UA124407C2 - Рекомбінантна молекула днк, яка надає рослині стійкості до лускокрилої комахи-шкідника, і спосіб її виявлення та використання - Google Patents
Рекомбінантна молекула днк, яка надає рослині стійкості до лускокрилої комахи-шкідника, і спосіб її виявлення та використання Download PDFInfo
- Publication number
- UA124407C2 UA124407C2 UAA201600271A UAA201600271A UA124407C2 UA 124407 C2 UA124407 C2 UA 124407C2 UA A201600271 A UAA201600271 A UA A201600271A UA A201600271 A UAA201600271 A UA A201600271A UA 124407 C2 UA124407 C2 UA 124407C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- soybean
- dna
- transgenic
- specified
- sample
- Prior art date
Links
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 457
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 362
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 200
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 92
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 38
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 190
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 380
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 191
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 110
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 98
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 97
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 71
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 59
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 57
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 48
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 48
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 38
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 16
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 14
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 14
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 12
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 7
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000037213 diet Effects 0.000 claims description 4
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 4
- 235000019710 soybean protein Nutrition 0.000 claims description 4
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 121
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 112
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 95
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 86
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 84
- 230000035613 defoliation Effects 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 53
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 50
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 41
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 37
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 34
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 32
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 26
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 25
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 21
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 19
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 18
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 241000894007 species Species 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 13
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 10
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003044 randomized block design Methods 0.000 description 6
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 6
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 5
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 241001455617 Sula Species 0.000 description 4
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 4
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 101100482058 Abies grandis ag11 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241001414720 Cicadellidae Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241000256682 Peregrinus maidis Species 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000030717 instar larval development Effects 0.000 description 2
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 2
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 2
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- IRLPACMLTUPBCL-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylyl sulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 101100482059 Abies grandis AS gene Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 1
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000353522 Earias insulana Species 0.000 description 1
- 241001144268 Echidna Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 235000009432 Gossypium hirsutum Nutrition 0.000 description 1
- 241001316290 Gypsophila Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100029797 Sodium-dependent phosphate transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710116331 Sodium-dependent phosphate transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020000005 Sucrose phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000348346 Suta Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229960005255 carbenicillin disodium Drugs 0.000 description 1
- RTYJTGSCYUUYAL-YCAHSCEMSA-L carbenicillin disodium Chemical compound [Na+].[Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)C(C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 RTYJTGSCYUUYAL-YCAHSCEMSA-L 0.000 description 1
- 229960002727 cefotaxime sodium Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- -1 lso Species 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000001069 nematicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- ABVRVIZBZKUTMK-JSYANWSFSA-M potassium clavulanate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 ABVRVIZBZKUTMK-JSYANWSFSA-M 0.000 description 1
- 238000012794 pre-harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000013528 soy cheese Nutrition 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960004075 ticarcillin disodium Drugs 0.000 description 1
- ZBBCUBMBMZNEME-QBGWIPKPSA-L ticarcillin disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C=1([C@@H](C([O-])=O)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)C=CSC=1 ZBBCUBMBMZNEME-QBGWIPKPSA-L 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
- A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Abstract
Винахід стосується рекомбінантної молекули ДНК, яка надає рослині стійкість до лускокрилої комахи-шкідника; молекули ДНК, що містить полінуклеотидний сегмент достатньої довжини для функціонування як зонд, який гібридизується специфічно з рекомбінантною молекулою ДНК, яка надає рослині стійкість до лускокрилої комахи-шкідника; пари молекул ДНК, які містить першу молекулу ДНК і другу молекулу ДНК, що відрізняється від першої молекули ДНК, які виконують роль ДНК-праймерів; способу виявлення присутності сегмента ДНК, який є діагностичним критерієм для рекомбінантної молекули ДНК, яка надає рослині стійкість до лускокрилої комахи-шкідника; рослини сої, частини рослини сої або її клітини, які містять рекомбінантну полінуклеотидну молекулу; способу захисту рослин сої від ураження лускокрилими комахами-шкідниками; способу відбирання потомства, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка надає рослині стійкість до лускокрилої комахи-шкідника; бактерії, яка містить виявлювану кількість рекомбінантної молекули ДНК, яка надає рослині стійкість до лускокрилої комахи-шкідника, та способу визначення зиготності рослини сої або насінини сої.
Description
полінуклеотидну молекулу; способу захисту рослин сої від ураження лускокрилими комахами- шкідниками; способу відбирання потомства, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка надає рослині стійкість до лускокрилої комахи-шкідника; бактерії, яка містить виявлювану кількість рекомбінантної молекули ДНК, яка надає рослині стійкість до лускокрилої комахи-шкідника, та способу визначення зиготності рослини сої або насінини сої.
ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
ІЇО0О1| У цій заявці заявляється пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо 61/834899, поданої 14 червня 2013, повний зміст якої включено у цей документ за допомогою посилання.
Включення переліку послідовностей
І002| Перелік послідовностей міститься у файлі під назвою МОМ5357УМО 5Т25.МХІ, розміром 43 кілобайти (розмір виміряно у Місгозой М/іпдом/5Ф), створеному 12 червня 2014 поданий в цьому документі в електронному вигляді і включений в цей документ за допомогою посилання.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
ІЇ0О3| Цей винахід стосується трансгенного об'єкту СіІусіпе тах (сої), згаданому як
МОМ87751. Об'єкт передбачає дві різні форми дії по опору ураженням сої від лускокрилих, надаючи унікальне поєднання інсектицидних токсичних білків, раніше не доступних рослинам сої. Поєднання цих інсектицидних токсичних білків є досить ефективним для контролю ураження видами лускокрилих, характерного для рослин сої. Винахід також відноситься до рослин сої, частин рослин, насіння рослин, рослинних клітин, потомства рослин, сільськогосподарської продукції, і способів, що належать до об'єкта МОМ87751 і забезпечує нуклеотидні молекули, які є унікальними для об'єкта, створені у зв'язку з включенням трансгенної ДНК в геном клітини Сіусіпе тах (сої), та придатні для виявлення присутності цього об'єкта в біологічних зразках, що містять нуклеїнові кислоти сої.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
ІЇ004| Соя (Сіусіпе тах) являє собою найважливішу сільськогосподарську культуру в багатьох регіонах світу, біотехнологічні способи були застосовані до цієї культури з метою створення різновидів сої з бажаними ознаками. Одною з таких бажаних ознак є стійкість до комах. Експресія трансгена стійкості до комах в рослині може наділити рослину бажаною ознакою стійкості до комах, але експресія трансгена може бути схильна до впливу багатьох різних факторів, включаючи орієнтацію і склад касет керуючих експресією окремих генів, перенесених в рослинну хромосому, хромосомним розташуванням і геномним результатом трансгенної вставки. Наприклад, було відмічено у рослин, що існують відмінності в рівні і характері експресії трансгена серед окремих об'єктів, які відрізняються сайтами вбудовування трансгена в хромосому, але в іншому ідентичні. Існують також небажані та/або бажані фенотипічні й економічні відмінності між об'єктами. Тому, часто виникає необхідність створювати і аналізувати велику кількість окремих трансформованих рослинних клітин для того, щоб вибрати об'єкт, що має як бажану ознаку, так і оптимальні фенотипічні та сільськогосподарські характеристики придатні для комерційного успіху. Вибір бажаного трансгенного об'єкта вимагає широкої молекулярної характеристики, а також тепличних і польових випробувань з великою кількістю об'єктів протягом декількох років, в декількох місцях, і за різних умов. Збирається значна кількість інформації про ефективність, фенотипічні і молекулярні дані, зібрані і отримані дані і спостереження потім аналізуються командами вчених і агрономів з метою вибору одного або більш комерційно придатних об'єктів. Одного разу вибраний об'єкт потім використовується для інтрогресії бажаної трансгенної ознаки в інші генетичні оточення за допомогою селекційних методів рослин, таким чином, виробляючи цілий ряд різних різновидів сільськогосподарських культур, які містять бажану ознаку і здатні адаптуватися до конкретних місцевих агрономічних умов. 005) Трансгенні рослини сої, які забезпечують інсектицидний контроль ураження комахами шляхом експресії єдиного токсину схильні до ризику обмеженою довговічності через підвищену ймовірності розвитку стійкості до токсину у комах-шкідників. Аналогічним чином, трансгенні рослини сої, що містять токсичні речовини, які не забезпечують кілька унікальних форм впливу можуть також піддаватися ризику обмеженою довговічності. Перший з сортів сої, який виробляє білок, токсичний для лускокрилих, містить єдиний токсичний білок - СтутАс. Нещодавно були розкриті трансгенні об'єкти сої, що містять токсичні білки СтутАс і Стуїб. Якщо має місце стійкість до СтуТАс, у СтгуТАс і СгуїЕ трансгенний об'єкт залишився б тільки токсин СтуїЕ в якості джерела ефективності. Тому необхідно передбачити рослину сої, яка має два або більше токсичних агента для контролю комах-шкідників, контрольованих СтутАс, в яких жоден з токсичних агентів не зв'язує ті ж або по суті ті ж рецептори в середній кишці комахи, які зв'язує
СтутАс. Винахід описаний в цьому документі пропонує трансгенний об'єкт сої МОМ87751, який долає описану вище проблему стійкості трансгенних об'єктів сої, описаних у відомому рівні техніки, шляхом надання двох або більше токсичних для лускокрилих шкідників агентів, серед яких жоден токсичний агент був раніше включений в будь-яку рослину сої з метою таргетингу для контролю лускокрилих шкідників сої. бо І006| Для створення трансгенної рослини, що містить один-єдиний трансформуючий об'єкт,
порція рекомбінантного ДНК конструкту переноситься в геном клітини сої, і клітина сої згодом виростає в рослину. Клітина сої, в яку спочатку переноситься об'єкт регенерує для отримання покоління КО. Рослина КО і потомство від рослини КО може бути протестовано на будь-яку бажану ознаку (ї), але на ефективність об'єкта може впливати цис та/або транс фактори, пов'язані з сайтом вбудовування об'єкта трансформації. Фенотип наданий об'єктом може також визначатися розміром і дизайном ДНК-конструкту, який може варіювати залежно від комбінації генетичних елементів в експресійній касеті, кількості трансгенів, кількості експрессійних касет, і конфігурації таких елементів і таких касет. Ідентифікація об'єкта з бажаними ознаками може бути додатково ускладнена факторами, такими як характеристики розвитку, а також добові, тимчасові або просторові характеристики експресії трансгена; або зовнішніми факторами, наприклад, умови навколишнього середовища для росту рослин, доступність води, доступність азоту, спека або стрес. Таким чином, можливість отримати об'єкт, який надає бажаний набір фенотипічних ознак, не є легко передбачуваною.
СУТЬ ВИНАХОДУ
І007| Винахід пропонує трансгенну рослину сої, що містить об'єкт МОМ87751 яка демонструє переважаючі властивості і продуктивність в порівнянні з існуючими трансгенними рослинами сої та новими об'єктами, сконструйованими одночасно. Об'єкт сої МОМ87751 містить в одному локусі вбудовування в геномі сої дві пов'язані експресійні касети, які по-окремо наділяють ознакою стійкості до лускокрилих комах-шкідників. Комбінація двох пов'язаних експресійних касет в об'єкті сої МОМ87751 забезпечує дві форми впливу проти комах-шкідників видів ряду
І ерідорієга, у тому числі Спгузодеїхіз 5рр., зродоріега 5рр., Неїїсомегра 5рр., Стосідозета 5рр.,
Васпіріизіа 5рр., Апіїсагвзіа 5рр., ЕіІазтораїрив 5рр., і Ріашурепа 5рр. Подвійна форма впливу забезпечує надмірність инсектицидного контролю проти видів лускокрилих комах-шкідників, а також значно зменшує ймовірність розвитку резистентності до ознаками боротьби зі шкідниками. (008) Об'єкт МОМ87751 характеризується специфічними унікальними сегментами ДНК, які є придатними для виявлення наявності об'єкта у зразку. Зразок призначений для позначення композиції, яка являє собою або по суті чисту ДНК сої, або композицію, що містить ДНК сої. У кожному разі, зразок являє собою біологічний зразок, тобто, він містить біологічні матеріали,
Зо включаючи без обмеження ДНК, отриману або вилучену, прямо або опосередковано, з генома сої, що включає об'єкт МОМ87751. "Напряму" відноситься до здатності фахівця в цій області прямо одержати ДНК з генома сої шляхом руйнування клітин сої (або шляхом отримання зразків сої, що містять зруйновані клітини сої) і виділяти геномну ДНК з цілей виявлення. "Опосередковано" відноситься до здатності фахівця в цій області отримати цільову або конкретну еталонну ДНК, тобто новий і унікальний сегмент сплайсингу, описаний в цьому документі який є маркером наявності об'єкта МОМ87751 в цьому зразку, за допомогою інших засобів, ніж шляхом руйнування клітин сої або шляхом отримання зразків сої, що містять зруйновані клітини сої. Такі непрямі засоби включають без обмеження ампліфікацію сегмента
ДНК, що містить послідовність ДНК, до якої націлений конкретний зонд, призначений для специфічного зв'язування з послідовністю-мішенню, або ампліфікацію сегмента ДНК, який може бути визначений і охарактеризований, тобто вимірюється шляхом відділення від інших сегментів ДНК за допомогою деяких ефективних матриць, таких як агароза або акріламідний гель або тому подібних, або характеризується прямим аналізом послідовності ампліконів або клонуванням ампліконів в вектор і прямим секвенуванням ампліконів вставлених в такий вектор.
Крім того, сегмент ДНК, відповідний позиції в хромосомі сої, в яку була вбудована трансгенна
ДНК ії який може бути використані для виявлення об'єкта МОМ87751, може бути клонований за допомогою різних засобів і потім ідентифікований і охарактеризований щодо його наявності в конкретному зразку або в конкретному геномі сої. Такі ділянки ДНК відомі під назвою сегменти або послідовності сплайсингу, при цьому вбудовані ділянки ДНК можуть сягати такої довжини, а суміжна (фланкована) хромосомна ДНК такої довжини, щоб точка стикування між вбудованою
ДНК ї геномом сої перебувала всередині сегмента. ЗЕО ІЮО Мо: 1, 5ЕО ІЮ Мо: 2, 5ЕО ІЮ Мо: 3,
ЗБОЮ Мо: 4, 5ЕО ІО Ме: 5, 5БО ІЮО Мо: 6, 5БО ІЮО Мо: 7, БО ІО Мо: 8 ї 5ЕО І Ме: 10, а також зворотні комплементи кожної з них являють собою такі ділянки.
І009| Конкретні послідовності, зазначені в цьому документі можуть бути однозначно присутніми в об'єкті МОМ87751, або конструкті, що міститься в ньому, а ідентифікація цих послідовностей, шляхом прямого аналізу послідовності, шляхом виявлення зондів пов'язаних з такими послідовності, або шляхом спостереження розміру і, можливо, складу окремих ампліконів, описаних у цьому документі, якщо вони присутні в конкретній зародковій плазмі або геномі сої та/"або присутнього в тому чи іншому біологічному зразку, що містить ДНК сої, є бо маркерами наявності об'єкта МОМ87751, або конструкту, що міститься в ньому, в такому зразку.
Відомо, що фланкуючі геномні сегменти (тобто, сегменти геному сої послідовності ДНК, суміжні з вбудованою трансгенною ДНК) піддаються незначною мінливості і, у зв'язку з цим, обмеження, щонайменше, 99 95 або більше ідентичності пов'язано з такими аномаліями або поліморфізмом від геному сої до геному сої. Нуклеотидні сегменти, які є повністю комплементарними по всій їх довжині в порівнянні з конкретними діагностичними послідовностями, згаданими в цьому документі, призначені, щоб бути в межах обсягу цього винаходу.
Ї0010| Положення нуклеотидних сегментів цього винаходу відносно один одного і всередині геному сої, наведено на фіг. 1, а нуклеотидна послідовність кожної ілюструється, в порядку, передбаченому ЗЕО ІЮ Мо: 10. Нуклеотидні сегменти, які характеризують об'єкт МОМ87 751, і які служать маркерами присутності об'єкта МОМ87751, або конструкту, що міститься в ньому, у зразку, включають 5ЕО ІО Мо: 1, БЕО ІО Мо: 2, БЕО ІЮО Мо: З, 5ЕО ІЮ Мо: 4, БЕО ІЮ Мо: 5, БЕО ІЮ
Мо: 6, 5ЕО ІО Ме: 7, 5ЕО ІЮ Мо: 8, 5ЕО ІО Мо: 9, 5ЕО ІЮО Ме: 10, 5ЕО ІО Ме: 17, БЕО ІО Мо: 168, ЗЕО
ІО Мо: 19, ЗЕО ІЮ Мо: 20, 5ЕО ІО Мо: 21, 5ЕО ІЮ Мо: 22, 5ЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІЮ Мо: 24, 5ЕО ІЮО Мо: 25 або 5БО ІЮ Ме: 26. Наявність однієї або двох, або більше з цих нуклеотидних послідовностей в зразку, коли такий зразок містить тканину сої і таку ДНК сої, свідчить про наявність об'єкта МОМ87751, або конструкту, що міститься в ньому. 0011) Слово "отриманий", зокрема означає, що конкретна молекула ДНК знаходиться в геномі рослини сої, або може бути виявлена в ДНК рослини сої. "Здатний до виявлення" означає здатність конкретного сегмента ДНК до ампліфікації, і його розмір і/або послідовність характеризується або виявляється шляхом аналізу послідовностей ДНК, а також може позначати здатність зонда зв'язуватися конкретно з конкретним відрізком ДНК, тобто сегментом-мішенню ДНК, і подальша здатність детектувати зв'язування зонда з мішенню.
Конкретний сегмент ДНК або сегмент-мішень ДНК даного винаходу присутня в рослині сої, що містить вбудований об'єкт МОМ87 751. 0012) По відношенню до сої передбачається, що клітини сої, насіння сої, частини рослини сої і рослини сої перебувають у межах обсягу цього винаходу доти, поки в кожному варіанті реалізації міститься детектуєма кількість ДНК, відповідна будь-якому одному, двом або більше сегментам, описаним у цьому документі, діагностованих на наявність ДНК об'єкта сої
МОМ87751 ДНК. Частини рослини сої включають клітини; пилок; сім'ябруньки; квіти; боби;
Зо насіння; тканину кореня; тканину стебла і тканину листа. Товарні продукти, створені з сої, в якій детектуєма кількість сегментів ДНК, описаних у даному документі є маркером наявності об'єкта
МОМ87751, знаходяться в межах об'єму винаходу. Такі товарні продукти можуть включати незбиране або оброблене насіння сої, соєву олію, соєвий білок, соєвий шрот, соєве борошно, соєві пластівці, соєві висівки, соєве молоко, соєвий сир, соєве вино, корм для тварин, що містить сою, папір, що містить сою, крем, що містить сою, соєву біомасу, пально-матеріали, вироблені з використанням рослини сої та частин рослин сої.
Ї0О013| ДНК об'єкта сої МОМ87751 може бути присутньою в кожній клітині і в кожному з геномів в одній хромосомі рослини сої, насіння сої, і тканинах сої, що містять об'єкт. Так-як геном сої передається нащадкам за законом Менделя, якщо рослина сої була гомозиготною по включенню об'єкта МОМ87751, кожна рослина і клітина нащадка сої буде містити об'єкт ДНК на кожній алелі батьківської хромосоми, що містить включення об'єкта МОМ87751 і успадковувати потомством від батька(ів). Однак, якщо геном сої, що містить об'єкт МОМ87751 ДНК належить гетерозиготному або гібридному батькові, то близько п'ятдесяти відсотків пилку і близько п'ятдесяти відсотків сім'язародків, що беруть участь у запиленні від гібридних батьків будуть містити ДНК об'єкта сої МОМ87751, в результаті чого виходить змішана популяція потомства, що містить ДНК об'єкта МОМ87751, і відсоток такого потомства, що виникає внаслідок таких схрещувань гібридів може коливатися від близько п'ятдесяти до близько сімдесяти п'яти відсотків, що мають ДНК об'єкта МОМ87 751 в такому потомстві.
І0014| Молекули ДНК цього винаходу можуть бути унікальними для двох окремих границь сплайсингу на кожному кінці ДНК вбудованого трансгенного об'єкта МОМ87751, а геномна ДНК сої, яка суміжна, тобто фланкована, з кожен кінцем вбудованої ДНК МОМ87751, або унікальна для вбудованої ДНК об'єкта сої МОМ87751. Ці молекули, коли вони присутні в конкретному зразку, дослідженому із застосуванням способів, описаних у цьому документі за допомогою зондів, праймерів і в деяких випадках з використанням аналізу послідовності ДНК можуть бути маркерами присутності кількості об'єкта МОМ87751 сої в цьому зразку. Такі молекули ДНК, унікальної для ДНК об'єкта сої МОМ87751, можуть бути ідентифіковані та охарактеризовано різними способами, що включають застосування молекул-зондів нуклеїнових кислот сконструйованих для специфічного зв'язування з унікальною молекулою ДНК з подальшим виявленням зв'язування таких зондів з унікальною ДНК, і методами температурної ампліфікації, 60 які використовують щонайменше дві різних молекули ДНК, які діють як зонди, але послідовність таких молекул може бути дещо менш специфічною, ніж у зондів, описаних вище. Фахівцям у цій галузі зрозуміло, що контактування конкретної ДНК-мішені з зондом або праймером при відповідних умовах гібридизації призведе до зв'язування зонда або праймера з сегментом- мішенню ДНК.
І0015| Молекулами ДНК цього винаходу можуть бути сегменти-мішені ДНК, які можуть бути здатні до ампліфікації і, в разі виявлення у вигляді одного або декількох ампліконів представленої довжини отриманих шляхом способів ампліфікації конкретного зразка, можуть служити маркерами присутності об'єкта МОМ87751, або конструкту, що міститься в ньому, в такому зразку. Такі молекули ДНК або полінуклеотидні сегменти можуть мати нуклеотидну послідовність у порядку, передбаченому в кожній з ЗЕО ІЮО Мо: 1, 5ЕО ІЮ Ме: 2, 5ЕО ІЮ Мо: З,
ЗЕО ІО Мо: 4, БЕО ІЮ Мо: 5, 5ЕО ІЮ Ме: 6, БЕО ІЮ Мо: 7, ЗЕО ІЮ Мо: 8, БЕО ІЮ Мо: 9, ЗЕО ІЮ Мо: 10,
ЗЕО ІО Мо: 17, ЗЕО ІЮ Мо: 18, ЗЕО ІЮ Мо: 19, 5ЕО ІО Ме: 20, 5ЕО ІЮО Мо: 21, ЗЕО ІЮ Мо: 22, ЗЕО ІЮ
Мо: 23, ЗЕО ІО Мо: 24, БЕО ІЮО Мо: 25 ії 5ЕО ІО Мо: 26, і далі визначені в цьому документі та в прикладах нижче. Молекули праймерів та/або зондів можуть бути надані у вигляді комплекту разом з необхідними реагентами, що включають контрольні зразки, і упаковані разом з інструкцією із застосування. 0016) Рекомбінантні молекули ДНК цього винаходу можуть бути присутніми всередині або можуть бути отримані з мікроорганізму. Мікроорганізм призначений для включення будь-яких мікроскопічних клітин - прокариотических або еукаріотичних чи інших, що містять ДНК в геномі або хромосомі або екстра-хромосомну структуру ДНК більш відому як плазміда або вектор. В одному варіанті реалізації, мікроскопічні організми можуть включати бактерій (прокаріоти) і клітини відповідні вищим життєвим формам (еукаріоти), які знаходяться поза оптичного діапазону, середньостатистичної людини, як правило, менше п'ятдесяти кубічних мікрон і частіше менше десяти кубічних мікрон. Бактерії являють собою мікроскопічні мікроорганізми, які можуть містити вектор або плазміду, що містить один або більше або всі з нових сегментів ДНК за даним винаходом, включаючи кожну з відповідних експресійних касет поданих у порядку, передбаченому в 5ЗЕО ІЮ Мо: 9. Клітини рослин і зокрема клітини рослин сої цього винаходу можуть містити будь-який один, два, або більше або всі з нових сегментів ДНК цього винаходу.
ІЇ0017| Зонди для використання в цьому документі, можуть містити молекули ДНК або
Зо полінуклеотидні сегменти достатньої довжини щоб функціонувати в жорстких умовах гібридизації, визначених у цьому документі, щоб зв'язуватися з конкретним сегментом ДНК- мішені, тобто, унікальний сегмент ДНК є маркером наявності ДНК об'єкка МОМ87751 у зразку.
Такий зонд може бути призначений для зв'язування тільки одне з'єднання або іншу нову послідовність присутню тільки в ДНК об'єкта сої МОМ87751, або два або більше таких одиничних сегментів сплайсингу. Виявлення зв'язування такого зонда з молекулою ДНК в конкретному зразку, що імовірно містить ДНК є маркером наявності об'єкта сої МОМ87751 у зразку.
ІЇ0018| Праймери можуть містити пари різних олігонуклеотидів або полінуклеотидних сегментів для застосування в реакції теплової ампліфікації, яка ампліфікує певний цільовий сегмент ДНК. Кожен праймер в парі призначений для зв'язування з досить специфічним сегментом ДНК всередині або поряд з сегментом ДНК становлять інтерес для ампліфікації.
Праймери зв'язуються таким чином, що це коли відбувається в локалізованих ділянках послідовності нуклеїнової кислоти в результаті полімеризації призводить до виробництва одного або декількох ампліконів (ампліфікованих цільових сегментів ДНК). У цьому винаході, застосування праймерів сконструйованих для зв'язування з унікальними сегментами ДНК об'єкта сої МОМ87751 в конкретному біологічному зразку і, ампліфікація конкретних ампліконів, що містять один або більше сегментів сплайсингу, описаних у цьому документі, і виявлення та/або характеризація таких ампліконів після завершення чи припинення реакції полімеризації, є маркером наявності ДНК об'єкта сої МОМ87751 в конкретному зразку. Фахівець у цій галузі добре знайомий з цим методом ампліфікації та перерахування особливостей ампліфікації не вимагається в цьому документі. 0019) Рослини сої, клітини рослини сої, тканини рослини сої та насіння сої цього винаходу можуть бути стійкі до ураження лускокрилими комахами-шкідниками, що включають без обмеження СпПгузодеїхі5 5рр., Зродорієга 5рр., Неїїсомегра 5рр., Стосідозета 5рр., Каспіріивіа 5рр., Апіїсагзіа 5рр., ЕІазтораїрив5 5рр. і Ріаїйурепа 5рр. Стійкість до ураження видами ряду лускокрилих виникає у зв'язку з експресією двох різних сегментів ДНК, що кодують два різні інсектицидних білка, які функціонально і ковалентно пов'язані в межах вбудованої трансгенної
ДНК: експресії білка Сгу2Ар з експресійної касети на 5 "проксимальному кінці вбудованої трансгенної ДНК, в порядку, передбаченому ЗЕО ІЮО Мо: 10 і проілюстрований на Фіг. 2; і бо експресії білка СтгутА.105 з експресійної касети на З "кінці вбудованої трансгенної ДНК в порядку, передбаченому ЗЕО ІО Мо: 10 і проілюстрований на Фіг. 2. Сту2АБ білок експресується
АГ.Асі2 промотором, а СтутА.105 експресується АЇ.Кро54 промотором. Білки Сту2АбБ і СтутлА.105 є токсичними агентами для видів лускокрилих комах-шкідників.
І0020| Конструкт, використовуваний для створення об'єкта сої МОМ87751 містить промотори, що керують експресію Стгуг2АБ і СтутА.105 білків, розташовані відносно послідовно транскрипції так, що експресія від кожного промотора відповідного Сгу білка відбувається в тому ж напрямку, але у кожного окремо з відповідним промотором (див. Фіг. 2). Інших конструкти, які були оцінені відрізнялися комбінаціями використаних елементів експресії, тобто, енхансер (Е), промотор (Р), лідер (У), інтрони (І), хлоропласт-націлений пептид (СТР) і 3' НТО (Т). Також конструкти містять або векторний стек обох Сгу білків (Сгу2АБ і СтутА.105), або містять один Сгу білок, тобто, Сту2АбБ або СтуТтА.105. Подальша зміна в екпрессіонних конструктах було відносної орієнтацією двох касет для Сгу білків у векторному стеці конструктів. Зокрема, дві касети були або в послідовній орієнтації транскрипції, або дві касети були в протилежної орієнтації, так що експресія від кожного промотора двох Сгу білків знаходиться окремо від точки по центру між двох промоторів, тобто, транскрипція кожної експресійної касети відбувається в протилежному напрямку і не сходиться з іншою. Послідовність ДНК, яка кодує СтутА.105 варіювала в деяких конструктах щодо послідовності трансгена вбудованого в об'єкт МОМ87751. Нарешті, у двох конструктах з двома експресійної касетами Стгу орієнтованими у зворотному напрямку транскрипції, енхансери транскрипції були розташовані між розбіжними промоторами (див. фіг. г). 0021) Об'єкт МОМ87751 був обраний на підставі порівняння з тисячами різних незалежних трансгенних об'єктів, кожен трансформований одним з конструктів, що містить сегмент Т-ДНК, як проілюстровано на Фігурі 2, і кожного з об'єктом МОМ87701 та/або об'єктом СМ А19478 (сконструйованим одночасно з МОМ87701, обидва експресують СгуїТАс); з трансгенним об'єктом 40-3-2 (відповідає за толерантність до гербіциду гліфосат); і нетрансгеннимі контрольними рослинами сої (АЗ555 або А5547). Результати як представлених нижче в прикладах, показано, що об'єкт МОМ87751 демонстрував чудові властивості завдяки експресії Стгу2АБ ії СтутА.105 білків. Безліч трансгенних об'єктів створених з використанням конструкту, який використовується для створення об'єкта МОМ87751 були переважно інших об'єктів, створених з
Зо іншими конструктами в демонстрації ефективного контролю лускокрилих комах-шкідників. 0022) Рослини сої та їх частини, включаючи насіння, кожна з яких містить ДНК, відповідно об'єкту МОМ87751, знаходяться в межах обсягу цього винаходу. Такі рослини та їх частини, включаючи насіння стійкі до ураження лускокрилими. У деяких варіантах, такі рослини і насіння включають гібриди та інбріди, і рослини, і насіння, які містять тільки одну алель об'єкта
МОМ87751, тобто, геном характеризується як гетерозиготний по відношенню до локусу ДНК, відповідному об'єкту МОМ87751. Такі гібриди можуть бути отримані шляхом схрещування рослин, що містять об'єкт МОМ87751 з бажаною зародковою плазмою в рамках процесу розвитку комерційної різноманітності та інших сільськогосподарсько-бажаних властивостей сої.
Гібриди можуть бути отримані будь-якими способами, але переважний спосіб використовує переважно перших інбрідних (гомозиготних) батьків, що містять конкретну аллель об'єкта
МОМ87751 в обох хромосомах в локусі, в якому вбудовано ДНК об'єкта МоОМ87751, і схрещуванням першого інбріда з другим інбрідом, який не містить ДНК МОМ87751. Обидві батьківські інбрідні різновиди будуть мати одне або більш вигідне властивість бажане в продукованих насіння, тобто гібридному насіння, і це гібридне насіння є гетерозиготним по алелю об'єкта МОМ87 751.
І0023| Трансгенна властивість або алель забезпечує деякі додаткові якості рослин, що містять ДНК об'єкта МОМ87751 можуть бути бажаними. Інші такі трансгенні алелі забезпечують бажані якості можуть включати стійкість до гербіцидів: ЗТ5 40-3-2, МОМ87708, МОМ89788,
А2704-12, А2704-21, А5547-35, А5547-127, ВРБ-СМ127-9, ОРЗБ5Б6О43, СО262, М/62, М98, ВАВБ- 44406-6, МБАБ-68416-4, БРИ72, ВРБ-СМ127-9, 5МУНТО4В, 5УНТОН2, 3560.4.3.5, ЕБ-СМЗ, ррАВ4472-1606, рРрАВ4468-0416, ррдв8291.45.36, 127, ААО-12; стійкістю до комах-шкідників:
МОМ87701, ОА5Б-81419-2; поліпшення олійних властивостей: ОР-305423, (194-1, (5394-19, (168,
ОТ96-15, МОМ87705, МОМ87769; збільшення врожайності: МОМ 87712, або риси фіксації азоту, риси, що регулюють водний обмін, стійкість до ураження грибами, стійкість до ураження нематодами і тому подібні. Нетрансгенні властивості (тобто, ЛКП або група стиглості) може також забезпечувати бажану межу і фахівець у цій галузі знає як схрестити сою для поєднання даного нетрансгенной риси і ДНК об'єкта МОМ87751.
І0024| Вищевикладені та інші аспекти винаходу стануть більш очевидними з подальшого докладного опису. 60 КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
ІЇ0025| Фігура 1 являє собою схематичне зображення взаємного розташування, проілюстроване кожної горизонтальною лінією, сегментів гетерологичних трансгенних ДНК, фланкирующей геномної ДНК, довільно сконструйованих 5 'ї 3' геномних/вбудованих ділянок сплайсингу ДНК, і відносні положення послідовності, унікальною для об'єкта МоОМ87751 всередині гетерологичних трансгенних ДНК, які можуть бути використані в якості маркера об'єкта сої МОМ87751; горизонтальні лінії помічені як (11, (21, ІЗІ, (41, І5І, ІбЇ, Г71, І8І, (91, 101, (171, 181, 1191, (201, (2111, (221, (231, 241, (251 і (26) відповідають 5ЕО ІЮ Мо: 1, БЕО ІЮ Мо: 2, ЗЕО ІЮ Мо: 3, ЗЕО ІО Мо: 4, БЕО ІО Ме: 5, 5ЕО ІЮО Ме: 6, 5ЕО ІЮ Ме: 7, БЕО ІЮ Ме: 8, БЕО ІЮО Ме: 9, 5ЕО ІЮ Ме: 10, ЗЕО ІЮ Мо: 17, ЗЕО ІО Мо: 18, 5ЕО ІЮО Мо: 19, ЗЕО ІЮ Мо: 20, 5ЕО ІЮ Мо: 21, 5ЕО ІО Мо: 22,
ЗЕБЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІЮ Мо: 24, 5ЕО ІЮО Мо: 25 ії 5ЕО ІО Мо: 26, відповідно; горизонтальна лінія з товстою смугою представляє комплекс гетерологічної трансгенної ДНК, вбудованої в об'єкт
МОМ87751 (5ЕО ІЮ Мо: 9) і обох 5'ї 3" фланкуючих геномних ДНК і являє собою 5ЕО ІЮ Мо: 10 містить БЕО ІЮ Мо: 7, 5ЕО ІЮ Мо: 9, ії 5ЕБЕО ІЮО Мо: 8; товсті горизонтальні стрілки позначають 5026901, 5020267, 5025826 і 5027115, відповідні ЗЕО ІЮ Мо: 15, ЗЕО ІО Мо: 11, БЕО ІО Ме: 12 і
ЗЕО ІО Мо: 14, відповідно; тонкі горизонтальні стрілки представляють відносну організацію двох окремих експресійних касет вбудованої гетерологічної трансгенної ДНК об'єкта МОМ87751, Р являє собою промотор, І. являє собою лідер, РІ. являють собою промотор і лідер, І являє собою інтрон, СТР являє собою транзитний білок хлоропласта, Сту2АБ являє собою кодуючу ділянку білка Сгу2АБ, Т-3 "елемент термінації транскрипції і полі«аденілювання (3 НТО) і СтутА.105 являє собою кодуючу ділянку білка СтутА.105.
І0026| Фігура 2 демонструє сегмент Т-ДНК, що кодує експресійну касету(ї) Сту білка в одинадцяти трансформаційних конструктах, використовуваних для створення трансгенних об'єктів сої апробованих при відборі об'єкта сої МОМ87751, і композицію кожної експресійної касети Сгу білка з кожним конструктом.
І0027| Фігура З являє собою графічне зображення результатів ІФА експресії Сту білка в об'єктах, створених з конструктом 1, конструктом 2 і конструктом 3, у порівнянні з нетрансгенною лінією сої (АЗ3555). Панель А. демонструє рівні Сгу2АбБ білка в тканинах листя, зібраних на етапах росту рослини КІ! і К3. Панель В. демонструє рівні СтутА.105 білка в тканинах листя, зібраних на етапах росту рослини КІ і КЗ.
Зо 0028) Фігура 4 являє собою графічне зображення результатів ІФА експресії Сту білка в об'єктах, створених з конструктом 1, конструктом 5, конструктом 6 і конструктом 4, у порівнянні з нетрансгенною лінією сої (АЗ3555). Панель А. демонструє рівні Сгу2АБ білка в тканинах листя, зібраних на етапі росту рослини КЗ від рослин, вирощених в умовах двох окремих теплиць.
Панель В. демонструє рівні СтутА.105 білка в тканинах листя, зібраних на етапі росту рослини
КЗ від рослин, вирощених в умовах двох окремих теплиць. 00291 Фігура 5 являє собою графічне зображення результатів ІФА експресії Сту2АБ білка в об'єктах, створених з конструктом 1, конструктом 2, конструктом 3, конструктом 4, конструктом 5, конструктом 6, конструктом 9, конструктом 7 і конструктом 11 у зразках листя зібраних на етапах росту рослини КЗ і К5.
І0ОЗ0О| Фігура 6 являє собою графічне зображення результатів ІФА експресії Сгу21А.105 білка в об'єктах, створених з конструктом 1, конструктом 2, конструктом 3, конструктом 4, конструктом 5, конструктом 6, конструктом 9, конструктом 7 і конструктом 11 у зразках листя зібраних на етапах росту рослини КЗ і КБ. На панелі А по осі М представлена суха маса 0-5000 м.ч., а на панелі В по осі МУ представлена суха маса 0-500 м.ч. для кращого уявлення на панелі
В даних для етапу КЗ.
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
0031) 5ЕО ІО Мое:1 являє собою послідовність двадцяти нуклеотидів, яка являє 5 "ділянку сплайсингу геномної ДНК сої та вбудовану трансгенну експресійну касету. 5БО ІЮ Мо: 1 розташований в ЗЕО ІЮ Ме: 10 в нуклеотидній позиції 1325-1344.
