frugiperda.

Tabla 5. Daño máximo por C. aporema y defoliación porcentual promedio por larvas R. nu y S. frugiperda en doseles infestados artificialmente que evalúan los eventos generados con las construcciones 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y comparación con los controles positivos y negativos.

Se realizó un ensayo con dosel de parcela pequeña en la primera ubicación geográfica con la infestación de una población de laboratorio de H. zea. El diseño del ensayo incluyó bloques de prueba de diseño de bloque completo al azar (RCBD) con tres réplicas por evento, los eventos y los controles evaluados se muestran en la tabla 6. Hubo dos infestaciones de H. zea y se evaluó la defoliación 19-27 días después de la infestación (etapa R2-R3 del crecimiento de la soja) para la primera infestación, y 25-28 días después de la infestación (etapa R5 del crecimiento de la soja) para la segunda infestación. Los resultados de los ensayos con doseles que evalúan la plaga de insectos H. zea son los siguientes: se logró una presión moderadamente fuerte. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la defoliación (F = 0,326; df = 2, 105; P = 0,7225), pero el evento fue altamente significativo (F = 13,8864; df = 35, 72; P < 0,0001). La defoliación máxima (tabla 6) promedió el 32-33 % en los controles negativos, pero fue insignificante en el control positivo Cry1Ac (1%) y en los eventos generados con la construcción 1 que expresan Cry2Ab+Cry1A.105 (2-4% ). Se observó una defoliación algo superior en los eventos generados con la construcción 4 que expresan Cry2Ab+Cry1A.105 (5-12 %), los eventos generados con la construcción 5 que expresan solamente Cry2Ab (13-17%) o los eventos generados con la construcción 6 que expresan solamente Cry1A.105 (8-12 %).

El evento de soja MON87751 presentó un daño significativamente inferior por H. zea en este ensayo con dosel en comparación con el daño de los controles negativos en el mismo ensayo. Este nivel de control por H. zea se encuentra dentro del nivel de control comercial aceptable para esta especie de plaga de la soja. Adicionalmente, en este ensayo con dosel, el evento de soja MON87751 presentó un daño significativamente inferior en comparación con los eventos de soja transgénicos generados con la construcción 5 que expresan solamente Cry2Ab (tabla 6), lo que demuestra un nivel de control ampliado. Sin embargo, la expresión de Cry2Ab es inferior en los eventos generados con la construcción 5 que en los eventos generados con la construcción 2 y la defoliación significativa de los eventos generados con la construcción 5 que expresan solamente Cry2Ab puede indicar que puede haber una eficacia reducida contra H. zea por Cry2Ab en los generados con la construcción 5.

Tabla 6. Defoliación estacional máxima para los eventos generados con las construcciones 1, 4, 5 o 6 por larvas de H. zea en un ensayo con dosel infestado artificialmente en comparación con los controles positivos y negativos.

continuación

En otra temporada de ensayos con doseles de parcela pequeña realizados en la primera ubicación geográfica, se evaluó la resistencia a la infestación de poblaciones de laboratorio de las plagas de insectos S. eridania (1° instar o 3° instar), A. gemmatalis (1° instar) y C. includens (1° instar). Los resultados de estos ensayos son los siguientes: se logró una presión extrema con el 1° instar S. eridania, y se logró una presión moderada con A. gemmatalis. La defoliación porcentual máxima (promedios ± S.E.) por larvas de A. gemmatalis (1° instar) y S. eridania (1° instar) se informa en la tabla 7.

Tabla 7. La defoliación porcentual máxima por larvas de A. gemmatalis (1° instar) y S. eridania (1° instar) en doseles infestados artificialmente que evalúan los eventos generados con las construcciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 10 y comparación con los controles positivos y negativos.

Para los ensayos que evalúan C. includens (1° instar) y S. eridania (3° instar), se logró una presión extrema para ambas plagas de insectos. La defoliación porcentual máxima (promedios ± S.E.) por larvas de C. includens (1° instar) y larvas de S. eridania (3° instar) en estos doseles infestados artificialmente se informa en la tabla 8.

Tabla 8. Defoliación porcentual máxima por larvas de C. includens (1er instar) y S. eridania (3er instar) en doseles infestados artificialmente que evalúan los eventos generados con las construcciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 10 y comparación con los controles positivos y negativos.

Los resultados para estos ensayos con doseles muestran que el evento de soja MON87751 presentó un daño significativamente inferior por S. eridania (1° instar o 3° instar), A. gemmatalis (1° instar) o C. includens (1° instar) en comparación con el daño de los controles negativos en el mismo ensayo (tabla 7 y tabla 8). Adicionalmente, en estos ensayos con doseles, el evento de soja MON87751 presentó un daño significativamente inferior por larvas de S. eridania (1° instar y 3° instar) en comparación con los eventos de soja transgénicos que expresan Cry1Ac (tabla 7 y tabla 8), lo que demuestra el rendimiento ampliado del evento MON87751 para el evento de soja transgénico disponible actualmente para el control de las plagas de lepidópteros. Además, en estos ensayos con doseles, el evento de soja MON87751 presentó un daño significativamente inferior por larvas de S. eridania en comparación con [1] cualquiera de los eventos generados con las construcciones 4, 5 o 6 (larvas de 3° instar) o los eventos generados con la construcción 6 que expresan solamente el evento Cry1A.105 (larvas de 1° instar) o los eventos generados con la construcción 3 que expresan solamente el evento Cry1A.105 (larvas de 1° instar y larvas de 3° instar) y [2] en comparación con los eventos generados con la construcción 7 que expresan Cry2Ab y Cry1A.105 sin un potenciador (larvas de 1° instar y de 3° instar), lo que demuestra el rendimiento superior del evento MON87751 que los eventos generados con las construcciones 4, 5, 6 o 7 (tabla 7 y tabla 8).

Ejemplo 4

Se realizaron ensayos de eficacia en campo abierto para evaluar la eficacia del evento de soja experimental MON87751 y los eventos creados con las diferentes construcciones de transformación 1, 2, 3, 4, 5 y 6, contra infestaciones de campo naturales de poblaciones de plagas de lepidópteros. Se utilizó la comparación de los eventos generados con la construcción 2 o 5 (expresión de Cry2Ab solamente), y los eventos generados con la construcción 3 o 6 (expresión de Cry1A.105 solamente) con los eventos generados con la construcción 1 o 4 (expresión de CrylAb y Cry1A.105) para determinar la contribución relativa de cada proteína Cry única (es decir, Cry2Ab solamente o Cry1A.105 solamente) hacia la eficacia observada en los eventos que expresan ambas proteínas Cry (es decir, Cry2Ab y Cry1A.105) de una única construcción. Se realizaron ensayos de campo de eficacia de poblaciones nativas de plagas de soja endémicas durante múltiples temporadas, en múltiples sitios de ensayo de campo y en tres ubicaciones geográficas.

