CN106086194A - 实时荧光pcr技术鉴定转基因大豆das‑44406‑6品系的引物组和方法 - Google Patents

实时荧光pcr技术鉴定转基因大豆das‑44406‑6品系的引物组和方法 Download PDF

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    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like

Abstract

本发明公开了一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS‑44406‑6品系的引物组和方法，方法依次包括下列步骤：（1）待检样品DNA的提取；（2）转基因大豆DAS‑44406‑6品系来源基因的实时荧光PCR扩增；（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。本发明通过建立DAS‑44406‑6特异性检测方法，从而对该品系进行有效的检测和监管，便于转基因标识制度的实施。从而加强对转基因产品的监督，保护消费者的合法权益。

Description

实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组 和方法
技术领域
本发明涉及一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组和方法，属于转基因产品检测鉴定技术领域。
背景技术
大豆是人类重要的油料作物，富含多种营养物质，可以作为粮食饲料以及营养品的来源，大豆油是中国需求最多的食用油，大豆加工产物豆粕是可以作为饲料添加物，因此大豆在我国粮食与饲料市场占有不可替代的重要地位。从1988年第一株转基因大豆问世至今，现在国际市场上转基因大豆种类可达30余种，囊括抗转基因除草剂、转基因高油酸、低亚麻酸、低棕榈酸、高硬脂酸、高棕榈酸、表达抗癌蛋白及富含脱敏因子等各式各样功能的转基因大豆品种。其中，孟山都公司研发的抗除草剂转基因大豆GTS40-3-2品系在全球近半数国家获得批准进行商业化种植，类似的还有拜尔公司的A2704-12抗除草剂品系等。
转基因大豆品种DAS-44406-6是美国陶氏益农公司研发的能耐受草铵膦、草甘膦还有2,4-D除草剂3 种成分的转基因大豆品系。其中含有的主要外来基因为来源于食酸戴尔福特菌的aad-12基因、来源于玉米的2mepsps基因和来源于绿色产色链霉菌的pat基因。自从2013年加拿大批准转基因种植以来，截止到2015年10月30日，已经先后有美国、日本、阿根廷等国家商业化种植，加拿大、南非、新西兰、澳大利亚、美国、墨西哥、日本、韩国、中国台湾等国家和地区批准用于食品和饲料的食用和加工。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组和方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供的实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组，引物序列如下：
上游引物DAS-44406-6 primerF：5’- cgtacaatattactcaccggatcct -3’，
下游引物DAS-44406-6 primerR：5’- tggtttggttcgaatttgttttac -‘3，
探针DAS-44406-6Probe：5’-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3’ BHQ。
本发明还提供一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的方法，依次包括下列步骤：
（1）待检样品DNA的提取
DNA 提取使用CTAB法；
（2）转基因大豆DAS-44406-6品系来源基因的实时荧光PCR扩增
A. 在装有24µL PCR扩增反应液A的反应管中加入1µL 待检样品DNA，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃ 15min，1个循环预变性；
95℃ 15sec，59℃ 1min，40个循环。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值；
有PCR扩增曲线且Ct值≤38判定为检出，无PCR扩增曲线或者PCR扩增曲线但有Ct值>38判定为未检出；
其中所述的PCR扩增反应液A包括1×PCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400 nmol/L上下游引物、200nmol/L探针；
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1；
本发明的有益效果：
本发明通过建立DAS-44406-6特异性检测方法，其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低。该方法可以对该品系进行有效的检测和监管，便于转基因标识制度的实施。从而加强对转基因产品的监督，保护消费者的合法权益。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1是转基因品系DAS-44406-6大豆粉的荧光PCR图谱。
图2是50%浓度转基因品系DAS-44406-6大豆粉的荧光PCR图谱。
图3是转基因品系DAS-44406-6大豆粉浓度梯度样品的荧光PCR图谱。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的方法，依次包括下列步骤：
（1）待检样品DNA的提取
DNA 提取使用CTAB法；
（2转基因大豆DAS-44406-6品系来源基因的实时荧光PCR扩增
A. 在装有24µL PCR扩增反应液A的反应管中加入1µL 待检样品DNA，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃ 15min，1个循环预变性；
95℃ 15sec，59℃ 1min，40个循环。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值；
有PCR扩增曲线且Ct值≤38判定为检出，无PCR扩增曲线或者PCR扩增曲线但有Ct值>38判定为未检出；
其中所述的PCR扩增反应液A包括1×PCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400 nmol/L上下游引物、200nmol/L探针；