Ї0032| 5ЕО ІО Ме:2 являє собою послідовність двадцяти нуклеотидів, яка являє З "ділянку сплайсингу геномної ДНК сої та вбудовану трансгенну експресійну касету. 5БО ІЮ Мо: 2 розташований в ЗЕО ІЮ Ме: 10 в нуклеотидної позиції 11444-11463. 0033) 5ЕО ІЮО Мо:3 являє собою послідовність шістдесяти нуклеотидів, яка являє 5 "ділянку сплайсингу геномної ДНК сої та вбудовану трансгенну експресійну касету. 5БО ІЮ Мо: З розташований в ЗЕО ІЮ Ме: 10 в нуклеотидної позиції 1305-1364. (0034) 5ЕО ІЮО Мо:4 являє собою послідовність шістдесяти нуклеотидів, яка являє З "ділянку сплайсингу геномної ДНК сої та вбудовану трансгенну експресійну касету. 5ЕБО ІЮ Мо: 4 розташований в ЗЕО ІЮ Ме: 10 в нуклеотидної позиції 11424-11483. 0035 5ЕО ІЮО Мое:5 являє собою послідовність ста нуклеотидів, яка являє 5 ' ділянку бо сплайсингу геномної ДНК сої та вбудовану трансгенну експресійну касету. 5БО ІЮ Мо: 5 розташований в ЗЕО ІЮ Ме: 10 в нуклеотидної позиції 1285-1384.
І0036| 5ЕО І Моб являє собою послідовність ста нуклеотидів, яка являє З "' ділянку сплайсингу геномної ДНК сої та вбудовану трансгенну експресійну касету. 5БО ІЮ Мо: 6 розташований в 5ЕО ІЮ Мо: 10 в нуклеотидної позиції 11404-11503.
І0037| 5ЕО ІЮ Ме:7 являє собою послідовність 1626 нуклеотидів, яка являє 5" фланкуючу геномну послідовність ДНК сої включно і містить з'єднання геномної ДНК і вбудованою трансгенної ДНК, і включає (з 5 по З ) 1334 нуклеотида фланкуючої геномної ДНК і 292 нуклеотида довільно сконструйованого 5' кінця вбудованої трансгенної ДНК
І0038| 5ЕО ІЮ Мо:8 являє собою послідовність 1452 нуклеотидів, яка являє фланкуючу геномну послідовність ДНК сої включно і містить з'єднання геномної ДНК і вбудованою трансгенної ДНК, і включає (з 5 "по 3) 265 нуклеотидів довільно сконструйованого 3' кінця вбудованої трансгенної ДНК та 1187 нуклеотидів 3' фланкуючої геномної ДНК. 0039) 5ЕО ІО Ме:9 являє собою послідовність 10119 нуклеотидів відповідно трансгенної ДНК вбудованої в геном об'єкта сої МОМ87751.
І0040| 5ЕО ІЮ Ме:/10 являє собою послідовність 12640 нуклеотидів відповідно складовою нуклеотидної послідовності трансгенної ДНК вбудованої в геном об'єкта МОМ87751 і 5' фланкуючої послідовності нуклеотидів геномної ДНК і 3' фланкуючої послідовності нуклеотидів геномної ДНК і містить зЕО ІЮ Мо: 7 ії 5ЕО ІЮ Ме: 9, і ЗЕО ІЮ Мо: 8.
І0041| 5ЕО ІЮО Мое:11 являє собою послідовність 27 нуклеотидів відповідно термальному праймеру ампліфікації під назвою 5020267 використовуваному для визначення ДНК об'єкта
МОМ87751 в зразку, і є ідентичним послідовності нуклеотидів відповідної позиціям 11400-11426 в 5ЕО ІО Ме: 10.
І0042| 5ЕО ІЮО Ме:12 являє собою послідовність 26 нуклеотидів відповідно термальному праймеру ампліфікації під назвою 5025826 використовуваному для визначення ДНК об'єкта
МОМ87751 в зразку, і є ідентичним зворотному комплементу послідовності нуклеотидів відповідної позиціям 11454-11479 в 5ЕО ІЮО Мо: 10. 0043) 5ЕО І Мое:13 являє собою послідовність 19 нуклеотидів відповідно зонду під назвою
РВ10263 використовуваному для визначення ДНК об'єкта МОМ87751 в зразку, і є ідентичним послідовності нуклеотидів відповідної позиціям 11428-11446 в 5ЕО ІЮ Мо: 10.
Зо (0044| 5ЕО ІЮО Мо:14 являє собою послідовність 24 нуклеотидів відповідно термальному праймеру ампліфікації під назвою 5027115 використовуваному для визначення присутності алелі ДНК сої дикого типу та/або ДНК об'єкта сої МОМ87751 в зразку, і є ідентичним зворотному комплементу послідовності нуклеотидів відповідної позиціям 11458-11481 в 5ЕО ІЮ Мо: 10.
І0045| 5ЕО ІЮО Ме:15 являє собою послідовність 30 нуклеотидів відповідно термальному праймеру ампліфікації під назвою 5026901 використовуваний в аналізі зіготності для визначення присутності алелі ДНК сої дикого типу в зразку, отриманому з сої і є ідентичним послідовності нуклеотидів відповідної позиціям тисячі двісті вісімдесят вісім 1288-1317 в ЗЕО ІЮ
Мо: 10. (0046) 5ЕО ІО Мое:16 являє собою послідовність 18 нуклеотидів відповідно зонду під назвою
РВІ11254 і використовується в аналізі зіготності для визначення присутності алелі ДНК сої дикого типу в зразку, отриманому з сої.
І0047| 5ЕО ІЮ Ме:17 являє собою послідовність 112 нуклеотидів відповідно унікальної послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87751, і є ідентичною позиціям 36-147 в 5ЕО ІЮО Мо: 9, і позиціям 1370-1481 в 5ЕО ІЮО Мо: 10. (0048| 5ЕБО ІЮ Мо:118 являє собою послідовність 52 нуклеотидів відповідно унікальній послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87751, і є ідентичною позиціях 1305-1356 в 5ЕО ІЮ Мо: 9, і позиціям 1639-1690 в БЕО ІЮ Мо: 10.
І0049| 5ЕО ІО Мое:19 являє собою послідовність 283 нуклеотидів відповідно унікальній послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87751, і є ідентичною позиціях 1 561-1843 в 5ЕО ІЮО Мо: 9, ії позиціям 2895-3177 в БЕО ІЮ Мо: 10... 0050 5ЕО ІО Мое:20 являє собою послідовність 486 нуклеотидів відповідно унікальній послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87751, і є ідентичною позиціях 2340-2825 в 5ЕО ІЮ Мо: 9, і позиціям 3674-4159 в БЕО ІЮ Мо: 10. 0051 5ЕО ІО Мое:21 являє собою послідовність 179 нуклеотидів відповідно унікальній послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87751, і є ідентичною позиціях 3326-3504 в 5ЕО ІЮ Мо: 9, і позиціям 4660-4838 в 5ЕО 10 Мо: 10.
І0052| 5ЕО ІО Ме:22 являє собою послідовність 106 нуклеотидів відповідно унікальній послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87751, і застосовується для визначення об'єкта МОМ87751 ДНК в зразку, і є ідентичною позиціям 3749- 60 3854 в ЗЕО ІЮ Мо: 9, позиціям 5083-5188 в ЗЕО ІЮ Мо: 10.
ІЇ0053| 5ЕБО ІЮ Мос223 являє собою послідовність 60 нуклеотидів відповідно унікальній послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87751, і застосовується для визначення об'єкта МОМ87751 ДНК в зразку, і є ідентичною позиціям 9320- 9379 в ЗЕО ІЮ Мо: 9, і позиціям 10654-10713 в 5ЕО ІО Мо: 10. 0054 5БО ІЮ Мос24 являє собою послідовність 66 нуклеотидів відповідно унікальній послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87 751, і застосовується для визначення об'єкта МОМ87751 ДНК в зразку, і є ідентичною позиціям 9620- 9685 в ЗЕО ІО Мо: 9, і позиціям 10954-11019 в 5ЕО ІО Мо: 10 0055 5ЕО ІО Ме:25 являє собою послідовність 156 нуклеотидів відповідно унікальній послідовності нуклеотидів в трансгенній ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) вбудованої в об'єкт сої МОМ87751, і застосовується для визначення об'єкта МОМ87751 ДНК в зразку, і є ідентичною позиціям 9720- 9875 в ЗЕО ІЮ Мо: 9, і позиціям 11054-11209 в 5ЕО ІО Мо: 10.
Ї0056Ї 5ЕО ІО Мое:26 являє собою послідовність 1 905 нуклеотидів відповідно відкритій рамці зчитування кодує білок Сгуг2АбБ, експрессіруемий в об'єкті сої МОМ877 51.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
І0057| Винахідники визначили трансгенний об'єкт сої МОМ87751 який проявляє комерційно прийнятну стійкість до важливих для сільського господарства комах-шкідників ряду Лускокрилі таким, як Зродорієга Ігидірегаа (кукурудзяна листова совка, ЕАММ), зродорієга егідапіа (південна совка, ЗАМУМ), зродорієга ехідча (совка мала, ВАМУ), З5родоріега огпіподаїїї (жовтополосата совка, УЗАМУ), Стосідозета арогета (моль стеблова фосолі, ВЗМ), Каспіріизіа пи (п'ядун соняшниковий, ЗЕ), Апіісагзіа деттагаїїє (гусениця оксамитових бобів, МВС), Спгузодеїхів іпсішдеп5 (металловідка соєва, 5ВІ), Неїїсомегра 7еа (гусениця совки бавовняної, 5РУМ),
Неїїсомегра деІоїореоп (південноамериканська бавовняна моль), ЕПІазтораїрив5 ІідпозеїПи5, (огневка кукурудзяна стеблова мала), Ебідтепе асгеа, і Ріаїпурепа 5сабга, серед інших. Об'єкт забезпечує дві різних функціонально пов'язаних експресійних касети, одна кодує Сту2АБб, а інша - СтгутА.105 інсектицидні білки, і забезпечує дві різних форми стійкості сої до ураження лускокрилими. Інші трансгенні об'єкти сої відомі в цій галузі техніки, тобто МОМ 88701, який експрессує токсичний білок СтутАс Васійи5 ІПигіпдіепзіє (ВО (МасКаеє еї аї. 2005, Рібспроїй 8
Репак 1995). МОМ 88701 забезпечує одну форму стійкості до більшості лускокрилих комах-
Зо шкідників сої, хоча ефективність відносно Зродоріега 5рр. не істотна. Було б бажано забезпечити трансгенну сою, яка експрессує два або більше різних інсектицидних білка, що виявляють ефективність до більшості шкідників сої і в тому числі контролюючу 5родоріега 5рр.
Винахідники представили щонайменше одне рішення цієї проблеми у вигляді об'єкта сої
МОМ87751, який об'єднує дві ковалентно пов'язані експресійної касети в одному локусу в геномі сої, ці касети забезпечують ознаки розширеного опору до видів лускокрилих, і додатково, забезпечують клітини сої, тканини сої, листя сої, боби сої, насіння сої та рослини сої більш ніж однією формою дії для запобігання або відстрочки розвиток резистентності серед видів ряду
Лускокрилі.
І0058| Об'єкт сої МОМ87751 був створений шляхом Адгобасіегішт опосередкованої трансформації меристематичної тканини сої плазмідним конструктом 1. Цей плазмідний конструкт містить дві ділянки, кожна обмежена прикордонним сегментом Адгобрасіегішт (Т-ДНК сегмент). Перший сегмент Т-ДНК містить дві пов'язаних рослинних експресійних касети, одна експресійна касета кодує селектируємий маркер, а інша експресійна касета кодує маркер підрахунку трансформантів. Другий сегмент Т-ДНК містить дві пов'язаних рослинних експресійних касети з регуляторними генетичними елементами необхідними для експресії двох інсектицидних білків Сту2АБ і СтутА.105 в клітинах рослин сої. Завдяки двом сегментам Т-ДНК в
Плазмідний конструкті 1, Т-сегмент ДНК, що містить селектируємі/оцінний маркерні гени вставлені випадковим чином в геном сої в сайт, окремий від сайту інтеграції сегмента Т-ДНК, що містить експресійні касети Стгу2Ар і СтутА.105, таким чином дозволяючи розділити два сегменти Т-ДНК в геномі трансформованих рослин сої в процесі самозапилення та/або зворотного схрещування, наприклад скринінгу КІ і подальших поколінь трансгенних рослин.
Трансформовані клітини сої регенерували в інтактну рослину сої та окремі рослини були відібрані з популяції рослин, які продемонстрували цілісність другого сегмента Т-ДНК, що кодує білки Стгу2АБ і СтутА.105. У КІ і наступних поколіннях, об'єкти були відібрані на підставі цілісності другого сегмента Т-ДНК, що кодує білки Сгу2АБ ії СгтутА.105, і відсутності (тобто сегрегації) першого сегменту Т-ДНК, що кодує селектируемих/оцінний маркерні касети, і рослин, що не містять будь-яку плазмідну послідовність. Експресія інсектицидних токсичних білків
СтгугАБ і СтутА.105 в клітинах об'єкта сої МОМ87751 забезпечує стійкість до лускокрилих комах- шкідників коли клітини об'єкта сої МОМ87751 потрапляють в раціон комах. 60 І0059| Плазмідна ДНК вбудована в геном об'єкта сої МОМ87751 була охарактеризована за допомогою детальних молекулярних аналізів. Ці аналізи включали: кількість вбудовування (кількість сайтів інтеграції в геном сої), геномна позиція вбудовування (конкретне місце в геномі сої, де сталося вбудовування), кількість копій (кількість копій Т-ДНК в межах одного локусу), і цілісність вбудованої трансгенної ДНК. Плазмідний конструкт містить дві пов'язані експресійні касети вбудовані в геном сої, що дають початок об'єкту МОМ87751, містить безліч сегментів (послідовності зрощування між елементами використовувані для створення або конструювання кількох експресійних касет) які не зустрічаються ні в природних умовах в геномі сої, ні в інших векторах або трансгенних об'єктах сої або за інших обставин (наприклад, послідовності в порядку, передбаченому в 5ЕО ІЮО Мо: 1, БЕО ІЮ Мо: 2, ЗЕО ІЮ Мо: 3, БЕО ІЮО Мо: 4, БЕО ІЮ Мо: 5,
ЗЕО ІО Мо: 6, 5ЕО ІО Ме: 7, 5ЕО ІЮО Ме: 8, БЕО ІЮ Ме: 9, 5ЕО ІО Мо: 10, 5ЕО ІО Мо: 17, 5ЕО ІО Мо: 18, ЗЕО ІЮ Мо: 19, ЗЕО ІО Мо: 20, 5ЕО ІЮО Мо: 21, ЗЕО ІЮ Мо: 22, ЗЕО ІЮ Мо: 23, 5ЕО ІЮО Мо: 24,
ЗЕО ІЮ Мо: 25 і 5ЕО ІО Мо: 26). Крім того, трансформаційний об'єкт, що дає початок вбудованої трансгенної ДНК в об'єкті МОМ87751 характеризується в цьому документі як инсерція в єдиний локус в геномі сої, що призводить до двох нових локусах або сполучною послідовностям між вбудованою ДНК і геномної ДНК сої. Також в цьому документі характеризуються додаткові унікальні послідовності в межах гетерологичної ДНК вбудованої в геном сої об'єкта МОМ87751 і які мають достатню довжину, щоб бути унікальним тільки для генома сої, що містить ДНК об'єкта МОМ87751. Ці сполучні послідовності використовуються для виявлення наявності ДНК об'єкта МОМ87751 в клітинах сої, тканинах сої, насінні сої, рослинах сої або продуктах з рослин сої (товарні продукти з сої). Молекулярні ДНК зонди і пари праймерів Описані у цьому документі, були розроблені для використання при виявленні присутності цих різних єднальних сегментів в біологічних зразках, що містять або імовірно містять клітини сої, насіння сої, частини рослин сої або рослинні тканини сої, які містять ДНК об'єкта МОМ87751. Дані демонструють, що об'єкт МОМ87751 містить одну вставку Т-ДНК з однією копією вбудованої трансгенної ДНК.
Ніяких додаткових елементів від трансформаційного конструкту 1 відмінні від частин лівого і правого прикордонних ділянок Адгобасіегішт їшптеїасіеп5 використаних для трансгенного переносу ДНК від трансформирующей рослини плазміди в геном сої не було виявлено в ДНК об'єкта МОМ87751. Нарешті, була проведена діагностика за допомогою теплової ампліфікації, що створює специфічні ампліко- на наявність такої ДНК об'єкта МОМ87751 в зразку, і був проведений аналіз послідовності ДНК, для визначення довільно заданих 5 "ї 3 вставок в рослинний геном, підтвердження організації елементів усередині вставки, і визначення повної послідовності ДНК вбудованої трансгенної ДНК (ЗЕО ІО Ме: 9) в об'єкті сої МОМ87751.
І0060| Десятки трансгенних об'єктів були отримані з використанням трансформаційного конструкту 1, використаним для отримання трансгенного об'єкта сої МОМ87751, і десять додаткових трансформаційних конструктів були створені і використані для виробництва багатьох десятків інших трансгенних об'єктів сої, які були порівняні з об'єктом сої МОМ87751 і подібними об'єктами сої. Ці об'єкти були протестовані методом ІФА на експресію в тканині листа двох інсектицидних білків Стгу2АбБ ї СтутА.105. Підмножина об'єктів створених для кожної трансформації, і більшість конструктів, були протестовані на ефективність контролю лускокрилих комах-шкідників в умовах дрібноделяночних теплиць. Було встановлено, що рослинні експресійні елементи і відносна орієнтація експресійних касет Стуг2АБ і СтутА.105 в трансформаційному конструкті 1 забезпечувало об'єкт з найкращого ефективністю проти протестованого широкого спектру лускокрилих комах-шкідників.
І0061| Якщо не вказано інше в цьому документі, терміни слід розуміти у відповідності з традиційним використанням, яке мається на увазі звичайним фахівцем у цій галузі техніки.
Значення загальних термінів в молекулярної біології можуть також бути знайдені в Кіедег еї аї.,
Сіоззагу ої Сепеїїсв: Сіазвзіса апа Моїесшіаг, Бій еайіоп, Зргіпдег-Мепйад: Мем/ Могк, 1991; апа
Гем/п, Сепе5 М, Охіога Опімегейу Рге55: Мем/ ХогК, 1994. Використовуваний в цьому документі термін "соя" означає Сіусіпе тах і включає всі різновиди рослини які можуть бути схрещені з рослинами сої, що містять ДНК об'єкта МОМ87751, включаючи дикі види сої, а також ті рослини відносяться до роду Сіусіпе і здатні до міжвидового схрещування. Використовуваний в цьому документі термін "містить" означає "включає без обмеження". (0062) Цей винахід забезпечує трансгенні рослини, які були трансформовані за допомогою
ДНК конструкту, що містить щонайменше дві експресійні касети; перша експресійна касета експресує токсичні кількості інсектицидного білка Сту2АБ, а друга експресійної касета експресує токсичні кількості інсектицидного белкаСтутА.105. Під токсичним кількістю мається на увазі ефективна кількість, інсектицидну кількість, ефективне інсектицидну кількість, інсектицидно ефективна кількість, переважна кількість відносно цільового комахи, ефективне пестицидних кількість, кількостей в раціоні комах загону Лускокрилі, яке є інсектицидною, та інші подібні бо терміни, які маються на увазі звичайним фахівцем в даній області техніки. Рослини сої трансформовані у відповідності зі способами, і за допомогою ДНК конструктів, описаних у цьому документі, є стійкими до лускокрилих комах-шкідників. Пов'язані господарсько-цінні ознаки забезпечують легкість у підтримці ці ознак в схрещують популяції, і проявляють стійкість до більш широкого спектру лускокрилих комах-шкідників, ніж рослини, що містять тільки один ген забезпечує стійкість до лускокрилих комах-шкідників (тобто СтуїТ Ас).
ІЇ0063| Трансгенну "рослину" отримують шляхом трансформації клітин рослини гетерологичною ДНК, тобто, полінуклеїновим конструктом, який включає ряд ефективних цікавлять функцій; регенерацію рослини в результаті вставки трансгена в геном рослинної клітини, і вибір конкретного рослини характеризується Інсерція в конкретне місце генома і числом ефективних функцій регенерованого трансгенної рослини. Термін "об'єкт" відноситься до ДНК з вихідного трансформанта, що містить вбудовану ДНК і фланкуючу геномну послідовність, яка безпосередньо межує з вбудованою ДНК. Така ДНК є унікальною і, як очікується, буде передана потомству, яке отримає вбудовану ДНК, що містить цікавить трансген як результат статевого схрещування однієї батьківської лінії що містить вбудовану ДНК (наприклад, вихідного трансформанта і потомства в результаті самозапилення) і батьківській лінії що не містить вбудовану ДНК. Цей винахід також забезпечує оригінальну рослину- трансформант і потомство трансформанта, яке містить гетерологічні ДНК. Таке потомство може бути зроблене за допомогою статевого ауткросса між рослинами, що містять об'єкт та іншими рослинами у яких потомство містить гетерологічні ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування для рекурентних батьків, об'єкт присутній в потомстві схрещування в тій же хромосомної позиції. Справжнє винахід відноситься до трансгенних об'єкту, рослині сої, що містить МОМ87 751, їх потомству, і композиціям ДНК містяться в них. 0064) "Зонд" являє собою ізольовану нуклеїнову кислоту, до якої може бути прикріплена звичайна мітка яку можна виявити або репортерна молекула, наприклад, радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент або фермент. Такий зонд є комплементарним нитці нуклеїнової кислоти мішені, у разі цього винаходу, нитці ДНК з МОМ87751 або МОМ87751 містяться в рослині або зі зразка, який містить ДНК МОМ87751. Зонди відповідно до цього винаходу включають не тільки дезоксирибонуклеїнові кислоти або РНК, а також поліаміди та інші матеріали зонда, які зв'язуються конкретно з послідовностю-мішенню ДНК, і можуть бути
Зо використані для виявлення присутності послідовності-мішені ДНК. 0065) ДНК праймери являють собою ізольовані полінуклеїнові кислоти, які кріпляться на комплементарну нитку-«мішень ДНК шляхом гібридизації нуклеїнових кислот утворюючи гібрид між праймерною і цільовою ДНК, потім подовжуючись по ДНК-мішені за допомогою полімерази, наприклад ДНК-полімерази. Пара ДНК-праймерів або набір ДНК-праймерів даного винаходу відносяться до двох ДНК-праймерів використовуваним для ампліфікації послідовності-мішені нуклеїнової кислоти, наприклад шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) чи іншими звичайними методами ампліфікації полінуклеінових кислот. (0066) ДНК-зонди і ДНК-праймери можуть мати 11 або більше полінуклеотидів в довжину, або можуть мати 18 полінуклеотидів або більше, 24 полінуклеотида або більше, або 30 полінуклеотидів або більше. Такі зонди і праймери вибираються так, щоб бути достатньої довжини, щоб гібридизувати специфічно з послідовністю-мішенню в особливо жорстких умовах гібридизації. Переважно зонди і праймери цього винаходу мають повне подобу з послідовністю- мішенню, хоча зонди, що відрізняються від послідовності-мішені, які зберігають здатність до гібридизації з послідовністю-мішенню можуть бути сконструйовані звичайними методами.
І0067| Праймери й зонди на основі фланкуючої геномної ДНК і вбудовані послідовності, описані в цьому документі, можуть бути використані для підтвердження (і, при необхідності, виправлення) представлених послідовностей ДНК звичайними способами, наприклад шляхом повторного клонування та секвенування таких молекул ДНК. 0068) Нуклеїнові кислоти-зонди і праймери цього винаходу гібридизуються в жорстких умовах з молекулою-мішенню ДНК. Будь які звичайні способи гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот можуть бути використані для визначення присутності ДНК трансгенної рослини у зразку. Молекули полінуклеінових кислот також відносяться до сегментів нуклеїнової кислоти або її фрагментів здатних специфічно гібридизувати з іншими молекулами нуклеїнових кислот при певних обставинах. Використовані в цьому документі, дві молекули полінуклеінової кислоти називаються, здатними специфічно гібридизувати один з одним, якщо дві молекули здатні утворювати анти-паралельну, дволанцюгову структуру нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти є "комплементарної" іншій молекулі нуклеїнової кислоти, якщо вони проявляють повну компліментарність. Використовувані в цьому документі, молекули проявляють "повну компліментарність", такі, коли кожен нуклеотид однієї з молекул бо комплементарний нуклеотиду інший. Дві молекули є "мінімально комплементарними" якщо вони гібридизуючись одна з одною 3 достатньою стабільністю, що дозволяє їм залишатися зчепленими один з одним, при щонайменше, звичайних умовах "зниженої жорсткості".
Аналогічно, молекули, називаються "комплементарними", якщо вони гібридизуючись один з одним з достатньою стабільністю, що дозволяє їм залишатися зчепленими один з одним, при щонайменше, звичайних умовах "підвищеної жорсткості". Звичайні умови підвищеної жорсткості описані Затьгоок еї аї., 1989, і Наутез еї аї., В: Мисівїс Асіа Нубгіаіганоп, А Ргасіїса! Арргоаси,
ІВІ. Ргез5, Вашинітон, Колумбія (1985). Відхилення від повної комплементарності допустимо, до тих пір, поки такі відхилення не виключає повністю здатність молекул утворювати дволанцюгові структури. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти служила в якості праймера або зонда, їй необхідно бути досить комплементарної послідовності, щоб бути в змозі сформувати стабільну дволанцюгову структуру в умовах конкретного розчинника і концентрації солі.
ІЇ0069| Використана в цьому документі, по суті гомологична послідовність являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка специфічно гибридизуєтся з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти з яким вона порівнюється при умовах високої жорсткості. Відповідні жорсткі умови, що забезпечують гібридизацію ДНК, наприклад, 6,0х хлорид натрію/цитрат натрію (55Х) при температурі близько 45 "С, З подальшим промиванням 2,0х 55С при 50 "С, відомі фахівцям в даній області або можуть бути знайдені в Сшитепі РгоїосоїЇ5 іп МоїІесшаг Віоіоду, допп Уміеу 4
Боп5, М. У. (1989), 6.3.1-6.3.6. Наприклад, концентрація солі при промиванні може бути обрана з від зниженої жорсткості близько 2.0 х 55С при 50 "С до підвищеної жорсткості близько 0.2 х 5БЗС при 50 "С. Крім того температура при промиванні може бути збільшена від умов зниженої жорсткості при кімнатній температурі, приблизно 22 "С, до умов підвищеної жорсткості при близько 65 "С. Можуть змінюватися як температура, так і концентрація солі, або концентрація солі, або температура залишаються константними при зміні іншої змінної. У кращому варіанті реалізації полінуклеінова кислота за цим винаходом буде конкретно гибридизуватися з однією або більше молекул нуклеїнової кислоти, викладеними в ЗЕО ІЮ Мо: 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24, або їх комплементами, або фрагментами в помірно жорстких умовах, наприклад при близько 2.0 х 55С і близько 65 "С. В особливо кращому варіанті реалізації нуклеїнова кислота по справжньому винаходу буде конкретно гібридизуватися з однією або більше молекул нуклеїнової кислоти, викладеними в 5ЗЕО ІЮО Мо: 1,2, 3,4,5,6, 7,8,
Ко) 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24, або їх комплементами, або фрагментами в особливо жорстких умовах. В одному аспекті цього винаходу, краща маркерна молекула нуклеїнової кислоти цього винаходу має послідовність нуклеїнових кислот, викладену в 5ЕО ІЮ Мо:/1 або
ЗЕО ІЮ Мо:2, або ЗЕО ІЮ Мо:3, або ЗЕО ІЮ Ме:4, або 5ЕО ІЮО Ме:5, або 5ЕО ІЮО Мо:б, або ЗЕО ІЮ
Мо:7, або ЗЕО ІЮО Мо:8, або ЗЕО ІЮО Мо:9, або ЗЕО ІЮО Мо:10; або 5ЕО ІЮ Ме:17, або ЗЕО ІЮО Мо:18, або ЗЕО ІЮ Ме:19, або 5ЕО ІЮО Мое:20, або 5ЕО ІО Мо:21, або 5ЕО ІЮ Мое:22, або 5ЕО ІОЮ Мо: 23, або їх комплементи, або їх фрагменти. Гібридизація зонда до молекули-мішені ДНК може бути виявлена за допомогою багатьох методів, відомих фахівців у даній області техніки, вони можуть включати, але не обмежуються, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл і хемілюмінесцентні мітки.
І0070| Що стосується ампліфікації послідовності-мішені нуклеїнової кислоти (наприклад за допомогою ПЛР) з використанням певної пари праймерів ампліфікації, "жорсткі умови" являють собою умови, які дозволяють парі праймерів гібридизувати тільки з послідовністю-мішенню нуклеїнової кислоти, з якої праймер, який має відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент) зв'яжеться і бажано зробити унікальний продукт ампліфікації, амплікон у термічної реакції ампліфікації ДНК. 00711) Термін "специфічний для (послідовності-мішені)" вказує на те, що зонд або праймер гібридизується в жорстких умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню у зразку, що містить послідовність-мішень. 00721) Використані в цьому документі, "ампліфікована ДНК" або "амплікон" відносяться до продукту методу ампліфікації полінуклеіїнової кислоти спрямованого на молекулу-мішень полінуклеінової кислоти, яка є частиною матриці полінуклеінової кислоти. Наприклад, щоб визначити, чи містить рослина сої в результаті статевого схрещування трансгенну рослинну геномну ДНК з рослини сої, що містить об'єкт МОМ87751 по справжньому винаходу, ДНК, витягнута з зразка рослинних тканин сої може бути піддана методом ампліфікації полінуклеінової кислоти з використанням пари праймерів, що включають перший праймер, отриманий від послідовності геномної ДНК в області, що примикає до гетерологічної вбудованої
ДНК об'єкта МОМ87 751 і подовженого полімеразою в 5' до 3' напрямку вбудованої ДНК. Другий праймер отриманий з гетерологічної вбудованої молекули ДНК і подовженого полімеразою в 5' до 3 напрямку фланкуючої геномної ДНК, з якої отримано перший праймер. Амплікон може бо відрізнятися в довжину від сумарної довжини пари праймерів плюс одна пара азотистих основ,
або плюс приблизно п'ятдесят пар азотистих основ, або плюс близько двохсот п'ятдесяти пар азотистих основ, або плюс близько чотирьохсот п'ятдесяти пар азотистих основ або більше.
Крім того, пари праймерів можуть бути отримані з геномної послідовності по обидві сторони вбудованої гетерологічної ДНК, так як для виробництва амплікона, що містить всю вбудовану полінуклеотидну послідовність (наприклад прямого праймера ізольованого з геномного ділянку на 5 5ЕО ІЮ Ме:10 ї зворотного праймера ізольованого з геномного ділянки на 3' кінці «ЕО ІЮ
Мо:10, що ампліфікує молекулу ДНК містить вбудовану гетерологічну послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ
Мо:9) визначену в цьому документі, в геномі, що містить МОМ87751). Член пари праймерів, отриманий із рослинної геномної послідовності суміжній з вбудованою трансгенної ДНК знаходиться на відстані від вбудованої послідовності ДНК, ця відстань може становити від однієї пари азотистих основ до близько двадцяти тисяч пар азотистих основ. Використання терміна "амплікон' специфічно виключає дімери праймерів, які можуть бути утворені в термальною реакції ампліфікації ДНК.
ІЇ0073| Для практичних цілей слід конструювати праймери, які виробляють амплікони в обмеженому діапазоні розмірів, наприклад, від 100 до 1000 основ. Амплікони меншого (коротше полінуклеотидної довжини) розміру в цілому більш надійно виробляються в термальних реакції ампліфікації, що дозволяє скоротити час циклу, і можуть бути легко розділені і візуалізовані на агарозному гелі або адаптовані для використання в кінцевих ТАОМАМФ-подібних аналізах.
Менші амплікони можуть бути зроблені і виявлені з допомогою способів, відомих в області виявлення ДНК ампліконів. Крім того, амплікони, отримані з використанням пар праймерів можуть бути клоновані у вектори, розмножені, ізольовані і секвеновані або можуть бути секвеновані безпосередньо з використанням методів добре відомих в даній галузі техніки. Будь- яка пара праймерів одержана від комбінації ЗЕО ІЮ Мо:7 і 5ЕО ІО Мо:9 або комбінації ЗЕО ІЮ
Мо8 ії 5ЕО ІО Мое:9, яка придатна в способі ампліфікації ДНК для отримання діагностичного амплікону для рослин, що містять МОМ87751 або їх потомства, є одним з аспектів винаходу.
Будь-яка одинична ізольована полінуклеотидна молекула ДНК праймера містить щонайменше 15 суміжних нуклеотидів ЗЕО ІЮО Мо:7, або її комплемент, який придатний спосіб ампліфікації
ДНК для отримання діагностичного амплікона для рослин, що містять МОМ87751 або їх потомства, є одним з аспектів винаходу. Будь-яка одинична ізольована полінуклеотидна
Зо молекула ДНК праймера містить щонайменше 15 суміжних нуклеотидів 5ЕО ІЮ Мо:8, або її комплемент, який придатний спосіб ампліфікації ДНК для отримання діагностичного амплікона для рослин, що містять МОМ87751 або їх потомства, є одним з аспектів винаходу. Будь-яка одинична ізольована полінуклеотидна молекула ДНК праймера містить щонайменше 15 суміжних нуклеотидів ЕС ІЮ Ме:9, або її комплемент, який придатний спосіб ампліфікації ДНК для отримання діагностичного амплікона для рослин, що містять МОМ87751 або їх потомства, є одним з аспектів винаходу.
І0074| Ампліфікацію полінуклеїнових кислот можна проводити будь-якими способами ампліфікації полінуклеінових кислот, відомими в даній галузі техніки, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Способи ампліфікації відомі в даній області техніки описані зокрема, в патентах США Мо 4683195 і 4683202, і в протоколах ПЛР: А Сціде о Меїпоаз апа Арріїсаціопв5, ей. Іппі5 еї аіІ., Асадетіс Рге55, Зап Оієедо, 1990. Способи ПЛР-ампліфікації, розроблені для ампліфікації до 22 т. о. (тисяч основ) геномної ДНК і до 42 т. о. ДНК бактеріофага (Спепо еї аї.,
Ргос. Маїй!. Асад. осі. ОБА 91:5695-5699, 1994). Ці методи, а також інші методи, відомі в області ампліфікації ДНК можуть бути використані в практиці цього винаходу. Послідовність гетерологічної ДНК вставки або фланкуючої геномної послідовності ДНК об'єкта сої МОМ87751 можна перевірити (і виправити, якщо необхідно) шляхом ампліфікації таких молекул ДНК з насіння сої, що містять ДНК об'єкта МОМ87751 сої або рослин сої, вирощені з насіння сої, що містять ДНК об'єкта МОМ87751 зберігаються в АТСС, що мають номер зразка РТА-120166, з використанням праймерів, отриманих з послідовності, представленої в цьому документі, стандартним ДНК секвенуванням ПЛР ампліконів або клонуванням фрагментів ДНК. 00751 Діагностичні амплікони отримані цими способами, можуть виявлятися за допомогою безлічі методів. Одним з таких способів є аналіз генетичної інформації (Мікітогом, еї аї. Мисієвїс
Асій Вевз. 22:4167-4175, 1994), в якому олігонуклеотид сконструйований, щоб перекрити як послідовність суміжній фланкуючої геномної ДНК, так і послідовність вбудованої ДНК.
Олігонуклеотид іммобілізований в лунках мікротитраційного планшета. Після ПЛР цільової ділянки (використовуючи один праймер під вбудованої послідовності і один в суміжній фланкуючої геномної послідовності), одноланцюговий продукт ПЛР може бути гібридизован з іммобілізованим олігонуклеотидом і служити в якості матриці для реакції подовження ланцюга на одну основу з використанням ДНК-полімерази та позначений дидезоксінуклеотид бо трифосфатом (дамМтТР), характерним для очікуваного наступної основи. Індикація може бути флюоресцентної або на підставі ІФА. Сигнал вказує на наявність трансгенної/геномної послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації, і подовження одну основу. 0076) Інший спосіб являє собою метод піросеквенувания, описаний М/іпде (Іппом. Рпагта.
Теспи. 00:18-24, 2000). У цьому способі олігонуклеотид сконструйований, щоб перекрити як суміжну геномну ДНК, так і вбудовану зв'язку ДНК. Олігонуклеотид гібридизируется з одноланцюговим продуктом ПЛР з цільовою ділянкою (один праймер під вбудованої послідовності, а інший під фланкуючої геномної послідовності) і інкубується в присутності ДНК- полімерази, АТФ, сульфурілази, люциферази, апірази, аденозин 5 фосфосульфата і люциферина. ОМТР додаються індивідуально і результатом є включення світловий сигнал, який вимірюється. Світловий сигнал вказує на наявність трансгенної/геномної послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації, і подовження на один або кілька підстав.
І0077| Флюоресцентна поляризація описана Спеп, еї аїЇ., (бепоте Кез. 9: 492-498, 1999) являє собою спосіб, який може бути використаний для виявлення ампліконів цього винаходу. У цьому способі використовується олігонуклеотид сконструйований, щоб перекрити як геномну фланкуючу ДНК, так і вбудовану зв'язувальну ДНК. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюговим продуктом ПЛР з цільової ділянки (один праймер у вбудованій ДНК послідовності, а інший у фланкуючій геномній ДНКпослідовності) і інкубується у присутності
ДНК-полімерази і флуоресцентно-міченого ЗаМТР. Подовження на одну підставу тягне за собою включення ЯаМТР. Включення може бути виміряна з використанням флуориметра як зміна поляризації. Зміна поляризації вказує на наявність трансгенної/геномної послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації, і подовження на одну підставу.