En los ensayos de campo de eficacia iniciales realizados en una ubicación geográfica, los eventos (es decir, las entradas) evaluados incluyeron doce eventos generados por la construcción 1 y que expresan ambas proteínas Cry, Cry2Ab y Cry1A.105 (e incluido el evento MON87751), dos eventos generados por la construcción 2 y que expresan solamente Cry2Ab y tres eventos generados por la construcción 3 que expresan solamente Cry1A.105. En los ensayos de campo de eficacia iniciales realizados en una segunda ubicación geográfica, se evaluaron los eventos generados por las construcciones 1, 2 y 3 e incluyeron 11 eventos que expresan ambas proteínas Cry, Cry2Ab y Cry1A.105 (generados a partir de la transformación con la construcción 1 e incluido el evento MON87751), dos eventos que expresan solamente Cry2Ab (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 2) y tres eventos que expresan solamente Cry1A.105 (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 3). En una segunda temporada de ensayos de campo de eficacia realizados en 3 ubicaciones geográficas, los eventos (es decir, las entradas) evaluados incluyeron tres eventos que expresan ambas proteínas Cry, Cry2Ab y Cry1A.105 (generados a partir de la transformación con la construcción 1 e incluido el evento MON87751), un evento que expresa solamente Cry2Ab (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 2) y un evento que expresa solamente Cry1A.105 (eventos generados a partir de la transformación con la construcción 3). Los eventos evaluados en los ensayos de eficacia en campo abierto incluyeron generaciones de R3 a R7.

Para cada sitio de ensayo de campo de eficacia, se plantaron bloques de prueba y se dejó que se produjera la infestación natural por poblaciones de plagas nativas de los insectos lepidópteros diana. El bloque de prueba permaneció sin tratamiento con insecticidas para las plagas diana (Lepidoptera). Sin embargo, es posible que se haya rociado los bloques de prueba para evitar un daño significativo por plagas de insectos no diana. Todos los eventos experimentales estaban en la base de germoplasma de soja A3555 del grupo de madurez relativa 3 (RM3). Las otras entradas en los ensayos incluyeron el control positivo MON87701 (que expresa Cry1Ac) o GM_A19459 (RM5); el control parental negativo A3555 (flor púrpura, RM3); y el control comercial negativo A5547 (flor blanca, MG5) o CMA5805 (flor blanca, RM5).

Se siguieron las prácticas convencionales para establecer y realizar los ensayos de eficacia en campo abierto. Se registraron periódicamente la incidencia de las larvas de las plagas de lepidópteros, la defoliación y la etapa del crecimiento de la planta (es decir, cada 5-14 días) desde la aparición de la actividad de los lepidópteros diana y hasta la finalización de la actividad de los lepidópteros diana o hasta que las plantas llegaron a la etapa R7 de crecimiento. Se recopilaron los datos de la incidencia de la plaga de las filas 1 y 4 solo para evitar el daño a las plantas en las filas 2 y 3, que se cosecharon para obtener datos de rendimiento. La monitorización y el registro de los datos de la incidencia de las plagas se realizó del siguiente modo: se monitorizaron los lepidópteros defoliantes (es decir, A. gemmatalis, C. includens, R. nu, Spodoptera spp.) con una tela protectora o una tela de batido vertical, con al menos dos muestreos de tela protectora o cuatro de tela de batido vertical por parcela. Se registraron la cantidad total de larvas para cada especie diana encontrada y la cantidad de muestreos dentro de cada parcela como la cantidad promedio de larvas por m de fila (cantidad total de larvas cantidad de muestreos longitud de tela en metros) para cada especie diana encontrada. Los muestreos posteriores se realizaron de un modo que evitó el muestreo repetido en la misma área de cada parcela. En los ensayos de campo de eficacia realizados en una ubicación geográfica, también se registraron los datos en dos sitios de ensayo aprovechando la ocasión para el daño por H. zea mediante la selección aleatoria de 20 o 33 plantas/ubicación y el registro de la cantidad con daño por alimentación de larvas. En una segunda ubicación geográfica, se calificó un ensayo para H. zea aprovechando la ocasión mediante la selección aleatoria de 10 plantas por parcela y el registro de la cantidad total de vainas y la cantidad de vainas dañadas por planta.

Se registraron los datos para la infestación por Elasmopalpus lignosellus mediante el conteo de la cantidad total de plantas en cada parcela con daño (marchita, moribunda o muerta) debido a la alimentación con larvas. Los datos del daño para este insecto se obtuvieron en un único momento cuando se advirtió el daño máximo.

Además de las plagas diana, se monitorizaron periódicamente las plagas no diana, principalmente aquellas con potencial para superar los umbrales económicos (por ejemplo, las chinches), mediante una red de barrido, red de barrido modificada o tela para piso en ubicaciones seleccionadas al azar dentro del bloque de prueba, y se evaluaron para determinar si alcanzaron o si se aproximaron a niveles de daño económico.

En la madurez del ensayo, se cosechó la longitud total de las filas 2 y 3 de cada parcela, y se registraron el peso total y el porcentaje de humedad para cada parcela. Durante la cosecha, se observaron espacios significativos (las plantas no se tocaban entre sí) en las filas cosechadas y se registró la longitud total de estos espacios. Se calcularon los rendimientos después de corregir el peso de las semillas al 13 % de humedad. Se sometieron los datos de incidencia de las larvas, defoliación y rendimiento a ANOVA para determinar fuentes significativas de variabilidad entre la línea y la réplica para cada ubicación en el nivel de probabilidad de 0,05 (P). Se determinaron diferencias significativas entre los promedios utilizando la prueba de Tukey-Kramer (Kramer 1956) a P = 0,05.