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1；
上下游引物、探针序列如下：
上游引物DAS-44406-6 primerF：5’- cgtacaatattactcaccggatcct -3’，
下游引物DAS-44406-6 primerR：5’- tggtttggttcgaatttgttttac -‘3，
探针DAS-44406-6Probe：5’-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3’ BHQ。
实施例2
按下述提供的方法检测转基因大豆DAS-44406-6品系的大豆做用作阳性对照。使用98140转基因玉米粉、DAS-40278-9转基因玉米粉、305423转基因大豆粉、MON87701转基因大豆粉、MON87708转基因大豆粉、3218转基因大豆粉、PH05转基因大豆粉、AM04转基因大豆粉、非转基因大豆粉、非转基因大豆粉和非转基因玉米粉作为实验的阴性对照：
包括1×PCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400 nmol/L上下游引物；
上游引物Potato DAS-44406-6 primerF（5’-ggtatcaggttctggaataagaccaa-3’），下游引物Potato DAS-44406-6 primerR（5’-tgtcgtgccagctgcatta-‘3），探针Potato DAS-44406-6 Probe （5’-FAM- cccgcgcgttggccgat-3’ BHQ）。其中上游引物、下游引物和探针比例：2：2：1；其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP:dCTP = 1:1:1:1。
按照以下程序进行检测：
（1）待测样品DNA的提取
A. 称取经过预处理的待测样本1.00 g至50 mL离心管中。
B. 加入10 mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶（使其终浓度为10 μg/mL），颠倒混匀后于65℃温育30 min，期间颠倒混匀离心管2~3次；12000 g离心10 min，转移1mL 上清液至2 mL离心管中。
C. 在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000 g离心10 min，转移上清液600 μL至2 mL离心管中。
D. 加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置1 h；12000 g离心10 min，弃去上清液。
E. 向沉淀中加入400 μL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5 mL 离心管。
F. 在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000 g离心10 min，转移上层水相至1.5 mL离心管中。
G. 加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30 min；12000g离心10 min，小心弃去上清液。
H. 加入500 μL70%乙醇，震荡离心柱管，12000 g离心10 min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。
I. 加入100 μL TE溶液溶解DNA，4℃保存备用。
（2）待测样品DNA的实时荧光PCR扩增
A. 在PCR反应管中加入24µL PCR反应液A和1µL 样品DNA，混匀。
B. 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃ 15min，1个循环预变性；
95℃ 15sec，59℃ 1min，40个循环。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。
转基因大豆DAS-44406-6品系粉末有PCR扩增曲线且Ct值为26.2判定为检出，其他阴性对照无PCR扩增曲线判定为未检出。结果如图1所示。
实施例3
按下述方法检测转基因大豆DAS-44406-6品系的大豆与等重量的非转基因大豆粉混合均匀做用作阳性对照。使用98140转基因玉米粉、DAS-40278-9转基因玉米粉、305423转基因大豆粉、MON87701转基因大豆粉、MON87708转基因大豆粉、3218转基因大豆粉、PH05转基因大豆粉、AM04转基因大豆粉、非转基因大豆粉和非转基因玉米粉作为实验的阴性对照：
包括1×PCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400 nmol/L上下游引物；
上游引物转基因大豆DAS-44406-6 primerF（5’- cgtacaatattactcaccggatcct -3’），下游引物DAS-44406-6 primerR（5’- tggtttggttcgaatttgttttac -‘3），探针转DAS-44406-6Probe （5’-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3’ BHQ）。其中上游引物、下游引物和探针比例：2：2：1；其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP:dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
按照以下程序进行检测：
（1）待测样品DNA的提取
A. 称取经过预处理的待测样本1.00 g至50 mL离心管中。
B. 加入10 mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶（使其终浓度为10 μg/mL），颠倒混匀后于65℃温育30 min，期间颠倒混匀离心管2~3次；12000 g离心10 min，转移1mL 上清液至2 mL离心管中。
C. 在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000 g离心10 min，转移上清液600 μL至2 mL离心管中。
D. 加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置1 h；12000 g离心10 min，弃去上清液。