І0078| Тадтапт (РЕ Арріїєд Віозуєіет»5, Фостер-Сіті, Каліфорнія) описується як спосіб виявлення і кількісного визначення присутності послідовності ДНК і повністю зрозумілий в інструкції, наданій виробником. Коротко, ЕКЕТ олігонуклеотидний зонд сконструйований, щоб перекрити як геномну фланкуючу ДНК, так і вбудовану в'язку ДНК. ЕРЕТ зонд і праймери ПЛР (один праймер у вбудованій послідовності ДНК, а інший у фланкуючій геномній послідовності) проходять цикли в присутності термостабільної полімерази і аМТР. Гібридизація ЕРЕТ зонда призводить до розщеплення і вивільнення флуоресцентного фрагмента від фрагмента гасіння
ЕКЕТ зонда. Флуоресцентний сигнал, який вказує на наявність трансгенної/геномної
Зо послідовності внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації.
І0079| Молекулярні маяки були описані для виявлення послідовностей Уапаі, еї аї. (Маїиге
Віоїесн.14: 303-308, 1996). Коротенько, ЕКЕТ олігонуклеотидний зонд сконструйований, щоб перекрити як геномну фланкуючу ДНК, так і вбудовану в'язку ДНК. Унікальна структура ЕКЕТ зонда призводить до того, що він містить вторинну структура яка підтримує флуоресцентний фрагмент і фрагмент гасіння в безпосередній близькості. ЕКЕТ зонд і праймери ПЛР (один праймер у вбудованій послідовності ДНК, а інший у фланкуючій геномній послідовності) проходять цикли в присутності термостабільної полімерази і аМТР. Після успішної ПЛР ампліфікації, гібридизація ЕКЕТ зонда з послідовністю-мішенню приводити до видалення вторинної структури зонда і просторового розділення флуоресцентного фрагмента і фрагмента гасіння. В результаті виникає флуоресцентний сигнал. Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкуючої/трансгенної вбудованої послідовності внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації.
І0080| Набори виявлення ДНК, засновані на способах ампліфікації ДНК містять молекули
ДНК праймерів, які специфічно гібридизуються з цільовою ДНК і ампліфікують діагностичний амплікон при відповідних реакційних умовах. Комплект може надавати спосіб виявлення на основі агарозного гелю або будь-які інші способи виявлення діагностичного амплікона, які відомі в даній галузі техніки. Набори виявлення ДНК можуть бути розроблені з використанням композицій, розкритих в цьому документі і використовуваних для ідентифікації ДНК об'єкта сої
МОМ87751 у зразку і можуть бути застосовані до способів схрещування рослин сої, що містять
ДНК об'єкта МОМ87751. Комплект, який містить ДНК-праймери, які є гомологічними або комплементарними будь-якій частині ділянки геному сої, в порядку, передбаченому 5ЕО ІЮ Мо: 10 ї будь-якій частині вбудованої трансгенної ДНК, в порядку, передбаченому 5ЕО ІЮ Ме: 10 є об'єктом винаходу. Молекули ДНК можуть використовуватися в методах ампліфікації ДНК (ПЛР) або в якості зондів в методах гібридизації полінуклеінових кислот, тобто Саузерн блот і нозерн блот. 0081) Послідовності зрощування можуть бути представлені у вигляді послідовності з групи, що складається з БЕО ІЮО Ме: 1, 5ЕО ІЮ Ме: 2, 5ЕО ІО Ме: 3, 5БО ІЮО Мо: 4, 5ЕО ІЮ Мо: 5, 5ЕО ІЮ
Мо: 6, ЗЕО ІО Ме: 7, 5БЕБЕО ІЮ Ме: 8, 5ЕО ІО Мо: 9, 5ЕО ІЮО Ме: 10; 5ЕО ІЮО Ме: 17, 5ЕО ІЮ Ме: 18, БЕО
ІО Мо: 19, ЗЕО ІЮ Мо: 20, 5ЕО ІО Мо: 21, 5ЕО ІЮ Мо: 22, 5ЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІЮ Мо: 24, 5ЕО ІЮО Мо: бо 25 і 5ЕО ІО Мо: 26. Наприклад, послідовність зрощування може бути безпідставно представлена нуклеотидними послідовностями представленими як 5ЕО ІЮО Мо: 1 і 5ЕБЕО ІЮО Ме: 2. Крім того, послідовність зрощування може бути безпідставно представлена нуклеотидними послідовностями представленими як 5ЕО ІЮ Ме: З і 5ЕБО ІЮ Мо: 4. Крім того, послідовність зрощування може бути безпідставно представлена нуклеотидними послідовностями представленими як 5ЕО ІЮ Мо: 5 і 5ЕО ІЮО Ме: 6. Ці нуклеотиди з'єднані фосфодіефірних зв'язком і в об'єкті сої МОМ87751 присутні як частина рекомбінантного генома рослинної клітини.
Ідентифікація однієї або більше з БЕО ІО Мо: 1, ЗЕО ІЮ Мо: 2, БЕО ІО Мо: 3, 5ЕО ІО Мо: 4, ЗЕО ІЮ
Мо: 5, 5ЕО ІЮ Мо: 6, ЗЕО ІЮ Мо: 7, ЗЕО ІЮ Мо: 8, 5ЕО ІЮ Ме: 9, ЗЕО ІО Мо: 10, 5ЕО ІЮ Мо: 17, ЗЕО
ІО Мо: 18, ЗЕО ІЮ Мо: 19, 5ЕО ІЮО Ме: 20, 5ЕО ІЮО Мо: 21, 5ЕО ІЮО Мо: 22, 5ЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІЮО Мо: 24, 5ЕО ІЮО Мо: 25 і 5ЕО ІО Мо: 26 у зразку, отриманому з рослини сої, насіння сої або частини рослини сої є визначальною, що ДНК була отримана з об'єкта сої МОМ87751 і є маркером присутності в зразку, що містить ДНК об'єкта сої МОМ87751. Таким чином винахід надає молекули ДНК, які містять щонайменше одну з послідовностей ДНК представлених як 5ЕО ІЮ
Мо: 1, ЕС ІЮ Ме: 2, ЕС ІО Мо: 3, 5ЕО ІО Мо: 4, БЕО ІЮО Ме: 5, 5ЕО ІЮО Ме: 6, БЕО ІЮ Ме: 7, ЗЕО ІЮ
Мо: 8, 5ЕО ІЮ Мо: 9, 5ЕО ІО Мо: 10, 5ЕО ІО Мо: 17, ЗЕО ІО Мо: 18, 5ЕО ІО Мо: 19, 5ЕО ІО Мо: 20,
ЗЕО ІО Мо: 21, 5ЕБЕО ІО Ме: 22, 5ЕО ІЮО Мо: 23, 5ЕО ІЮО Ме: 24, БЕО ІЮ Мо: 25 ії 5ЕО ІЮО Мо: 26. Будь сегменти ДНК, отримані від трансгенного об'єкта сої МОМ87751, які достатні, щоб утримувати за меншою одну з послідовностей представлених як ЗЕО ІЮ Мо: 1, БЕО ІЮ Мо: 2, БЕО ІЮО Мо: 3, БЕО
ІО Ме: 4, БЕО ІО Ме: 5, БЕО ІЮО Ме: 6, ЗЕО ІЮО Мо: 7, ЗЕО ІЮО Мо: 8, ЗЕО ІЮ Мо: 9, ЗЕО ІЮ Мо: 10, ЗЕО
ІО Ме: 17, ЗЕО ІЮ Мо: 18, 5ЕО ІО Мо: 19, 5ЕО ІЮ Ме: 20, 5ЕО ІО Ме: 21, 5ЕО ІО Ме: 22, 5ЕО ІЮ Мо: 23, ЗЕО ІЮ Мо: 24, 5ЕО ІЮ Мо: 25 або 5ЕО ІО Ме: 26 знаходяться в межах об'єму винаходу. Крім того, будь полінуклеотид, що містить послідовність комплементарну будь якій з послідовностей, наведених у цьому пункті знаходяться в межах об'єму винаходу. (0082) Винахід забезпечує зразкові молекули ДНК, які можуть бути використані в якості праймерів або зондів для детекції наявності ДНК, отриманої з рослин сої, що містять ДНК об'єкта МОМ87751 ДНК у зразку. Такі праймери або зонди є специфічними для послідовності- мішені нуклеїнової кислоти і можуть бути використані для ідентифікації послідовності нуклеїнової кислоти об'єкта сої МОМ87751 способами винаходи, описаних у цьому документі.
І(0083| "Праймер" може бути високоочищеним, ізольований полінуклеотидом,
Зо сконструйованим для використання в способах зв'язування або гібридизації, що передбачає термічну ампліфікацію. Пара праймерів може бути використана з матрицею ДНК, такий як зразок геномної ДНК сої, у тепловій ампліфікації, такий як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), для отримання амплікона, де амплікон, отриманий при такій б реакції матиме послідовність ДНК відповідну послідовності матриці ДНК, розташованої між двома сайтами, де праймери гібридизуючись з матрицею. Використовуваний в цьому документі "амплікон" представляє собою копію шматка або фрагмента ДНК, який був синтезований з використанням методів ампліфікації. Амплікон за винаходом може містити щонайменше одну з послідовностей наданих як 5ЕО ІО Мо: 11 ї 5ЕБО ІЮО Мо: 12. Праймер, як правило, сконструйований для гібридизації нитки-мішені комплементарної ДНК у вигляді гібрида між праймером і ниткою- мішенню ДНК, і наявність праймера є точкою розпізнавання для полімерази, щоб почати добудову праймера (тобто, полімеризацію додаткових нуклеотидів в подовжену молекулу нуклеотидів), використовуючи як матрицю ДНК-мішень. Пари праймерів, використовувані у винаході, призначені для позначення використання двох праймерів зв'язуються на протилежних нитках дволанцюгового нуклеотидного сегмента з метою лінійної ампліфікації полінуклеотидного сегмента між позиціями призначеними для зв'язування окремих членів пари праймерів, як правило, в реакції термічної ампліфікації чи іншими звичайними способами ампліфікації нуклеїнової кислоти. Зразкові молекули ДНК використовувані як праймерів наведені у вигляді 5ХЕО ІЮ Мо: 11, 5ЕО ІЮО Мо: 12, 5БО ІЮ Мо: 14 або 5ЕБО ІЮО Мо: 15. Пара праймерів представлених як 5ЕО ІЮ Мо: 11 ї БЕО ІЮ Ме: 12 використовується як перша молекула
ДНК, і друга молекула ДНК, яка відрізняється від першої молекули ДНК, і обидва мають достатню довжину послідовних нуклеотидів ЗЕО ІЮО Ме: 10 для функціонування в якості ДНК - праймерів, які, спільно використовуються в реакції теплової ампліфікації з матрицею ДНК, отриманої з об'єкта сої МОМ87751, для отримання діагностичного амплікона для ДНК об'єкта сої
МОМ87751 у зразку.
І0084| "Зонд" являє собою ізольовану нуклеїнову кислоту, яка комплементарна ланцюга нуклеїнової кислоти-мішені. Зонди згідно винаходу включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або РНК, а також поліаміди та інші матеріали зонда, які зв'язуються конкретно з послідовності- мішені ДНК, і виявлення таких зв'язувань може бути використана в розпізнаванні, відділенні, виявленні або підтвердження присутності послідовності-мішені ДНК в конкретному зразку. До бо зонду може бути прикріплена звичайна мітка яка визначається або репортена молекула,
наприклад, радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент або фермент. Зразкова молекула ДНК використовувана як зонда приведена в ЗЕО ІЮ Мо: 13 ї ЗЕО ІЮ Мо: 16.
І0085| Зонди і праймери згідно винаходу можуть мати повну подобу з послідовністю- мішенню, хоча зонди, що відрізняються від послідовності-мішені, які зберігають здатність до гібридизації з послідовністю-мішенню можуть бути сконструйовані звичайними методами. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти служила в якості праймера або зонда, їй необхідно бути досить комплементарної послідовності, щоб бути в змозі сформувати стабільну дволанцюгову структуру в умовах конкретного розчинника і концентрації солі. Будь звичайні способи гібридизації або ампліфікації можуть бути використані для визначення присутності трансгенного ДНК об'єкта сої МОМ87751 у зразку. Зонди і праймери, як правило, мають, щонайменше приблизно 11 нуклеотидів, щонайменше приблизно 18 нуклеотидів, щонайменше приблизно 24 нуклеотиду або щонайменше приблизно 30 нуклеотидів або більше в довжину.
Такі зонди і праймери гібридизуються специфічно з послідовністю-мішенню ДНК в жорстких умовах гібридизації. Звичайні умови підвищеної жорсткості описані Затбгоок еї аї., 1989, і
Наутевз еї аї., В: Мисієїс Асіа Нубгідігайноп, А Ргасіїса! Арргоасії!, ІКГ. Рге55, Вашингтон, Колумбія (1985). (0086) Будь-які способи, розкриті у винаході, добре відомі фахівцям у цій галузі, можуть використовуватися для ізоляції і маніпуляції молекулою ДНК, або її фрагментом включаючи спосіб термальною ампліфікації. Молекули ДНК, або їх фрагменти, також можуть бути отримані іншими способами, наприклад, шляхом прямого синтезу фрагмента хімічним шляхом, як це звичайно практикується з використанням автоматизованого синтезатора олігонуклеотидів.
Ї0087| Молекули ДНК їі відповідні нуклеотидні послідовності, представлені в цьому документі, є тому придатними для, серед іншого, виявлення об'єкта сої МОМ87751, вибору різновидів або гібридів сої, що містять об'єкт МОМ87751, виявлення присутності ДНК, отриманої з трансгенної об'єкта сої МОМ87751 у зразку, і контролю присутності та/або відсутності у зразку об'єкта сої МОМ87751 або частин рослин, отриманих з рослин сої, що містять об'єкт МОМ87 751. (0088) Винахід забезпечує рослини сої, клітини рослини сої, насіння сої, частини рослин сої (такі як пилок, сім'ябрунька, боб, тканина квітки, тканина кореня, тканина стебла і тканину листа), потомство рослин сої, соєва олія, соєва вино, соєве молоко, соєвий білок і товарну
Зо продукцію з сої. Такі рослини сої, клітини рослини сої, насіння сої, частини рослин сої, потомство рослин сої, соєва олія, соєва вино, соєве молоко, соєвий білок і товарну продукцію з сої містять детекуєму кількість полінуклеотиду за винаходом тобто, таке, щоб полінуклеотид мала щонайменше одну з послідовностей представлених як ЗХЕО ІЮО Мо: 1, БЕО ІО Ме: 2, БЕО ІЮ
Мо: 3, ЗБОЮ Мо: 4, 5ЕО ІО Мо: 5, 5ЕО ІО Мо: 6, БЕО ІЮО Ме: 7, 5ЕО ІЮО Ме: 8, 5ЕО ІЮ Ме: 9, 5ЕО ІЮ
Мо: 10; 5ЕО ІЮО Мо: 17, 5ЕО ІО Мо: 18, БЕО ІЮ Мо: 19, 5ЕО ІО Ме: 20, 5ЕО ІО Мо: 21, ЗЕО ІО Мо: 22,
ЗЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІЮ Мо: 24, 5ЕО ІЮ Мо: 25 або 5ЕО ІЮО Ме: 26. Рослини сої, рослинні клітини, насіння, частини рослин, і потомство рослини винаходу можуть також містити один або більше додаткових трансгенів. Таким додатковим трансгенних може бути будь нуклеотидних послідовність, що кодує білок або молекулу РНК забезпечує бажаний ознака включає без обмеження підвищену стійкістю до комах-шкідників, підвищення ефективності використання води, підвищення врожайності, підвищена посухостійкості, підвищення якості насіння, поліпшення харчових якостей, та/або підвищення толерантності до гербіцидів, в яких бажаний ознака вимірюється по відношенню до рослини сої у якого відсутні такі додаткові трансгени. 0089) Винахід забезпечує рослини сої, клітини рослини сої, насіння сої, частини рослин сої (такі як пилок, сім'ябрунька, боб, тканина квітки, тканина кореня, тканина стебла і тканину листа), потомство рослин сої отримані від трансгенної рослини сої містить ДНК об'єкта
МОМ87751. Репрезентативна вибірка насіння сої, що містять ДНК об'єкта МОМ87751 були поміщена відповідно до будапештських договором в американську колекцію культур (АТССФ).
Сховище АТСС присвоїло патентне позначення РТА-120166 насіння, що містить ДНК об'єкта
МОМ87751. 0090) Винахід пропонує мікроорганізм, що містить молекулу ДНК, мають щонайменше одну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ Мо: 1, БЕО ІЮО Мо: 2, ЗЕО ІЮ Мо: 3, 5ЕО ІЮ Мо: 4, 5ЕО ІЮО Мо: 5,
ЗБЕО ІО Мо: 6, 5ЕО ІО Мо: 7, 5ЕО ІЮО Ме: 8, ЗЕО ІЮ Мо: 9, 5ЕО ІО Мо: 10, 5ЕО ІО Мо: 17, 5ЕО ІО Мо: 18, ЗЕО ІЮ Мо: 19, ЗЕО ІО Мо: 20, 5ЕО ІЮО Мо: 21, ЗЕО ІЮ Мо: 22, ЗЕО ІЮ Мо: 23, 5ЕО ІЮО Мо: 24,
ЗБО ІО Мо: 25 і 5ЕО ІЮО Мо: 26 представлену в її геномі. Прикладом такого мікроорганізму є трансгенної рослинна клітина. Мікроорганізми, такі як рослинна клітина по винаходу, застосовуються в багатьох промислових галузях, включаючи без обмеження: (ії) використання в якості дослідницького інструменту для наукових досліджень і промислових досліджень; (ії) використання в культурі для виробництва ендогенних або рекомбінантних вуглеводів, ліпідів, 60 нуклеїнових кислот, або білкових продуктів або малих молекул, які можуть бути використані для подальших наукових досліджень або в якості промислової продукції; і (ії) використання з сучасними методами культурою тканини рослин, для отримання трансгенних рослин або рослинних культур тканини, які можуть потім бути використані для сільськогосподарських досліджень або виробництва. Отримання і застосування мікроорганізмів, таких як трансгенні рослинні клітини використовує сучасні мікробіологічні методи і участь людини для створення рукотворного, унікального мікроорганізму. У цьому процесі, рекомбінантна ДНК вбудовується в геном рослинної клітини для створення трансгенної рослинної клітини, що є окремою і унікальною по відношенню до природних рослинним клітинам. Ця трансгенна рослинна клітина може потім бути культивована на подобі бактерій і дріжджових клітин з використанням сучасних методів мікробіології і може існувати в недиференційованому, одноклітинні стані. Нова генетична композиція і фенотип трансгенної рослинної клітини являють собою технічний ефект, створений шляхом інтеграції гетерологічної ДНК в геном клітини. юІншим аспектом винаходу є спосіб з застосування мікроорганізму по винаходу. Способи використання мікроорганізмів по винаходу, таких як трансгенні рослинні клітини, включають: (ї) способи отримання трансгенних клітин шляхом інтеграції рекомбінантної ДНК в геном клітини і потім використання цієї клітини для отримання додаткових клітин, що володіють тією ж гетерологічної ДНК; (ії) способи культивування клітин, що містять рекомбінантні ДНК з використанням сучасних мікробіологічних методів; (ії) способи отримання та очищення ендогенних або рекомбінантних вуглеводів, ліпідів, нуклеїнових кислот, або білкових продуктів з культивованих клітин; і (їм) способи застосування сучасних методів культивування рослинних тканин з трансгенними рослинними клітинами для отримання трансгенних рослин або культур тканин трансгенних рослин.
ІЇ0091| Рослини за винаходом можуть передавати ДНК об'єкта МОМ87751, у тому числі трансген вбудований в об'єкт сої МОМ87751 потомству. Використовуване в цьому документі "потомство" включає будь рослини, насіння, клітку рослини, і/або регенеруюча частина рослини містить ДНК об'єкта МОМ87751, отриману з рослини-предка і/або містить молекулу ДНК має щонайменше одну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ Мо: 1, 5ЕО ІЮО Мо: 2,
ЗБЕО ІО Мо: 3, 5ЕО ІО Ме: 4, БЕО ІЮО Ме: 5, 5ЕО ІЮО Ме: 6, 5ЕО ІЮ Ме: 7, БЕО ІО Ме: 8, БЕО ІЮ Ме: 9,
ЗЕО ПО Мо: 10; 5ЕО ІО Мо: 17, 5ЕО ІЮ Ме: 18, 5ЕО ІЮО Ме: 19, 5ЕО ІЮО Ме: 20, 5ЕО ІО Ме: 21, БЕО І
Мо: 22, 5ЕО ІЮО Ме: 23, 5ЕО ІО Мо: 24, 5ЕО ІО Ме: 25 і 5ЕО ІО Ме: 26. Рослини, потомство і насіння
Зо можуть бути гомозиготною або гетерозиготною по відношенню до трансгена. Потомство може бути вирощено з насіння, отриманого від рослини сої, що містить об'єкт МОМ87751 та/або з насіння, вироблених рослиною заплідненим пилком рослини сої, що містить об'єкт МОМ87751. (00921 Рослини-нащадки можуть бути самозапиленими (також відомі як "самовідтворюються") для створення істинної лінії схрещування рослин, , тобто рослин, гомозиготних по відношенню до трансгена. Самозапилення відповідного потомства дозволяє отримувати рослини, які є гомозиготними по обох доданим екзогенним генам. 00931 Крім того, рослини-нащадки можуть бути схильні ауткроссінгу, наприклад, схрещені з іншим неспорідненими рослиною, для отримання різновидів або гібридного насіння або рослин.
Інші неспоріднених рослини можуть бути трансгенними або нетрансгенними. Сортові або гіоридне насіння або рослину винаходу можуть таким чином бути отримані шляхом статевого схрещування першого батька, у якого відсутня конкретна і унікальна ДНК об'єкта сої МОМ87751 з кожним з батьків містить об'єкт сої МОМ87 751, в результаті чого виходить гібрид, що включає специфічну й унікальну ДНК об'єкта сої МОМ87751. Кожен батько може бути гібридним або інбрдним/сортовим, до тих пір, поки як результати схрещування або запилення призводять до появи рослини або насіння по винаходу, тобто насіння, що має хоча б один алель, що містить
ДНК об'єкта сої МОМ87751 та / або молекулу ДНК, що має щонайменше одну послідовність, вибрану з БЕО ІЮО Мо: 1, БЕО ІЮО Ме: 2, ЗЕО ІО Мо: 3, ЗЕО ІЮ Мо: 4, 5ЕО ІЮО Мо: 5, 5ЕО ІЮО Ме: 6,
ЗЕО ІО Мо: 7, БЕО ІЮ Мо: 8, 5ЕО ІЮ Мо: 9, 5ЕО ІЮ Мо: 10; 5ЕО ІЮ Мо: 17, ЗЕО ІЮО Мо: 18, 5ЕО ІО Мо: 19, ЗЕО ІЮО Ме: 20, 5ЕО ІО Мо: 21, ЗЕО ІЮ Мо: 22, ЗЕО ІЮО Ме: 23, ЗЕО ІЮ Мо: 24, 5ЕО ІЮ Мо: 25 і
ЗБО ІО Мо: 26. Дві різних трансгенних рослини можуть таким чином бути схрещені для отримання гібридного потомства, яке містить два незалежно розділених доданих, екзогенних гена. Наприклад, МОМ87751 містить Сгуг2АбБ і СтутА.105 забезпечують подвійну форму стійкості до комах у сої можуть бути схрещені з іншими трансгенними рослинами сої, щоб справити рослина, що має характеристики обох трансгенних батьків. Одним прикладом цього є схрещування МОМ87751 містить Стуг2АБ і СтутА.105 забезпечують подвійну форму стійкості до комах у сої з рослиною, що має один або більше додаткових ознак, таких як стійкість до гербіцидів (наприклад об'єкт сої МОМ89788 або об'єкт сої МОМ 87708) та/або боротьби з комахами (наприклад об'єкт сої МОМ 88701), в результаті чого виходить потомство рослин або насіння, який має подвійну форму дії стійкості до лускокрилих комах-шкідників і мають 60 щонайменше один або більше додатковий ознака. Поворотні схрещування з батьківським рослиною і схрещування з не-трансгенних рослин, також розглядаються, як і вегетативне розмноження. Опис інших способів схрещування, які широко застосовуються для різних ознак і культур можуть бути знайдені в одній з декількох посилань наприклад, Репйг, в Вгеєдіпда МеШйоа»
Тог Симаг ОемеІортепі, Умісох у. ед., Атегісап 5осіеїу ої Адгопоту, Медісон, Вісконсін (1987).
І0094| Винахід забезпечує частину рослини, отриману з рослин сої, що містять об'єкт
МОМ87751. Використовувана в цьому документі "частина рослини" означає будь-яку частину рослини, яка складається з матеріалу, отриманого з рослини сої містить об'єкт МОМ87751.
Частини рослини сої включають без обмеження пилок, сім'ябруньку, боб, квітку, тканина кореня або стебла, волокна і листя. Частини рослин можуть бути життєздатними, нежиттєздатними, регенерованими, та/або не регенерується.
І0095| Винахід забезпечує товарний продукт, одержуваний з рослин сої, що включають об'єкт МОМ87751 і, що містять детектуєму кількість нуклеїнової кислоти, специфічною для об'єкта МОМ87751. Використовуваний в цьому документі "сировинної продукт" відноситься до будь-якої композиції або продукту, який складається з матеріалу, отриманого з рослини сої, цільного або обробленого насіння сої, однієї або більше клітин рослини і/або частин рослини, що містять ДНК об'єкта сої МОМ87751. Товарна продукція може бути реалізована споживачам і може бути життєздатною або нежиттєздатною. Нежиттєздатні товарні продукти включають без обмеження нежиттєздатні насіння; цільні або оброблене насіння; частини насіння і частини рослин; соєва олія, соєвий білок, соєвий шрот, соєве борошно, соєві пластівці, соєві висівки, соєве молоко, соєвий сир, соєве вино, корм для тварин, що містить сою, папір містить сою, крем містить сою, соєву біомасу, пально-матеріали, вироблені з використанням рослини сої та частин рослин сої. товарні продукти включають без обмеження насіння, рослини і рослинні клітини. Рослини сої, що містять об'єкт МОМ87751 можуть таким чином використовуватися для виробництва будь-якої товарної продукції, як правило, одержувану з сої. Будь-який такий товарний продукт, отриманий з рослин сої, що містить об'єкт МОМ87751 може містити щонайменше детектуєму кількість специфічної і унікальної ДНК, відповідної об'єкту сої
МОМ87751, і зокрема, може містити визначуване кількість полінуклеотиду, що включає молекулу ДНК, що має щонайменше одну послідовність, обрану з БЕО ІЮ Мо: 1, 5ЕО ІЮО Мо: 2,
ЗБЕО ІО Мо: 3, 5ЕО ІО Ме: 4, БЕО ІЮО Ме: 5, 5ЕО ІЮО Ме: 6, 5ЕО ІЮ Ме: 7, БЕО ІО Ме: 8, БЕО ІЮ Ме: 9,
Коо) ЗЕО ПО Мо: 10; 5ЕО ІЮ Ме: 17, 5ЕО ІЮ Ме: 18, 5ЕО ІО Мо: 19, 5ЕО ІО Ме: 20, 5ЕО ІЮ Ме: 21, 5ЕО ІЮ
Мо: 22, ЗЕО ІЮО Ме: 23, 5ЕО ІЮО Мо: 24, 5ЕО ІЮ Мо: 25 ії 5ЕО ІО Ме: 26. Будь стандартний спосіб виявлення нуклеотидних молекул може бути використаний, зокрема способи виявлення розкриті в цьому документі. Товарний продукт входить в об'єм винаходу, якщо є яка-небудь детектуєма кількість молекули ДНК, що має щонайменше одну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ
Мо: 1, БО ІЮ Ме: 2, ЕС ІО Мо: 3, 5ЕО ІО Мо: 4, БЕО ІЮО Ме: 5, 5ЕО ІЮО Ме: 6, БЕО ІЮО Ме: 7, 5ЕО ІЮ
Мо: 8, ЗЕО ІЮ Мо: 9, 5ЕО ІО Мо: 10, 5ЕО ІО Мо: 17, 5ЕО ІО Мо: 18, 5ЕО ІЮ Мо: 19, 5ЕО ІО Мо: 20,
ЗБОЮ Мо: 21, 5ЕО ІЮО Ме: 22, 5БО ІО Ме: 23, 5БО ІЮ Мо: 24, БО ІО Ме: 25 ії 5БО ІЮО Ме: 26 в товарному продукті.
ІЇ0096| Рослини, потомство, насіння, клітини рослин, частини рослин (такі як пилок, семяпочка, боб, квітка, тканини кореня або стебла і листя), і товарні продукти по винаходу, використовуються для, серед іншого, вирощування рослин для одержання насіння та/або частин рослин, що містять об'єкт сої МОМ87751 для сільськогосподарських потреб, виробництво потомства, що містить об'єкт сої МОМ87751 в селекційних і дослідницьких цілях, використання мікробіологічних методів для промислових і дослідницьких застосувань, і продажу споживачам.
І0097| Також забезпечуються способи отримання рослин сої, стійких до комах містять послідовності ДНК специфічні і унікальні для об'єкта МОМ87751 по винаходу. Трансгенні рослини, використовувані в цих способах можуть бути гомозиготними або гетерозиготними по відношенню до трансгена. Рослини-нащадки вироблені цими способами, можуть бути сортовими або гібридними рослинами; можуть бути вирощені з насіння, вироблених рослиною, що містить об'єкт сої МОМ87751 та/або насіння, вироблених рослиною заплідненим пилком рослини, що містить об'єкт сої МОМ87751; можуть бути гомозиготними або гетерозиготними по відношенню до трансгена. Рослини-нащадки можуть бути самозапилені для створення істинної лінії розведення рослин, , тобто рослин, гомозиготних по відношенню до трансгена, або альтернативно можуть бути схильні ауткроссінгу, наприклад, схрещеними з іншим неспоріднених рослиною, для виробництва сортових або гібридного насіння або рослин. (0098) Представлені способи виявлення наявності ДНК, отриманої з клітин сої, тканини сої, насіння сої або рослини сої, що містять об'єкт сої МОМ87751 у зразку. Один спосіб складається з () виділення зразка ДНК, із щонайменше, однієї клітини сої, тканини сої, насіння сої, або бо рослини сої, (ії) контактування зразка ДНК з щонайменше одним праймером, який здатний виробляти послідовності ДНК, специфічні для ДНК об'єкта МОМ87751 в умовах, відповідних для секвенування ДНК, (ії) проведення реакції секвенування ДНК, а потім (ім) підтвердження, що нуклеотидних послідовність містить нуклеотидну послідовність, специфічну для об'єкта
МОМ87751, або конструкт, що міститься в ній, наприклад, вибраний з групи, що складається з
ЗЕО ІО Мо: 1, БЕО ІО Ме: 2, БЕО ІЮО Ме: 3, 5ЕО ІЮО Ме: 4, 5ЕО ІЮ Ме: 5, 5ЕБЕО ІО Ме: 6, БЕ ІЮ Мо: 7,
ЗЕО ІО Мо: 8, 5ЕО ІО Мо: 9, 5ЕО ІЮО Ме: 10; 56О ІЮО Мо: 17, 5ЕО ІЮ Ме: 18, 5ЕО ІО Мо: 19, 5ЕО І
Мо: 20, 5ЕО ІО Мо: 21, 5ЕО ІЮ Мо: 22, 5ЕО ІЮ Мо: 23, ЗЕО ІО Мо: 24, 5ЕО ІЮО Мо: 25 і ЗЕО ІЮ Ме: 26.
Інший спосіб складається з (ї) виділення зразка ДНК, із щонайменше, однієї клітини сої, тканини сої, насіння сої, або рослини сої, (її) контактування зразка ДНК з парою праймерів, здатних призвести амплікон з ДНК об'єкта МОМ87751 в умовах, належних для ампліфікації ДНК, (її) проведення реакції ампліфікації ДНК, а потім (м) виявлення молекули амплікона та / або підтвердження, що нуклеотидних послідовність амплікона містить нуклеотидну послідовність, специфічну для об'єкта сої МОМ87751, наприклад, обрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ Мо: 1, ЗЕО ІО Ме: 2, 5ЕО ІЮО Мо: 3, ЗЕО ІЮ Мо: 4, 5ЕО ІЮ Мо: 5 і 5ЕО ІЮО Мо: 6. Амплікон повинен бути специфічним для об'єкта МОМ87751, таким як амплікон, який містить зЕО ІЮО Ме: 1, або ЗЕО ІЮ
Мо: 2, або 5ЕО ІЮ Мо: 3, або 5ЕО ІЮ Ме: 4, або 5ЕО ІЮО Ме: 5, або 5ЕО ІЮ Ме: 6. Виявлення в амплікона нуклеотидної послідовності специфічною для об'єкта МОМ87751 є визначальним і / або маркером наявності специфічною ДНК об'єкта сої МОМ87751 у зразку. Приклад пари праймерів, здатних призвести амплікон з ДНК об'єкта МОМ87751 при умовах, що підходять для ампліфікації ДНК представлена як ЗЕО ІЮ Мо: 11 ї 5ЕО ІО Мо: 12. Інші пари праймерів можуть бути легко розроблені фахівців у даній галузі техніки і використані для отримання амплікона, представленого як ХЕО ІЮ Мо: 1 або 5БЕО ІО Мо: 2, або 5ЕО ІЮ Мо: 3, або ЗЕО ІО Мо: 4, або 5ЕО
ІО Мо: 5, або 5ЕО ІО Мо: 6, причому кожна пара праймерів містить щонайменше один праймер всередині геномного ділянки фланкуючої вставку і другий праймер всередині вставки. Інший спосіб виявлення присутності ДНК, отриманої з клітин сої, тканин сої, насіння сої, або рослини сої, що містить об'єкт сої МОМ87751 у зразку складається з (ї) виділення зразка ДНК, із щонайменше, однієї клітини сої, тканини сої, насіння сої, або рослини сої, (ії) контактування зразка ДНК з ДНК зондом специфічним для ДНК об'єкта МОМ87751, (ії) проведення гібридизації зонда і зразка ДНК в жорстких умовах гібридизації, а потім (ім) виявлення гібридизації між зондом і зразком-мішенню ДНК. Приклад послідовності ДНК-зонда, специфічного для ДНК об'єкта МОМ87751 представлений в ЗЕО ІЮ Мо: 13 або 5ЕО ІЮО Мо: 16 Інші зонди можуть бути легко розроблені фахівців у даній галузі техніки і містити щонайменше один фрагмент геномної
ДНК фланкуючий вставку і щонайменше один фрагмент вбудованої ДНК, такий як послідовності представлені без обмеження в 5ЕО ІЮ Мо: 1, 5ЕО ІЮ Мо: 2, 5ЕО ІЮ Ме: 3, ЗЕО ІЮО Мо: 4, 5ЕО ІЮ
Мо: 5, 5ЕО ІЮ Мо: 6, ЗЕО ІЮ Мо: 7, ЗЕО ІЮО Мо: 8 ії 5ЕО ІО Мо: 10. Виявлення гібридизації зонда з
ДНК зразка є маркером наявності специфічною ДНК об'єкта сої МОМ87751 у зразку. Відсутність гібридизації є навпаки свідченням відсутності специфічною ДНК об'єкта сої МОМ87 751 у зразку.
І0099| Представлені набори виявлення ДНК використовувані для ідентифікації ДНК об'єкта сої МОМ87751 в зразку, і можуть бути застосовані до способів розмноження рослин сої, що містять присвоєну ДНК об'єкта. Такі набори містять ДНК-праймери та / або зонди, що містять фрагменти по 5ЕО ІО Мо: 1, БЕО ІЮО Ме: 2, БЕО ІО Ме: 3, БЕО ІО Мо: 4, БЕО ІО Ме: 5, 5ЕО ІО Ме: 6,
ЗЕО ІО Мо: 7, БЕО ІЮ Мо: 8, 5ЕО ІЮ Мо: 9, 5ЕО ІЮ Мо: 10; 5ЕО ІЮ Мо: 17, ЗЕО ІЮО Мо: 18, 5ЕО ІО Мо: 19, 5ЕО ІЮ Мо: 20, 5ЕО ІЮО Мо: 21, 5ЕО ІЮО Мо: 22, 5ЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІЮ Мо: 24, 5ЕО ІЮ Мо: 25 і
ЗЕО ІЮ Мо: 26. Одним із прикладів такого набору містить, щонайменше одну молекулу ДНК достатньої довжини послідовних нуклеотидів з ЕС ІЮО Мо: 10 використовувану в якості ДНК- зонда для виявлення наявності та / або відсутності ДНК у зразку, отриманому з трансгенних рослин сої, що містять об'єкт МОМ87751. ДНК, отримана з трансгенних рослин сої, що містять об'єкт МОМ87751 буде містити молекулу ДНК, що має щонайменше одну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО Ме: 1, 5ЕО ІЮО Ме: 2, БЕО ІО Ме: 3, БО ІО Мо: 4, 5ЕО ІЮО Мо: 5, 5ЕО ІО Мо: 6, 5ЕО ІЮ Мо: 7, ЗЕО ІО Мо: 8, БЕО ІЮО Ме: 9, БЕО ІЮ Ме: 10, 5ЕО ІО Ме: 17, 5ЕО ІО Мо: 18, БЕО ІО Ме: 19, 5ЕО ІЮ
Мо: 20, 5ЕО ІО Мо: 21, 5ЕО ІЮ Мо: 22, 5ЕО ІЮ Мо: 23, ЗЕО ІО Мо: 24, 5ЕО ІЮО Мо: 25 і ЗЕО ІЮ Ме: 26.