En los ensayos en campo abierto realizados en el sitio de ensayo de campo 1, se encontraron en primer lugar orugas defoliantes en la etapa R3 de crecimiento y aumentaron a niveles moderadamente dañinos para la etapa R6 de crecimiento. Las especies encontradas incluyeron A. gemmatalis (98 %), R. nu (2 %) y Spodoptera spp. (1 %). La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la incidencia de las larvas (F = 0,0435; df = 2, 57; P = 0,9575), defoliación (F = 0,0807; df = 2, 57; P = 0,9226) o rendimiento (F = 0,0213; df = 2, 57; P = 0,979), pero el evento fue altamente significativo para los tres (incidencia de las larvas: F = 69,6956; df = 19, 38; P < 0,0001; defoliación: F = 25,9918; df = 19, 40; P < 0,0001; rendimiento: F = 3,357; df = 19, 38; P = 0,0007). La incidencia de las larvas acumulada (tabla 9) alcanzó 139-189 larvas por m de fila en los controles negativos, mientras que prácticamente no se encontraron larvas en ninguna de las entradas transgénicas. La defoliación máxima (tabla 9) promedió 21-27 % en los controles negativos y fue inexistente en todas las entradas transgénicas. Se redujeron los rendimientos (tabla 9) en ambos controles negativos con relación a todas las entradas transgénicas, aunque la variabilidad en el rendimiento redujo la importancia de estas reducciones.

El evento MON87751 tuvo una incidencia significativamente inferior de larvas de lepidópteros defoliantes (acumulado de la temporada) y una defoliación porcentual significativamente inferior (máximo de temporada) en comparación con los controles no transgénicos.

Tabla 9. Incidencia de larvas de lepidópteros defoliantes (acumulado de la temporada) y defoliación (máximo de temporada) de los eventos generados con la construcción 1,2 o 3 en ensayos de eficacia en campo abierto con infestación natural en el sitio de ensayo de campo 1.

En otro ensayo en campo abierto realizado en el sitio de ensayo de campo 2, se encontraron en primer lugar orugas defoliantes en la etapa vegetativa tardía de crecimiento y aumentaron a niveles altamente dañinos para la etapa R3 de crecimiento. Las especies encontradas incluyeron A. gemmatalis (53 %), "orugas agrimensoras" (probablemente C. includens, pero posiblemente R. nu) (44 %) y Spodoptera spp. (3%). La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la incidencia de las larvas (F = 0,0085; df = 2,57; P = 0,9915) o la defoliación (F = 0,0027; df = 2,57; P = 0,9973), mientras que el evento fue altamente significativo para ambos (incidencia de las larvas: F = 19,644; df = 19, 40; P < 0,0001; defoliación: F = 671,3147; df = 19,40; P < 0,0001). La incidencia de las larvas acumulada (tabla 10) alcanzó 43-50 larvas por m de fila en los controles negativos, mientras que se encontraron cantidad insignificantes en las entradas transgénicas. La defoliación máxima (tabla 10) promedió 87-90 % en los controles negativos, mientras que se observaron solo niveles de traza en todas las entradas transgénicas.

El evento MON87751 tuvo una incidencia significativamente inferior de larvas de lepidópteros defoliantes (acumulado de la temporada) y una defoliación porcentual significativamente inferior (máximo de temporada) en comparación con los controles no transgénicos.

Tabla 10. Incidencia de larvas de lepidópteros defoliantes (acumulado de la temporada) y defoliación (máximo de temporada) de los eventos generados con la construcción 1, 2 o 3 en un ensayo de eficacia en campo abierto con infestación natural en el sitio de ensayo de campo 2.

En otro ensayo en campo abierto, realizado en el sitio de ensayo de campo 3, la réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en las vainas totales (F = 0,312; df = 2, 24; P = 0,7349) o dañadas (F = 0,0438; df = 2, 24; P = 0,9572) por planta o rendimiento (F = 0,2221; df = 2, 24; P = 0,8025). El evento, sin embargo, fue una fuente significativa de variabilidad en las vainas totales (F = 4,3643; df = 8, 18; P = 0,0045) y dañadas (F = 34,5288; df = 8, 18; P < 0,0001) por planta, aunque no el rendimiento (F = 0,6237, df = 8, 18, P = 0,7475). Los controles negativos promediaron 25,0­ 26,0 vainas por planta con 30,8-31,0 % de las vainas dañadas, mientras que los eventos de prueba, incluido el evento MON87751, promediaron 28,9-38,9 vainas por planta con <2 % de las vainas dañadas (tabla 11). La cantidad reducida de vainas por planta en los controles negativos es probablemente consecuencia de la abscisión prematura de la vaina causada por daño por gusano de la vaina, ya que se observaron numerosas vainas dañadas en el suelo debajo de las plantas en los controles negativos (pero no en los eventos de prueba) (tabla 11).

Tabla 11. Vainas totales y dañadas por planta en ensayo de eficacia en campo abierto infestado con gusano de la vaina, realizado en el sitio del ensayo de campo 3, que evalúa los eventos generados con la construcción 1, 2 o 3.

En los ensayos en campo abierto realizados en el sitio de ensayo de campo 4, se encontraron orugas defoliantes en la etapa R3 de crecimiento y aumentaron a niveles altamente dañinos para la etapa R6-R7 de crecimiento. Las especies encontradas incluyeron A. gemmatalis (77 %), Plathypena scabra (green cloverworm) (17 %) y C. includens (6 %). La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la incidencia de las larvas (F = 0,0219; df = 2, 69; P = 0,9783), la defoliación (F = 0,0007; df = 2, 69; P = 0,9993) o el rendimiento (F = 1,1477; df = 2, 69; P = 0,3233). El evento fue significativo, a altamente significativo, para los tres (incidencia de las larvas: F = 96,9673; df = 23, 48; P < 0,0001; defoliación: F = 363,8854; df = 23, 48; P < 0,0001; rendimiento: F = 1,7814; df = 23, 48; P = 0,046). La incidencia de las larvas acumulada (tabla 12) alcanzó 117-123 larvas por m de fila en los controles negativos, mientras que prácticamente no se encontraron larvas en ninguna de las entradas transgénicas. La defoliación máxima (tabla 12) promedió 68-83 % en los controles negativos y fue inexistente en todas las entradas transgénicas, incluido el evento MON87751.

Tabla 12. Incidencia de larvas de lepidópteros defoliantes (acumulado de la temporada) y % de defoliación (máximo de temporada) de los eventos generados con la construcción 1, 2 o 3 en un ensayo en campo abierto con infestación natural en el sitio de ensayo de campo 4.

En otro ensayo en campo abierto realizado en el sitio de ensayo de campo 5, se encontraron en primer lugar orugas defoliantes en la etapa R2 de crecimiento y aumentaron a niveles altamente dañinos durante la etapa R5-R6 de crecimiento. Las especies encontradas incluyeron A. gemmatalis (93 %), C. includens (5 %) y Spodoptera omithogalli (2 %). La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la incidencia de las larvas (F = 0,0206; df = 2, 69; P = 0,9796), la defoliación (F = 0,0054; df = 2, 69; P = 0,9946) o el rendimiento (F = 0,2379; df = 2, 69; P = 0,7889). El evento fue altamente significativo para los tres (incidencia de las larvas: F = 122,46; df = 23,48; P < 0,0001; defoliación: F = 623,0217; df = 23,48; P < 0,0001; rendimiento: F = 2,9366; df = 23,48; P = 0,0008). La incidencia de las larvas acumulada (tabla 13) alcanzó 76-137 larvas por m de fila en los controles negativos, mientras que prácticamente no se encontraron larvas en ninguna de las entradas transgénicas. La defoliación máxima (tabla 13) promedió 82-88% en los controles negativos y fue inexistente en todas las entradas transgénicas, incluido el evento MON87751.

Tabla 13. Incidencia de larvas de lepidópteros defoliantes (acumulado de la temporada) y defoliación (máximo de temporada) de los eventos generados con la construcción 1,2 o 3 en un ensayo en campo abierto con infestación natural en el sitio de ensayo de campo 5.

En otro ensayo en campo abierto, realizado en el sitio de ensayo de campo 6, se encontraron orugas defoliantes (principalmente H. zea y C. includens) durante las etapas R6 de crecimiento, pero nunca alcanzaron cantidades altamente significativas. Sin embargo, se produjo un daño sustancial a las plantas por E. lignosellus en los bordes, tampones y controles negativos anteriormente en la temporada, lo que produjo plantas marchitas, moribundas o muertas para la etapa R5-R6 de crecimiento, momento en el cual se registraron los datos sobre el daño. La réplica no fue una fuente significativa de plantas dañadas por E. lignosellus (F = 0,3431; df = 2, 69; P = 0,71). El evento fue altamente significativo para las plantas dañadas por E. lignosellus: F = 16,7555; df = 23, 48; P < 0,0001). El porcentaje de plantas dañadas por E. lignosellus (tabla 14) promedió el 10-28 % en los controles negativos, mientras que ninguna planta en ninguna de las entradas transgénicas presentó daño, incluido el evento MON87751.

Tabla 14. Incidencia de daño defoliante por E. lignosellus (ensayo de eficacia en campo abierto con infestación natural de LCSB, realizado en el sitio de ensayo de campo 6, que evalúa los eventos generados con la construcción 1, 2 o 3.

En otro ensayo en campo abierto realizado en el sitio de ensayo de campo 7, se encontraron en primer lugar orugas defoliantes en la etapa R1-R2 de crecimiento y aumentaron a niveles altamente dañinos para la etapa R4-R6 de crecimiento. Las especies encontradas incluyeron C. includens (54 %), Spodoptera exigua (43 %) y Estigmene acrea (2 %). La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la incidencia de las larvas (F = 0,0866; df = 2, 69; P = 0,9172) o la defoliación (F = 0,1129; df = 2, 69; P = 0,8934). El evento fue altamente significativo para ambas (incidencia de las larvas: F = 69,918; df = 23, 48; P < 0,0001; defoliación: F = 21,6603; df = 23, 48; P < 0,0001). La incidencia de las larvas acumulada (tabla 15) alcanzó 152-166 larvas por m de fila en los controles negativos, mientras que prácticamente no se encontraron larvas en el control positivo Cry1Ac o en los eventos generados con las construcciones 1, 2 o 3 que expresan Cry2Ab y/o Cry1A.105. La defoliación máxima (tabla 15) promedió el 24 % en los controles negativos, pero no superó los niveles de traza en los eventos generados con las construcciones 1, 2 o 3 que expresan Cry2Ab y/o Cry1A.105, incluido el evento MON87751 o el control positivo Cry1Ac.

Tabla 15. Incidencia de larvas de lepidópteros defoliantes (acumulado de la temporada), defoliación (máximo de temporada) y rendimiento de los eventos generados con la construcción 1, 2 o 3 en un ensayo en campo abierto con infestación natural en el sitio de ensayo de campo 7.

continuación

En otro ensayo en campo abierto, realizado en el sitio de ensayo de campo 8, se produjo una presión moderada por las orugas defoliantes C. includens (41 %), A. gemmatalis (38 %), S. frugiperda (13 %) y S. omithogalli (8 %) durante las etapas R4-R6 de crecimiento. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en la incidencia de las larvas (F = 0,0924; df = 3, 52; P = 0,9639) o la defoliación (F = 0,372; df = 3, 52; P = 0,7735). El evento fue una fuente significativa de variabilidad en la incidencia de las larvas (F = 40,008, df = 13, 42, P < 0,0001) y la defoliación (F = 11,9356, df = 13, 42, P < 0,0001). La incidencia de las larvas acumulada y la defoliación máxima promediaron 9,1­ 13,9 larvas por m de fila y 31-35 % (la última moderadamente por encima del umbral económico), respectivamente, en los controles negativos, pero no superó la traza en el control positivo y en todos los eventos de prueba, incluido el evento MON87751 (tabla 16). No se observó aparición significativa de plagas no diana en el ensayo.

Tabla 16. Incidencia acumulada de larvas de lepidópteros defoliantes, defoliación porcentual máxima y rendimiento en ensayo de eficacia en campo abierto con infestación natural realizado en el sitio de ensayo de campo 8.

Durante una segunda temporada de ensayos en campo abierto realizados en el sitio de ensayo de campo 6, se produjo una presión muy fuerte por H. zea durante las etapas R3-R5 de crecimiento. La réplica no fue una fuente significativa de variabilidad en las vainas dañadas (F = 0,0280; df = 3, 52; P = 0,9936). El evento fue una fuente significativa de variabilidad en las vainas dañadas (F = 15,4758, df = 13, 42, P < 0,0001). Los controles negativos promediaron el 64­ 78 % de vainas dañadas, mientras que prácticamente no se produjo daño en ninguno de los eventos de prueba, incluido el evento MON87751 (tabla 17).

Tabla 17. Incidencia acumulada de larvas de lepidópteros defoliantes, defoliación porcentual máxima, producción de vainas, porcentaje de vainas dañadas por larvas heliothine y rendimiento en ensayo de eficacia en campo abierto con infestación natural realizado durante una segunda temporada en el sitio de ensayo de campo 6.

Los resultados de los múltiples ensayos en campo abierto descritos en este ejemplo, combinados con los resultados de los múltiples ensayos con doseles (descritos en el ejemplo 3) confirman adicionalmente la supresión eficaz, durante toda la temporada, de las poblaciones de larvas de las plagas de lepidópteros de la soja encontradas por los eventos de soja transgénicos generados por las construcciones 1,2 o 3 a lo largo de cinco generaciones de plantas (R2 a R7), lo que sugiere una expresión del transgén estable dentro y entre las generaciones.