Молекула ДНК, достатня для використання в якості ДНК-зонда за умови, якщо придатна для визначення, виявлення або діагностики наявності та / або відсутності ДНК об'єкта сої
МОМ87751 у зразку представлена як 5ЕО ІЮ Мо: 13. Інші зонди можуть бути легко розроблені фахівців у даній галузі техніки і повинні містити щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26, щонайменше 27, щонайменше 28, щонайменше 29, щонайменше 30, щонайменше 31, щонайменше 32, щонайменше 33, щонайменше 34, щонайменше 35, щонайменше 36, щонайменше 37, бо щонайменше 38, щонайменше 39 або щонайменше 40 послідовних нуклеотидів по 5ЕО ІЮ Мо:
10 ї бути досить унікальними для ДНК об'єкта сої МОМ87751 з метою виявлення ДНК, отриманої з об'єкта. Інший тип комплекту містить пару праймерів придатних для виробництва ампліко-, придатного для виявлення наявності та / або відсутності ДНК, отриманої з трансгенної об'єкта сої МОМ87751 у зразку. Такий комплект буде використовувати спосіб, що включає контактування ДНК-мішені з парою праймерів, як це описано вище, після чого виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, достатньої для отримання ампліко-, що містить молекулу ДНК, що має щонайменше одну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ Мо: 1, 5ЕО ІЮ Мо: 2, ЗЕО ІЮ Мо: З,
ЗЕО ІО Мо: 4, БЕО ІЮ Мо: 5, 5ЕО ІЮ Ме: 6, БЕО ІЮ Мо: 7, ЗЕО ІЮ Мо: 8, БЕО ІЮ Мо: 9, ЗЕО ІЮ Мо: 10,
ЗЕО ПО Мо: 17, БЕО ІЮО Мо: 18, 5ЕО ІЮ Ме: 19, 5ЕО ІО Ме: 20, 5ЕО ІО Мо: 21, БЕО ІО Ме: 22, 5ЕО ІЮ
Мо: 23, БО ІО Мо: 24, 5ЕБЕО ІЮ Ме: 25 і 5БО ІЮ Мо: 26, і потім визначення присутності та/або відсутності. Такий спосіб може також включати секвенування амплікона або його фрагмента, який буде визначальним, тобто маркером наявності специфічною ДНК об'єкта сої МОМ87751 у зразку ДНК-мішені. Інші пари праймерів можуть бути легко розроблені фахівців у цій галузі техніки і повинні містять щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26, щонайменше 27, щонайменше 28, щонайменше 29 або щонайменше 30 послідовних нуклеотидів послідовностей, представлених без обмеження в ЗЕО ІЮ Мо: 1, 5ЕО ІЮ Мо: 2, ЗЕО ІЮ Мо: 3, 5ЕО ІЮ Мо: 4, ЗЕО ІЮ Мо: 5, ЗЕО ІЮ
Мо: 6, ЗЕО ІО Ме: 7, 5ЕО ІЮ Ме: 8, 5ЕО ІО Мо: 9, 5ЕО ІЮО Ме: 10, 5ЕО ІЮО Ме: 17, 5ЕО ІО Мо: 168, ЗЕО
ІО Мо: 19, ЗЕО ІЮ Мо: 20, 5ЕО ІО Мо: 21, 5ЕО ІЮ Мо: 22, 5ЕО ІО Мо: 23, 5ЕО ІЮ Мо: 24, 5ЕО ІЮО Мо: і 5ЕО ІО Мо: 26 і бути досить унікальними для ДНК об'єкта сої МОМ87751 з метою виявлення
ДНК, отриманої з об'єкта.
ІЇ00100| Набори й способи детекції даного винаходу є придатними для, серед іншого, виявлення об'єкта сої МОМ87751, відбору різновидів або гібридів сої, що містять об'єкт 25 МОМ87751, виявлення присутності ДНК, отриманої з трансгенної об'єкта сої МОМ87751 в зразку, і контролю присутності та/або відсутності у зразку об'єкта сої МОМ87751 або частин рослин, отриманих з рослин сої, що містять об'єкт МОМ87751.
ІЇ00100| Послідовність гетерологичной ДНК вставки, що зв'язує послідовності, або фланкуючої послідовності об'єкта сої МОМ87751 можна перевірити (і виправити, якщо
Зо необхідно) шляхом ампліфікації таких послідовностей з об'єкта з використанням праймерів, отриманих з послідовностей, передбачених цим документом, за яким прямує стандартне секвенування ДНК амплікона або клонованої ДНК.
І00101| Наступні приклади включені, щоб продемонструвати приклади деяких кращих варіантів здійснення винаходу. Фахівець у даній галузі техніки повинен зрозуміти методи, розкриті в прикладах, які представляють підходи, які, з досвіду винахідників, функціонують в практиці винаходи, і, таким чином, можуть розглядатися як приклади кращих варіантів для його занять. Втім, фахівці в даній області техніки повинні, в світлі сьогодення опису, зрозуміти, що багато змін можуть бути зроблені в конкретних варіантах реалізації, і при цьому отримати подібний або аналогічний результат без відходу від духу і об'єму винаходу.
ІНФОРМАЦІЯ ПРО ЗБЕРІГАННЯ
І00102| Депонування репрезентативного зразка насіння СіІусіпе тах містить ДНК об'єкта
МОМ87751 було здійснено 28 лютого 2013 відповідно до будапештських договором в американську колекцію культур (АТСС) за адресою 10801 Опімегейу Вошемага, Мапаззав,
Вірджинія США, 7ір Соде 20110, ії отримало номер доступу АТОС РТА-120166. Доступ до депозиту доступний на час розгляду заяви Комісаром патентного відомства і товарних знаків і особами, визначеними комісаром, які мають мати доступ до нього за запитом. Після видачі патенту, всі обмеження щодо доступності для громадськості будуть безповоротно видалені.
Депозит буде зберігатися в депозитарії протягом 30 років, або 5 років після останнього запиту, або протягом ефективного життя патенту, залежно від того, що довше, і буде замінений у міру необхідності протягом цього періоду.
ПРИКЛАД 1 00103) У цьому прикладі описуються трансформації та селекції об'єкта сої МОМ87751.
Експресія чужорідних генів у рослинах, як відомо, схильна до впливу їх хромосомної позиції, можливо через структури хроматину (наприклад, гетерохроматина) або близькості регулюючих транскрипцію елементів (наприклад, енхансера) поблизу сайту вбудовування (Уеїізіпод, 1988). З цієї причини, часто виникає необхідність перевірки великої кількості об'єктів з метою виявлення об'єкта характеризується оптимальною експресією введеного цікавить гена. Наприклад, у рослин та інших організмів спостерігалися великі розбіжності в рівнях експресії введеного гена серед об'єктів. Також можуть бути відмінності в просторових або тимчасових характерах бо експресії, наприклад, відмінності у відносній експресії трансгена в різноманітних тканинах рослин, що може не відповідати очікуваним характерам від транскрипційних регуляторних елементів, присутніх у вбудованому генетичному конструкті. З цих причин, одинадцять різних експресійних векторів були отримані і випробувані в трансформованих рослинах сої під час селекції об'єкта МОМ87751.
І00104| Одинадцять різних експресійних конструктів були трансформовані і випробувані на рослинах. Окремі експресійні конструкти розрізнялися комбінаціями використаних елементів експресії, тобто, енхансер (ЕЕ), промотор (Р), лідер (Г), інтрони (І), хлоропласт-націлений пептид (СТР) ї З "сигнал термінації транскрипції і поліаденілювання (Т). Також сегменти Т-ДНК утримувала дві експресійні касети, що кодують обидва Сгу білка (Сту2АБб і СгтутА.105), або містять одне Сту білок, тобто, Сгу2АбБ або СтутА.105. Подальшим зміною в екпрессійних конструктах з сегментами Т-ДНК, утримувала дві експресійні касети Сгу2АбБ ії СтгутА.105 була відносна орієнтація двох касет, що кодують Сгу білки. Зокрема, дві експресійної касети Сгу білка були або в щодо послідовної орієнтації транскрипції, так що експресія кожного промотора відповідного Стгу білка протікає в однаковому напрямку, але кожен від свого окремого відповідного промотора (див. Фігуру 2), або дві касети були в протилежної орієнтації, так що експресія від кожного промотора двох Сгу білків знаходиться окремо від точки по центру між двох промоторів, тобто, транскрипція кожної експресійної касети відбувається в протилежному напрямку і не сходиться з іншого (див. Фігуру 2). Послідовність ДНК кодує СтуТтА.105 була диверсифікована в конструкти 4, 6, 7,8 9, у порівнянні з конструктами 1 і 3. У ще одному варіанті, у двох конструктах з двома експресійними касетами Сгу орієнтованими у зворотному напрямку транскрипції, енхансери транскрипції були розташовані між розбіжними промоторами (див. Фіг. 2) 00105) Одинадцять експресійних конструктів були трансформовані три окремі рази, за допомогою Адгорасіегішт-опосередкованої трансформації меристематичної тканини сої. Спосіб, який дозволяє створювати трансформовані рослин без використання калюсу був описаний в патенті США Мо 8030544. Коротко, меристематичні тканини були вирізані із зародків пророслого насіння сої АЗ555 (Аздгом/, Сент-Луїс, Міссурі). Конструкт 1 містить два окремих сегмента Т-
ДНК, кожен обмежений прикордонним сегментом Адгобрасіегішт (Т-ДНК сегмент). Перший сегмент Т-ДНК трансформаційного конструкту містить дві експресійної касети, перша
Зо експресійна касета, яка кодує ділянку гена аденілілтрансферази Тп7 від Езспегіспіа соїї (який забезпечує стійкість до спектиноміцину і стрептоміцину; аадА-5РЕ) і використовується для селекції; і друга експресійна касета, яка кодує ділянку гена фосфорілази сахарози від
Адгорасієегічт їшптеїасіеп5 штам С58 (яка каталізує перетворення сахарози в фруктозу і глюкозо-1-фосфат; ЗТКОГгікі) і використовується в якості маркера підрахунку трансформантов.
Другий сегмент Т-ДНК різних трансформаційних конструктів містить або одну експресійну касету, що кодує тільки Сту2АбБ (конструкти 2, 5, 10 або 11), або експресійну касету яка кодує тільки СтгутА.105 (конструкти З або 6); або другий сегмент Т-ДНК різних трансформаційних конструктів містить одну експресійну касету, що кодує Стгу2Ар кодування і одну експресійну касету, що кодує СтуТтА.105 (конструкти 1, 4, 7, 8 або 9) (див. Фігура 2). Через те, що кожен сегмент Т-ДНК трансформаційного конструкту обмежений окремої прикордонної послідовністю
Адгорасіегішт, сегмент Т-ДНК, що містить касети маркера відбору та маркера підрахунку трансформантів може інтегруватися в геном клітин сої на сайт, відмінний від сайту інтеграції сегмента Т-ДНК, кодує експресійні касети Сгу2Ар та / або СтутА.105. Таким чином, об'єкти можуть бути перевірені на наявність сегрегації і втрати послідовностей маркера відбору та маркера підрахунку трансформантов. Всі об'єкти були відібрані на підставі відсутності остова і відсутності послідовностей касет маркера відбору та маркера підрахунку трансформантів. Після ко-культивування з Адгобасіегішт, який містить трансформаційний конструкт, меристеми були розміщені на селективної середовищі, що містить спектиноміцин, карбеніциліна динатрієву сіль, цефотаксиму натрієву сіль, і тикарциліну динатрієву сіль / калію клавуланату суміш для інгібування росту нетрансформованих рослинних клітин і надлишку Адгобасієегішт. Меристеми були після розміщені на середовищах, що сприяють розвитку пагонів і коренів. Укорінені рослини (КО) з нормальними фенотипичними характеристиками були відібрані і переміщені в грунт для зростання та подальшої оцінки. 00106) ЕЄкспресійний конструкт 1, використовуваний, щоб згенерувати об'єкт МОМ87751, що містить сегмент Т-ДНК кодує два різні Сгу білка в 5 'до 3' відносному порядку експресійних елементів рослини (з або без проміжних послідовностей): промотор, лідер і перший інтрон, отриманий від гена Асіїп 2 Агабрідорвзів ІПпаїйапа (Р-АСАсіг2), химерна кодуюча послідовність, що складається з М-кінцевої кодуючої послідовності транзитного білка хлоропласту отриманого від похідних від гена 5-енолпірувілшікімат-3-фосфат синтази арабідопсису (ЕРБР5) злитого в рамці 60 з геном, що кодує Сту2АБ (який кодує білок, який наділяє стійкістю до комах-шкідників) від
ВасшШив ІПигіпдіепзіз (ВО з нуклеотидами модифікованими для рослинної експресії (СТР2-
Сгуг2АБ), в 3' елемент термінації транскрипції і поліаденілювання (3' НТО) отриманим від гена металлотіонен-подібного білка Огула займа (Т.О5МІЙ), проміжні послідовності між першою експресійної касетою Стгу білка і другий експресійною касетою Сгу білка; промотор і лідер, отримані гена малої субодиниці ТА 1,5-бісфосфат карбоксілази арабидопсису (Р-АЇ.Кре54), цей промотор-лідер пов'язаний з химерною кодує послідовністю, що складається з послідовності, що кодує транзитного білка хлоропластів отриманої з отримані гена малої субодиниці ТА 1, 5- бісфосфат карбоксілази арабидопсису (СТРІ), яка також містить послідовність, що кодує кодирующую повтор сайту розщеплення транзитного білка і З амінокислоти від зрілого білка злиті у рамці з геном, що кодує СгутА.105 (який кодує білок, який наділяє стійкістю до комах- шкідників), складається з сегментів генів, що кодують СтутАбБІ1 (домени І і ІІ), СтуїРа1 (домен ЇЇ), і СтулАс1 (домен протоксін) від Васійи5 (Пигіпдіепзіз (ВО з нуклеотидами модифікованими для рослинної експресії, З "НТО (Т-МЕРИ), отриману від гена фосфат-траспортеру 1 Медісадо їгипсаїша. У експресійної касети конструкту 1 касета Т-ДНК, що містить дві окремі Сту2АБ і
СтулА.105 експресійної касети має праву кордон з довільно призначеним 5 "кінцем від
Адгорасіегішт, який знаходиться в 5' до касеті Стуг2АрБ; і ліву кордон з довільно призначеним 3' кінцем від Адгобасіегішт, який знаходиться в 3' до касеті СтутлА.105. Сту2АБ касета (промотор через термінатор) знаходиться в позиції 123-3785 в 5ЕО ІО Ме: 9, ії СтутА.105 касета (промотор через термінатор) знаходиться в позиції 3831-9754 в БЕО ІЮ Мо: 9.
І00107| Касета Т-ДНК для конструкту 2 (Сгуг2АБ) і для конструкту З - (СтутА.105) містить одиничні касети, що кодують Сгу білок з тими ж елементами для відповідних Сгу білок кодуючих генів, використовуваних у конструкті 1, див. Фігуру 2.
І00108| Конструкти 4, 5 і б були подібні в орієнтації елементів конструктам 1, 2 і 3, відповідно, але з різними промоторами-лідерами-интронами і транзитним білком хлоропласту для касет Стгуг2АБ і СтутА.105. Термінатори для відповідних касет Сту білка (Сгу2АБ з Т-О5.МІй, або СтутА.105 з Т-МЕ.РИ) були однакові у всіх експресійних конструктах з 1 по 11 (див. Фігуру 2).
І00109| Промотор-лідер-інтрон і транзитний білок хлоропласту, що кодує послідовність Стгу білка і термінатор використовувані для обох касет Стуг2АБ і СтутА.105 в кожному з конструктів 7- 11 були ідентичні використаним в конструкти 4, 5 і 6. Втім, для конструктів 7, 8 і 9 орієнтація
Зо касети Сту2АБр і касети СтгутА.105 була інвертованою або зворотної відносно один одного і орієнтація транскрипції була в протилежних напрямках, кожна від своїх відповідних промоторів, див. Фігуру 2. Конструкти 7, 8 і 9 відрізнялися відсутністю (конструкт 7) енхансера між двома касетами, або наявністю енхансера; конструкт 8 з енхансером 1 (Е1), або конструкт 9 з енхансером 2 (Е2), див. Фігуру 2. Конструкт 10 ї конструкт11 мали єдину касету Сту2АБ з Е1 (конструкт 10) або Е2 (конструкт 11). 00110) Після перетворення, та переміщення об'єктів (КО) в грунт, обширні молекулярні, агрономічні і фенотипічні аналізи був проведені, щоб вибрати об'єкти для подальшого тестування. Крім того, об'єкти були самозапилені і отримані насіння від обраного об'єкта були використані для польових і додаткових молекулярних випробувань.
ІЇ00111| Молекулярні дослідження включають наступні: аналізи для визначення кількості копій, аналізи для визначення цілісності обох експресійних касет, які містять Стгу білок (конструкти 1, 4, 7, 8 і 9), присутність Т-ДНК касети, що кодує Сгу білок (одинична експресійної касета Сгу білка (конструкти 2, 3, 6, 10 або 11) або двох експресійних касет Сгу білка (конструкти 1, 4, 7, 8 або 9)); аналізи для визначення експресії білка, вимірюваного ІФА, і аналізи, щоб визначити коефіцієнт сегрегації Т-ДНК експресійної касети (1: 2: 1 або 1: 3). Агрономічні аналізи включають (для об'єктів КО створених з конструктів 1, 2 і 3, ефективність комах на досвіді на листовому диску для двох видів комах-шкідників (Апіїсагзіа деттаїйаїї5 (гусениця оксамитових бобів, МВС) і Спгузодеїхі5 іпсіцдеп5 (металовідка соєва, 5ВІ)). КО рослини вирощували до зрілості, об'єкта були самоопиліться, і був визначений набір насіння стартового набору для кожного об'єкта. 001121 Кількість об'єктів КО, що виникли при трансформації з 11 окремими конструктами і перенесених у грунт варіювало в межах від 420 об'єктів до більш, ніж 5000 об'єктів (див.
Таблицю 1). Для трансформації за допомогою конструкту 1, з якого був згенерований об'єкт
МОМ87751, налічувалося в цілому 1102 КО рослин, вкорінених у грунті, з яких тільки 281 від пройшли первинний молекулярний аналіз. Додаткові молекулярні, агрономічні і фенотипічні аналізи цих 281 об'єктів, які були створені шляхом трансформації з конструктом 1 забезпечили лише 29 КІ об'єктів оцінених для додаткових тепличних дослідів.
Таблиця 1
КО об'єкти, отримані з одинадцяти трансформованих конструктів із зазначенням кількості об'єктів, перенесених в грунт і кількості об'єктів минулих аналіз на кількість копій. о0оконотул | Жобоптівтеронееникуттт й
Конструкт Ж об'єктів, перенесених у грунт с. що кількість копій 00113) Для 29 об'єктів К1, створених в результаті трансформації за допомогою конструкту 1 і оцінених для подальшого аналізу, К1 насіння було посаджено в теплиці для аналізу об'єкта К1 аналізи, що включають: (а) схожість КІ! (100 95 схожість); (Б) ідентифікацію гомозиготних рослин; (с) підтвердження за допомогою аналізу ПЛР, що гомозиготні рослини містять послідовність маркера відбору та маркера підрахунку трансформантів (вона сегрегується незалежно); (а) ефективність комах обумовлена біотестуванням за допомогою листових дисків для С. іпсіндеп5 (ЗВІ); і (є) ефективність комах обумовлена біотестуванням за допомогою листових дисків для Зродоріега їгидірегаа (кукурудзяна листова совка, РАМ), (І) аналіз експресії білка в тканинах листа за допомогою ІФА на етапі М7, поліпшення об'єктів з рівнем білків Сту2АБ і СтулА.105 понад » 4 м.ч. На додаток до результатів молекулярного аналізу і біотестуванню за допомогою листових дисків, були проведені агрономічні фенотипічні спостереження і набір насіння з чотирьох відборів/об'єктів були зібрані. Виходячи із сукупності цих даних, К2 насіння від 21 об'єкта К1, створені шляхом трансформації з конструктом 1 оцінювалися в агрономічних польових випробуваннях і тепличних випробуваннях.
ПРИКЛАД 2
І00114| Агрономічні польові випробування були розроблені для оцінки фенотипічних характеристик і врожайності об'єктів сої що експресують Стгу2АБ і СтутА.105 в порівнянні з контролем, АЗ555 (батьківські фоновий контроль). У цих агрономічних польових випробуваннях, контролі і об'єкти були сортом сої АЗ555, з відносною групою зрілості З (КМ3). Для дослідження використовували рандомізований блоковий дизайн (ЕСВО) протягом 4 сезонів і в двох географічних локаціях. В одній географічній локації агрономічні польові випробування були проведені в 25 місцях в кожному сезоні, а в другій географічної локації агрономічні польові випробування були проведені в 14 місцях в кожному сезоні. Стандартні агрономічні методи використовувалася в посадці і зборі даних для всіх випробувань. Зібрані дані включали рейтинг проростання, енергійність проростків, дату цвітіння, спостереження забарвлення квітки, спостереження фенотип, колір опушення, зрілість, вилягання, висоту рослин, підрахунок осипання насіння, дату врожаю, вага насіння / ділянку, вологість насіння / ділянку, і врожай у
Зо бушлях на акр (бушель / акр). 00115) Для аналізу даних, деякі локації були відкинуті через передзбиральні проблем якості (, тобто стоячої води, недостатній вологості грунту, слабкою схожості, в кінці сезону розтріскування стручків через град), або деякі локації були відкинуті з -за коефіцієнта варіації (СМ) вище 15 95 та/або високого індексу якості локації (ГО). 00116) У всіх протестованих місцях, проведені зміни фенотипу свідчили, що агрономічні рейтинги для об'єктів були в межах нормального діапазону контролю, АЗ555. Не всі обстеження були взяті на всіх сайтах і деякі дані, наприклад проростання, можливо, були зібрані, але урожай був не визначений, тому що місце було залишено за проблем, які виникли після збирання ранніх фенотипічних даних.
І00117| Для агрономічних польових випробувань, число об'єктів, створених конструктами 1, 2, 3, 4, 5 або 6 і протестованих в кожному польовому випробуванні в двох географічних місцях, і тести поколінь об'єкта сої (тобто КЗ, К4, К5, Кб або К7) представлені в таблиці 2.
Таблиця 2
Кількість об'єктів (і покоління об'єкта сої) випробуваних на конструкт протягом двох сезонів і в двох географічних місцях агрономічних польових випробувань (н.п. означає не перевірялася). 11111111. | Сезон /місце2 | Сезон ї/місцеї | Сезоно/місце2 | Сезон 2/місце 1 о Конструєт4 | нл./// 1777 9083) | ни 1777777 нл. о Конструєт5ї | - нл.// 177 3083) | 7 нл 17777177 ня.
Конструктб.ї | нл.///// | 3083) | ни | 7 нл. 00118) Мета-аналіз економічних польових випробувань для об'єктів випробуваних протягом кожного сезону, в кожному географічному місці, і аналіз середньої врожайності по кожному полю (бушель/акр) показали, що існує статистично значуще збільшення врожаю для об'єкта
МОМ87751 порівняно з контролем АЗ555 (Таблиця 2). Об'єкти, які експресують тільки Сту2АБ не мали статистично значущих відмінностей у врожайності в порівнянні з контролем АЗ555, див.
Таблицю 3. Об'єкти, експресують тільки СтутА.105 мали статистично достовірне зниження врожайності в порівнянні з контролем АЗ555, див. Таблицю 3.
Таблиця З
Мета-аналіз економічних польових випробувань для об'єктів випробуваних протягом кожного сезону, в кожному географічному місці, і аналіз середньої врожайності по кожному полю в порівнянні з нетрансгенною лінією сої АЗ555.
Середній ' врожай | Оєй | РЕК | Значен | 1500 | 1501
Конструкт ЦГ Об'єкт (бушель/ а с ня Р 5 0 акр)
Конструкт 1|СтугАр-СтутА.105| МОМ87751 | 6816 )|1,83 2,76 | 000 | 117 | 0,98 11111118 | 6488 |-145) 219) 002 | 17 | 098 17777177 1 ло | 6659 026039 | 066 | 117 | 0,98
Конструкт З СтутАлЛоб5 | 29 | 6406 |-227| 342| 000 | 117 | 0,98 11111111 АзБ5 | 6бб33 | | | / /
ПРИКЛАД З
І00119| Тепличні випробування ефективності були проведені, щоб оцінити ефективність експериментальних об'єктів сої, експресують обидва Сгу білка з вбудованого сегмента Т-ДНК з одного конструкту з двома експресійної касетами (тобто, як Сгу2АбБ, так і СтутА.105), або одиничний Стгу білок (тобто, тільки Сту2АБб, або тільки СтутА.105) проти штучної спалаху чисельності популяції лускокрилих комах-шкідників, що містяться у вольєрах теплиць.
Порівняння одне- до дво- генних об'єктів було використано для визначення відносного внеску кожного окремого Сту білка по відношенню до ефективності спостережуваної в конструкті об'єкта з експресією двох генів. Тепличні випробування проводилися протягом декількох сезонів у двох географічних місцях. В одному географічному місці були випробувані 5 цільових видів шкідників: Апіїсагзіа дептітаїйарйв (гусениця оксамитових бобів, МВС), СПгузодеїхіб іпсійдепе5 (металовидка соєва, З5ВІ), Зродорієга егідапіа (південна совка, БАММ), Зродоріега Іпидірегда (кукурудзяна листова совка, БАМУ), і Неїїсомегра 7еа (гусениця совки бавовняної, ЗРУМ).. У другому географічному місці були випробувані З цільових види шкідників: Стосідозета арогета (моль пагонів квасолі, В5М), Каспіріизіа пи (п'ядун соняшниковий, 5РЇ) і зродоріега їтидірегаа (кукурудзяна листова совка, ЕАММ). 00120) Трансформаційні об'єкти, отримані від конструктів 1, 2 або 3, були оцінені в поколінні
К2 в тепличних дослідах і включали двадцять об'єктів експресуючих обидва білки (об'єкти,
Зо отримані в результаті трансформації за допомогою конструкту 1), шість об'єктів експресуючих тільки Сту2АбБ (об'єкти, створені в результаті трансформації за допомогою конструкту 2), і шість об'єктів експресуючих тільки СтутА.105 (об'єкти, створені в результаті трансформації за допомогою конструкту 3). З них 12 об'єктів з обома СгугАБб і СтутА.105 (конструкт 1), два об'єкта тільки з Стгу2АбБ (конструкт 2), і три об'єкти тільки з СтуТтА.105 (конструкт 3) були оцінені в КЗ поколінні в тепличних дослідах. Одинадцять об'єктів з обома Стуг2АбБ їі СтутА.105 (конструкт 1) були надалі оцінені в К4 поколінні в тепличному досвіді. Три об'єкти з обома Стуг2АБ і СтутА.105 (конструкт 1), один об'єкт тільки з Сту2Ар (конструкт 2), і один об'єкт тільки з СтутА.105 (конструкт 3) були оцінені в К5, Кб і К7 в тепличних дослідах. Десять об'єктів експресуючих
СтгугАБ і СтутА.105 (об'єкти створені в результаті трансформацій за допомогою конструкту 4), три об'єкта тільки з Сту2АБ (об'єкти створені в результаті трансформацій за допомогою конструкту 5), і три об'єкти тільки з СгутА.105 (об'єкти створені в результаті трансформацій за допомогою конструкту 6) були оцінені в КЗ поколінні в тепличних дослідах. Два об'єкти з обома
СтгугАБ і СтутА.105, один об'єкт тільки з СтугАБ, і один об'єкт тільки з СтуТтА.105 були оцінені в
К4 в тепличних дослідах, і один об'єкт кожного оцінювався в К5 в тепличних дослідах. Три об'єкти експресуючих обидва Стгуг2АБ і СтутА.105 в протилежній 5 "до 3' орієнтації з енхансером (об'єкти, сконструйовані в результаті трансформації за допомогою конструкту 8), З спільних об'єкта експресуючих обидва СгугАБ і СтгутА.105 в протилежній 5 ''до 3' орієнтації без енхансера (об'єкти, сконструйовані в результаті трансформації за допомогою конструкту 7), і 2 об'єкта тільки з Сту2АБ (об'єкти, сконструйовані в результаті трансформації за допомогою конструкту 10) були оцінені в К2 поколінні в тепличних дослідах. Позитивний трансгенний контроль сої включав МОМ87701 або об'єкт ОМ А19478 (створені одночасно МОМ87701), і обидва експресують Сту1Ас. Нетрансгенні лінії сої АЗ555 (батьківський фон для об'єктів МОМ87 751, відносна зрілість З (КМ3)) ії АБ5547 (батьківський фон для МОМ87701 і ЗМ А19478, КМ5) були включені у всі тепличні та польові досліди в якості негативного контролю. Нетрансгенна лінія сої
АС3705 була включена у вигляді перевірки на білу квітку в ряді дослідів.
І00121| При створенні та проведенні тепличних дослідів використовувалися стандартні методи. Ділянки оцінювалися один раз після кожного зараження в момент максимального пошкодження в порівнянні з контролем (зазвичай через 3-4 тижні після приміщення лялечок в теплицю).При кожній оцінці, фіксувались такі агрономічні спостереження: дата і стадія росту рослини. Крім того, для дефоліїруючих комах записувався розрахунковий відсоток дефолиації на кожній дільниці. Для С. арогета випадковим чином були обрані десять рослин на кожній ділянці і було записано число рослин з пошкодженням. У деяких випадках число живих личинок були також записано.
І00122| Дані дефолиації були піддані дисперсійному аналізу для визначення значущих джерел варіабельності серед лінії і повторності для кожного комахи в кожному місці при 0,05 рівні ймовірності (Р). Суттєві відмінності між середніми значеннями визначалася з використанням тесту Тьюки-Крамера (Кгатег 1956) при Р-0,05. 00123) Три дрібноділяночних тепличних досліди були проведені в другому географічному розташуванні протягом одного сезону з використанням К. пи і С. арогета для ураження. Дизайн дослідження включав рандомізований блоковий дизайн (КОВО) випробувальних блоків з трьох повторних на об'єкт або контроль, з протестованими об'єктами наведеними в таблиці 4. В одному досліді зараження здійснювалося С. арогета в середині вегетативної стадії росту сої їі знову в ранній репродуктивний період росту сої. У двох дослідах зараження здійснювалося Кк. пи в середині вегетативної стадії росту сої. 00124) Для дослідів з С. арогета був досягнутий дуже сильний вплив. Повторення не було значущим джерелом мінливості у поразці (Е-0,8794; аг2, 69; Р-0.4196), але об'єкт був дуже значним (Е-11,9398; аг23, 48; Р «0,0001). Максимальний відсоток пошкоджених рослин (табл. 4) нарахував 83-100 95 в негативному контролі, але був відсутній у позитивному контролі
Сту1Ас. Об'єкти, створені в результаті трансформації конструктом 1 і експресують Сгуг2АБб і
СтулА.105 демонстрували 0-13 96 пошкоджених рослин, а у тих, які експресують тільки Сту2АБ або тільки СтуТтА.105 демонстрували 10-17 95 ії 10-13 95 відповідно. Невелике, але значне число рослин позначених пошкоджені в цьому досвіді можуть зустрічатися через критеріїв, які використовуються фізичними особами при записі в ступеня пошкодження. 00125) Для дослідів з ЮК. пи, в одному тепличному досвіді було досягнуто сильну дію.
Повторення не було значущим джерелом мінливості при дефоліації (Б-0,203; аг2, 69;
Р-0,8167), але об'єкт був досить значним (Б-20,2461; аг23, 48; р «0,0001). Максимальна дефоліація (табл. 4) в середньому 60-63 95 спостерігалася в негативному контролі, але була відсутня в СтгутАс позитивного контролі і у об'єктів, створених в результаті трансформації конструктом 1, експресуються Сгту2АБяеСтутА.105 або об'єктів, створених в результаті трансформації конструктом 2, експресуються тільки Сту2АБр. Об'єкти, створені в результаті трансформації конструктом З експресують тільки СтгутА.105 демонстрували трохи більшу бо дефоліацію (4-10 95). Помірно сильний тиск було досягнуто в другому тепличному досліді з
Е.пи. Повторення не було значущим джерелом мінливості при дефоліації в кожному досвіді (Е-0,2542; аге-2, 69; Р - 0,7763), але об'єкт був досить значним (Е-16,1793; аг-23, 48; р «0,0001).
Максимальний ступінь дефоліації (табл. 4) в середньому 38-40 95 спостерігалася в негативному контролі, але була незначною в СтгуїАс позитивному контролі (4 95), але була відсутня в об'єктах створених з конструктом 1 і експресують Сгу2АбБеСтутА.105 або об'єктів, створених з конструктом 2 і експресують тільки Сту2АБ. Об'єкти, створені за за допомогою конструкту З і експресують тільки СтгутА.105 демонстрували трохи більшу дефоліацію (2-7 95).
Ї00126| У цих тепличних дослідах, об'єкт сої МОМ87751 демонстрували неушкоджені рослини при інвазії комах-шкідників, С. арогета або К. пи, яке було значним у порівнянні зі збитком та/або дефоліацію в контрольній групі в цьому ж досвіді (Таблиця 4).
Таблиця 4
Пошкодження від С. арогета і дефоліація від личинки В. пи для об'єктів, створених за допомогою конструкту 1, 2 або З і оцінених у штучно заражених теплицях. о Пошкоджених
Конструкт ЦГ Об'єкт рослин до Дефоліації (максимум за сезон) (максимум за сезон)
МИ ПО МОЯ Пе ПОСТИ арогета
ПИ ПИ ПНЯ ПОЛОН Б ЛИ ПВ дослід 1 дослід 2 77777111. | Сулас |ОМ АТЯ459| 050 |р6/| 050 || 37500 | рс
Конструкт!(СтугАрСтутА.т05| 2 | 6,7-6,7 |р| 050 || 050 | с 1111131 1о5о0 |16| 050 || о | сі 11111141 13333 (6. 050 || о | сі 11111111 рмоме7751| 050 |6| 050 || о | с 11111171 6767 |16| 050 || о | сі 11111118 111 133:6,8 (16. 050 || о | сі 11111911 335333 (6, 050 || о | сі 11111110 | 133:607 |6| 050 || о | сі 111111 335333 (6. 050 || о | сі 11111114 167607 |16| 050 || о | сі 11111118 | 33:68 (6. 050 || о | сі 17111119 | 133:83,8 |6| 050 || о | сі
Конструкт2| Сугар | 20 | 100-100 |р6/| 050 | 03500 | с 1711111111111111122 | 167533 |6| 050 || о | сі
Конструкт3| Стутіло5 | 29 | 1005100 |р| 100501 | са 53:00 | рес 111111111111130 | 33:68 | 6 60 | са 20500 | с 11111131 1100558 | 6 37500 | а | 700 | ре 117111. | Негативний | АЗББ5 | 83,33416,7 |а)| 633500 | а / 3830 | а 11111111 АБбЯ? | 10030 |а)| 600200 | а | 400501 | а
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05).
І00127| У подальшому сезоні в дрібноделянкових тепличних дослідах, проведених у другому географічному місці, для ураження були використані місцеві лабораторні популяції К. пи, С. арогета і 5. їпидірегда. Протоколи для проведення досліджень були переважно подібні описаним вище, і з тестованими об'єктами і контролем представленими в таблиці 5. 00128) У досліді з ураженням С. ароїета було досягнуто сильну дію. Повторення не було значущим джерелом мінливості у поразці (Е-0,2742; аг-2, 33; Р - 0,7619), але об'єкт був досить значним (Б-8,2313; аг11, 24; Р «0, 0001).Максимальна поразку становило 4,2-5,5 очок пошкодження на рослину в негативному контролі, 800-100 95 рослин демонстрували пошкодження, але був незначним в позитивному контролі і у всіх тестових об'єктах (Таблиця 5). 00129) У досліді з ураженням К. пи, було досягнуто помірно сильну дію. Повторення не було значущим джерелом мінливості у поразці (Е-0,041; аг-2, 33; Р - 0,9599), але об'єкт був досить значним (Е-143,5526; аг-11, 24; Р «0,0001). Максимальне поразку становило 33,3-40,0 95 дефоліації в негативному контролі (значно вище економічного порогу шкодочинності), але було відсутнє або пренебрежимо мало в позитивному контролі і у всі тестові об'єкти, за винятком об'єктів, створених в результаті трансформації з конструктом 6, експресуються тільки ТІС105 (Таблиця 5). 001301 У досліді з ураженням 5. Ітидірегаа, була досягнута легке вплив. Повторення не було значущим джерелом мінливості у поразці (Е-0,1187; аг-2, 33; Р - 0,8884), але об'єкт був дуже значним (Б-12,8602; аг11, 24; Р «0, 0001). Максимальне поразку становило 7,5-15,0 95 дефоліації в негативному контролі - тільки досягнувши економічного порогу шкодочинності.
Деякий збиток був також відзначений в об'єктах, що експресують тільки Сту2Ар створених шляхом трансформації або конструктом 2 або конструктом 5, але збиток був незначним або відсутній в позитивному контролі і у всіх інших тестових об'єктах (Таблиця 5).
Ї00131| У цих тепличних дослідах, об'єкт сої МОМ87751 демонстрували неушкоджені рослини при ураженні комахами-шкідниками, С. арогета, К. пи, 5. їгидірегаа яке було значним у порівнянні з пошкодженням негативного контролю в тому ж досвіді (Таблиця 5).Об'єкт сої
МОМ87751 отримав значно менше збитку від К. пи в порівнянні з трансгенними об'єктами сої, створеними в результаті трансформації за допомогою конструкту б експресують тільки
СтулА.105 (Таблиця 5), хоча слід зазначити, що існує зниження експресії білка СтгутА.105 в об'єктах, створених трансформацією за допомогою конструкту 6. Ці результати також свідчать про вперше розширеному спектрі контролю комахи-шкідника 5. їгидірегаа.