Los resultados combinados demuestran que, en condiciones de presión por encima del umbral por las cuatro plagas diana principales (Anticarsia gemmatalis y Chrysodeixis includens en una ubicación geográfica y las mismas plagas diana más Rachiplusia nu y Crocidosema aporema en una segunda ubicación geográfica), la eficacia por los eventos transgénicos generados con las construcciones 1, 2 o 3, incluido el evento MON87751, fue equivalente a la de un evento transgénico que expresa Cry1Ac que se demostró anteriormente que controla las plagas de insectos lepidópteros de la soja. Los eventos generados con las construcciones 2 o 3 y que expresan solamente la proteína Cry2Ab o solamente la proteína Cry1A.105, respectivamente, también demostraron eficacia equivalente a la del evento transgénico que expresa la proteína Cry1Ac, lo que sugiere que la expresión de las proteínas Cry2Ab y Cry1A.105 en el evento MON87751 tendrá una durabilidad mejorada sobre el evento transgénico Cry1Ac a través de un manejo mejorado de la resistencia a los insectos.

La eficacia equivalente entre los eventos generados con la construcción 1, incluido el evento MON87751, también se demostró contra numerosas plagas diana secundarias, incluidas tres especies de gusano cogollero (Spodoptera exigua, S. frugiperda y S. eridania), dos gusanos de la vaina heliothine (Helicoverpa zea y H. gelotopeon), un insecto "stalkboring" (Elasmopalpus lignosellus) y un defoliador (Plathypena scabra).

Ejemplo 5

Este ejemplo describe la caracterización molecular del evento MON87751, el cual incluía expresión de proteínas y caracterización molecular extensiva. Esta caracterización molecular se completó simultáneamente en los eventos que se estaban evaluando en ensayos de campo agronómicos, ensayos con doseles de eficacia y ensayos de campo de eficacia.

Para la caracterización molecular del evento MON87751, se determinó la cantidad de copias de la secuencia del inserto transgenética (que comprende casetes de Cry2Ab y Cry1A.105, SEQ ID NO:9) utilizando una combinación de análisis "Southern" y ensayo de criterios de valoración TAQMAN®. El análisis molecular confirmó que había un único inserto (casete de expresión de T-ADN que contiene casetes de expresión para proteínas Cry2Ab y Cry1A.105 y representado por SEQ ID NO:9) sin ninguna detección de la estructura del vector y sin ninguna detección del casete de T-ADN que contiene las secuencias de los marcadores de selección/calificables. La secuencia completa del único inserto (SEQ ID NO:9) en el ADN genómico del evento MON87751 confirmó que la secuencia era idéntica a la secuencia de la construcción de transformación.

Para la expresión de proteínas, se recolectaron muestras de hojas de plantas homocigotas para el alelo del evento MON87751 y se prepararon extractos de muestras liofilizadas, se llevaron a cabo ELISA por protocolos estándar que medían el nivel de proteínas Cry2Ab o Cry1A.105 con anticuerpos específicos para Cry2Ab o Cry1A.105, respectivamente, y los resultados se expresaron como partes por millón (ppm) de peso seco. Se recolectaros muestras de hojas en la etapa R1 y R3 del crecimiento de la planta para los eventos generados por transformación con construcciones 1, 2 o 3 y la A3555 de control no transgénica. Los resultados de ELISA indicaron que los niveles de Cry2Ab para los eventos generados a partir de la construcción 1 y la construcción 2 oscilaban entre aproximadamente 20 ppm y aproximadamente 50 ppm de peso seco, con la excepción del evento 8 (el cual se determinó que tenía un promotor unido, pero ninguna otra secuencia, del T-ADN del marcador de selección/calificable, y el evento 8 no se evaluó adicionalmente), y ninguna expresión de Cry2Ab de los eventos generados con la construcción 3 (que solamente expresa Cry1A.105) o la soja de control no transgénica (figura 3A). Además, los niveles de expresión de proteína Cry2Ab fueron aproximadamente iguales para ambas etapas del crecimiento, R1 y R3. Los resultados de ELISA indicaron que los niveles de Cry1A.105 de los eventos generados a partir de la construcción 1 y la construcción 3 oscilaban entre aproximadamente 150 ppm y aproximadamente 800 ppm de peso seco, y ninguna expresión de Cry1A.105 de ninguno de los eventos generados con la construcción 2 (que solamente expresa Cry2Ab) o la soja de control no transgénica (figura 3B). Además, los niveles de expresión de la proteína Cry1A.105 oscilaron superiores para las muestras de hojas en la etapa de crecimiento R3 en comparación con la etapa de crecimiento R1.

Los resultados de ELISA adicionales muestran que los niveles de proteína Cry2Ab de los eventos generados con construcción 1 eran mayores con respecto a los eventos generados ya sea con construcción 5 o construcción 4 y, tal como se esperaba, no se detectó ninguna Cry2Ab ni para la soja de control no transgénica ni para los eventos generados con construcción 6 (que solamente expresa Cry1A.105) (figura 4A). En el mismo conjunto de muestras de hojas, los resultados de ELISA muestran que hay un nivel dos veces mayor o más de expresión de Cry1A.105, para los eventos generados con construcción 1, con una expresión aproximadamente cuatro veces mayor para MON87751, cuando se compara con los eventos generados ya sea con construcción 6 o construcción 4 y, como se esperaba, no se detectó ninguna expresión de Cry1A.105 ni para la soja de control no transgénica ni para los eventos generados con construcción 5 (que solamente expresa Cry2Ab) (figura 4B). Para estos ELISA, se recolectaron muestras de hojas de la etapa R3 de crecimiento de las plantas cultivadas en cada una de las dos ubicaciones para ensayos con doseles de eficacia separados.

Además, los resultados de ELISA muestran que los niveles de proteína Cry2Ab en los extractos de un evento generado con construcción 1 y un evento generado con construcción 2 eran a) mayores con respecto a los eventos generados ya sea con construcción 4, construcción 5 o construcción 7; b) aproximadamente los mismos o algo inferiores con respecto a los eventos generados ya sea con construcción 9 o construcción 11; y c) como se esperaba, no se detectó ninguna Cry2Ab ni para la soja de control no transgénica (no se muestra) ni para los eventos generados con construcción 3 o construcción 6 (que solamente expresa Cry1A.105) (figura 5). Para estos ELISA, se recolectaron muestras de hojas en la etapa R3 y R5 de crecimiento, los niveles de Cry2Ab fueron mayores en la etapa de crecimiento R5 para los eventos generados con construcción 1 y construcción 2 y los niveles de Cry2Ab fueron mayores en los eventos generados con construcción 9 y construcción 11 (figura 5). En el mismo conjunto de muestras de hojas, los resultados de ELISA muestran que los niveles de proteína Cry1A.105 en los extractos de los eventos generados con construcción 1 y construcción 3 eran significativamente mayores con respecto a los eventos generados con construcción 4, construcción 6, construcción 9 o construcción 7 y, como se esperaba, no se detectó ninguna Cry1A.105 ni para la soja de control no transgénica (no se muestra) ni para los eventos generados ya sea con construcción 2 o construcción 5 (que solamente expresan Cry2Ab) (figura 6). Para estos ELISA, se recolectaron muestras de hojas en la etapa R3 y R5 de crecimiento, los niveles de Cry1A.105 eran órdenes de magnitud mayores en la etapa de crecimiento R5 para los eventos generados con construcción 1 y construcción 3, en comparación con los eventos generados con construcción 4, construcción 6, construcción 9 o construcción 7, véase el eje Y de la figura 6A graficada a 0 - 5000 ppm de peso seco y el eje Y de la figura 6B graficada a 0-500 ppm de peso seco. Los datos de ELISA indican que hay una mayor expresión tanto de Cry2Ab como de Cry1A.105 en los eventos generados con construcción 1 en comparación con los eventos generados con construcción 4, construcción 7 o construcción 9; todos contienen dos casetes de expresión de proteína Cry - un casetes de expresión que codifica Cry2Ab y un casetes de expresión que codifica Cry1A.105. Adicionalmente, se observó que la expresión de proteína relativamente alta en los eventos generados con construcción 1 (incluso el evento MON87751), construcción 2 y construcción 3, era estable en al menos 4 generaciones de soja (R0, R1, R2 y R3), y el nivel de proteína Cry1A.105 aumentó en tejido de hoja recolectado de eventos homocigotos en la etapa de R3 a R5 de crecimiento.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe procedimientos útiles para identificar la presencia de ADN del evento MON87751 en una muestra de soja. Se diseñaron un par de cebadores de PCR y una sonda para identificar la unión única formada entre el ADN genómico y el extremo designado arbitrariamente 3' del ADN insertado del evento MON87751 (es decir, la unión 3') y se encuentran en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6.

La secuencia del cebador directo de oligonucleótidos SQ20267 (SEQ ID NO:11) es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 11400 a 11426 de SEQ ID NO:10, las posiciones de 212 a 238 de SEQ ID NO:8 y las posiciones de 10066 a 10092 de SEQ ID NO:9. La secuencia del cebador inverso de oligonucleótidos SQ25826 (SEQ ID NO:12) es idéntica al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 11454 a 11479 de SEQ ID n O:10, las posiciones de 266 a 291 de SEQ ID NO:8, las posiciones de 51 a 76 de SEQ ID NO:6 y las posiciones de 31 a 56 de SEQ ID NO:4. La secuencia de la sonda de oligonucleótidos PB10263 (SEQ ID NO:13) es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones de 11428 a 11446 de SEQ ID NO:10, las posiciones de 10094 a 10112 de SEQ ID NO:9, las posiciones de 240 a 258 de SEQ ID NO:8, las posiciones de 25 a 43 de SEQ ID NO:6 y las posiciones de 5 a 23 de SEQ ID NO:4. Los cebadores SQ20267 (SEQ ID NO:11) y SQ25826 (SEQ ID NO:12) de PCR amplifican un amplicón de nucleótidos 80 del ADN insertado/genómico único en la unión derecha del evento MON87751. Se puede utilizar este mismo par de cebadores con sonda PB10263 (SEQ ID NO:13), que puede estar marcado con fluorescencia (por ejemplo, una etiqueta fluorescente 6FAM™), en un ensayo de criterios de valoración TaqMan® de PCR para identificar la presencia de ADN derivado del evento MON87751 en una muestra.

Además de SQ20267 (SEQ ID NO:11), SQ25826 (SEQ ID NO:12) y PB10263 (SEQ ID NO:13), será evidente para los expertos en la técnica que se puede diseñar otros cebadores y/o sondas ya sea para amplificarse y/o hibridarse a las secuencias dentro SEQ ID n O:10 que son únicas, y útiles, para detectar la presencia de ADN derivado del evento MON87751 en una muestra.

Siguiendo las prácticas de laboratorio convencionales de biología molecular, se desarrollaron ensayos PCR para identificación de eventos para la detección del evento MON87751 DNA en una muestra. Se optimizaron los parámetros de un ensayo PCR convencional o un ensayo TaqMan® de PCR con cada conjunto de pares de cebadores y sondas (es decir, sondas marcadas con una etiqueta fluorescente tal como 6FAM™) utilizados para detectar la presencia de ADN derivado del evento MON87751 en una muestra SQ20267 (SEQ ID NO:11), SQ25826 (SEQ ID NO:12) y PB10263 (SEQ ID NO:13). Un control para la reacción PCR incluye cebadores de control interno y una sonda de control interno (por ejemplo, marcados con VIC™), específicos para un solo gen de copia en el genoma de soja. Los expertos en la técnica sabrán cómo diseñar cebadores específicos para un gen de copia simple en el genoma de soja. Generalmente, los parámetros que se optimizaban para la detección del ADN del evento MON87751 en una muestra incluían parámetros de concentración de sonda y cebador, de cantidad de ADN molde y de ciclos de amplificación de por PCR. Los controles y las muestras de ADN molde eran de la siguiente forma: [1] ADN extraído ya sea de una muestra de hoja o una única muestra de semilla para ser analizado; [2] ADN de control negativo (ADN de soja no transgénica); [3] control de agua negativo (sin molde); y [4] ADN del MON87751 de control positivo. Otros procedimientos conocidos para los expertos en la técnica que producen amplicones que identifican el ADN del evento MON87751 en una muestra quedan comprendidos en la técnica.