Таблиця 5
Максимальне пошкодження С. ароїєта означає відсоток дефолиації від личинок В. пи і 5. тидірегаа при оцінці об'єктів, створених за допомогою конструктів 1,2,3,4,5або6б в порівнюванні з позитивним і негативним контролем в штучно заражених теплицях. 01777111 цг1111 | Об'єкт | Максимум пошкодження ?(середнеж ЗЕ.) 11111111 Сарошта! | Ап? | 5. тидіреаг? поз | Сугдйс фо МоАТО459, 0:30 |В 050 || 08508 ВС (Конструкт1| СтугАрСтутА.105 | МОМ87751 0:30 |В 050 |0| ою сС 1111 11181111оз3о |в о |0| ою сі 11111110 11030 |в 0 |0| ою с (Конструкт2| Сугаь | 20 03:03 |В 050 || 17508 ВС (Конструкт3| СтутАло5 | 29 / 0:10 |В 08508 |0| ою сС (Конструкт4| СтугАрСтутА1о5 | 32 0:30 |В 050 |0| ою сС 11111140 оизом |в 050 |0| ою с (Конструкт5| Сугар | 46 | 0:30 |В 20515 | 0 | 652 ВС (Конструктб| Сутало5 | 42 | 0:30 |В 133) СІ ою сі о НЕС | Негативний | АЗББ5 | 55322 | А | 333233 | В | 15,052,9 А 11111111 АББЯ? | 425303 | А | 400300 | А| 75:25 |В
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05) 1.Середня кількість очок пошкоджень / рослину. 2. Середній відсоток дефоліації 00132) Один дрібноділянковий тепличний досвід було проведено в першому географічному місці, з використанням лабораторної популяції Н. 7еа для ураження. Дизайн дослідження включав рандомізований блоковий дизайн (КСВ) випробувальних блоків з трьох повторних на об'єкти і контролі, з протестованими об'єктами наведеними в таблиці б. Проводилось дві поразки Н. 7єа і дефоліація оцінювалася через 19-27 днів після поразки (К2-КЗ стадії росту сої) для першої поразки, і через 25-28 днів після поразки (К5 стадія зростання сої) для другої поразки. Результати тепличних дослідів комахи-шкідника, Н. 76еа були наступними: було
Зо досягнуто помірно сильну дію. Повторення не було значущим джерелом мінливості при дефоліації (Е-0,326; аг-2, 105; Р - 0,7225), але об'єкт був досить значним (Е-13,8864; аф - 35, 72; Р «0,0001). Максимальний ступінь дефоліації (табл. 6) в середньому 32-33 95 спостерігалася в негативному контролі, але була незначним в СтутАс позитивному контролі (1 90) і у об'єктів, створених за допомогою конструкту 1 і експресують Сту2Ар-СтгутА.105 (2-4 95). Трохи більш висока дефоліація спостерігалася у об'єктів, створених за допомогою конструкту 4, що зкспресують Сту2Ар-Сту1тА.105 (5-12 95), об'єктів, створених за допомогою конструкту 5, що експресують тільки Сту2АБ (13-17 95) або об'єктів, створених за допомогою конструкту 6, що експресують тільки СтутА.105 (8-12 95).
ІЇ00133| Об'єкт сої МОМ87751 демонстрував значно менше пошкоджень від Н. 76а в тепличному досвіді в порівнянні з ушкодженнями в негативному контролі в цьому ж досвіді.
Даний рівень контролю від Н. 7еа знаходиться в межах прийнятного комерційного рівня контролю для цих видів шкідників сої. Крім того, в цьому тепличному досвіді, об'єкт сої
МОМ87751 отримав значно менший шкоди в порівнянні з трансгенними об'єктами сої, створеними за допомогою оконструкту 5, експресуючими тільки Сгту2АБ (Таблиця б), демонструючи розширений рівень контролю. Однак, експресія Сту2АбБ в об'єктах створених за допомогою конструкту 5 нижче, ніж в об'єктах, створених за допомогою конструкту 2, і значна дефоліація об'єктів, створених за допомогою конструкту 5 що експресують тільки Сту2Аб може означати, що може існувати знижена ефективність відносно Н. 7еа по Стуг2АБ у створених за допомогою конструкту 5
Таблиця 6
Максимум сезонної дефоліації для об'єктів, створених за допомогою конструктора 1, 4, 5 або 6 від личинок Н. 2єа в тепличному досвіді зі штучним зараженням при порівнянні з позитивним і негативним контролем сезон) 11111111 нсва7 11101171 СуїАс 0171 ОМА | тою | є 81111120 | дв 14111111 2703 | сое 11111111 моМме7?б! | 43507 | сое нІ?нИККНИВОВВВВВ ЛИ В И г 911111112овою | бе юс 23о3 | б 111113 | сое 11111111 33509 | о сое в 37о | сое
ОП 111ля111111123о3 | б 83111111 50500 | сое 11118я4111171111тоюмо | сае 18611117 | се 11113611 87507 | сае 811111 | осде 11381111 87о | сае 11139111 93ж07 | се м 1117ли5 | се 11111111 93ж07 | сае 3111111 | осде 14411111 75 | сде 11114611 б | 6 4111111 латяз | рсй 11111110, Негативний, 0/7 АЗОВ | 333367 | а и 1111 АБ? | зі | а '"
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05). (00134) В іншому сезоні в дрібноділянкових тепличних дослідах, проведених у першому географічному місці, була випробувана стійкість до ураження місцевими лабораторними популяціями 5. егідапіа (перша стадія або третіх стадія), А. деттаїйаїїх (перша стадія), і С. іпсіцдеп5 (перший-стадія). Результатами цих дослідів є наступне: було досягнуто екстремальні вплив при першій стадії 5. егідапіа, і помірне вплив було досягнуто від А. детітпаїаїї5.
Максимальний відсоток дефоліації (середнє х ЗЕ) від личинок А. деттаїйаїй5 (перша стадія) і 5. егідапіа (перший-стадія) представлений в таблиці 7.
Таблиця 7
Максимальний відсоток дефоліації об'єктів створених за допомогою конструктора 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, і 10 від личинок А. детітпаїаїї5 (перша стадія) і С. егідапіа (перший-стадія) і від личинок Н. 7ва в тепличному досвіді зі штучним зараженням порівняно позитивним і негативним контролем 77717171 Обєкт | (ЦО |Максимальний 95 дефоліації (середнє х 5.Е.) 11111111 А оєттатаів | | Б.епдапа поз |ОМАТХВ| Судс | 050 |вВ| | 650565 | А о Конструкті! | МОМ87751 | СтугАр-СтутА.105 | 0,5:503 |В| | 385 | ВС 17701771 03:503 |в) | 18503 | С о Констрзукт2| 20 2 | Сугаь | 03:03 |в| | зз3-о | ВС о Конструкт3| 29 | СтутАЛО5Є | 05:03 |В | 5255633 | А (Конструкт4| 40 | СугАреСтутАлЛоб | 050 |В) | 163213 | ВС о Конструкт5| 46 | Сугаь | ї5:12 |В| | 150329 | ВС о Конструктб| 42 | СтутАЛО5 | 05:03 |В| | 5000500 | А (Конструкт8 | 48 |еСтугарСтуталоб5| 18:03 |В| | 28:08 | ВС 17711749 77777717 о50 |в/| | 18503 | С 11501171 |11лохо4 |в) | 23509 | вс о Конструкт7| 51 | СтугАрСтутАлЛо5 | 0,5:505 |В | 5255118 | А 15277111 11лохо4 |в) | 225325 | В 17775571 о50 |в) | 13,8:324 | ВС
Конструкт10!Ї 54 | еСугаь | 05:05 |В| | 25:09 | ВС 17711855. | юЮщК | 050 |в| | 35509 | вс о НЕС | АЗБББ | Негативний | 35,8:380 |А| | 58,8530 | А 11111111 1 АББЯ | 77777777 | 35514 (А | 450565 | А
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05). 00135) У дослідах з С. іпсіцде5 (перша стадія) і 5. егідапіа (третій стадія), було досягнуто екстремальний вплив для обох комах-шкідників. Максимальний відсоток дефоліації (середнє ж
ЗЕ) від личинок С. іпсішдеп5 (перший-стадія) і личинок 5. егідапіа (третій стадія) в тепличному досвіді зі штучним зараженням представлений в таблиці 8.
Таблиця 8
Максимальний відсоток дефоліації (середнє х 5Е) від личинок б. іпсійадез (третій стадія) і личинок 5. егтідапіа (третій стадія) в тепличному досвіді зі штучним зараженням об'єктів створених за допомогою конструктів 1, 2, 3, 4,5,6, 7, 8 і 10 у порівнянні з позитивним і негативним контролем. конструкт 5.Е.) 11111111 01 Соіпсішбєпв | | Б.епдапа. З 1. по3 01 ОМ оАТЯХ78 | Сус | 10507 |С| |788н13| А о Конструкт! | МОМ87751 СтугАріСтутАло5| 05503 |СІ| |їз8З о 11011111 о50 |СІ |з о о Конструєт2ї | 20 | Суга | 08:05 |С| | 138324. 0 о Конструєт3ї 7777029 | СУТАЛО5 | 35516 |С| |8253448|ЙДГ А о Конструкт4 040 СтугараСтутАлову 3310 |С| | 363255 В
Конструєт5 | 46 | Сугаь | 48-10 |С| | 300346) ВС
Таблиця 8
Максимальний відсоток дефоліації (середнє х 5Е) від личинок б. іпсійадез (третій стадія) і личинок 5. егтідапіа (третій стадія) в тепличному досвіді зі штучним зараженням об'єктів створених за допомогою конструктів 1, 2, 3, 4,5,6, 7, 8 і 10 у порівнянні з позитивним і негативним контролем. конструкт я 5.Е. Конструєтбї | 42 | СУТАЛОБ | 98-10 |С| |800346| А о Конструкт8ї 048 еСтугАбеСтутАлоБ| 03503 |С| 125325 0 11117149 103503 |С| | зви о 15011111 роми |сСІ| |л1433081 о о Конструкт7 | 51 СугаАраСтутАлоб| 400368 || | 733333 ЩД А 15211111 рома |С| 350329 В 11115311 р авно |сС| | 388343 В о Конструкт10ї | 54 177 ебугаь | 08:05 |С| 150320 СО 11111851 105503 |С| | 25 о 11111 НЕС 1711 АЗБО5 0/0 Негативний | 769553 |А| 794320 ГА 11111111 АББА | 65004 |А| |825325| А
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05).
ІЇ00136| Результати цих тепличних дослідів показують, що об'єкт сої МОМ87751 демонстрували значно менше пошкоджень від 5. егідапіа (перша стадія або третіх стадія), А. деттаїаїїб (перша стадія), або С. іпсіцдеп5 (1-ша стадія) при порівнянні з ушкодженнями в негативному контролі в тому ж досвіді (Таблиця 7 і Таблиця 8). Крім того, в цих тепличних дослідах, об'єкт сої
МОМ87751 отримав значно менше пошкоджень від личинки С. егідапіа (перша стадія і третя стадія) порівняно з трансгенними об'єктами сої, що експресують СтгуїАс (Таблиця 7 і Таблиця 8), демонструючи розширену активність об'єкта МОМ87751 в порівнянні з трансгенним об'єктом сої доступним в даний час для контролю лускокрилих шкідників. Далі, в цих тепличних дослідах, об'єкт сої МОМ87751 отримав значно менше пошкоджень від личинки С. егідапіа в порівнянні з
ПІ будь-яким з об'єктів, створених за допомогою конструктів 4, 5 або 6 (третій-стадія розвитку личинки), або об'єктів, створених за допомогою конструкту 6, що експресують тільки СтгутА.105 об'єкт першого стадія розвитку личинки), або об'єктів, створених за допомогою конструкту 3, що експресують тільки СгутА.105 об'єкт (перший стадія розвитку личинки і третій-стадія розвитку личинок) і І2| при порівнянні об'єктів, створених за допомогою конструкту 7, що експресують
Сту2АБ і СтутА.105 без енхансеру (перший-стадія і третя-стадія розвитку личинки), що демонструють чудову продуктивність об'єкта МОМ87751 в порівнянні з об'єктами, створеними за допомогою конструктів 4, 5, 6 або 7 (Таблиця 7 і Таблиця 8).
ПРИКЛАД 4
І00137| Відкриті польові досліди ефективності проводилися для оцінки ефективності експериментального об'єкта сої МОМ87751 і об'єктів, створених за допомогою різних трансформаційних конструктів 1, 2, 3, 4, 5 і 6, проти природної польовий спалахи чисельності лускокрилих шкідників. Порівняння об'єктів, створених за допомогою конструктів 2 або 5 (експресія тільки Сту2АБ), і об'єктів, створених за допомогою конструктів З або 6 (експресія тільки СтуТтА.105), з об'єктами, створеними за допомогою конструктів 1 або 4 (експресія і
СтгутАБ, і СтгутА.105) було використано для визначення відносного внеску кожного окремого Стгу білка (тобто тільки Стуг2Аб, або тільки СтгутА.105) до ефективності зазначеної в об'єктах, що експресують обидва Сгу білки (тобто, Сту2АБ і СтутА.105) з одного конструкту. Польові досліди
Зо ефективності аборигенних популяцій ендемічних шкідників сої проводилися протягом декількох сезонів, в кількох місцях проведення польових дослідів, і в трьох географічних місцях. 00138) У початкових польових дослідах ефективності проведених в одному географічному місці, оцінювані об'єкти (т. Е., Вихідні) включали дванадцятій об'єктів, створених за допомогою конструкту 1 і експресують обидва Сгу білка, Сту2АБ і СтутА.105 (у тому числі і об'єкт
МОМ87751), два об'єкти, створених за допомогою конструкту 2 і експресують тільки Сгу2АБ, і три об'єкти, створених за допомогою конструкту З що експресують тільки СтутА.105. У початкових польових дослідах ефективності проведених у другому географічному місці, об'єкти,
створені за допомогою конструктів 1, 2 і З були оцінені і включали 11 об'єктів, що експресують обидва Сгу білка, Стгу2АБ ії СтутА.105 (створених шляхом трансформації за допомогою конструкту 1 включаючи об'єкт МОМ87751), два об'єкта, що експресують тільки Сту2Аб (об'єкти, створені шляхом трансформації за допомогою конструкту 2), і три об'єкти, які експресують тільки СтгутА.105 (об'єкти, створені шляхом трансформації за допомогою конструкту 3). У другому сезоні польові досліди ефективності проводилися в 3-х географічних місцях, оцінювані об'єкти (тобто, вихідні) включали три об'єкти що експресують обидва Сгу білка, Сгуг2АБ і
СтутА.105 (об'єкти, створені шляхом трансформації за допомогою конструкту 1 включаючи об'єкт МОМ87751), один об'єкт експресуючий тільки Сту2АБ (об'єкти, створені шляхом трансформації за допомогою конструкту 2), і один об'єкт експресуючий тільки СтутА.105 (об'єкти, створені шляхом трансформації за допомогою конструкту 3). Об'єкти оцінювані у відкритих польових дослідах ефективності включали, покоління з КЗ по К7.
І00139| На кожній дільниці відкритого польового досвіду були поміщені тестові блоки і проводилося природне поразку аборигенними популяціями цільових лускокрилих комах- шкідників. Тестовий блок залишався неураженим цільовими комахами (Лускокрилі). Однак, випробувальні блоки, були обприскати, щоб запобігти значної шкоди від нецільових комах- шкідників. Всі експериментальні об'єкти були на підставі зародкової плазми сої АЗ555, відносна група зрілості З (КМ3). Інші вихідні об'єкти в дослідах включали позитивний контроль МОМ87701 (експресуючий СтгуїАс) або СМ А19459 (КМ5); негативні батьківський контроль АЗ3555 (фіолетовий квітка, ЕМ3); і негативний промисловий контроль А5547 (біла квітка, МО5) або
СМАФЗ805 (біла квітка, ЕМ5).
І00140| При створенні та проведенні тепличних дослідів використовувалися стандартні методи. Захворюваність від личинок лускокрилих шкідників, дефоліація і стадія росту рослин реєструвалися періодично (тобто, кожні 5-14 днів) починаючи з початку активності цільових лускокрилих і закінчуючи, коли активність цільових лускокрилих припинялася або рослини досягли стадії росту К7. Дані по ураженню комахами були зібрані з рядків 1 та 4 тільки для того, щоб уникнути пошкодження рослин у рядках 2 і 3, які були зібрані для прибутковості даних.
Контроль та облік шкідників за даними захворюваності проводився наступним чином: дефоліюючи лускокрилі (тобто, А. детітаїйаїйє5, С. іпсішдеп5, К. пи, бБродорієга б5рр.
Зо Відстежувалися з використанням куліси або вертикального ударного листа, з використанням як мінімум двох лаштунків або вертикальних ударних листів на ділянку. Загальна кількість личинок для кожного цільового виду, було враховано і число вибірок в межах кожної ділянки були записані як Середнє кількість личинок на м рядів (загальне число личинок - число вибірок хз довжина тканини / листа в метрах) для кожного цільового виду було враховано. Наступні відбори проб були зроблені так, щоб уникнути повторних вибірок в тому ж районі кожної ділянки. У польових дослідах ефективності проводилися в одному географічному місці, дані також були записані в досвідчених позиціях для раціоналізації для пошкоджень від Н. 76а шляхом випадкового вибору 20 або 33 рослини / місце, і запис кількості пошкоджень від личинок. На другому географічне місці, один досвід був раціоналізований Н. 76а шляхом випадкового вибору 10 рослин на ділянці і запису загальної кількості бобів і число пошкоджених бобів на одній рослині. 00141) Дані по зараженості ЕІазтораїрих Іїщдпозеїйш5 були зафіксовані шляхом підрахунку загального числа рослин в кожної ділянки з пошкодженням (пониклі, вмираючі або померлі) внаслідок харчування личинок. Дані з пошкоджень для цієї комахи був взяті в одній часовій точці, коли відзначалося максимальне пошкодження.
І00142| Крім цільових шкідників, нецільові шкідники, в першу чергу, з потенціалом для випередження економічних порогів шкодочинності (наприклад, щитники), контролювалися періодично сачком, модифікованим сачком, або наземної тканиною в довільно вибраних місцях у випробувальному блоці, і оцінювалися, якщо досягли або наближалися до рівня економічного збитку. 00143) У ході досвіду зрілості, всі ряди 2 і З з кожної ділянки були зібрані, і обидва загальну вагу і відсоток вологості для кожної ділянки був записаний. Під час збору врожаю, значні прогалини (рослини не торкалися одне одного) в збираних рядах були відзначені і загальна протяжність цих прогалин була записана. Врожаї були розраховані після корекції ваги насіння по 13 95 вологості. Захворюваність від личинок, дефоліація, і дані по урожаю були піддані дисперсійному аналізу (АМОМА) для визначення значущих джерел варіабельності серед лінії і повторності для кожного комахи в кожному місці при 0,05 рівні ймовірності (Р). Істотні відмінності між середніми значеннями визначалася з використанням тесту Тьюки-Крамера (Кгатег 1956) при Р-0,05. 60 І00144| У дослідах на відкритому полі, проведених в польовому дослідній ділянці 1,
Зо дефоліюючи гусениці були вперше виявлені на стадії росту КЗ, і збільшився до помірно ушкоджують рівнів на стадії росту Кб. Виявлені види включають А. деттаггаїї5 (98 Ус), А. пи (2 Фо) і Зродоргіега 5рр. (1 95). Повторення не є значущою джерелом мінливості в захворюваності від личинок (Е-0,0435; аг2, 57; Р - 0,9575), дефоліації (Е-0,0807; аг-2, 57; Р - 0,9226) або врожаї (Б-0,0213; аг2, 57; Р - 0,979), але об'єкт був дуже значущим для всіх трьох (захворюваності від личинок: Е-69,6956; аг-19, 38; р «0,0001; дефоліації: Е-25,9918; аг-19, 40; р «0,0001; врожайність: Е-3,357; аг-19, 38; р - 0,0007). Кумулятивна захворюваність від личинок (табл. 9) досягала 139-189 личинок на м рядів в негативному контролі, в той час як личинки практично не були виявлені в будь-якому з трансгенні зразків Максимальний ступінь дефоліації (табл. 9) становила 21-27 95 в негативному контролі і була відсутня у всіх трансгенні зразках.
Врожайність (табл. 9) були знижена в обох негативних контролях щодо всіх трансгенні зразків, хоча мінливість врожайності знижується значення цих скорочень. 00145) Об'єкт МОМ87751 виявляв значно меншу захворюваність від дефоліірующіх личинок лускокрилих (сезон кумулятивно) і значно менший відсоток дефоліації (сезонний максимум) порівняно з нетрансгенним контролем.
Таблиця 9
Захворюваність дефоліюючими личинками лускокрилих (сезон кумулятивно) і дефоліація (сезонний максимум) об'єктів, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З в дослідах ефективності у відкритому полі, проведені в польових дослідах ділянки 1. пе Личинок/ на м до Дефоліації 5. конструкт (кг/га) кумулятивне) сезон) 71111111 | Сус (ОМ Ат9459) 22303 | с) 00 |в )|2194589| а о Конструкт! |СтугАрСтутАлОо5| 2 | 08:02 |с| хо |В |2130528| а 11111113 1 08:02 | с| охо | в 18552240 арс 11111111 4103300 |с| охо | в М б43а105) арс 10177111 |моМме7751)| 03:03 | су) хо | в 9702126) аб 11111117 1 08:02 | с| охо | в 552218) арс 11111118 11120303 | с| охо |в розоз38) аб 11111119 1117508 | су охо | в 6282155) арс 11111110 1 05:04 |с| охо | в 6532247 арс 11111111 роизом | су охо | в (1957244) аб 177111111111111111711711114 1 16:09 |с| охо | в/|1990265) аб 11111118 1 05:03 |с| охо |в /|1885:591) аб 777111111111111111171711119 1 15:09 |с| охо |в /|1839555| арс о Конструєт2 | СугАь | 20 | 20306 |с| 00 |в /|1993264| аб 111111111111111711122 | 13:07 | с| охо |в /|1957531) аб о Конструкт3 | СтутАлЛоб5 | 29 | 08:05 |с| 00 |в 8412124 арс 17777111111111111111711130 1 08:04 |с| охо | в/|1833269| арс 11111111111117111151 1 04:02 |с| охо | в 4395357 арс 11111111 | Негативний | АЗББ5 /138,6:10,2| р |27,21,7| А |1288531| рс 11111111 АББЯ? 188,952511| а |21,036,3| А (731 жн/д) с
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05). (00146) В іншому досліді на відкритому полі, проведеному в польовому досліді на ділянці 2, дефоліїрующіє гусениці були вперше виявлені в кінці вегетативної стадії росту, і збільшилися до дуже разрушітельнонго рівня на стадії росту КЗ. Виявлені види включають А. детипагїгаїїз» (53 95), "п'ядуна" (імовірно С. іпсішдеп5, але можливо К. пи) (44 905) і 5родорієега 5рр. (З 95). Повторення не є значущою джерелом мінливості при личинкової захворюваності (Е-0,0085; аг2, 57; Р - 0,9915) або дефоліація (Е-0,0027; аг22, 57; Р - 0,9973), хоча об'єкт був дуже значущим для обох (захворюваність від личинок: Е-19,644; аг-19, 40; Р «0,0001; дефоліація: Е-671,3147; аге19, 40;
Р «0, 0001). Кумулятивна захворюваність від личинок (табл. 10) склала 43-50 личинок на м рядів в негативному контролі, в той час як незначне число зустрілося у трансгенних зразків.
Максимальний ступінь дефоліації (табл. 10) налічувала 87-90 95 в негативному контролі, в той час як слідові рівні спостерігалися для всіх трансгенних зразків.
І00147| Об'єкт МОМ87751 виявляв значно меншу захворюваність від дефоліюючих личинок лускокрилих (сезон кумулятивно) і значно менший відсоток дефоліації (максимум за сезон) в порівнянні з нетрансгенним контролем.
Таблиця 10
Захворюваність дефоліюючими личинками лускокрилих (сезон кумулятивно) і дефоліація (максимум за сезон) об'єктів, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З в дослідах ефективності у відкритому полі, проведені в польових дослідах ділянки 2.
ШЕ жен рем ШО
ЦГ Об'єкт рядків (сезон конструкт максимум) кумулятивне) 11111111 Сус | ОМ оАТО459 1,504 |ру| 05 о Конструкт! (СтугарСтутАлЛов| 2 | 1,33402 | р| 0 11111131 2306 ьо 11111141 3ио4 | ь|1ою 11111111 | моме7751 0 16:03 |ру| ою 11111170 ьо 11111183 ьо 11111111911112оз07 || лит | Б 1111111тло1оино ьо 1111113 ьо 11111141 лог | ьо 11111118 1128506 | Ьь| ою 11111191 зов | 6 | ою о Конструкт! | СугАб | 20 | 295213 |в о 11111122 2409 | 6| ою о Конструкт3 | СУуТАЛО5 | 29 ТБ | р | 20320 11111130 24-09 | Б | 20320 11111131 вот ьо 11111111 Негативний | АЗБ55 3 42,94104 | а | 867533 | а 11111111 АББЯ7 | 49,9:584 | а | 900500 | а
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05). 00148) В іншому досліді на відкритому полі, проведеному в польовому досліді на ділянці 3, повторність не була важливим джерелом мінливості в загальних бобах (Е-0,312; аг-2, 24; Р - 0,7349) або пошкоджених бобах (Е-0,0438; аг2, 24; Р - 0,9572) на рослину або урожай (Е-0,2221; аг2, 24; Р - 0,8025). Об'єкт, проте, був істотним джерелом мінливості в загальних бобах (Е-4,3643; аг-8, 18; Р - 0,0045) і пошкоджених бобах (Е-34,5288; аг-8, 18; Р « 0,0001) на рослину або урожай, але не урожай (Е-0,6237, аг8, 18, Р - 0,7475). Негативним контроль нарахував 25,0-26,0 бобів на рослину з 30,8-31,0 95 пошкоджених бобів, хоча тестові об'єкти, включаючи об'єкт МОМ87751, нарахував 28,9-38,9 бобів на рослину з «2 95 пошкоджених бобів (Таблиця 11).
Зниження кількості бобів на рослину в негативному контролі, швидше за все, результат передчасного опадання бобів викликаного ушкодженнями гусеницею бавовняної сойки, як численні пошкоджені боби були помічені лежачими на землі під рослинами і в негативному контролі (але не в тестових об'єктах) (Таблиця 11).
Таблиця 11
Загальна кількість та пошкоджені боби на одній рослині в дослідах у відкритому полі при зараженні бавовняної сойка, проведеного в польових дослідах ділянки 3, оцінюваних об'єктів, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З конструкт бобів/рослина бобів/рослина о Конструкт! 0 МОМ87751 ІСугАбаСтуїА105 38,9:42,9 | А 10504 |В 81111111 розм АВ 14504 В 11017111 1 злою |АВ 09505 В Конствукт2ї 20 | Сула | зввбио | А 08505 ВІ 0 Конструкт3ї//// 1777729 | СуїАлоб | 351527 |АВ 06502 В 11117 НЕС 1740-32, юю | о2503440 |АВ 308413 А 11111111 АЗББ | | обов | В | 310365 | А
Середні значення (5 5Е) у стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх Тьюки-Крамера, р « 0,05).
І00149| У дослідах на відкритому полі, проведених в польовому дослідній ділянці 4, дефоліюючі гусениці були вперше виявлені на стадії росту КЗ, і збільшився до високо ушкоджують рівнів на стадії росту Кб6-К7. Виявлені види включають А. детртайаїй5 (77 ро),
Ріашурепа 5сарга (1795) і С. іпсіцдеп5 (695). Повторення не було значущим джерелом мінливості при захворюваності від личинок (Б-0,0219; аг2, 69; Р - 0,9783), дефоліації (Е-0,0007; аг2, 69; Р - 0,9993), або врожаї (Е-1,1477; аг2, 69; Р - 0,3233). Об'єкт був від значного до вельми значного, для всіх трьох (захворюваність від личинок: Е-96,9673; аг-23, 48;
Р «0,0001; дефоліації: Е-363,8854; аг23, 48; Р «0,0001; врожайності: Е-1,7814; аг23, 48;
Р-0,046). Кумулятивна захворюваність від личинок (табл. 12) досягала 117-123 личинок на м рядів в негативному контролі, в той час як личинки практично не були виявлені в будь-якому з трансгенні зразків. Максимальний ступінь дефоліації (табл. 12) становила 68-8395 в негативному контролі і була відсутня у всіх трансгенних зразках МОМ87751.
Таблиця 12
Захворюваність дефоліюючими личинками лускокрилих (сезон кумулятивно) ідо дефоліації (максимум за сезон) об'єктів, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З в дослідах ефективності у відкритому полі, проведені в польових дослідах ділянки 4 в ІМ Ше ПЕ
ЦГ Об'єкт рядків (сезон конструкт максимум) кумулятивне) 11111111 Д|СулАс фам оАТЯ478 | 075007 |в | 050 (с (Конструкт! |СтугареСтутАлЛою | 2 | 07507 |в | 050 с 11113110 (ь | 050 с 11111141 оо |ь | 050 с 11111111 |моме7751. | 050 | | 050 с 11111181 ою |ь | 050 с 11119111 з |ь | 050 с 111111тло11оз5о0(ь | 050 с 11111111 лою |ь | 050 с 11111111ла1 1 оо |ь | 050 с 11111181 1050 (ь | 050 с 11111119 1 оз |ь | 050 с
Конструкт2 |СугАв | 20 | 20320 |в | 050 с 111111111111221 | оо |ь | 050 с
КонструктЗ3 |СутАлЛоб | 31 | тоб |в | 050 с 11111291 оо |ь | 050 с 11111111 Негативний |АЗББ5 | 122,74162|а | 833533 за
Таблиця 12
Захворюваність дефоліюючими личинками лускокрилих (сезон кумулятивно) ідо дефоліації (максимум за сезон) об'єктів, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З в дослідах ефективності у відкритому полі, проведені в польових дослідах ділянки 4 в НЕ ВЕС пе
ЦГ Об'єкт рядків (сезон конструкт максимум) кумулятивне 11111111 ФАББЯ | 1170521 |а | 6835344 |ь
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05). 00150) В іншому досліді на відкритому полі, проведеному в польовому досліді на ділянці 5, дефоліюючі гусениці були вперше виявлені на етапі зростання К2, і збільшилися до дуже руйнівного рівня на стадіях росту К5-Кб. Виявлені види включають А. детітагцаїї5 (93 96), 0. іпсіцдепе (5595) і Зродоріега огпійподаїйй (295). Повторення не було значущим джерелом мінливості при захворюваності від личинок (Е-0,0206; аг2, 69; Р - 0,9796), дефоліації (Е-0,0054; аг2, 69; Р - 0,9946), або врожайності (Е-0,2379; аге2, 69; Р - 0,7889). Об'єкт був вельми знаменним для всіх трьох (захворюваність від личинок: Е-122,46; аг-23, 48; р «0,0001; дефоліації: Е-623,0217; аг23, 48; р «0,0001; врожайності: Е-2,9366; аг23, 48; р - 0,0008).
Кумулятивна захворюваність від личинок (табл. 13) досягала 76-137 личинок на м рядів в негативному контролі, в той час як личинки практично не були виявлені в будь-якому з трансгенні зразків. Максимальний ступінь дефоліації (табл. 13) становила 82-8895 в негативному контролі і була відсутня у всіх трансгенних зразках МОМ87751.
Таблиця 13
Захворюваність дефоліюючими личинками лускокрилих (сезон кумулятивно) і дефоліація (максимум за сезон) об'єктів, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З в дослідах ефективності у відкритому полі, проведених у польових дослідах ділянки 5
ШІ жо рок веб АВМ
ЦГ Об'єкт рядків (сезон конструкт максимум) кумулятивне) 11111111 бу1Ас ОМ АТЯ478| 10506 |с| 050 | с 11111117 | сі 050 с 11111141 о06 | сі| 050 с 11111111 момв7751 | 0506 | с| 050 с 11111181 1 тїо06 | сі| 050 с 11111191 1703 | сі 050 с 1111111ло 1070 | с| 050 с 1111111 1з3ж09 | сі 050 с 11111111 гоюа | сі| 050 с 111111111тв лоно | с| 050 | с 11111119 | 03503 | с| 050 | с 11111122 | 03503 | с| 050 | с 11111129 | 1303 | сі 050 с 11111110 | Негативний. | АЗББ5 | 76,057,0 | р| 81,7:44 | Б 11111111 Ба? |1з7омова| 883517 | а
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05). (00151) В іншому відкритому польовому досліді, проведеному в польовому досліді на ділянці
6, дефоліірующіє гусениці (в першу чергу Н. 7єа і С. іпсідеп5) були виявлені на етапі зростання
Еб, але ніколи не досягали значної кількості. Однак, істотний збиток рослинам від Е. ІдпобзеПив5 в кордонах, буферах, і негативному контролі стався на початку сезону, привівши до пониклим, вмираючим або померлим рослинам на етапах росту К5-Кб під час яких були зібрані дані з пошкоджень. Повторення не було значним джерелом пошкодження рослин Е. ІдпозейПи5 (Е-0,3431; аг2, 69; Р - 0,71). Об'єкт був вельми знаменним для пошкодження рослин Е.
Ідпозеїйи5: Е-16,7555; аг-23, 48; р «0,0001). Відсоток рослин, пошкоджених Е. Іїщдпозеїш5 (табл. 14) нарахував 10-28 95 в негативному контролі, в той час як рослини трансгенних зразків не продемонстрували ушкоджень, у тому числі об'єкт МОМ87751.
Таблиця 14
Поширеність поразки дефоліацією Е. ІдпозеПи5 ГСОЗВ в дослідах у відкритому полі при зараженні бавовняної сойка, проведеного в польових дослідах ділянки 6, оцінюваних об'єктів, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З конструкт Попозеїв5 11111111 СулАс | ОМоАТЯХУВ | ою | с г3111ою|1с 11411106 |1с 11111111 моМме7т! | ою | с г в811111ою|1с г я1111ою|11с 1ло1 1 ою |7с г11ою|1с 11111411 ою |7с 1гв1 1 ою |7с 11111119 111 ою |7с 11111122 | |1с 11112811 |17с 11111111 Негативний | АЗББ5 | 10,3559 | 6 11111111 АББЯ? | 28584 | а
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05). 00152) В іншому досліді на відкритому полі, проведеному в польовому досліді на ділянці 7, дефоліюючи гусениці були вперше виявлені на етапах росту К1-К2, і збільшилися до дуже руйнівного рівня на стадіях росту К4-Кб. Виявлені види включають С. іпсішаеп5 (54 95),
Зродорієга ехідна (43 95), і Евіїдтепе асгеа (295). Повторення не було значущим джерелом мінливості при захворюваності від личинок (Е-0,0866; аг2, 69; Р - 0,9172), або дефоліації (Е-0,1129; аг2, 69; Р - 0,8934). Об'єкт був вельми знаменним для обох (при захворюваності від личинок: Е-69,918; аг23, 48; р «0,0001; дефоліації: Е-21,6603; аг23, 48; р «0,0001).
Кумулятивна захворюваність від личинок (табл. 15) досягала 152-166 личинок на м рядів в негативному контролі, в той час як личинки практично не були виявлені в СтгутАс позитивному контролі або об'єктах, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З експресуючих СгугАБ та / або СгтутА.105. Максимальний ступінь дефоліації (табл. 15) в середньому 24 95 спостерігалася в негативному контролі, але не перевищувала слідові рівні в об'єктах, створених за допомогою конструктів з 1, 2 або 3, експресуються Сгу2АБ та / або СтутА.105, у тому числі в об'єкта
МОМ87751 або у позитивного СтутАс контролю.
Таблиця 15
Захворюваність дефоліюючими личинками лускокрилих (сезон кумулятивно) і дефоліація (максимум за сезон) об'єктів, створених за допомогою конструктів 1, 2 або З в дослідах зараження у відкритому полі, проведені в польових дослідах ділянки 7. в МЕ ПЕТ ПЕС
ЦГ Об'єкт рядків (сезон конструкт максимум) кумулятивне) 11111111 Сус | ОМ АТО478| 6бох5 || 07507 | с о Конструкт! /СтугабеСтутАлЛоВ! 2 2 | 25512 || 050 с 11111311 зби |а|1050 с 11111411 зон ра 03503 с 11111111 моме7иві | 35515 || 2 щ050 с 11111118 11139508 фа 1050 с 11111119 1130506 фа 050 7 с 11111101 23505 || 050 2 с 11111111 30304 |а|1050 с 11111114 1 27ьою | а 1050 с 11111118 | 43508 фа 03503 с 11111119 | 43506 |а| 050 2 с о Конструкт2 | СугАб | 20 2 | 7бох14 || 050 с 11111122 | 45507 фа 03503 с о Конструкт3 / СутАлЛоб | 31 | 33:09 || 050 с 11111129 | Бо. фа 050 2 ( с 11111111 Негативний | АЗББ5 | 15204146, а| 240510 а 11111111 АББя? | 65816 а| 240510 | а|/
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05).
ІЇ00153| В іншому досліді на відкритому полі, проведеному в польовому досліді 8, спостерігалося помірне тиск дефоліюючими гусеницями С. іпсішдеп5 (41 95), А. деттаїаїїй5 (38 Фо), С. їидірегаа (13 Фо) ії С. отпійвподаїї (8 95) протягом К4-Кб стадій росту. Повторення не було значущим джерелом мінливості при ураженні личинками (Е-0,0924; аге3, 52; Р - 0,9639), або дефоліації (Е-0,372; аг3, 52; Р - 0,7735). Об'єкт став важливим джерелом мінливості при ураженні личинками (Е-40,008, аг13, 42, Р «0,0001) ії дефоліації (Е-11,9356, аг13, 42, Р «0,0001). Кумулятивна захворюваність від личинок і максимальна дефоліація в середньому 9,1- 13,9 личинок на т рядів і 31-35 95 (останнє помірно вище економічного порогу шкодочинності), відповідно, в негативному контролі, але не перевищувало слідові кількості в позитивному контролі і у всіх тестових об'єктах, включаючи об'єкт МОМ87751 (Таблиця 16).
У досвіді не було зазначено появи нецільових комах-шкідників.
Таблиця 16
Кумулятивна поширеність дефоліюючих личинок лускокрилих, максимальний відсоток дефоліації і врожай в дослідах з природним поразкою у відкритому полі, проведені в польових дослідах ділянки 8
Трансформаційний Об'єкт цг поширеність Максимальний Чо конструкт личинок/м рядків дефоліації поз 1 ОМоАТЯМУВ| /// Сутас | 05502 |С| 0 |в о Конструкт! | МОМ87751 | СтугАреСтутАл05 | 0,35402 |С| 050 |В нн шш ши ШИ КЕ еВ ге ПИ Є Ето ШИ 17011111 10704 | СІ 05505 |В 0 Конствукт2 | 20 | Сугаь | 07505 || 50550 |В
Конструкт3ї | 29 | СтутАлЛоб | 13208 || 50550 |В
Таблиця 16
Кумулятивна поширеність дефоліюючих личинок лускокрилих, максимальний відсоток дефоліації і врожай в дослідах з природним поразкою у відкритому полі, проведені в польових дослідах ділянки 8
Трансформаційний Об'єкт Цг поширеність Максимальний Чо конструкт личинок/м рядків дефоліації 0 Конструкт4 | 32 | СугАбСутАлоБ | 14507 || 03503 |В 11140111 обом | СІ 03503 |в о Конструкт5д | 46 | Сугаь | 05 | СІ 03503 |В Конструктб,/// | 42 | СутАлоб | 10304 || 03503 |В 711111 НЕС 171 АЗЬББ | Негативний | 91-05 |В| 350596 |А 11111111 АББЯУ | 77777771 р лзеюо | А 31,3:343 |А
Середні значення (5 5Е) у стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх Тьюки-Крамера, р « 0,05). 00154) У дослідах на відкритому полі у другому сезоні, проведених на польовому дослідній ділянці 6, дуже високе вплив Н. 7єа спостерігалося на стадіях росту К3-К5. Повторення не було значущим джерелом мінливості при пошкодженні бобів (Е-0,0280; аг3, 52; Р - 0,9936). Об'єкт став важливим джерелом мінливості при пошкодженні бобів (Е-15,4758, аг-13, 42, Р «0,0001).
Негативним контроль нарахував 64-78 95 пошкоджених бобів, у той час як практично ніяких пошкоджень не відбулося в будь-якому з тестових об'єктів, включаючи об'єкт МОМ87751 (Таблиця 17).
Таблиця 17
Кумулятивна поширеність дефоліюючих личинок лускокрилих, максимальний відсоток дефоліації і врожай в дослідах з природним поразкою у відкритому полі, проведені на польових дослідах ділянки 6 конструкт 81111111 ом | с ло111111111111111111111111 0704 | с 40111111 05502 | с 7711711 НЕГ | 7771 ЗБ | Негативний. | 638344 | В 11111111 АББЯ? | 77777771 1711 780:88 | А
Значення в стовпцях, помічених однаковою буквою істотно не розрізняються (тест середніх
Тьюки-Крамера, р « 0,05). 00155) Результати декількох відкритих польових дослідів, описаних у цьому прикладі, в поєднанні з результатами декількох тепличних дослідів (описаних у прикладі 3) далі підтверджують ефективність, сезонного придушення популяцій личинок лускокрилих шкідників, з якими стикаються всі трансгенні об'єкти сої, створені за допомогою конструктів 1, 2 або З протягом п'яти поколінь рослин (від К2 до К7), припускаючи стабільну експресію трансгенів всередині і між поколіннями.
ІЇ00156| Об'єднані результати демонструють, що в умовах, перевищення порогового значення впливу всіма чотирма основних цільових шкідниками Апіїсагзіа детртагаїй5 і
Спгузодеїхіз іпсішдеп5 в одному географічному місці, і тих же цільових шкідників плюс
Каспіріивіа пи і Стосідозета арогета в другому географічному місці), ефективність трансгенних об'єктів, створених за допомогою конструкту 1, 2 або 3, включаючи об'єкт МОМ87751, була еквівалентна трансгенним об'єктам експресуючим Стгуї1Ас і була раніше продемонстрована для контролю лускокрилих комах-шкідників сої. Об'єкти створені за допомогою конструкту 2 або З і експресують тільки білок Сту2АБбБ або тільки білок СтгуТА.105, відповідно, також продемонстрували таку ж ефективність як трансгенні об'єкти експресують Сту1тАс білок, припускаючи, що експресія обох Сту2АБ і Сту1тА.105 білків в об'єкті МОМ87751 матиме підвищену довговічність, більшу ніж у СтутАс трансгенних об'єктів шляхом поліпшеного управління стійкістю до комах-шкідників.
І00157| Еквівалентна ефективність серед об'єктів, створених за допомогою конструкта 1, у тому числі об'єкта МОМ87751, крім того, була продемонстрована проти численних вторинних шкідників, у тому числі трьох видів совок (5родоріега ехідца, 5. їтидірегаа і 5. егідапіа), двох видів (Неїїсомегра 7еа і Н. деіоїореоп), одного виду (ЕІазтораїри5 Ідповзеїйи5) і одного дефоліюючого виду (Ріаїпурепа 5сарбга).
ПРИКЛАД 5
І00158| У цьому прикладі описується молекулярне дослідження об'єкта МОМ87751, яке включає експресію білка і велике молекулярне дослідження. Дане молекулярне дослідження було завершено одночасно на об'єктах, які були випробувані в агрономічних польових дослідах, тепличних дослідах ефективності, і польових дослідах ефективності.
Ї00159| Для молекулярного дослідження об'єкт МОМ87751, кількість копії вбудованих трансгенних послідовностей (містять обидві Сту2АБ і СтутА.105 касети, ЗЕО ІЮО Мо: 9) визначали з використанням комбінації Саузерн блоту і ТАОМАМФ аналізу кінцевих проб. Молекулярний аналіз підтвердив, що там була тільки одна вставка (Т-ДНК експресійна касета, що містить експресійні касети для обох Стгуг2АБ і СтутА.105 білків, і представлена 5ЕО ІЮ Мо: 9) без виявлення кістяка вектора, і без виявлення Т-ДНК касети, містить для селекції/оцінний маркерні послідовності. Повний секвенування одиничної вставки (5ЕО ІЮ Мо: 9) в геномної ДНК об'єкта
МОМ87751 підтвердило, що послідовність ідентична послідовності трансформаційного конструкту.
Зо 00160) Для експресії білка, листові зразки були зібрані з рослин, гомозиготних по алелі об'єкта МОМ87751 і витяжки, отримували з ліофілізованих зразків, ІФА проводили згідно стандартних протоколах вимірювання рівня білка Сту2АБбБ або Сгу1А.105 з антитілами специфічними для Сту2АБ або СгутА.105, відповідно, і результати були виражені у мільйонних частках (мч) сухої маси. Зразки листя були зібрані на КІ і КЗ стадіях росту рослин для об'єктів, які були створені шляхом трансформації з конструктами 1, 2 або З і нетрансгенного контролю
АЗ555. Результати ІФА продемонстрували, що рівні Сгту2АБ у об'єктів, створених за допомогою конструктів 1 і 2 варіювали від приблизно 20 мч до приблизно 50 мч сухої маси, за винятком об'єкта 8 (у якого, як було встановлено, був присутній пов'язаний вірусний промотор, але ніяких інших послідовностей, з для селекці/оціночною маркерною Т-ДНК, і об'єкт 8 надалі не оцінювався), і відсутність експресії Сту2Ар у об'єктів, створених за допомогою конструкту З (експресуючі тільки СтгутА.105) або нетрансгенного контролю (Фіг. ЗА). Рівні експресії білка
Стгуг2АБ були приблизно рівні на КІ і КЗ етапах росту. Результати ІФА продемонстрували, що рівні СтутА.105 у об'єктів, створених за допомогою конструкту 1 і конструкту З варіювали від приблизно 150 мч до близько 800 мч сухої маси, і відсутність експресії СтутА.105 у об'єктів, створених за допомогою конструкту 2 (експресуючі тільки Сту2АБ) або нетрансгенного контролю (Фіг. ЗБ). Рівні експресії білка СтуТтА.105 сильно варіювали для зразків листя на етапі зростання
ЕЗ в порівнянні з етапом зростання К1. 00161) Додаткові результати ІФА демонструють, що рівні білка Сгуг2АБ у об'єктів, створених за допомогою конструкту 1 були вище щодо об'єктів, створених за допомогою конструкту 5 або конструкту 4, і як і очікувалося, не було виявлено експресії Сту2АБ ні в нетрансгенном контролі, ні в об'єктах, створених за допомогою конструкту 6 (експресуючих тільки Стгу1тА.105) (Фіг. 4А). У тому ж наборі зразків листя, результати ІФА демонструють, що мається подвійний або більш високий рівень експресії СтутА.105, у об'єктів, створених за допомогою конструкту 1, приблизно в чотири рази вище експресія для МОМ87751, при порівнянні об'єктів, створених або з конструктом 6 або з конструктом 4, і як і очікувалося, не було виявлено експресії СтутА.105 вираз виявлено ні в нетрансгенном контролі, ні в об'єктах, створених за допомогою конструкту 5 (експресуючих тільки Стгу2АБ) (фіг. 4Б). Для цих ІФА, зразки листя були зібрані на стадії росту КЗ від рослин, вирощених в кожному з двох роздільних місць тепличного досвіду ефективності. 00162) Додаткові результати ІФА демонструють, що рівні білка Сгу2АБ в витяжках з об'єкта, бо створеного за допомогою конструкту 1 і об'єкта, створеного за допомогою конструкту 2 були а)
вище щодо об'єктів, створених за допомогою конструкту 4, конструкту 5 або конструкту 7; б) приблизно таким же або трохи нижче щодо об'єктів, створених за допомогою конструкту 9 або конструкту 11, ії с) як і очікувалося, не було виявлено експресії Сгу2Аб ні в нетрансгенном контролі, ні в об'єктах, створених за допомогою конструкту З або конструкту 6 (експресуючих тільки СтутА.105) (Фіг. 5). Для цих ІФА, зразки листя були зібрані на КЗ і Е5 стадіях росту, і рівні
Стгу2Ар були вище на К5 стадії росту для об'єктів, створених за допомогою конструкту 1 і конструкту 2, і рівні Сту2Ар були вище у об'єктів, створених за допомогою конструкту 9, і конструкту 11 (Фіг. 5). У тому ж наборі зразків листя, результати ІФА демонструють, рівні білка
СтутА.105, у витяжках у об'єктів, створених за допомогою конструкту 1 і конструкту 3, були значно вищими по рівнянню з об'єктами, створеними за допомогою конструкту 4, конструкту 6, конструкту 9 або конструкту 7, і як очікувалося, не було виявлено експресії СгтгуТтА.105 ні в нетрансгенном контролі, ні в об'єктах, створених за допомогою конструкту 2 або конструкту 5 (експесуючих тільки Сгуг2АБб) (фіг. 6) Для цих ІФА, зразки листя були зібрані на КЗ і К5 стадії росту, і рівні СтутА.105 були на кілька порядків вище в К5 стадії росту для об'єктів, створених за допомогою конструкту 1 і конструкту 3, у порівнянні з об'єктами, створеними за допомогою конструкту 4, конструкту 6, конструкту 9 або конструкту 7, див. Фіг. бА осі М нанесені 0-5000 мч в сухій масі і Фіг. 6Б осі У нанесені 0-500 мч в сухій масі. Дані ІФА вказують на те, що є підвищена експресія обох СтугАБ і СтутА.105 в об'єктах, створених за допомогою конструкту 1 в порівнянні з об'єктами, створеними за допомогою конструкту 4, конструкту 7 або конструкту 9, все утримувала дві експресійні касети Сгу білків - одна експресійна касета, що кодує Стуг2АБ і одна експресійна касета, що кодує СтутА.105. Крім того, було відзначено, що порівняно висока експресія білків в об'єктах, створених за допомогою конструкту 1 (включаючи об'єкт МОМ87751), конструкту 2 і конструкту 3, була стабільною протягом щонайменше 4 поколінь сої (КО, К1, К2 і
ЕКЗ), а рівень білка СтгутА.105 підвищувався в тканинах листка, зібраних з гомозиготних об'єктів на стадіях росту від КЗ до К5 стадії.
ПРИКЛАД 6
ІЇ00163| Цей приклад описує способи, корисні при визначенні наявності ДНК об'єкта
МОМ87751 у зразку сої. Пара ПЛР праймерів і зонд були розроблені з метою ідентифікації унікального зв'язки, утвореної між геномної ДНК і довільно заданих З "кінцем вбудованої ДНК
Ко) об'єкта МОМ87751 (тобто, на 3' сайті сплайсингу) і полягає в ЗЕО ІЮ Мо: 10, ЗЕО ІЮМе: 8, 5ЕО ІЮ
Мо: 2, ЗЕО ІЮО Мо: 4 або ЗЕО ІЮ Мо: 6.
І00164| Послідовність прямого олігонуклеотидного праймеру 5020267 (5БО ІЮО Мо: 11) ідентична нуклеотидної послідовності, відповідної позиціям 11400-11426 5ЕО ІОМео: 10, і позиціям 212-238 5ЕО ІЮО Мо: 8, і позиціям 10066-10092 Мо: 9. Послідовність зворотного олігонуклеотидного праймеру 5025826 (5БО ІЮО Мо: 12) ідентична зворотному комплементу нуклеотидної послідовності, відповідної позиціям 11454-11479 5БЕО ІО Мо: 10, і позиціям 266-291
ЗЕБЕО ІЮ Мо: 8, і позиціям 51-76 5ЕО ІЮ Мо: 6, і позиції з 31 по 56 5ЕО ІЮ Мо: 4. Послідовність олігонуклеотидного зонда РВ10263 (5ЕБО ІЮО Мо: 13) ідентична нуклеотидної послідовності, відповідної позиціям 11428-11446 5ЕО ІЮ Мо: 10, ї позиціям 10094-10112 від 5ЕО ІЮ Мо: 9, їі позиціям 240-258 5ЕО ІЮ Ме: 8, і позиціям 25-43 5БЕО ІО Мо: 6, і позиціям 5-23 5ЕО ІЮ Ме: 4. ПЛР- праймери 5020267 (З5ЕО ІЮО Мо: 11) і 5025826 (5ЕО ІЮ Мо: 12) ампліфікують 80 нуклеотидний амплікон унікальною геномної / вбудованої ДНК в правий сегмент сплайсингу об'єкта
МОМ87751. Ця ж пара праймерів із зондом РВ10263 (ЗЕБО ІЮ Мо: 13), які можуть бути флуоресцентно-мічені (наприклад флуоресцентною міткою бЕАМ'М), може бути використана в
ПЛР аналізі ТадмМапФ для визначення наявності ДНК, отриманої з об'єкта МОМ87751 у зразку. 00165) Додатково до 5020267 (ЗЕО ІО Мо: 11), БО 25826 (ЗЕО ІО Мо: 12) і РВ10263 (ЗЕО ІЮ
Мо: 13), це повинно бути очевидним для фахівців в цій області техніки, інші праймери та/або зонди можуть бути сконструйовані так, щоб або ампліфікувати та / або гібридизувати послідовності в зЕО ІЮ Мо: 10, які є унікальними і придатними для виявлення ДНК, отриманої з об'єкта МОМ87751 у зразку. (00166) Дотрумуючись стандартної практиці лабораторії молекулярної біології, аналізи ПЛР для ідентифікації об'єкта були розроблені для виявлення ДНК об'єкта МОМ87751 у зразку.
Параметри стандартної ПЛР або ТадМапФ ПЛР були оптимізовані з кожним набором пар праймерів і зондів (тобто зондів, мічених флуоресцентною міткою, такий як бБАМ "М), які використовуються для виявлення ДНК, отриманої з об'єкта МОМ87751 у зразку 5020267 (5ЕО
ІО Мо: 11), 5025826 (5ЕБО ІЮ Мо: 12) і РВ10263 (5ЕО ІЮО Ме: 13). Контроль для ПЛР праймерів включає праймери внутрішнього контролю й зонди внутрішнього контролю зонда (наприклад,
МІС тм -мічений), специфічні для однієї копії гена в геномі сої. Фахівець у даній галузі буде знати, як конструювати праймери, специфічні до однієї копії гена в геномі сої. Як правило, бо параметри яких були оптимізовані для виявлення ДНК об'єкта МОМ87751 у зразку включають концентрацію праймера і зонда, обсяг матриці ДНК і параметри циклів ампліфікації ПЛР.
Матриця ДНК зразків і контролю наступна: (1) ДНК екстрагована зі зразка листя або одиничного зразка насіння для аналізу; І(2| негативна контрольна ДНК (нетрансгенна ДНК сої); |З негативний водний контроль (без шаблону); і (4 позитивна контрольна ДНК МОМ87751. Інші способи, відомі фахівцям у даній галузі техніки, які виробляють амплікони, які ідентифікують
ДНК об'єкта МОМ87751 у зразку знаходяться в межах даної галузі техніки.
ІЇ00167| Аналіз зиготності придатний для визначення, чи містить рослина об'єкт, гомозиготних по події ДНК; тобто складові екзогенної ДНК в тому ж місці на кожній хромосоми в хромосомної парі; або гетерозиготних по об'єкту ДНК, тобто складові екзогенної ДНК тільки однієї хромосоми в хромосомної парі; або є нулем для об'єкта ДНК, тобто диким типом. Спосіб термальною ампліфікації ТАОМАМФО був використаний при розробці аналізу зиготності для об'єкта МОМ87 751. Для цього аналізу, три праймера і два зонда були змішані разом із зразком для аналізу. Три праймера були 5020267 (5ЕО ІЮ Мо: 11), який гібридизується і подовжують специфічно до З "області вбудованої екзогенної ДНК; праймер 5027115 (5ЕО ІЮ Мо: 14), який гибрідизуючою і подовжується, специфічно, на геномної ДНК сої, фланкуючої з З "боку вбудовану екзогенну ДНК; і праймер 5026901 (5ЕБО І Мо: 15), який гибрідизуючою і подовжується, в специфічно на геномної ДНК сої, фланкуючої 5 "сторону вбудованої екзогенної
ДНК. 5020267 і 5027115 праймери і зонд РВ10263 (5ЕБО ІЮ Мо: 13) (6-БАМ "М -мічений) є діагностичним, при наявності копі вбудованої екзогенної ДНК присутньої в шаблоні ДНК, тобто об'єкта МОМ87751. 5026901 і 5027115 праймери і зонд РВ11254 (ЗЕО ІЮ Мо: 16) МІС "м - мічених) є діагностичним, за відсутності копії вбудованої екзогенної ДНК присутньої в геномної
ДНК, тобто дикого типу. Коли три праймера і два зонди змішуються разом в ПЛР з ДНК, виділеної з рослин, гомозиготних по об'єкту МОМ87751, мається флуоресцентний сигнал тільки від 6-БГАМ "М -міченого зонда РВ10263 що свідчить про виявлення у рослин, гомозиготності по об'єкту МОМ87751. Коли три праймера і два зонди змішуються разом в ПЛР з ДНК, виділеної з рослин, гетерозиготних по об'єкту МОМ87751, мається флуоресцентний сигнал і від 6-БАМ "М - міченого зонда РВ10263 і від МІС 7м - міченого зонда РВ11254, що свідчить про виявлення у рослин, гомозиготності по об'єкту МОМ87 751. Коли три праймера і два зонди змішуються разом в ПЛР з ДНК, виділеної з рослин, з відсутністю об'єкта МОМ87751 (тобто дикий тип), мається
Зо флуоресцентний сигнал тільки від МІС "мМ -міченого зонда РВ11254, що свідчить про відсутність у рослин, об'єкта МОМ87751, тобто дикий тип Матриця ДНК зразків і контролю наступна: (1| ДНК екстрагували з листя або насіння зразок один зразок для аналізу; І(2| негативний контроль ДНК (нетрансгенна ДНК сої); ІЗ| негативний водний контроль (без шаблону); (4| позитивний контроль
МОМ87751 геномної ДНК з відомих гетерозиготних зразків; і (5) позитивний контроль МОМ87751 геномної ДНК з відомих гомозиготного зразка.
ПРИКЛАД 7
І00168| У наступному прикладі описується, як можна визначити об'єкт МОМ87751 у потомстві при будь-якому схрещуванні з використанням об'єкта сої МОМ87751.
І00169| Пара праймерів ДНК об'єкта використовуються для виробництва діагностики ампліко- ПЛР для об'єкта сої МОМ87751. Діагностичний амплікон для МОМ87751 містить щонайменше одну сполучну послідовність, представлену як 5ЕО ІО Мо: 1, або 5ЕО ІО Мо: 2, або
ЗБЕО ІЮ Мо: 3, або 5ЕБО ІЮ Мо: 4, або 5ЕБО ІО Мо: 5, або 5ЕО ІО Мо: 6. Пара праймерів, які створюватимуть діагностичний амплікон для МОМ87751 включають пару праймерів на основі фланкуючої послідовності і вбудованою експресійної касети (як (5ЕО ІЮО Мо: 9). Для створення діагностичного амплікону в якому виявляються ЗЕО ІЮ Мо: 1 або ЗЕО ІО Мо: З або 5ЕО ІЮ Мо: 5 необхідно створити молекулу прямого праймера на підставі ЗЕО ІЮ Мо: 7 від 1 до тисячі триста тридцять чотири підстави і зворотну молекулу праймера на основі послідовності ДНК вбудованої експресійної касети (ЗЕО ІЮ Мо: 9 позиції 1-10119), в якому молекули праймерів мають достатню довжину послідовних нуклеотидів для специфічної гібридизації з з«ЕО ІЮ Мо: 7 і
ЗЕО ІЮО Мо: 9. Для створення діагностичного амплікону в якому виявляються 5ЕО ІЮ Мо: 2 або
ЗБЕО ІЮО Мо: 4 або 5ЕО ІЮО Мо: б необхідно створити молекулу прямого праймера на основі послідовності ДНК вбудованої експресійної касети (ЗЕО ІО Мо: 9 позиції 1-10119) і зворотну молекулу праймера на основі 3 фланкуючої послідовності (ЗЕО ІЮО Мо: 8 позиції 266-1452), в якій молекули праймерів мають достатню довжину послідовних нуклеотидів для специфічної гібридизації з ФЕО ІО Мо: 8 ії БЕО ІЮО Мо: 9.
І00170| Приклад ампліфікації умови для цього аналізу ілюструється на прикладі 4. Втім, будь-яка модифікація цих способів або використання ДНК-праймерів, гомологічних або комплементарних 5ЕО ІЮО Мо: 7 ії 5ЗЕО ІЮО Мо: 8 або послідовностей ДНК в генетичних елементів, що міститься в трансгенної вставці ЗЕО І Мо: 9 МОМ87751, які виробляють діагностичного 60 амплікон для МОМ87751 розташовується в межах області винаходи. Діагностичний амплікон містить молекулу ДНК, гомологічну або комплементарну щонайменше, однієї трансгенної / геномної зв'язує ДНК (як 5ЕО ІЮ Мо: 1 і 5ЕО ІЮО Ме: 2 і 5ЕО ІЮ Мо: З ії ЗЕО ІЮ Мо: 4 і 5ЕО ІО Мо: 5 і
ЗЕО ІО Мо: 6), або значної його частини. Крім того, діагностичний амплікон містить молекулу
ДНК, гомологічну або комплементарну до щонайменше однією унікальною послідовності трансгена (5ЕО ІЮ Мо: 17 і 5ЕО ІЮО Ме: 18 5БЕО ІО Ме: 19 ії 5ЕО ІО Ме: 20 5ЕО ІО Ме: 21 ї 55:00 І
Мо: 22 ії ЗЕО ІО Ме: 23). (00171) Аналіз зразка тканини МОМ87751 повинен включати позитивний контроль з тканини об'єкта МОМ87751, негативний контроль від рослини сої, що не містить об'єкт МОМ87751 (наприклад, але не обмежуючись АЗ555), і негативний контроль, що не містить геномної ДНК сої. Пара праймерів, які амплифицируют ендогенні молекули ДНК сої буде служити в якості внутрішнього контролю умов ампліфікації ДНК. Додаткові послідовності праймерів може бути обрана з ЗЕО ІЮ Мо: 7, БЕО ІЮ Мо: 8, і 5ЕО ІЮ Мо: 9 за допомогою фахівця в даній області техніки ампліфікації ДНК способи, і умови обраного для створення амплікона за допомогою способів, показаних в прикладі 4 можуть відрізнятися, але приведуть до діагностичних ампліко- для ДНК об'єкта МОМ87751. Використання цих послідовності ДНК-праймера з модифікаціями способів прикладу 4, входять в об'єм винаходу. Амплікон, отриманий з щонайменше однією послідовністю ДНК праймерів, отриманих з 5ЕО ІО Мо: 7, ЗЕОІО Мо: 8, і 5ЕО ІЮО Мо: 9, що є діагностичним для МОМ87 751 є одним з аспектів винаходу. 00172) ДНК набори виявлення містити щонайменше один праймер ДНК достатньої довжини суміжних нуклеотидів, отриманих з 5ЕО ІО Ме: 7, ЗЕБО ІЮО Мо: 8, ії 5ЕБО ІЮ Мо: 9, що при використанні в методі ампліфікації ДНК виробляє діагностичного амплікону для МОМ87751 або його потомства є одним з аспектів винаходу. У МОМ87751 сої рослини, частини рослин, рослинна клітина, насіння, або товарний продукт, який вироблятиме діагностичного амплікону для МОМ87751 в дослідах ампліфікації ДНК є одним з аспектів винаходу. Аналіз для МОМ87751 амплікон може бути виконана за допомогою Арріїей Віозузіет5 СепеАтр! ПЛРЗувієт 9700 (запущеного з максимальною швидкістю) або МУ Кезеагспй ОМА Епдіпе РТО-225 термоциклер чи якась інша системи ампліфікації, яка може використовуватися для виробництва амплікону діагностики МОМ87 751 як показано в прикладі 4.
ПРИКЛАД 8
Зо 00173) Для виробництва рослини сої або його частини, які містять поліпшені агрономічні, інсектицидну, або гербіцидних властивості рослин сої, що містять об'єкт МОМ87751 схрещуються з рослиною сої, що містять потенційно будь-який інший соєвий об'єкт або їх комбінації фенотипів і оцінюються для визначення обумовлених ними властивостей в потомстві рослин. Властивості, надані потомства рослин в результаті такої селекції можуть виходити за рамки опору лускокрилих об'єкта МОМ87751, включаючи, але не без обмеження стійкістю до надземним шкідників, до гербіцидів, нематіцідниеє властивості, посухостійкість, опір вірусам, анти-грибковий контроль, опір бактеріям, чоловічого безпліддя, холодостійкістю, солестійкість, підвищену врожайність, підвищений вихід олії, підвищений вміст масла, підвищеною поживною ефективності, або змінене вміст амінокислот. Приклади трансгенних об'єктів з поліпшеними господарсько-цінних ознак є добре відомими в даній галузі техніки. Нижче наведено ще не вичерпний перелік можливих трансгенних ліній сої, які можуть бути використані в селекції з об'єкта МОМ87751 для наділення покращеними властивостями рослин сої, частин рослин, насіння або товарної продукції. У селекції може включати в себе будь-які і всі комбінації наступні: стійкість до гербіцидів: Т5 40-3-2, МОМ87708, МОМ89788, А2704-12, А2704-21, А5547- 35, АБ5547-127, ВРО-СМ127-9, ОРЗБ560О43, 1Ш262, Муб62, М98, ОА5-44406-6, ОВА5-68416-4, ГС72,
ВРБ-СМ127-9, 5УНТО4В8, 5УНТОН2, 3560.4.3.5, ЕБ-2М3, рраАВ4472-1606, ррАВ4468-0416, ррАВ8291.45.36, 127, ААЮО-12; стійкістю до комах-шкідників: МОМ87701, ОАБ-81419-2; поліпшення олійних властивостей: ЮР-305423, (394-1, (1594-19, (1168, 0Т96-15, МОМ87705,
МОМ87769; збільшення врожайності: МОМ 87712. 00174) Усі публікації та неопубліковані патентні документи, цитовані в цій специфікації, і яка є суттєвою для винаходу, включені тут шляхом посилання в тій же мірі, як якби кожна індивідуальна публікація або патентна заявка була конкретно і індивідуально вказані для включення шляхом посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Мопздпто Тесппотоаду С «120» Трансгенний об'єкт сої МОМ8В7751 1 способи його виявлення та застосування «1305 Ммом5: З5 МО «150» 51/834599 к«і5іІ» 14.06.2013: «1505 26 «1795 рРатепетв версии 3.5 «гій» 1 «г11хМ 20 «212з ДНК 2, «її» штучна послідовність кад. . ! «вй3х Штучна послідовність ДНК, яка містить геномну послідовність сої та травегенну послідовність «400ж її тгодадакстї ссадєсадса 20 кйійх 2? «її» 20 «212з ДНК ! «213» Штучна послідовність «20» , | о «23» Штучна кослідовність ДНК, яка містить геномну послідовність сої та трансгенну послідовність «00 сахатадаєк сстасоадаа 20 «Мох 3 «киіїї» 60 «й1йз ДНК . Й «213» Штучна послідовність «АЮ І . : «223» Штучна послідовність ДНК; яка містить геномну послідовність сої та трансгенну послідовність «Ой» З | Ї , татадатате тсссстсаст тсодЧчадасся ссадссвоаса ксаєсвзсасєс вавадстада 50 «еїОз 4 «вії» 60. «2175 днк й «вії» штучна послідовність «22о» ц у с. «223» штучна послідовність ДНК, Яка містить геномну послідовність сої та трансгенну послідовність ха» 4 ши й сассатастіс абєсостватс сасотайатс сстасоаовна гогодадозса адасадесесо 65 «210» 5 «Ії» ЩО «12» дик й й «213» ЩШтучна послідовність
«ого» І й «геЗУ Штучна послідовність ДНК, яка містить геномну послідовність сої та трансгенну послідовність «00 ! тгоасісссто пвдсктатстх сосадататт тсссстсаст стодадаксь ссадхсавоса Бо ктсассасасс завадієвзоу сссозатаці їтдааактаа 100 «210» 6 «211» 3100 «гід» ДНК й «гії» Штучна послідовність «0 І «223» Штучна послідовність ДНК, яка містить геномну послідовність сої та трансгенну послідовність «4005 б жЕсСтткттсСт ссататтрас савсатастс астостватс сатосазаєє сстаєзазаа 6О0 тодададцдаса адасадстса чссаавастс ваассассоваа 100 «гід й «ії» 1626 «212» ДНК . , «213» Штучна послідовність «КО» , о «223» Штучна лослідовність ДНК, яка містить геномну послідовність сої та трансгенну послідовність «400» 7 тсзаттітста адтазаєтаа ТІтактагста ааддасссає сссадавата достаасаавиє во зазасттсат агчакттктї таїсазасас ааядастатт сазааєтаат тсвазкттай 120 астааттста дастазазаай саасттатса атасуазосс таататаєза асастассся 180 акасттасає стграаотато тоадссадоє ссастзатєає тататттсат аоатсттті 240 кустаятттЕ акзсатаккт стсстсаєатї аадтсаатсаас аттететтат сотзаттатх 300 заактстттат сессаєтаас зодааттсоа ааксатактт аттестктсє соатттадата з650 дсаасетаат зеєсасостаст кссодттаата саттттїтада айааїттасо ахахтакдах 20 зачесаєдат сазатасода асабасттац сатаасотса стазакссса ктхссахтода 480 ахогозоатас ачстсастат сттаатттаак сс та стосадааєє таассчаєсса 540 паст токоо тдасдістст дсасадасех сссосавуує десстаатса саатссваза 6Оо0 актсттєсаає асстасстко саїкусддоє аасодзраааа ссадастсоа сстутаств 6бБО сайктосаат кстсскссве стсаєдастс єссаотасст кстдассто засодасттад 720 ттаатстсса ааттассттс астазасаєтс сусссуавії аддтоаєтаса стогтадоас 780 сасаасдасто тоасстсаса асстсосода пссзаєтату одтодастаах адасасасах 8540 асапасесає саєсадйдаас аааяаататс тасцааасса стзтасссакє ссскассосх 900 тоздастоєс басасуваєу зтасоздаст азадаєтоєх: астстоксадо аассохаавсе зво тактстаст асаатсатаза саасодададаа аасаасодеє адодстоасає досааєсаас 1020 таассоїтасї сааааадааа аааазаваса атстотассат сотасттоус ссатсоузчаєс ово сєесасагсуєтх садассадоцо саасессттаа єтаксастсв тдаасссад сасвасасахє 1140 ададбазтад ссадсузату сдасесдаас астосасдаєс тсссахдаса сстдакаєує 1200 ахтасатазас ссадаєдаца дастсасасоа сасаєткттає тсасєсссаат табазатсаса 1260 тазасастає адаасассає їааактастс тІсодадстє акстсосаца тасттсссся 1320 састтсосад аксесссвоєс восаєсаєса сассаваанї тасоасесцава кадзесевдава 1380 тхаздаавусєт сесвзаїттуао ЯдІстоєсЧас сстідсазата састчасосо ссассесаос 1440 астахассто сбасбрасаас таїтікстсата бсабасазодао їсаосатато татазессдаї 1500 тсаадзассях єЕсдбасоаає ксодасоатад тачеазссає сасксаасає асатастзає 1560 сосдааєзає озасатдато азасаттуєта тсссассота тааатаєсса сазасасатс 1620 асзаза 1626 «й10х 8 «1» 1452 «12х ДНК «213» Штучна послідовність ке» ; «вгїіх Штучна послідовність ДНК; яка містить геному послідовність сої та трансгенну послідовність -4005 8 | Ши судсасєсдакс агдазоскхс ссСакєскааче ссссаєттдо асоєдаасує ачасасуєсу 50 аайхтазадатє їсссдаатта оОвахтааттсту ттсастасеє хсасстаєсава атасвасода 12а тсусзастта тсоссЕтатс дазасотаст стсаєстттає аатазасоєтао содасакєсва ІВО састстткОаа їсраазазаа аїсоддсаакт астстесстї сссстссата ктозссаїтса 240 тасесаєтує тдакссахтоє адаттсстах дачаасдада здасаацаса озсесодесва 300 застсаатсу тсдазатіса асподавсат сттддтатст аасстсваст ссаатаєстодй 360 адаїсодааа ссссастаає азодаалахєца ссастсдаїтс ддасстсаєс абаастсаде 420 адтаасатаї сотаєттова зозасаатта ааїсасатат заосітскоє одазааааау 50 патастасоає астааватат дазсостодза Зтааастаса саазатоста атттсаєавас 540 асооїтаєсті їсадаїіїтта дійайсссоєї саадсестад їтаааєсааа сатаєуватй во сапсєтатах асзапотато сатогастаї абссватсда зістаозтаа стздаатсяа БО ататєагоаїї аасоаосасст оготсасава айдаддастаз ЕБаассстава ссстодвасаа 720 осхаакттаатс азасаєстсааа стдатабату ссапасскаа асссацдадса таасстутає 78о0 дссзатдавс стасазаєтЕк сасастадав асасасатто аасттссетЕ ссттсоита. 8540 засксстттє стктсааста єсктссосо тстаятсава гтіттасоатає уксдассдав: щоб адстздааяатї тасаастаає засзаастсв адстдасота атттткссає датасстасо 9360 таттастсдча адхстадако стабатааас актазоєзата асатадетсє аавеєватасє 1020 тссачесо стассатдаа стааазааєс тсатадотаа стосаадаза асахтозссав 31080 тссаохсато ассосодіса Сдабасоахт дбсасадаатс аазатасстії даваєсусов з1ча їкесааттої тагтсасадас їссаатттаа забсасчацє даддаєттта сватазаєсо 1200 заксаасуєт тсасастаса сстодзасва авасссозаї сосхтатсадуд аєсстататсе 1260 жсататосає сатотасст таостатєтса сстттсасєд базасєстста сєеєсасасєта 1320 ааатацесох дсасстоата сстодзатова атгстатадчау стттсдаєту дадасадтсс 380 сасстстатї садЧікоЧс азесасудад сатдаааааа асаасаціїї адстадоєса 1440 дассазатєса ах 1452 «210х 9 бігу днк «213» Штучна послідовність 55» Штучна послідовність ДНК, яка містить трансгенну послідовність «Ах 9 ссадтсвоса ссабсасасс аазацеєадо сссадаєаає стоззастад зазустсоса. 50 зседадаєст пдусоасссто садоатасаст пасосоуєсає сссадсоєсто сасстостос 120 дасзастатї сттатоастасо саадавісво сасатотаста асісасесао зассосттсго 180 асдвоажєсяя ахотазтації адссаттатєє їзатоїтасаї астааєсово затзасовах 240 агозтозаас актосакстї астуктаєзав тасссастаза сасаїсаєда аадасаєтьє 300 стттІсасєдоат столаєтват татоасасаа стстзатада аазасоддяаасєта аажтасоєта 360 айстасатуа ааїстаатїсо дасаадесяла ссасоасавс даствасоаєє осстодчахта 428 астєчасєтта адсстаассас кааазазасу чадстаїтсат акаасасевсо дассоаасай «во ассасадеса тозадссаєс азадсавазо даскаассса аддостоада сдаттзаєта 540
Чітхтазааах тасттаасає дозддазазац одсєудсстовс адссвозеса суєсатстех во асстотодтс дваатуаєтс дідсстоксо аттттаатта тттттттола асоудссавава БО їзааутсота адаоаєааайс ссоссткатає ааастсатат астекстстс состетовах 720 тутстсоЄтоа Есстсстсає стісаєсдос сатстттаза стссодосда сссбасздад 780 аасзасаачу задаасаста адацадазад гаададчаєва сссаодадат ссастестссо що ттстдавест хсстсаатст сатсттсттс сусескстст ттссазодста асаддаасти 900 тстасаєста сестатекас ходаєстсоа хсстотЕтес тсавестсст соадаєстод 9650 аажЕсвбіІтта агтідчаксі зсдайсстсс актааватске стозЕссттас хадзатсавї 1020 стаацєтоас соассадіта зстсдаєсаї адсстассада асттоасєво асстєдаєовд 1080 зоаздаєссаї дугсаїсдтта сстасдйазас оатсвотаста тоасзаасєтояз аасстовасх 1140 сетозадчета дастоааєст зайсастоєс засустяадає сЗавістова саствсєттаа 1200 ддєтадатоа адсттдсота тадатесттс дагастттау даєстоєадє єсохасуєє 1260 паасайазаз статтєстода ттсааксвоаа отттаттвоа стобтахтоаа сток сех 1320 асатттосад сапатстаса зходдсосаяадд стаздсадзає стусватодеу атЗсадавсс 1384 саїстосттат стссааїтстс тспаваєсса уесаасодасява акстссстта сові 1430 тйзасасоса чзсадсассса суаайсттатєс сдасетсасс чЕсСатовауа сСУЗадзоваза. 1500 отддчасоас дттваткодс тссдаостіс дксстсттаа дахсатотсє Естотттсса 1560 свосатосає осєтуссасо дагаастсад сгттозасай тооддадааст асаатстото 1620 агдсттаєаа сосодсаяст сатдассстт тевстескса осасзаваду сскдасасто 1680 тссаазавдуа дтадасадаа содававада асаассасос їстстастту дассстатсв 1740 тоаосастає сасстсетс ссссттаава зазетаозїс астсужтода аздадааееє 1800 таосдацес дадаватстє ассттєсстя сасопаєстас саасттцато саадасакттс 1860 тсазочавдас хуаазааєтт стсаассада ддстсаасає єдасассстс чссадазсоа 1920 агоссдацеє састдоссто савостазто ттзаддацтт тсзасадосаа десдакаатяс 1580 кестсаассс азасадазає остутасесс ссаосахвас ссСассасто аасастасос 2040 засаастотт Сссбаатада тідссссаді єссадасоса адуссассва скссесттос 2100 тсссастстх сусссадоєтє дскаасстос асстсадссє тассаудудат охоаєтстоа 21650 атостдатоа вкододоатт тсадестосса сссстадазс стассоасзає гаїстсайаа 2220 астасаство ддастастст аастастоса сузасаєтта ксарадсост геЕсвададає 2280 ттаатассад астосасєсає атустссдадт ссададастта сагуєтесто аабсоатстесо 2340 здтасоєсад тасссаозас сткстсзах ассазксасс сстсостадє адсоотаста 2400 асттатасос стстоадЗеса доадссесазс адастсадчач сестасавос сзодаєстодс 2460 сстссстаса тСсСЕсКаЄсТ сазоєузата асазітасдє дссозасоачи: сесессоооа 2520 стадаскотс ааакассксс сесзасатта сдодастксс содаксстасе ассастсасо 2580 стстестодс аодстадодїт аассаєтсто одсодсаєсао тадсобадає аєсодаостя 2540 стссаттсяа ссадзаєтсє аастоакєтста сеткжствсс тесастсстт астссстсо 2700 ттадаєссто деЕсадаєадє додтстоата дададудасої соссассоаєт асааастодес 2760 азассозатс ссттовайаса асастсоацчає стацосстач состсссаса дстададуза 2820 аттссаатта стттсстдає таскссатта дузасатвад тодсаттеса стсотхотта г88о водааїтсаоза сстододада сстсттсасєт асазсуадакє ззуддааасаєс дсаєстссає 2940 сзадсасссс тоадсудадстї арастстата єдотстссує дсатазсада азузасааса. 3000 тесатостот ссасувозає сдаєссааєца Кссасстаоє тсссаасдвс сетассчоо 3060 ттастатєтіс ассстаїтсас дссасасаво їсаасааєса дасазадаєс тесасстсся 3120 адазаєтсою аазтсадуодо сасадсстда саїїсуадса дааксаасась ассусаавдах 3180 абастсттад адодааатада авіїстстаса асттутастх: дадоусавоє тсаяусооса 3248 акхтсдасааї садачтетаст асстазсодса доотосасає сосазасаває дісаасаєта 3300 стасааасай гдасодсукс аахцдатаасо сздсаачаст стесадатакєь азсатскової 3350 акоткаєсос ааогсссаає ссадасчсос ссстсуастає сзасоєдаса сстваєтсау 3420 дсасссаатт Тоасттрасу засасаатає тодтдсссас ааататсєса ссастетасе їА8О затазодЗсса здоссаїста соастозакс яссзатосасє садсскаєст асатцатаова 3540 тазатазава дуссаєссад сакдастоадсх сатосстова тдадсокуас тааатссаєс 3600 апботогтоато кусоссктука єсаассаєтоє зсдаатсадуо токсзаават сосозстдаа 3660 засссатоаєу ассхствосу ссатогалат зстосттото азагасааах астассккає 3720 птатотоває тттастстсє саєттєжтсес стосастсас сатєестаєта Хата 3780 сіїхаассосс адсадаасас зсоссдацос заатсестасс асстсаєтва сазаєтідІї 3840 асосакссЕк сесссасоді сдадаєтого таттаєєсть гадстаєтас аацдастеєхтта 3900 одстачааттї дазараатст: ассєстааова аатсттвзаса кстоадаєза Сеесайдсавх 3960 адатєтасатєт єктсаєсаєтс стадсаутає стттосадає саатсосаас агагатодєє 4020 дстадааааа асосастата сататасата тсатттсттс ааттазаааої осасозєвта 4080 тТаасатасає ататататєає ахотосасає отасасодіс зазовааттє стагасазає АТ) асасасдаає асататбаттт: дасаазатса задктаєсаса стазасаака аодссодіоса 4205 тодссаавас авататоасад ассааазаєт ссадсстсса задзазадєє саавсаттає 4250 заадсаєтат агататаєад тадаєсссаз акттттутас аастссасає козєсузатх аз2а їсазааятсу затаєстчає охадуасєстт сетаатеасеє тасстцаєса тесаставта 4380 асаттсатає зстжтсатсх дазакатсст стаєзаттат атсдаатєсто дсасатаата 4440 адагасстаа гсоуссатстс аттттастац таздатттста чедасадасе гсстасезай 4500 аадсестсац аазатсекод ассааатсса тассссатаа сттсоаесех сазссстатх а5а0 аз Ісаса засастастає сСаасаєсасї зЗсСаасупзаа аддсасавус аазасатіса 4870 атссоатаду чаадсдатаї адуадоссод даадасадує ссадзвадад аєтхаєстда 4680 сткаттєсає дсасадісеє саатуєссат заадовадат одадасітда базусесее а74й тїтодасттсо сттаЗсесто ссаддсессх стссттстоа ссаатаастт суседоосе 4800 асєдатетоєа зсаттттсоє пдасеЕстста дсстатттай асутуустаас сеЕтаєсадає 4850 ттасдасесто їтаєзасата стаїаасаца соасттдата сасоастлає сстстасасає 4920