Un ensayo de cigosidad es útil para determinar sin una planta que comprende un evento es homocigota para el ADN del evento que comprende el ADN exógeno en la misma ubicación en cada cromosoma de un par de cromosomas; o heterocigótica para un ADN del evento, que comprende el ADN exógeno solamente en un cromosoma de un par de cromosomas; o es nula para el ADN del evento, que es natural. Se utilizó un procedimiento de amplificación térmica de criterios de valoración TAQMAN® para desarrollar un ensayo de cigosidad para el evento MON87751. Para este ensayo, se mezclaron tres cebadores y dos sondas junto con la muestra para el ensayo. Los tres cebadores eran SQ20267 (SEQ ID NO:11), que se hibrida y se extiende específicamente desde la región 3' del ADN exógeno insertado; cebador SQ27115 (SEQ ID NO:14), que se hibrida y se extiende específicamente desde el ADN genómico de soja que flanquea la parte 3' del ADN exógeno insertado; y cebador SQ26901 (SEQ ID NO:15), que se hibrida y se extiende específicamente desde el ADN genómico de soja que flanquea la parte 5' del ADN exógeno insertado. Los cebadores SQ20267 y SQ27115 y la sonda PB10263 (SEQ ID NO:13) (marcados con 6-FAM™) son de diagnóstico cuando hay una copia del ADN exógeno insertado presente en el ADN molde, es decir, para el evento MON87751. Los cebadores SQ26901 y SQ27115 y la sonda PB11254 (SEQ ID NO:16) (marcados con VIC™) son de diagnóstico cuando no hay copia del ADN exógeno insertado presente en el ADN genómico, es decir, natural. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción PCR con ADN extraído de una planta homocigota para el evento MON87751, hay una señal fluorescente solamente desde la sonda PB10263 marcada con 6-FAM™ que es indicativa de un diagnóstico para una planta homocigota para el evento MON87751. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción PCR con ADN extraído de una planta heterocigota para el evento MON87751, hay una señal fluorescente desde la sonda PB10263 marcada con 6-FAm ™ y la sonda PB11254 marcada con VIC™ que es indicativa de un diagnóstico para una planta heterocigota para el evento MON87751. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción PCR con ADN extraído de una planta que es nula para el evento MON87751 (es decir, natural), hay una señal fluorescente solamente desde la sonda PB11254 marcada con VIC™ que es indicativa de un diagnóstico para una planta nula para el evento MON87751, es decir, de tipo salvaje. Los controles y las muestras de ADN molde eran de la siguiente forma: [1] ADN extraído ya sea de una muestra de hoja o una única muestra de semilla para ser analizado; [2] ADN de control negativo (ADN no transgénico); [3] control de agua negativo (sin molde); [4] ADN genómico del MON87751 de control positivo de muestra heterocigota conocida; y [5] ADN genómico del MON87751 de control positivo de muestra homocigota conocida.

Ejemplo 7

El siguiente ejemplo describe cómo se puede identificar el evento MON87751 dentro de la progenie de cualquier actividad de mejoramiento utilizando evento de soja MON87751.

Se utilizan pares de cebadores del evento de ADN para producir un amplicón de diagnóstico por PCR para el evento de soja MON87751. Un amplicón de diagnóstico para MON87751 comprende al menos una secuencia de unión, proporcionada como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEC. ID. N.:5 o SEQ ID NO:6. Los pares de cebadores que producirán un amplicón de diagnóstico para MON87751 incluyen pares de cebadores en base a las secuencias de flanqueo y casete de expresión insertado (SEQ ID NO:9). Para adquirir un amplicón de diagnóstico en el cual haya SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5, se debe diseñar una molécula de cebador directo en base a SEQ ID NO:7 de las bases de 1 a 1334 y una molécula de cebador inverso en base a la secuencia de ADN del casete de expresión insertado (SEQ ID NO:9 de las posiciones de 1 a 10119) en donde las moléculas de cebadores son de longitud suficiente de nucleótidos contiguos para hibridarse específicamente con SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:9. Para adquirir un amplicón de diagnóstico en el cual haya SEQ ID n O:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6, se debe diseñar una molécula de cebador directo en base a la secuencia de ADN del casete de expresión insertado (SEQ ID NO:9 desde las posiciones de 1 a 10119) y una molécula de cebador inverso en base a la secuencia de flanqueo de 3' (SEQ ID NO:8 desde las posiciones de 266 a 1452), en donde las moléculas de cebadores son de longitud suficiente de nucleótidos contiguos para hibridarse específicamente con SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9.

En el ejemplo 4 se ilustra un ejemplo de las condiciones de amplificación para este análisis. Sin embargo, cualquier modificación de estos procedimientos o el uso de los cebadores de ADN homólogos o complementarios a SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 o las secuencias de ADN de los elementos genéticos contenidos en el inserto transgenético (SEQ ID NO:9) de MON87751 que producen un amplicón de diagnóstico para MON87751 se encuentra en la técnica. Un amplicón de diagnóstico comprende una molécula de ADN homólogo o complementario a al menos un ADN de unión genómica/transgén (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6) o una porción sustancial de este. Alternativamente, un amplicón de diagnóstico comprende una molécula de ADN homólogo o complementario a al menos una secuencia transgenética única (SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23).

Un análisis para una muestra de tejido de planta del evento MON87751 incluirá un control de tejido positivo del evento MON87751, un control negativo de una planta de soja que no sea evento MON87751 (por ejemplo, entre otros, A3555) y un control negativo que no contenga ADN genómico de soja. Un par de cebadores que amplificará una molécula de ADN de soja endógena servirá como control interno para las condiciones de amplificación de ADN. Los expertos en la técnica de procedimientos de amplificación de ADN pueden seleccionar secuencias de cebadores adicionales de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9, y las condiciones seleccionadas para la producción de un amplicón a través de los procedimientos que se muestran en el ejemplo 4 pueden diferir, pero producen un amplicón de diagnóstico para el ADN del evento MON87751. El uso de estas secuencias de cebadores de ADN con modificaciones a los procedimientos del ejemplo 4 se encuentran dentro del alcance de la invención. El amplicón producido por el menos una secuencia de cebadores de ADN derivada de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9 que es diagnóstico para MON87751 es un aspecto de la invención.

Los kits de detección de ADN contienen al menos un cebador de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos derivado de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9, que cuando se utiliza en un procedimiento de amplificación de ADN produce un amplicón de diagnóstico para MON87751 o su progenie en un aspecto de la invención. Una planta de soja, parte de una planta, célula de una planta, semilla o producto básico de MON87751 que produce un amplicón de diagnóstico para MON87751 cuando se evalúa en un procedimiento de amplificación de ADN es un aspecto de la invención. Se puede realizar el ensayo para el amplicón de MON87751 utilizando un sistema 9700 de p Cr Applied Biosystems GeneAmp® (corrida a máxima velocidad) o termociclador MJ Research DNA Engine PTC-225 o cualquier otro sistema de amplificación que se pueda utilizar para producir un amplicón de diagnóstico de MON87751 como se muestra en el ejemplo 4.