Єааасатадаі Ста даааохтстт ахктттсаєте гтаєєтодзає зїтатасаєх 4980 ттЕстататс татзастста Чсаазасдса заттетостт єтазатоваа азайсатата з04й тжЕссасацтї тїсасстзатсе статосаттї здсадтіасна аїтсСадазає тісссаєссх 5300 таєссатуза хсзтассате асатаїткаас сазасссаао осавааавах датасдааад зіва стстатацта адсаазатає азаїтсссси саадцазазо пдссаауєска ссавдсааає КУ зааатазоса здсассаскс сассатсаса сазтссєсасе сатачаєаас датааваєсе 5280 акддаакєтає сстссасото осаттаєєсс здсдпттсаа дссуаєавда дсстсаасас 5340 сЕстсствад дсскЕсосод ссдтсассаа дтавааєтсаа сстсасасає атссасастє 5400 азавіссвас досотадатс стадтссасе єуаакстсат дтатсстада ссстосдатс 5460 астссаадцє їхатЕсСтсає сахтаєтасс зетатахата дахдассааа зсастадасс 5520 ааасстсаді Сасасаазой дсдаадааца асаатачетс ссестакяасє сесттссяЯсе 5580 аєтатостто ссбстіссодс ссадудссасє ахудєсостс сектсаасов асітавотсе 5640 тесостасст ссссадссас ссосаадЯсе засзасдаса сіастетссає сасазосвас 5700 десададаво хгаастосає дсадасесод Єсессдаєсо дааадавоаза чессзадасе 5750 стстсттасс єтсствасст гассоаттсс сЯсвассосу ссзастосат осадуєсаєд 5820 басвасвасс сааасаєсяаа соузатосате ссатасаасс осттоаотад сссацдаадіс 5880 даадтасєєта чеддавдгасу сатсдахласс доктасаскс ссатсоасатє сіссттоксс 5940 тхдасасаді: гЕстостсад соадстсога ссадотасто десесугест содастадех вора дасатсаєсь ддоосаєссє туокссатсє сааєдоадато сасссстоді осаааєтово бОБо садстдатса ассададчає сдаздадітс дссадузаєс адоссатсіс хадостадаз 6120 озактоадса асстестасса засєстаєуєа давадестсса дайдоктондза зассоатсся БІО астаасссяо стстссосоа сдаватоасує актсвастса асоасатайа садсоасєстів 6240 ассасадеєта ксссатстоїс сосадіссад застассаад ттсстстсеє осссукокаєс 6300 пессазодсао стаакстскса ссбсадсото сттсоачасу ссадсоєуєе собусзааад 5360 тадодатсса атостосаас саєсаатаус соїтасаваса ассстастад остааєтуда 65420 застасассо ассасостат ксостадсас азсастцост сдааосоїтої ссдовоєсся БІ8О
Чатєсстадау агхтадастад атасаассад єтсзададад азєтцдассст сасадсетев 65540 часастокуї сесксттссс озастатєвас гссадзасся ассстаєссо тасаасаєсс БО сайсттасса чадазаєста тастяаассса яктсстоада асессоасва тадсесесох бббО
Чадхескоссс азоддстаєсуа адостосСатс задассссас астсдакадіа сасстсозас вуга ацсастааскта єстасаєсода тустсасада сдадацтайт: астацієтод асассацдатс б78о акдоасстссс садссєудаєт садсадоссс дадтккасст скЕсстстска садзастахто бо здааасассу сессасааса зсоататсосє дстсаастад згсадодтах стасадаасс 65900 тсоЕствсса ссттотасач вацасссттс засаксодта ссаасаасса чсвастітсс 2960 дежЕсЕБдасо сбаасададес сусстасода асстсттсва асттуссаєс састутетас 7020 здазададсо ззассустда сЕссттодас давзассссас сасадаасва сзастатасся 7080 сессачасаго чатссіссса саоддісозас сасотутсеса тетсссас содатссадвс 7140 засадьіссу хооаоасатсяї сасадсісст атоттстстї осатасасси тапсостдав 7200 тесаасааса ссастосаєс сцуасаєсатт астсазасас сстгоддтова адсасатаса 7250 сЕжхсацісаз ухастаєтах тоссададає ссаддустеса сауозовдара саєтссстсає 7У32й сосасааудєд дасвассстє сусстасасст аїтуєтаася Єсаатоодсса ассуссесва 7380 адосассукао сазозаєссо стаєдесьст астасаааєс тсадовтстяа сегоаастоте 7440 осадосоаза ддасстстос тудссадетс засазраста бодатассца тоасесттто 7500 асаттссвас сесттааста соусвастатс васасаусст єтасасттссє дасуаЗссяо, 75650 апезостеса садсадотас сдасастттс задсісавовза акозацттта сатсврасада 78520 тккозатсоаа сЕссвоктас Єосаассстс дадоствпадї асаассттоа дададсесад ува задастосоа асуєсстстк тасстссасс ваксадстїо одсттоаадає сзасоттасх 7740 дастатсаса схудассавух діссаваасіїа дгсасстасс стаосоааєов откстоссе 7890 часдздаадс дЕайвасьстс содразацчіє азасаєцсса адсуєстсао свасоачача 7860 захстсттос задастссав стісааяабас актсаасадує адссадгасо состав 7920 пдаацдсассо ддассассат ссаазоодоус дасчаєакок їсаадозоза стасатсасс 7980 схсЕсСсддза стттсдасої дкастассст асстасттоє ассадаадаї соатоваєсс 8040 азастсзаао ссттсассад отаєсаасет: здадууєтаса гсоаадасад ссаздаєстх 8100
Чаваєстаст сдассадуєа саастоссаао сасуадасся сдааєотссс адотастоде 8160 тссстстдос састстстоє ссааєстссс аєтводааох дкодададсс тазсадатас 5220 астссасасс стоадсоддаа ссстдастсо дастостсст псадоздатоо соддзавтої 8280 дсссассаєтє стсатсастє скссттодає ахсдаєоаєоз дасатаства сставатдай 5340 часстсддаоа сстодохсат сттсаадатс аадасссава асодасасаас аадасттвос 8400 зассттовоє ксстсдаада оааассатто дЕсадсовад стстсостса собхдазозоа 8450 дсзавазада адтоудадода сазасотоаа ааастсозаї доддааастаа сакхсотїтас 8520 аадчадосса аадачіссЯє сдатастіка їїсотозасії сссаататца тсадітасаа 8580 дссдасасса асассоссає дчаїссасоасс дсадасазає атотосасад свттсатаад 8640 дсттасттос стодваєтатс сосдатссссю посотдаасо стоссатсії созподааєтх 8700 чзадасасоєта жсттІтассоус асістссттаЯа тасдатасса аааасяахсат саазаасаде 5750 дасттсзаса атопосстсад стастодааї дедазадоїтс ахтатодасої дододаасад 8820 гасааєсацс дітссокест ааттасасся ааосададава стдааатасс ссаздаадіх вяво асачістоєс сасястададчо стасаттсте сасзтоавсса стсасааода аадасасаає 8940 завооєтоса їсассатсса соадассодяу аасаасассо асдадстєаа дЕєскссаас 9000 касоссдасо аадазааєста тсссаасваає ассуттастії осазєдасєта сассосоває 9060 саддазоазах асодавосоє стасаєтазцс сестаасадад дстасааєча зОастссСсЕсс 9120 акксстасто астасоссєс сотостасоао дадавактсстї асасадакда садасат9ад 9180 засссттусо адессаасад адоєтасадя дастасаєсає састісєсдаає тадстасосє 9240 ассаадаалоас стоадтастс тсстоадасс дасазатєції оддатсдадає садкоааасс 9300 даддсзаассії їсассостада садсотодад сттстсЕтда тодадозата ахдадсавад 9360 аддатсакда асатсасааа чтоозатттах тстатасттб сассасатає тасстаєсстук 9420 дасасаєттєс адаастстта аассаттттт стоакттосає сстаостаст адссостота 480 тїсасаатав стаасгосаціс статостссЕ кадтагаада сссазасаста сусазачтЧі 9550 асассестоо єсотатаста тітазаатст аєтсккутат сосасаасєстє асстевосст 6500 тсосєсЧада ссовоадстас тідгЕсСтуст дсасєкаасс асаачеєестс аєтесоткат з6560 асосасосої татассстат стттодассє азазасасто досссваєсттє сассесазвас 9728 тІтоагсааттї ахсСааатттс застосасад сесасадата чадсдавчасс чзатттасодс 95780 сосасаксст дстсдасста стацоссавс оасадасаста ассасвасдо ссасаовдвасода 98540 астзадссст одоссосаєс датсогодаад тІтстсатєстї аадсссссаї хтосасатоа 9900 ахасасасасє десдазаєва адаєсктссоа актадаатай тЕтоасттаєє дстттсассх 9965 затазатаєдча содаксатаай гтхоссосЕЄ сассаазаєо бастєтсаєт ттатаатаає 10020 пстосодаса сстасаєттс товаєсдзва ааадатєтодт аастастстт стек 10080 сатассодасс аксатастса гсоскоаксс агутадахх 10119 «хх с «і» 196540 «12» ДНК 213» Штучна послідовність «020 «223» Штучна послідовність ДНК, яка містить геномну послідовність сої та трансгенну послідовність «400» 10 їтаатттссз адтазасьаа сЕстахтдісса засадістає ссхтавазаса оотїдахвах ва адааєтстсає атоатссскс кассадаасас ааааасєтасєт таадаїстаат Стаааєтсва 120 ассзатсттта дастаааава сазіїтатса ататдазосс таатаєуєоа агаєтасссс 180 ахахттасаї сттавокато їдадітавої стассаакає Сасактесає аодбсстттт 240 тостоакттЄ акасататтт стгбтсатаї саактазтзас ЯІтткессаї сасааєтаєх 300 засстіттає стткассаас адозаєтсса аоссататтіт асттстттст соєставата 3650 дсаастєаає дттатохатт тссоттаата саттїстваа азаасссасо асаєстатоде 420 задтсаєсоакє сааатасоза асасасттад соїтаасоїса таааїтоса гтессахода 480 ахтасозохас аосссаєстає ттаатстєває тс їтосадаатт тааттдасса ща уста гбасоєске: дсасарустт сссотаауус охсстазтіса їзаєсставаа 600 асестксаає ахстасстєу татттторох ааєудуаааа їсадастсяв Естататстє 660 садісодсаак сстстссстк стсатдастс єссайтасст Хаїтавтєвд заасаастсод 724 тїзакссттєа заттассттєс атїтаваасатт сотстозаті адосаттаса ттаттаццає 780 саєвасодко саасстсаса ассттдсода уттаатсато атодаєєоах соосасатає 840 асадастсає сахсадозає аазазатаєс тасуазасса ссасаєттає сстдетосх 900
Едачастоєс тасатдаато асасодацаст аазадатстосх: акттатссадо застосвати 960 таїсссстаст асааєсатаза сазсуауааа засаасодеє адуттдасат доатазєсвас 1020 таасствіасс сазаааааава азазазааса азїтокассатх сабасекуас їсасвадасс 1080 сесасатосі гадаєсадад саасєссттай ссяссасіса гозастсаде сасовзсасах 140 ададдазстад стадсоваакто єдастсудаає азттосасоає тсссаєдаса сстдататає 1200 агатасацаї ссадаєсдада дастсасасо тасаттттас гсатсссаає татазатаса 12650 тавасастає айзасассас хазатсоасес тттдаваст аттестосада тастссесх 1320 сассссочао аєсстссасієсє аосахтсатса сассааааох таедусєссдав тасгтсоава 1350 їхавдазачес сосааттоава чсстотсдас сстосаоота састовдсосо ссасстсаде ї440 чстотосско стдсдасаає татстєксато татосаасзо тсадсахтато татаастоах 1500 тсадаатсує сссдасцдадт ссодавастад тадтаодсєсаї кКахтссавтує асатастаах 1550 сухозарабс даакатдато азасаєсута їсітаєсоста тавасасєсса тавасасатс 1620 аєдавадаса стбтстсвсСа содсссдаає Євактатоає асаатктства тадаааасов 16850 актаваєтас дЕсовассоє асдазатста астозасадо ссазссасуа сдасваєтаа 1740 соттосстод астрастсод сттзадессаа ссастазааа засодадсто тсатаєваса 1800 сясадаєсва дсадуєсаса уїсаєоавос саєсавадса зайоаастая єссазодасє 1860 дадаїсатта аскздеєттаз азатізоєта асасосаддаа азадосєтоєс тдасвассва 1920 дЕсасоттає стктасстди дуксоазасо агтсоасоссс ахсдаєстта астастки 198а тазаадассо ваваасааадї сосдадацаї азасссасст агактаваєтєс ататаєтесс 2040 тстссосттс дзастокстс десууєсстсс тсаскттсає содссокттє созаєстссо 2100 пеЧасссдас адачавоваєсє азддавозад астаадачад ааацкагого асазіссадо 2160 асаттсатсс сссатєтттза ахсттсстса атстсаєстє сстессоаєтсу ЕСЕ Ессаа ве чЧчасаасаоуа астттстода сстасттсат стустодаєс тсваатсттох сетстсайтя ВО тссоттоздає стодаактсо сссаатькоу аєстотоавас ссссастааа ссстстауєе 2340
Ктастпозає сратстааоє тдассуатса оссадсжсоа Есабаостає савдаатткаЗ 2400 сктозсстто аєоддададає ссабоасссає оттасстода ааатдатссо татаєосуай 2459 ттдазаєсто аастоєсоаа дстадассуа ахстдаасас тухсаатаєє адаттоваєс 2520 тогасастоє стаздостад асоавоктто сосатадатєє сттсраваст сеаоддатєсто 2580 тадсцісота соєтузасає ааачстаттх стодстсвах садосеттає седастотах 2640 тазасесект стотОосасЕ асайсадаєс тасзаторсо саайттаяааса даатсвоасавз 2ю тачвхасусад азсссатстс сСсатстссза кстсссозаз сссдассаас дсзаакстсс 75о0 сетаєсодії сстссоаада сосадсадса сссасуадст тахссоуавеє сексоссоко 2820 додаттсадо зададтзода соасаткаає содстстозо стссуєсстс тсааддхсах 2880 пЕскесвоЄс сссасоусоє дсахоасттос саєддаєаас ссаостттсда асачедачад 2940 вастасааєс сотосактастс асвасоссос адсесасцчає сстестссс тЕСвосасаа 3000 задтсстоаї астаєссааа аадаптдаас сазатодаяа задзаатаасс астстстева 3060 сттадассстї агтасодеава стассоссіс стсссСТссСІї аазавадеєко датсастсох 3120 тодаазасада аєсттцуацєсо зостоарава ксттатсссс ссстсаддає стассаатеє 31850
Чатосаасає атісссадос адастузааа асттстсаає садяаддскта асастдасає 3240 сстсдссаса дтодатоста адсттастод сетодсаадес: закоастодадо адсєсаасадф 3300 зсаацісцаї застесстса атссааасад ааасоєтито сесстсваса саасттсаєвс 3350 адтіодасасті агодсаасаас тост тоаа садаєтоссо садтсскєсада сосаадуєта 3420 ссаастсстс ксостІтссвВвс жсСессоссса застоссзас стосатссса асттсатсад ЗАКО осдатассаєтї ттозаєзссо атоаатооЗзо дакстесвоасє одссассстса овасстасса 3540 сдаїтатсєс ааазастаса стадсооаста сестадстас тусастааса сстаєсадад 3500 содсЕкссзай ддасссаата ссадастоса сдсдасасостс дадсстадда сттасатоєе 1660 тстдаасоєї сесСоаптасо єсаотаттто дЗазксететс азотатсаах саєтесетах 3720 тасдсаусоді одстзасестат асостєстоз зісадозссс садсадасто адаостхтас 3780 азоссаццає соаосссттсс тотастстст бтттсавото азхтадтаахт асотостозва 3840 соодтстстсс дозостароєс коїсазатає сттЕссссаас аттотодоає тесстадатс 3900
Ттастассаст сасостсксс хдосадстад постаатєтає сстазсодса ссадсвдсод 3960 адатассстао дсссстссає ссаатсадаа сттсдзастоає сстасттєте тесстссасє 4020 бсттастссс єесостадає сстдаттода тадтодоєст сатададаод осотсоссає 4080 сегтасааає спосСсазаєсо затсстїїтоз засаасастс дпаасктадоат стдасаст 4140 касаастаца додаваєссса актастттсс тдаєтатссї аттардааса саадкоусає 320 їссастсції огтаасвасо аодасстоза дадасстстс саєтасвасо ааатаадада 4260 саксусатст ссаєсвдоаса сссстоосоо адстзоадась татабтоадссє ссотодсаїаа 4320 тадааасзайс аасастсатуо стосссасда даактодатса агсастсвсс гдодстсссаа 4380 свастакасс доотттаста їттсасстає ссасассаса сазазуєссазеа ассадаєзавд 4440 чдассттсатт: тссоадаааї тсодазатєса содосасаої стдадчаттсо адсадазіва 4500 састассоса адатастасіс ттададодаа содаааєтст тасаасстої асттдадади 4560 чадстсватєс досааєстсаз саатсадаої тастаттаає часадуусоє асастоєсвас 4520 заасодатсзаєсє астастасаа асзатаатиц саттаатоає васузаусва зосестсада аб) тастаасаєє ооозатаєта гсдсавоїсс саасьсвоає осоассссетаа атаєєвасаї 4740
Часасттааї їсадасассс аасттсуасск датдаасата асастаутас ссасаватає 4800 стсассастс тастваєзад дссавдосда сстатддасту ааттассзат усаєсадеся 4850 чістасаєда гудзасзаата задаатссає ссаядтоєпає дастсасуєсєс сохаєдавхо 4920 тдастозаєс сатсаокато кататоатаєт сгасуссаасс асотосвоаає садатоєсай ач аавесоходос тодаааєсса хукоадескст адстттатої азатотсосе сосчаваєсає 5040 ааатаєтотї їтогоабасоє озакестаст сьсісатєттї тсСтіствосає гбассасєссє 5109 аттатадтва КІжЕЕЕтавє соссасаоа асасоососто адосазаєсс сассасстса зіба кттасаааттї таїтатотає іт тосо сдогесуадає котосаттає сссстадеста 5220 тсасаадасх сххадстаза ахтттдазада асстастста аддваатсстт васасстдад 5280 атааттєсао саатараєса таттестсах тастстацса дтатсестас зодаїсвахтса 5340 саасататає даттостаса ааваатосас сасатасаса татактасту ттесааттаа 3400 азостосакда тататзатає агататасат атасатоєот отвіотатає дуєсаваова 5450 аєссттатас ааататасас даасасатат агтідасааа аїсавачтає тасаставас 5520 аатчадсєцдо єрсасоосса ааасадатат дкацдатєтааа затіссадсс тссазааава 5580 засссвадчіЗ єсосаазоса їтататастах агадсадакс ссаааттттт дгасавттсс 5640 асастоасєсо аасктїтааа дстдазтасєс єзасувадоав КЕКС Есаас ЧЕсСЕКассту 5700 ассакттастї ватаасаткс атасоссттс аттсцдазата гсстстатач стасавсвач з7650 тЕкддсасат васзадаває стаасєтозту асстатстска стадсазакс сссодідака 52га задсеєЕсСтас тадаазоастс тсподзавате ссооаєсааа сссататхсс атоасутсда 5880 тхсотсаассс тастадітїтт сасазасата стаїтсаатає саєтосвасо даззадотас 5940 задсавгааса стсааєссоа сарддзайто асогадогод хобоааодас зодсссадад во азадатєссає стоасттоєт ссусутатад ссттсаатує ссагтавадох ачатодадає 5Б06о тєрадаваєє сЕфтєтодає тесотскадс ЄЄКостодос осЕтЕКссЕє гтовесваха 65120 асстсдтїдо осктасєдаєс кутаасакст ссотодастс бесастттат єездасеєос 8180 таассттотт д9одсттасоа сЕКестотая сатаєтотаа садаєдасєтє затотосоас бай таатстсктас дсаєтазаса сах кстатс ссттодааої ссстассттс акттктаєі 65300 даататтата таттєттста тасттатаат сстаотазаа досазаєтст дсттттазах б3Бо
Чайзаазата сатастссає аосттсасст аассстатоас аєстаюдсасі асааасєстсай 6420 ааасскссса кктттаттса созатєсатас саттататакє Каастаааєс сазодсавааа баво азазуудтато аадоссстат аусазусаза асасааасес сссатазода аздбоссаад вай єссаєсадчусє аводсаваата зосаадсаєс асессаєсає сасасааттї састсатада 6ББО0 таасцдаєваз аїтсасодаа стаїтстссса сатодсаєта гІссдосоак їсадоссдай веБо задодсстса асасстстсс ттасоссттї Осооссостта ссаадтаада гхаасстсас 5УгО асататссас асісаааакс сазасочкота саєсстадтс састкалатс ссаєотатсс 57Бо садассстсс даксасссса айдстсосіс тсастаєтає таїсаєтаєа татадаєчає 65840 сазацсасєта зассаадссї сассасаса аадачсааво задаасавтоа остсстста 500 тастстсттс состастато дісосстстс суйстсавос саєтасаотс пастесесеса 6960 асадасієва дкісстіссуєє ассттсссад ссассбосаа ддстаасває дасаттастх 7020 ссаєсасазо сазсодсода зудаоєтазст асатсусадує дтодсскссд аскодазада ово зазачестеза састсестсях таєстісста ассттассодз ктссатоуЕ сасоісааси. 7140 сдсахосадос сатоарасаас васссаааса ссаасозата састоссаїтас вастдсттода 7200 дсзасссада адссзазота сттдатодад азсосаттда азссоадттає астсссатсо 72ва асатстссев аксстєдаса сзеттестас ссаоасоасії сатоссаоє стос са 7320 ттІстсоОдаст зостоасатс асстодадта сстстодтсс аєстсаатою сатасаттсс 7180 хпдсасааак сдаосадуссто ахсавссаца одатсувада дсссассаою зассадоєса 7440 хстстасаєс одааодзатсо зосвактстіст ассаватєста госСсадададс гсадададе 75980 здадавассда гсстастаас ссвастстес асозодавах дсохастсваа ссСаасовса 7550 сззасавсос сттоассаса яастатсссає єдстсосадс ссадаастає саздчттсстс 7520 тсікосссої фіасууєсесаа дсвоссаатс кісасеєсадя сатосетсой дасоттадса 7580 тагІтодаса аасостоЧеча сссдатассЯ сзассатєтсаза сарссястас засдасстта 7740 стасостоасє содавастає ассцассася стасксоєто дтасавсаст пдстгодозос 2800 тстстдоЧеа состаастст ададаєтода ттадасєасаа ссвахксадо ададзаттов 7860 ссстсасаді Іссодасаєс охоєстстсь їссеуааста їуастссада асстассста 7920 тоссатасаає бхсссзассс ассададзаа сстатастаа сссадттсте дзаозасттсо 7980 асадтадйстс ссатодсест осссаводта ссплаадастс сатсадоаоє ссасасттда 8040 ходдасаїсії даасадсата астасстаєса ссдасостса садводаває таттасводиі 8100 стддасасса чассатодсс єстссадето даїтсаосдо дсссозатіє ассткксстє 8160 їстатоцаас тасодогаас оссостосає аасзаєутає состостсза сСтавассаво 8220 дсосссасад аассттатст тссасстсує асадаацаєс сттсватаєс додтатсааса 8280 ассвосааст стссустстт засодаасад ауексосста єдозассксю хстаасттос вз40 сатссостос ттасадавау зоспдвасся ссраттсстсю ддасдаваєс ссассасада 400 асаасзаєсот адассасссапа садвузатєтесх сссасадаєє оадссасото сесакаєтсє 460
Ікссоддате садсвасади хєссдхдаоса тсассадазеє тсстакахтс тстсадасас 8520 ассатватос сдадексаас аасатсаксу сасссдасєгу састастсаа атасссевоа 8550 їравадсаса тасасттсад їсадотаста стостоассад аддсссаооа сзасадаза вело дадасаєтст тсптсосаса адсодавдчає сстесостта састаттуєє аасассаатд 8700 дссааттосс ссазацотає соатопсааудзаяа тссастатасє стстастаєса затсссавуй 5760 їстасоєдас хостосадає дазаддатся стастадеса дстсаасаза астатацдата вн2го ссодсотоассс ттбоасаттс сдватстттта остасоудсаасє тагсаасаса асттттасах вядо тсссаасдад ссадазтадс сксясадтзо дстостдасає сессадстса додааєозад 8940 тІсасаєсоа сапююітдаа ссдассссад їтастдсаає сстсоарост падтасваєс 9000 ссдававаос ссадзадасх дтдзасассс сскетассіс сассазтсад сесодсетоаа зова авастаасої їастодстає сасасєєсасс азасатссаа сттодісасс тассттавсв, 9120 атозоскско сстсдасого задсосодаас сссссуаоза адттааасає дссаадсоіс 9150
Хсєавдсавсуа Задозакстс їтосаазаст ссаасттсаа азасаєсзас ададсвассад 9240 васутоддтто с9тодаводс ассодоатса ссаєссвадо адосоасчає дедсєссавод азво здаастасоах сассстстсс ооддаасестсо ассадсоста ссстасстас кгтатассача 3350 адатсдаєсца дхссазаскс заадссттса ссадутаєса асттадводс тасаєсозад 9420 асацесзача ссттоазаєс хастсдатса дусасаасоє сааасасдадй ассотовата з480 ссссадухтає тадеіссесстс соадссасттв стосссаатс хсссаттодо азотатодай 3550 адссезасао акосастсса сасстідачс дааахтсстдда сттодастос ссстосавод 9600 ахкоддсдадаз охотосксас сатсстсвіс астсстсстс ддасаєсоає дсоодахота з660 стчасстяза тузодасесс бовдасстдаа ссассттсаа даєсаадаєє сзабасодас 9750 асдсаацастє соосаасстт дадтттстсо аададазасс аттодтсодт бааостстсо 9780 сесуготоза дададсадає аадаадтода дооасадасо срадазастс озатододай 9840 ссаасаєсос гсасаводад оссаааоаує ссотодасас сесоєксохо аастсссаає 9900 агчатсації зсавпоссоас ассаасаєсо ссасдатсса соссасадас авасотатос з96о асадсаїттса гозпзсетає ссосстдаде тоатссоїдас ссстдутоєо засастоаєса 100270 їсттісовода асткдапоца сотатсссста ссосаєтстс стсусасдає десадазасо Т008о тсассаадза соадтізастсс засааєддєс тсзуссосто чаасудєдава додксатоатад 10140 асатовадода асадаасааї садсоттссо кестоастує осствавсод спааастазав 10200 тотсссааца зоссадаукс коатссадота дадуссасає сстесосото ассосттаса 10260 адввададата соотуададх сосоутоасса єссасдадає созозасває ассоасовоє 10320 стазоссстс саастосоєс дзддавозаа Естаєсссаа Саасассоуїї асттасаасо 1380 астасСастої дзатсацдуая оадсасодад дсодсстасас тадссоївас адаооєстаса 10440 асдаадстсс євссодсссст дсевастато сстосувота сазддадзаа ссстасасад 10500 асцусадаса суадаасост хосдадсєса асадавдоста саудчастає асассастес 10550 садтєдоста состассаау зайсхкоавх астстсстоа дассдасаза одеогтодассо 10620 адассодсоа аассоаоора ассетсатсо содасадсоє даадстсстс стодасудада 680 затаасуаос аадовоспасс асозасаєса сзааотовах хтастсєсата хстасассає 10740 асаттастат стдкоасаса ТтЄсадааст сттазаєсає текста ссу дсаєтетаос 108.00 тастодастух хотаттсаса атазтовкас здксстатос кжхсесодсує задаттсзах То8560 астатоутаза псогатотст сеооктосат астатєттвааа абстаттстт дтаєтоотата 10920 атттатсєса дссестоєсе садастоаду стасттасєсс ксоастосастс аассаєзацде 16980 їттсСакттто єтатасотас дсактатасс стоєстттад асстазаває астчудесєса 11040 аксесатттс ааастттаєс азаїтасєсзза сстсазстос асадстсаса аатадзоєва 11100 чЧоасезаттто сопассосаса тестодсттдо сстастадоас саасоасадас остдоссахо 5160 асдассасса дсозастачо ссттодуссо сассрассеє даааєтстстс агстаацеєсс 419520 ссасттасас агоазасоастад асасутсава атазацдаттт ссоаатїзоа атаастстаки 11280 таксосттсс осстастзаає асдасосахтс осаакттоєс сісїсатсаа загосасітс 11340 саєсттатаа сзасостосо дасатстаса єсстковаєх дазаааззає годсаавттас 11400 тстттстстс їстссататс дсассатсатста стсаєтостд атссатотао астсстатда 11460
Чазсогоаво асаачасадс ксодссаааа стсаатсоєс даваєссаає здазасатсє 11520 єуасаєстай ссссвасттс аатастодад атссодвавте ссастаасай доазатодес 11550 актсоакссао асстсаєсад аасссадтад їаасактатсо сасксдазаад ааслаєтава 11640 єсакататаа уст ааазаазаода тастасутас таздасаєтаа асостоавох 117060 звазєтасаца азасустаає тїсаїтаасає оустассттс аааттсваос часссокска 11760 зоссстадсє вааїсавака тасуаатстаса осстатотає азодхатаса тосостаєад 11820 жхааїсаазі стаздатавстї адазтсазає атасєдаєтза содсасстоє оєсасасаваз 118580 пзаасізатс аасставест стоаяасаадс зассваєсай асаїтцазуоє чаєазатеє пед водсстваах ссададсата асстттасоє саагдласта савазтсттся састадавас 12000 акасаєтуова сістсткїсс тісаєттааа сессттвісє сссаастобо ЕстссоСоКЕ мово їзассаааїє стасотосоє сдассравао стадаваєса Таастаатаа садастєсава 12120 тсддасосдає стЇтїсСатда тасстасоса стастсдово тЕсадатаст ататавасає 12180 дадгодтдас асдостттаа аттдгасетс садсвоутдєє ассатстозаст зааааатстт 12240 атачосааїє осаадаяває атоассдаєс сазссатчає сосодесатсо асосааттоє 12300 асацааєсаа захтассттда зассосцасє дсаастоєта стасадастс саактсвава 12360 тсасозотда одаєттсасо зтасакссодва кСсаасотттс асастасаєс тдоватазав 12420 асстцдаатсо сстастацає статсаєсттс ататасатас ахокасстта остатєксатх 12480 тктсастата аатсткутаст сасасетааа зтаптсотос атетоакаєт тазасозадії 12580 тсатададст гсссцаєссоа дасадьссса ЕСтсСТасссо 9ухтодссаз ссаходзоса 12600 кдаавзазаас затадеттач стасоєсадо ссазакєхазе 12640 «2 «2115 87 «12 ДНК | с. «213» Штучна послідовність «80» с, «223» хімічно синтезований олігонуклеотидний праймер пле «0 стстІКжсятЄ кЕсСкссатає соассах 27 «210» 15 «2112 26 «2125 ДНК . ; к2і3» Штучна послідовність «2205 й й «ва3» Хімічно синтезований олігонуклесотидний праймер пль «00 12 стухсеєоєтс стсксаттст сатава 26 «2 3 «2115 а «212» ДНК , й «15» штучна поспідовнієть 2205 . . й «23» хімічно синтезований олігонуклеотидний зонд о пле «4005 13 ахтастсатто стдвкекає 19 «г10ж 14 «211х 24 «10 ДНК п, «213» Штучна послідовність «220» Й . , їй - «83» Хімічно синтезований олігонуклеотидний праймер ПЛР «4005 14. аастатсста сссестсаєт ста 24 «210» 15 «21» 30 «їй ДНК , . «213х Штучна послідовність ке ж . п й щ «223» Хімічна синтезований олігонуклеотидний праймер ПЛЕ «400» 15 , сеісттковао геЕсаєттсох здакатссс 30
«2 16 «211» 18 «в1йж ДНК «213» Штучна послідовність кве0х о -ййі» Хімічно синтезований олігонуклеотидний зонд пле «400» 15 тсастткада сатсводаа 18 «80» 17 «ер 1» «їх ДНК «е13з Штучна послідовність «ла. й «023 Штучна послідовність ДНК, яка містить трансеенну послідовність «00х 37 атадсттчаз астадаавос тсосааєтда дуїстутєсда сестосацує асассдасоєс 65О0 дссассєсад состоутосст оссосдасаа стасттттат усатосаауа 9 112 «210 18 «ії» 58 «212х ДНК н й «213» Штучна послідовність «ех Й ; к223з Штучна послідовність ДНК, Яка містить трансгенну послідовність «4005 ІВ актдаастст сЕссаКотох стосадсада хстасаатод сосадоттав са и; «2105 19. «211» 283 «2125 днк , Щщ «243» штучна ПОСЛІДОВНІСТЬ «вх я БІ х я Її «223 Штучна послідовність Дню, яка містить трансгенну послідовність «400» 19 | ше по ! сддсугосає одсттоссато датавстсад сІтсбавсаз сгурддадааст асваєската БО агосскасав сесддосадст саєдассстт ЕСЕ ЕттІса дсасаадаат стедакаєто 120 кссаваадайа ссоадасацва кудаазазоа атзассастс тстттасста Зассстатта 180 тоаосасстах сасстсстсс сессесзаза ааоссодаєс астсоєтода аададааттс 240 тоазакгазусє Задзааксте актсерсссте сасозістає сад 283 «0» 2. «2іїїх 485 «хдїд» ДНК . , «213» Штучна послідовність «ой і й «23» Штучна послідовність ДНК, яка містить трансгаенну вослідовність «4005 20
Чацктасосєса зтавстоадад сту сваай сажсавдтсас сесттцієац садсоусасЕ 6о аасстатасо стістуоаєс задуссссад сачастсача Яссстасаво ссадааскад 120 сестесстає агтстстуєт гсзадтдаат адтааттасо сагтуаасоя Еєстссао9 180 пстасдстоає сааятаєсєстї сссказсатт ясодвасттс стобаєстає тассастсас ла
ЯсЕСТеСТтОа саостадоде сбаагтаєстсе одозсудсаєта зсвосодада таттвоадаєє 00 тстесатіса ассадаастт сазастоттст астттксктс сессастесє хастссстсс 360 оттзоахссу бестодасно кудоїстовЕ здавадозсо ссоссассуї тасааастод 4230 савлассодпає сстєсєоааас аасаєєсоза стєаавбЕссоЯ асустттсас адстададва Ко азкьсс 4856 «210» 7 «211» 179 «2122» ДНК «213» штучна послідовність «го» І , «223» Штучна послідовність ДНК, яка містить трансгенну: послідовність «00 г тазсодаЗса задутсссад асаттаасатє сододакаєє атсосайоєє ссзаттсавза 60 тагоссестї датаїсаасо сдасасттва їтсадосасс сааттстдасе тдакозасах 120 затаствасо сесасазата тстсассастї стастватаз ооссзадцсо аессасдаас 179 «єв4А0» 022 «211» 106 «212» ДНК І й «йї3» щЩтучна послідовність «дО» | , І : «й23У Штучна послідовність ДНК, Яка містить трансгенну послідовність «4005 22 що тсієсастс ассаттстах татадтзасс тесїааєсо сслоасздвас асосостоаа БО сааатсста ссассісакь тосазаєста єтатосоктє секс 106 «2105 23 «211» 560 2125 ДНК І й «г13» Штучна послідовність «220» . вив «и?3» штучна послідовність ДНК, яка містить трансгенну послідовність «00» 23 асадсосуда дскхсЕстєЯ асодачоаає захозосаао бадваєсасо аасассасав БО «10» 24 «і» 66 «212» днк й Я «213» ЩщШтучна послтдавність «2205 . ! І си23» штучна послідовність ДНК, яка містить трансгеняу послідовність «00» 24 І сЕкаттсСтодЄ тосатітїаах сасаваїтттїї саттттаєста гасоатасуєва єсатассста Бо
СЕС 56
ЗИ: її «212з ДНК «213» Штучна послідовність «игйх «223ж Штучна послідовність ДНК, ака містить трансганну послідовність «4005 85. й стстаоссває жаксазаєсс саастосаса діссасааат аозогоадоє тдасттосао 6о сефасцісс тусттодсся астадоєсаа сосасосостї одссахозсу дссасдадсо 1250 аастацассх тадоссосає содассотоза Ясе 156 «2105 25 «й1її» 1905 «е1йх ДНК «213» Штучна послідовність
У
«аа3» Штучна постідовність ДНК, ака містить трансгенну послідовність «005 26 асддатаасу сзусіттдаа садсодозоа астасаатся дсзатуєєса таасосодса 60
Четсасдасєс стКЖтесСкЕх ссадсасаао адссттдата стдтссааайа 9дастодаса 120 заасадаааа аозасаасся стсссевкає стодассста схаєодатас тдксасстес 180 жЕестества азазаєттод атсастсотї удааасауаа ттскаадтоя дттдадаває 240 сттатттєсс сттсадоатс тассзаттту ахтосавдаса єтстІсадвоз састдавадая що
Етсеісаасс заадасссаа сассдасСсасе стсоссадад тозатастаа осттассоас 36о кгосаадста асустовода сессаасада сааоссоаса аттссстсая жссавасавда 420 вагостоавос сестсадсає васттсвЕса Чідаайсаста тоасвасааєт Чет соваї 480 адаттостссс адогтісачає дсяадчастас саасьсстст тосесссасє стссесссаб 240 астостаасс содсатстсяа сссраїсацо дасотоасії говзатастда гвбадсвадад ва0 асктсадстя ссасссттабд дасстассос атсакстсяа аааасстасає садодаєтас 560 тставттасі осагтайасас гтассадздє дстгссааод дасттаатає садастосас 720 засасостсо одЕтставддас стасатоассї стозатуєтт тсвавткасоє садтаєекод 780 ауесттєсса адбахссадес астсстсотї адсадсоаєа стаасттоїта соаскксвова 840 тсавонсссє адсадасєтса уавстттаса адссаодаєт одссстксст дтаєтстсто 300 тстсзадєда агадтаатєта сосуктазає цагстссссо дудстачосе дссавзатасс аво тЕїсссааса ссосдодасс ссстадаєст аєсассаєтс асастстссст ддсадссадо 1020
Четаасєсаєє скдосодсає гадсавсода датасєтодод стсстссате саатєсазовах іїо8о тссвастаєт стасттттст тсстссастс сітастссст ссоттадатс стаді тадає 1140 адходоссто асадацдасчо соїсоссасс дттасаваст досаваассса ахсстттова 1200 асаасасіса дзасттадакс тадсоскЕкс асаостазая павааттссва Ктассвесст 1250 паттатттта гтадоаасаї аастоосотєє ссастсуєто стадодааєса воаєстовов 1320 ачасстстІс аттасаасца заїтзададає атсосаєстс Ссасслодсас сессадсуда 1380 остадаостя атасоцієтс свсосатаат адааадааса асаттсавос тоатсесаєсцад 1440 заходаєсва счаїтсаєст достесссадс дастасассо досктастат сесасстаєе 1500 сасодссасас аадссаасаа ссадасаадо ассетсатттї ссоадаватх содагатса9 15650 поддасвоєс соабастсда дсадаатазс астассусаа дататасест тададозват 1820 пдазаттстї асаасттота строадодіЗ адсеєсааесо осаваттсаас адтхсадаеє 16580 астаєстзаса осазутота тастосааса васассваса стастнсаваа сваточатоє 1740 дсєааєоата асодадсаво біхстсасат астаасаєто осдватаєтоє сосавоктсс 1800 загтсасато тпссссетда гаїтаасосо асасттвааєт садоасассся асттоасеко 1850 ахазасатаа тостодтоасс сасааатаєс тсассастст астаа 1905
Claims (22)
1. Рекомбінантна молекула ДНК, що виявляється у зразку, який містить ДНК сої, причому нуклеотидна послідовність вказаної молекули являє собою: а) вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО І МО: 4, ЗЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО І МО: 7, БЕОІЮО МО: 8 і ЗЕО ІЮ МО: 10; або Б) нуклеотидну послідовність, повністю комплементарну (а), причому присутність такої молекули ДНК є діагностичним критерієм наявності трансгенного об'єкта сої, де репрезентативний зразок насіння, який містить зазначений трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу в АТСС РТА-120166, і зазначений трансгенний об'єкт сої містить БЕО ІЮ МО: 10.