Ejemplo 8

Para producir plantas de soja o partes de plantas de estas que comprendan propiedades agronómicas, insecticidas o herbicidas mejoradas, se cruzan plantas de soja que contienen evento MON87751 con plantas de soja que contienen potencialmente cualquier otro evento de soja o combinación de estos y se evalúan los fenotipos para determinar las propiedades resultantes de las plantas de la progenie. Las propiedades conferidas a las plantas de la progenie que resultan del fitomejoramiento de dicha planta pueden extenderse más allá de la resistencia a lepidópteros del evento MON87751, incluso, entre otros, al control de la plaga sobre el suelo, tolerancia al herbicida, propiedades nematicidas, resistencia a la sequía, resistencia al virus, control anti-hongos, resistencia a las bacterias, esterilidad masculina, tolerancia al frío, tolerancia a la sal, mayor rendimiento, composición de aceite mejorado, mayor composición de aceite, mayor eficacia del uso de nutrientes o contenido de aminoácido alterado. Los ejemplos de eventos transgénicos con rasgos agronómicos mejorados se conocen en la técnica. A continuación se presenta una lista no exhaustiva de posibles líneas de soja transgénicas que se pueden utilizar en el fitomejoramiento con el evento MON87751 para conferir propiedades mejoradas en plantas de soja, partes de plantas, semillas o producto básico. El fitomejoramiento puede incluir cualquiera y todas las combinaciones de las siguientes: tolerancia al herbicida: soja g Ts 40-3-2,

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN recombinante detectable en una muestra que contiene ADN de soja caracterizada por la secuencia de nucleótidos de dicha molécula es:

a) SEQ ID NO:10; o

b) una secuencia de nucleótidos totalmente complementaria a (a),

caracterizada porque detectar la presencia de dicha molécula de ADN es un diagnóstico para el ADN del evento de soja MON87751 en dicha muestra.

2. Un par de moléculas de ADN que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, que funcionan como cebadores de ADN cuando se utilizan juntas en una reacción de amplificación con una muestra que contiene el ADN molde del evento de soja MON87751 para producir un amplicón de diagnóstico para dicho ADN del evento de soja MON87751 en dicha muestra, caracterizada porque dicho amplicón comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:10.

3. Un procedimiento para detectar la presencia de un segmento de ADN de diagnóstico para el ADN del evento de soja MON87751 en una muestra, el cual procedimiento comprende:

a) poner en contacto dicha muestra con un par de moléculas de ADN que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN que sirve como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con una muestra que contiene ADN molde del evento de la soja MON87751 para producir un diagnóstico de amplicón para dicho ADN del evento de la soja MON87751 en dicha muestra, caracterizado porque dicho amplicón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10;

b) realizar una reacción de amplificación suficiente como para producir un amplicón de ADN; y

c) detectar la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción, caracterizado porque dicho amplicón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq iD NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:10 y caracterizado porque dicha detección de la presencia de dicho amplicón es diagnóstico para el ADN del evento de la soja MON87751 en dicha muestra.

4. Una planta de soja, la parte de una planta de soja o la célula de soja de estas que comprende una molécula de polinucleótido recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10, caracterizado porque la planta de soja, la parte de una planta de soja o la célula de soja de estas expresa una proteína CryAb y una proteína Cry1A.105 de un casete de expresión transgénico y es insecticida cuando se proporciona en la dieta de una plaga de insectos lepidópteros.

5. La planta de soja, la parte de una planta de soja o la célula de soja de estas de la reivindicación 4, caracterizada porque dicha plaga de insectos lepidópteros se selecciona del grupo que consiste en Chrysodeixis spp., Spodoptera spp., Helicoverpa spp., Crocidosema spp., Rachiplusia spp., Anticarsia spp., Elasmopalpus spp. y Plathypena spp.

6. La planta de soja, la parte de una planta de soja o la célula de soja de estas de la reivindicación 4 caracterizada porque dicha planta de soja se define adicionalmente como una progenie de cualquier generación de una planta de soja que comprende dicho evento de soja MON87751.

7. Un procedimiento para proteger una planta de soja de la infestación de insectos caracterizado porque dicho procedimiento comprende proporcionar en la dieta de una plaga de lepidópteros de la soja una cantidad eficaz como insecticida de células o tejido de la planta de soja que comprende la SEQ Id NO: 10.

8. Una semilla de soja que comprende una cantidad detectable de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:10, caracterizada porque la planta de soja, parte de la planta de soja o la célula de soja de éstas obtenible de la semilla expresa una proteína Cry2Ab, y una proteína Cry1A.105 de un casete de expresión transgénica y es insecticida cuando se proporciona en la dieta de una plaga de insectos lepidópteros.

9. Una planta de soja, una parte de una planta de soja o una semilla de soja de estas que comprende ADN que funciona como un molde cuando se evalúa en un procedimiento de amplificación de ADN que produce un amplicón de diagnóstico para la presencia de la SEQ ID NO: 10.

10. Un procedimiento para determinar la cigosidad de una planta de soja o de una semilla de soja que comprende la SEQ ID NO: 10 que comprende:

a) poner en contacto una muestra que comprende ADN de soja con un conjunto de cebadores capaz de producir un primer amplicón de diagnóstico para la SEQ ID NO: 10 y un segundo amplicón de diagnóstico para el ADN genómico de soja nativo que no comprende la SEQ ID NO: 10;

i) realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con dicha muestra y dicho conjunto de cebadores; y

ii) detectar en dicha reacción de amplificación de ácidos nucleicos dicho primer amplicón de diagnóstico para la SEQ ID NO: 10 o dicho segundo amplicón de diagnóstico para el a Dn genómico de soja nativo que no comprende el evento MON87751;

caracterizado porque la presencia de dicho primer amplicón solamente es un diagnóstico de un ADN homocigótico de la SEQ ID NO: 10 en la muestra y la presencia de dichos primer amplicón y segundo amplicón es un diagnóstico de una planta de soja heterocigota para el alelo de la s Eq ID NO:10; o

b) poner en contacto una muestra que comprende ADN de soja con un conjunto de sondas que contiene al menos una primera sonda que se hibrida específicamente con el ADN de la SEQ ID NO: 10 y al menos una segunda sonda que se hibrida específicamente con el ADN genómico de soja que fue alterado por la inserción del ADN heterólogo de la SEQ ID NO: 10 y no se hibrida con el ADN de la SEQ ID NO: 10,

i) hibridar el conjunto de sondas con dicha muestra en condiciones rigurosas de hibridación,

caracterizado porque la detección de la hibridación de dicha primera sonda solamente en dichas condiciones de hibridación es un diagnóstico para un alelo homocigoto del ADN de la SEQ ID NO: 10 en una muestra, y caracterizado porque la detección de la hibridación de dicha primera sonda y dicha segunda sonda en dichas condiciones de hibridación es un diagnóstico para un alelo heterocigoto del ADN de la SEQ ID NO: 10 en dicha muestra.