2. Рекомбінантна молекула ДНК, що містить нуклеотидну послідовність що має щонайменше 99 95 ідентичності з БЕО ІЮО МО: 10, або повністю комплементарна їй, що вказує на присутність трансгенного об'єкта сої, де репрезентативний зразок насіння, яке містить трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА-120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить 5хЕО ІЮ МО: 10.
З. Молекула ДНК, що містить полінуклеотидний сегмент достатньої довжини для функціонування як зонда, який гібридизується специфічно за жорстких умов гібридизації з ДНК трансгенного об'єкта сої у зразку, причому виявлення гібридизації вказаної молекули ДНК за вказаних умов гібридизації являє собою діагностичний критерій наявності ДНК трансгенного об'єкта сої в зразку, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА-120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить ЗЕО ІЮ МО: 10.
4. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний зразок містить рослину сої, клітину рослини сої, насінину сої, частину рослини сої, рослину-нащадок сої, соєву олію, соєвий білок або товарний продукт сої. Зо
5. Пара молекул ДНК, яка містить першу молекулу ДНК і другу молекулу ДНК, що відрізняється від першої молекули ДНК, які виконують роль ДНК-праймерів у випадку, якщо використовуються разом у реакції ампліфікації зі зразком, який містить матрицю ДНК трансгенного об'єкта сої для створення амплікону, який є діагностичним критерієм для вказаної матриці ДНК трансгенного об'єкта сої у вказаному зразку, причому вказаний амплікон містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО. 4, ЗЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІО МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 7, БЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІО МО: 10; 5ЕО І МО: 17, БЕО ІО МО: 18, БЕО ІО МО: 19, 5ЕО ІО МО: 20, 5ЕО ІО МО: 21, 5ЕО ІЮ МО: 22, ЗЕО ІЮО МО: 23, 5ЕО ІЮ МО:24 і 5БО І МО:25, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА-120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить 5ЕО ІЮ МО: 10.
6. Спосіб виявлення присутності сегмента ДНК, який є діагностичним критерієм для ДНК трансгенного об'єкта сої у зразку, причому вказаний спосіб включає: а) контактування вказаного зразка з ДНК-зондом за п. 3; р) піддавання вказаного зразка і вказаного ДНК-зонда жорстким умовам гібридизації; і с) виявлення гібридизації вказаного ДНК-зонда з вказаним зразком, бо причому вказаний етап виявлення є діагностичним критерієм присутності вказаної ДНК трансгенного об'єкта сої в зазначеному зразку, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА-120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить 5ХЕО ІЮ МО: 10.
7. Спосіб виявлення присутності сегмента ДНК, який є діагностичним критерієм для ДНК об'єкта сої у зразку, причому вказаний спосіб включає: а) контактування вказаного зразка з парою молекул ДНК за п. 5; Юр) проведення реакції ампліфікації достатньої для отримання ДНК-амплікону; і с) виявлення присутності вказаного ДНК-амплікону у вказаній реакції, причому вказаний ДНК-амплікон містить послідовність нуклеотидів вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕОІЮ МО: 5, 5ЕО І МО:6, ЗЕО ІО МО: 7, 5ЕО ІЮО МО: 8, 5ЕО ІО МО: 10; 5ЕО ІЮ МО: 17, 5ЕО І МО: 18, 5ЕО І МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІЮ МО: 21, 5ЕО ІЮ МО: 22, 5ЕО ІЮ МО: 23, 5ЕО ІО МО: 24 і ЗЕО ІЮ МО:25, і де вказане виявлення присутності вказаного амплікону є діагностичним критерієм присутності ДНК об'єкта сої у вказаному зразку, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА- 120166, і, де вказаний трансгенний об'єкт сої містить ЗЕО ІЮ МО: 10.
8. Рослина сої, частина рослини сої або її клітина, які містять рекомбінантну полінуклеотидну молекулу за п. 2.
9. Рослина сої, частина рослини сої або її клітина за п. 8, яка відрізняється тим, що вказані рослина сої або частина рослини сої, або її клітина є інсектицидними, коли надаються до раціону лускокрилої комахи-шкідника.
10. Рослина сої, частина рослини сої або її клітина за п. 9, яка відрізняється тим, що вказана лускокрила комаха-шкідник вибрана з групи, що складається з С/гузодеїхіх 5рр., бродорієга
5рр., Неїсомегра 5рр., Стосідозета 5рр., Наспіріивзіа 5рр., Апіїсагзіа 5рр., ЕІазтора!рив 5рр. і Ріатурепа 5рр.
11. Рослина сої, частина рослини сої або її клітина за п. 8, яка відрізняється тим, що вказана рослина сої також представлена як потомство будь-якого покоління рослини сої, яке містить трансгенний об'єкт сої, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА-120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить ЗЕО ІЮ МО: 10.
12. Спосіб захисту рослин сої від ураження комахами, причому вказаний спосіб включає надання в раціон лускокрилої комахи-шкідника сої інсектицидно-ефективної кількості клітин або тканин рослини сої, що містять трансгенний об'єкт сої, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА- 120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить ЗЕО ІЮ МО: 10.
13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що вказана лускокрила комаха-шкідник вибрана з групи, що складається з Спгузоаеїхіх зрр., бродорієга 5рр., Неїїсоуегра зрр., Стосідозхета 5рр., Наспіріизіа 5рр., Апіїсагвіа 5рр., ЕІазтораї!рив5рр. і Ріатурепа рр.
14. Спосіб відбирання потомства, що містить ДНК трансгенного об'єкта сої, який включає: а) виявлення присутності сегмента ДНК, який є діагностичним критерієм для трансгенного об'єкта сої у зразку насіння або тканини для визначення потомства, яке містить трансгенний об'єкт сої; і Б) відбір вказаного потомства, яке містить ДНК трансгенного об'єкта сої, причому вказане потомство являє собою стійку до комах рослину сої, яка містить ДНК трансгенного об'єкта сої, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА-120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить БЕО ІЮ МО: 10.
15. Насінина сої, яка містить виявлювану кількість нуклеотидної послідовності, представленої БЕО ПО МО: 10 або повністю комплементарної їй.
16. Бактерія, яка містить виявлювану кількість рекомбінантної молекули ДНК за п. 1.
17. Рослинна клітина, яка містить виявлювану кількість рекомбінантної молекули ДНК за п. 2.
18. Рослина сої, частина рослини сої або її насінина, які містять ДНК, що функціонує як матриця, при тестуванні способом ампліфікації ДНК, що продукує амплікон, який є діагностичним критерієм присутності ДНК об'єкта трансгенного об'єкта сої, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТСС РТА-120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить 5ЕО ІЮ МО: 10.
19. Спосіб визначення зиготності рослини сої або насінини сої, що містять трансгенний об'єкт сої, який включає:
а) контактування зразка, що містить ДНК сої з набором праймерів, здатних створити перший амплікон, який є діагностичним критерієм для трансгенного об'єкта сої і другий амплікон, який є діагностичним критерієм для нативної геномної ДНК сої, що не містить трансгенний об'єкт сої; ї) проведення реакції ампліфікації з вказаним зразком і вказаним набором праймерів; і і) виявлення у вказаній реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти вказаного першого амплікону, який є діагностичним критерієм для трансгенного об'єкта сої, або вказаного другого амплікону, який є діагностичним критерієм для нативної геномної ДНК сої, що не містить трансгенний об'єкт сої; причому присутність тільки вказаного першого оамплікону є діагностичним критерієм гомозиготності трансгенного об'єкта сої у зразку, а спільна присутність вказаного першого і вказаного другого ампліконів є діагностичним критерієм гетерозиготності сої по алелю трансгенного об'єкта сої; або р) контактування зразка, що містить ДНК сої, з набором зондів, який містить щонайменше перший зонд, який специфічно гібридизується з ДНК трансгенного об'єкта сої, і щонайменше другий зонд, який специфічно гібридизується з геномною ДНК сої, яка була порушена шляхом вбудовування гетерологічної ДНК трансгенного об'єкта сої і не гібридизується з ДНК трансгенного об'єкта сої, ї) гібридизація набору зондів з вказаним зразком за жорстких умов гібридизації, причому виявлення гібридизації тільки першого вказаного зонда за вказаних умов гібридизації є діагностичним критерієм гомозиготності алелю ДНК трансгенного об'єкта сої у досліджуваному зразку, і причому виявлення спільної гібридизації вказаного першого зонда і вказаного другого зонда за зазначених умов гібридизації є діагностичним критерієм гетерозиготності алелю ДНК трансгенного об'єкта сої в досліджуваному зразку, де репрезентативний зразок насіння, яке містить вказаний трансгенний об'єкт сої, був депонований під номером доступу АТОС РТА-120166, і де вказаний трансгенний об'єкт сої містить БЕО ІЮ МО: 10.
20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що набір праймерів містить ХЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 14 їі БЕО ІЮ МО: 15.
21. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що набір зондів містить 560 ІЮ МО: 13 і 5ЕО ІО Зо МО: 16.
22. Рослина сої або її частина за п. 10, яка відрізняється тим, що вказана рослина сої також містить трансгенний об'єкт, вибраний з групи, що складається з МОМ87751, МОМ89788, МОМм87708, МОМ87701, МОМ87712, МОМ87769, МОМ87705, МОМ87754, пТ5 40-3-2, А2704-12, А2704-21, А5547-35, А5Б547-127, ВРБ-СМ127-9, ОР-305423, ЮРЗБ56О43, (94-1, (94-19, С168, сО262, 0196-15, Муб2, М98, САБ-44496-6, БА5-68416-4, ЕС72, ВРІ-СМ127-9 Сої, 5УНТО4Е, рорАВ4472-1606, ррАВ4468-0416, ррАвВ8291.45.36.2, ррАВО582.814.19.1, БУНТОН2, 3560.4.3.5, ЕЕ-СМ3З і об'єкта 127.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361834899P | 2013-06-14 | 2013-06-14 | |
| PCT/US2014/042100 WO2014201235A2 (en) | 2013-06-14 | 2014-06-12 | Soybean transgenic event mon87751 and methods for detection and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA124407C2 true UA124407C2 (uk) | 2021-09-15 |
Family
ID=52020504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201600271A UA124407C2 (uk) | 2013-06-14 | 2014-06-12 | Рекомбінантна молекула днк, яка надає рослині стійкості до лускокрилої комахи-шкідника, і спосіб її виявлення та використання |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US9719145B2 (uk) |
| EP (2) | EP3296403A1 (uk) |
| JP (1) | JP6635916B2 (uk) |
| KR (1) | KR102180294B1 (uk) |
| CN (1) | CN105531376B (uk) |
| AR (2) | AR096610A1 (uk) |
| AU (1) | AU2014278155B2 (uk) |
| BR (1) | BR112015031127A2 (uk) |
| CA (1) | CA2914941A1 (uk) |
| CL (1) | CL2015003608A1 (uk) |
| CR (2) | CR20200207A (uk) |
| EA (1) | EA036941B1 (uk) |
| ES (1) | ES2869439T3 (uk) |
| GT (1) | GT201500345A (uk) |
| MX (1) | MX356384B (uk) |
| NI (1) | NI201500174A (uk) |
| PT (1) | PT3008187T (uk) |
| TW (1) | TWI718088B (uk) |
| UA (1) | UA124407C2 (uk) |
| UY (1) | UY35613A (uk) |
| WO (1) | WO2014201235A2 (uk) |
| ZA (1) | ZA201509201B (uk) |
Families Citing this family (147)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015057571A2 (en) * | 2013-10-14 | 2015-04-23 | Mendel Biotechnology, Inc. | Yield improvement in plants |
| WO2015069557A2 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | Mendel Biotechnology, Inc. | Resource use efficiency improvement in plants |
| BR112018004779A8 (pt) | 2015-09-11 | 2022-08-09 | Bayer Cropscience Lp | Variantes de hppd e métodos de uso |
| CN106086194A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-11-09 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 实时荧光pcr技术鉴定转基因大豆das‑44406‑6品系的引物组和方法 |
| BR112019011293A2 (pt) | 2016-12-19 | 2019-10-08 | Basf Se | compostos de fórmula i, intermediários, composição agroquímica, uso e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos |
| BR112019012499A2 (pt) | 2016-12-22 | 2020-04-14 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | moléculas de ácido nucleico, dna, plantas, produto de soja, métodos para produção de um produto, proteção de plantas, produção de uma planta, identificação do evento de elite ee-gm5, confirmação da pureza de sementes, determinação do estado de zigosidade, redução da perda de rendimento e para aumento do rendimento, processo para controle de ervas daninhas, uso da planta, uso de uma semente de soja, par de iniciadores, sonda, estojos e métodos de detecção da presença do evento de elite ee-gm5 |
| US11572361B2 (en) | 2016-12-22 | 2023-02-07 | Syngenta Participations Ag | Polymorphs |
| CA3046232A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Elite event ee-gm4 and methods and kits for identifying such event in biological samples |
| GB201622007D0 (en) | 2016-12-22 | 2017-02-08 | And See Cambridge Display Tech Ltd Syngenta Participations Ag | Polymorphs |
| US11425910B2 (en) | 2017-02-21 | 2022-08-30 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| UY37623A (es) | 2017-03-03 | 2018-09-28 | Syngenta Participations Ag | Derivados de oxadiazol tiofeno fungicidas |
| CA3055680A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
| WO2018177880A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
| EP3606913B1 (en) | 2017-04-03 | 2022-04-27 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
| WO2018184985A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
| BR112019020756B1 (pt) | 2017-04-05 | 2023-11-28 | Syngenta Participations Ag | Compostos derivados de oxadiazol microbicidas, composição agroquímica compreendendo os mesmos, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos e uso desses compostos |
| BR112019020819B1 (pt) | 2017-04-05 | 2023-12-05 | Syngenta Participations Ag | Composto de fórmula (i), composição agroquímica, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por micro-organismos fitopatogênicos e uso de um composto de fórmula (i) |
| WO2018184987A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
| WO2018184986A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
| WO2018184982A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
| EP3606912A1 (en) | 2017-04-07 | 2020-02-12 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018188962A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018202487A1 (en) | 2017-05-04 | 2018-11-08 | Basf Se | Substituted 5-(haloalkyl)-5-hydroxy-isoxazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018202491A1 (en) | 2017-05-04 | 2018-11-08 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| EP3630753A1 (en) | 2017-06-02 | 2020-04-08 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
| BR112019024993A2 (pt) | 2017-06-02 | 2020-06-16 | Syngenta Participations Ag | Composições fungicidas |
| WO2018219797A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| US11154058B2 (en) | 2017-06-14 | 2021-10-26 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
| EP3642187A1 (en) | 2017-06-19 | 2020-04-29 | Basf Se | 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi |
| CN107177687A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-09-19 | 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 | 转基因棉花mon88701品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 |
| CA3067309A1 (en) | 2017-06-28 | 2019-01-03 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
| WO2019011929A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Syngenta Participations Ag | MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES |
| WO2019011923A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Syngenta Participations Ag | MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES |
| WO2019011928A1 (en) | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Syngenta Participations Ag | MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES |
| BR112020000371A2 (pt) | 2017-07-12 | 2020-07-14 | Syngenta Participations Ag | derivados de oxadiazol microbiocidas |
| BR112020000414A2 (pt) | 2017-07-12 | 2020-07-21 | Syngenta Participations Ag | derivados de oxadiazol microbicidas |
| WO2019012003A1 (en) | 2017-07-13 | 2019-01-17 | Syngenta Participations Ag | MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES |
| WO2019025250A1 (en) | 2017-08-04 | 2019-02-07 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| WO2019038042A1 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| BR112020004441B1 (pt) | 2017-09-18 | 2024-01-16 | Basf Se | Compostos da fórmula i, composição agroquímica, semente revestida, uso de compostos e método não-terapêutico de combate de fungos |
| UY37912A (es) | 2017-10-05 | 2019-05-31 | Syngenta Participations Ag | Derivados de picolinamida fungicidas que portan grupos terminales heteroarilo o heteroariloxi |
| UY37913A (es) | 2017-10-05 | 2019-05-31 | Syngenta Participations Ag | Derivados de picolinamida fungicidas que portan un grupo terminal cuaternario |
| EP3710429B1 (en) | 2017-11-15 | 2023-04-05 | Syngenta Participations AG | Microbiocidal picolinamide derivatives |
| US11147275B2 (en) | 2017-11-23 | 2021-10-19 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019121143A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Substituted cyclopropyl derivatives |
| WO2019137995A1 (en) | 2018-01-11 | 2019-07-18 | Basf Se | Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
| WO2019145221A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | BASF Agro B.V. | New agrochemical formulations |
| WO2019154665A1 (en) | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Basf Se | New pyridine carboxamides |
| WO2019154663A1 (en) | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Basf Se | New pyridine carboxamides |
| UA126830C2 (uk) | 2018-03-01 | 2023-02-08 | Басф Агро Б.В. | Фунгіцидні композиції мефентрифлуконазолу |
| US20190276840A1 (en) * | 2018-03-09 | 2019-09-12 | James A. Baum | Methods and compositions for making and using compatible insecticidal proteins |
| BR112020021645A2 (pt) | 2018-04-26 | 2021-01-26 | Syngenta Participations Ag | derivados de oxadiazol microbicidas |
| WO2019219464A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019224092A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Basf Se | Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides |
| US20210269426A1 (en) | 2018-06-29 | 2021-09-02 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
| BR112020027003A2 (pt) | 2018-07-02 | 2021-04-06 | Syngenta Crop Protection Ag | Derivados de 3-(2-tienil)-5-(trifluorometil)-1,2,4-oxadiazol como fungicidas agroquímicos |
| EP3823966A1 (en) | 2018-07-16 | 2021-05-26 | Syngenta Crop Protection AG | Microbiocidal oxadiazole derivatives |
| EP3613736A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-26 | Basf Se | Substituted glutarimide derivatives |
| EP3628158A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-01 | Basf Se | Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide |
| BR112021007156A2 (pt) | 2018-10-17 | 2021-07-20 | Syngenta Crop Protection Ag | derivados de oxadiazol microbiocidas |
| AR116628A1 (es) | 2018-10-18 | 2021-05-26 | Syngenta Crop Protection Ag | Compuestos microbiocidas |
| ES2955718T3 (es) | 2018-10-23 | 2023-12-05 | Basf Se | Compuestos pesticidas tricíclicos |
| EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3670501A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-24 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| MA54689B1 (fr) | 2019-01-11 | 2023-07-31 | Basf Se | Formes cristallines de 1-(1,2-diméthylpropyl)-n-éthyl-5-méthyl-n-pyridazine-4-yl-pyrazole-4-carboxamide |
| EP3696177A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2020165403A1 (en) | 2019-02-15 | 2020-08-20 | Syngenta Crop Protection Ag | Phenyl substituted thiazole derivatives as microbiocidal compounds |
| US20220132849A1 (en) | 2019-02-20 | 2022-05-05 | Syngenta Crop Protection Ag | Use of spiropidion |
| GB201903942D0 (en) | 2019-03-22 | 2019-05-08 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
| WO2020208095A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal picolinamide derivatives |
| CN113966171A (zh) | 2019-04-10 | 2022-01-21 | 先正达农作物保护股份公司 | 杀真菌组合物 |
| CN113748337A (zh) * | 2019-04-16 | 2021-12-03 | 花王株式会社 | 大豆的产量预测方法 |
| EP3769623A1 (en) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| WO2020239517A1 (en) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| WO2020244969A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | Pyridine derivatives and their use as fungicides |
| MX2021014864A (es) | 2019-06-06 | 2022-01-18 | Basf Se | N-(pirid-3-il)carboxamidas fungicidas. |
| WO2020244970A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | New carbocyclic pyridine carboxamides |
| EP3994124A1 (en) | 2019-07-05 | 2022-05-11 | Syngenta Crop Protection AG | Microbiocidal picolinamide derivatives |
| GB201910037D0 (en) | 2019-07-12 | 2019-08-28 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
| EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
| CN111247255B (zh) * | 2019-08-09 | 2023-06-27 | 北京大北农生物技术有限公司 | 用于检测大豆植物dbn8007的核酸序列及其检测方法 |
| AU2019460919B2 (en) * | 2019-08-09 | 2024-03-21 | Beijing Dabeinong Biotechnology Co., Ltd. | Nucleic acid sequence for detecting soybean plant DBN8002 and detection method therefor |
| WO2021063735A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | New bicyclic pyridine derivatives |
| WO2021063736A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | Bicyclic pyridine derivatives |
| UY39115A (es) | 2020-03-05 | 2021-10-29 | Syngenta Crop Protection Ag | Mezclas fungicidas de derivados de arilo metoxiacrilato |
| KR20220151177A (ko) | 2020-03-05 | 2022-11-14 | 신젠타 크롭 프로텍션 아게 | 살진균 조성물 |
| CN115443267A (zh) | 2020-04-28 | 2022-12-06 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀害虫化合物 |
| EP3903584A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv |
| EP3903581A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i |
| EP3903583A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii |
| EP3903582A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii |
| GB202006399D0 (en) | 2020-04-30 | 2020-06-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
| GB202006386D0 (en) | 2020-04-30 | 2020-06-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal Compounds |
| GB202006480D0 (en) | 2020-05-01 | 2020-06-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
| GB202006606D0 (en) | 2020-05-05 | 2020-06-17 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
| EP3909950A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-17 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP3945089A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v |
| WO2021249800A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| CN111705154A (zh) * | 2020-07-13 | 2020-09-25 | 大连海关技术中心 | 检测转基因大豆mon87712的试剂盒及方法 |
| EP3939961A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-19 | Basf Se | Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi |
| WO2022017836A1 (en) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol |
| EP3970494A1 (en) | 2020-09-21 | 2022-03-23 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii |
| MX2023002436A (es) | 2020-08-31 | 2023-03-22 | Basf Se | Mejora del rendimiento. |
| GB202014840D0 (en) | 2020-09-21 | 2020-11-04 | Syngenta Crop Protection Ag | Microbiocidal compounds |
| EP4236691A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-09-06 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| WO2022090069A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Compositions comprising mefenpyr-diethyl |
| WO2022090071A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi |
| WO2022106304A1 (en) | 2020-11-23 | 2022-05-27 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| AR124281A1 (es) | 2020-11-27 | 2023-03-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones plaguicidas |
| UY39544A (es) | 2020-12-02 | 2022-06-30 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones fungicidas que comprenden una mezcla de componentes (a) y (b) como principios activos |
| WO2022117650A1 (en) | 2020-12-02 | 2022-06-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
| KR20230121790A (ko) | 2020-12-14 | 2023-08-21 | 바스프 에스이 | 술폭시민 살충제 |
| EP4043444A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-17 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| AR125089A1 (es) | 2021-03-19 | 2023-06-07 | Syngenta Crop Protection Ag | Composiciones plaguicidas |
| EP4333616A1 (en) | 2021-05-03 | 2024-03-13 | Basf Se | Additives for enhancing the pesticidal effectiveness of pesticidal microorganisms |
| CN117222314A (zh) | 2021-05-04 | 2023-12-12 | 先正达农作物保护股份公司 | 烯草酮用于昆虫控制的用途 |
| EP4091451A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-23 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| WO2022243109A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Basf Se | New substituted quinolines as fungicides |
| KR20240008857A (ko) | 2021-05-18 | 2024-01-19 | 바스프 에스이 | 살진균제로서의 신규한 치환된 피리딘 |
| WO2022243111A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Basf Se | New substituted pyridines as fungicides |
| EP4355764A1 (en) | 2021-06-14 | 2024-04-24 | Basf Se | Yield improvement by gene combinations |
| CN117597025A (zh) | 2021-07-02 | 2024-02-23 | 先正达农作物保护股份公司 | 精吡氟禾草灵用于昆虫控制的用途 |
| EP4119547A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-18 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2023011958A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Basf Se | (3-pirydyl)-quinazoline |
| WO2023011957A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Basf Se | (3-quinolyl)-quinazoline |
| EP4140986A1 (en) | 2021-08-23 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4140995A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4151631A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-22 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2023072671A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix |
| WO2023072670A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x |
| EP4194453A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4198033A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-21 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| WO2023156402A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| WO2023156270A1 (en) | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Basf Se | Coumarin synthesis and uses thereof |
| EP4238971A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-06 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| WO2023183765A2 (en) * | 2022-03-21 | 2023-09-28 | Donald Danforth Plant Science Center | Geminivirus resistant plants |
| WO2024006698A2 (en) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | Monsanto Technology Llc | Soybean transgenic event gm_csm63770 and methods for detection and uses thereof |
| WO2024018016A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | Syngenta Crop Protection Ag | Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides |
| WO2024028243A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Basf Se | Pyrazolo pesticidal compounds |
| CN116064891A (zh) * | 2022-08-08 | 2023-05-05 | 拱北海关技术中心 | 用于检测mon87751转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法 |
| WO2024033374A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-15 | Syngenta Crop Protection Ag | Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds |
| CN116103326B (zh) * | 2022-08-19 | 2023-12-29 | 大连民族大学 | 用于转基因大豆品系特异性检测的质粒标准分子及其应用 |
| CN116103332A (zh) * | 2022-09-07 | 2023-05-12 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 转基因大豆事件cal16及其检测方法 |
| EP4342885A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-27 | Basf Se | N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides |
| GB202214203D0 (en) | 2022-09-28 | 2022-11-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Fungicidal compositions |
| GB202214202D0 (en) | 2022-09-28 | 2022-11-09 | Syngenta Crop Protection Ag | Agricultural methods |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DE69033816T2 (de) | 1989-02-24 | 2002-08-08 | Monsanto Technology Llc | Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung |
| US6713063B1 (en) | 1996-11-20 | 2004-03-30 | Monsanto Technology, Llc | Broad-spectrum δ-endotoxins |
| US6017534A (en) | 1996-11-20 | 2000-01-25 | Ecogen, Inc. | Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity |
| US6489542B1 (en) | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
| EG26529A (en) | 2001-06-11 | 2014-01-27 | مونسانتو تكنولوجى ل ل سى | Prefixes for detection of DNA molecule in cotton plant MON15985 which gives resistance to damage caused by insect of squamous lepidoptera |
| US7166771B2 (en) * | 2002-06-21 | 2007-01-23 | Monsanto Technology Llc | Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs |
| ES2400809T3 (es) | 2005-08-31 | 2013-04-12 | Monsanto Technology Llc | Secuencias de nucleótidos que codifican proteínas insecticidas |
| EP2021476B1 (en) * | 2006-05-26 | 2014-07-09 | Monsanto Technology, LLC | Corn plant and seed corresponding to transgenic event mon89034 and methods for detection and use thereof |
| DE102007009957A1 (de) * | 2006-12-27 | 2008-07-03 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionsptentials transgener Pflanzen |
| WO2008112633A2 (en) | 2007-03-09 | 2008-09-18 | Monsanto Technology Llc | Method of meristem excision and transformation |
| EP2209897A1 (en) * | 2007-11-15 | 2010-07-28 | Monsanto Technology, LLC | Soybean plant and seed corresponding to transgenic event mon87701 and methods for detection thereof |
| KR101597376B1 (ko) * | 2008-02-15 | 2016-02-26 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 트랜스제닉 계통 ｍｏｎ８７７６９에 상응하는 대두 식물 및 종자, 및 그의 검출 방법 |
| WO2011084629A1 (en) * | 2009-12-16 | 2011-07-14 | Dow Agrosciences Llc | Use of cry1da in combination with cry1ca for management of resistant insects |
| KR102270067B1 (ko) | 2013-03-14 | 2021-06-28 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 식물 조절 성분 및 이의 용도 |
-
2014
- 2014-06-12 CA CA2914941A patent/CA2914941A1/en active Pending
- 2014-06-12 KR KR1020167000825A patent/KR102180294B1/ko active IP Right Grant
- 2014-06-12 EP EP17183527.5A patent/EP3296403A1/en active Pending
- 2014-06-12 CN CN201480044096.XA patent/CN105531376B/zh active Active
- 2014-06-12 JP JP2016519646A patent/JP6635916B2/ja active Active
- 2014-06-12 PT PT148101942T patent/PT3008187T/pt unknown
- 2014-06-12 ES ES14810194T patent/ES2869439T3/es active Active
- 2014-06-12 EA EA201690018A patent/EA036941B1/ru unknown
- 2014-06-12 BR BR112015031127A patent/BR112015031127A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-06-12 US US14/303,042 patent/US9719145B2/en active Active
- 2014-06-12 MX MX2015017071A patent/MX356384B/es active IP Right Grant
- 2014-06-12 CR CR20200207A patent/CR20200207A/es unknown
- 2014-06-12 EP EP14810194.2A patent/EP3008187B1/en active Active
- 2014-06-12 AU AU2014278155A patent/AU2014278155B2/en active Active
- 2014-06-12 WO PCT/US2014/042100 patent/WO2014201235A2/en active Application Filing
- 2014-06-12 UA UAA201600271A patent/UA124407C2/uk unknown
- 2014-06-13 AR ARP140102265A patent/AR096610A1/es active IP Right Grant
- 2014-06-13 UY UY0001035613A patent/UY35613A/es active IP Right Grant
- 2014-06-13 TW TW103120625A patent/TWI718088B/zh active
-
2015
- 2015-12-10 NI NI201500174A patent/NI201500174A/es unknown
- 2015-12-10 GT GT201500345A patent/GT201500345A/es unknown
- 2015-12-11 CL CL2015003608A patent/CL2015003608A1/es unknown
- 2015-12-17 ZA ZA2015/09201A patent/ZA201509201B/en unknown
-
2016
- 2016-01-11 CR CR20160020A patent/CR20160020A/es unknown
-
2017
- 2017-06-27 US US15/635,041 patent/US10584391B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-16 US US16/745,320 patent/US11236399B2/en active Active
- 2020-04-30 AR ARP200101233A patent/AR118831A2/es unknown
-
2022
- 2022-01-04 US US17/568,571 patent/US11767568B2/en active Active
-
2023
- 2023-08-11 US US18/448,493 patent/US20240084407A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11767568B2 (en) | Soybean transgenic event MON87751 and methods for detection and use thereof | |
| UA120246C2 (uk) | Молекула рекомбінантної днк, яка вказує на присутність об'єкта кукурудзи mon 87411 та спосіб її виявлення | |
| CN101027396A (zh) | Cry1F和Cry1Ac转基因棉花株系及其事件特异性鉴定 | |
| US11286499B2 (en) | Cotton transgenic event MON 88702 and methods for detection and uses thereof | |
| CN112512305B (zh) | 玉米转基因事件mon 95379及其检测方法和用途 | |
| CN111247255A (zh) | 用于检测大豆植物dbn8007的核酸序列及其检测方法 | |
| CN111406117A (zh) | 用于检测大豆植物dbn8002的核酸序列及其检测方法 | |
| WO2023155193A1 (zh) | 用于检测大豆植物dbn8205的核酸序列及其检测方法 | |
| CN110881367A (zh) | 一种玉米事件t抗-4及其使用方法 | |
| CN104718293B (zh) | 大豆事件pDAB9582．816．15．1检测方法 |