E. 向沉淀中加入400 μL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5 mL 离心管。
F. 在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000 g离心10 min，转移上层水相至1.5 mL离心管中。
G. 加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30 min；12000g离心10 min，小心弃去上清液。
H. 加入500 μL70%乙醇，震荡离心柱管，12000 g离心10 min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。
I. 加入100 μL TE溶液溶解DNA，4℃保存备用。
（2）待测样品DNA的实时荧光PCR扩增
A. 在PCR反应管中加入24µL PCR反应液A和1µL 样品DNA，混匀。
B. 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃ 15min，1个循环预变性；
95℃ 15sec，59℃ 1min，40个循环。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。
转基因大豆DAS-44406-6品淀粉有PCR扩增曲线且Ct值为25.2判定为检出，其他阴性对照无PCR扩增曲线判定为未检出。结果如图2所示。
实施例4
按下述方法检测转基因大豆DAS-44406-6品系的大豆，核酸提取后稀释成为195,19.5, 1.95, 0.195, 0.0195和 0.00195 ng/μL的浓度梯度，分别对应226000, 22600,2260, 226, 22.6, 2.26 基因组拷贝数/μL。每个浓度梯度做3个PCR平行孔。
包括1×PCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物；
上游引物转基因大豆DAS-44406-6 primerF（5’- cgtacaatattactcaccggatcct -3’），下游引物DAS-44406-6 primerR（5’- tggtttggttcgaatttgttttac -‘3），探针转DAS-44406-6Probe （5’-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3’ BHQ）。其中上游引物、下游引物和探针比例：2：2：1；其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP:dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
按照以下程序进行检测：
（1）待测样品DNA的提取
A. 称取经过预处理的待测样本1.00 g至50 mL离心管中。
B. 加入10 mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶（使其终浓度为10 μg/mL），颠倒混匀后于65℃温育30 min，期间颠倒混匀离心管2~3次；12000 g离心10 min，转移1mL 上清液至2 mL离心管中。
C. 在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000 g离心10 min，转移上清液600 μL至2 mL离心管中。
D. 加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置1 h；12000 g离心10 min，弃去上清液。
E. 向沉淀中加入400 μL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5 mL 离心管。
F. 在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000 g离心10 min，转移上层水相至1.5 mL离心管中。
G. 加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30 min；12000g离心10 min，小心弃去上清液。
H. 加入500 μL70%乙醇，震荡离心柱管，12000 g离心10 min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。
I. 加入100 μL TE溶液溶解DNA，4℃保存备用。
（2）待测样品DNA的实时荧光PCR扩增
A. 在PCR反应管中加入24µL PCR反应液A和1µL 样品DNA，混匀。
B. 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃ 15min，1个循环预变性；
95℃ 15sec，59℃ 1min，40个循环。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。
转基因大豆DAS-44406-6品系粉末195 ng/μL浓度梯度的PCR扩增曲线且Ct值为25.3。最低检出的浓度为0.02 ng，相当于 23个 DAS-44406-6转基因大豆基因组拷贝数。结果如图3所示。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组和方法
<160> 3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> prim_bind
<222> (1)…(26)
<400> 1
cgtacaatattactcaccggatcct 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> prim_bind
<222> (1)…(19)
<400> 2
tggtttggttcgaatttgttttac 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> prim_bind
<222> (1)…(17)
<400> 3
tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta 29

Claims (2)

1.实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组，其特征在于，引物序列如下：
上游引物DAS-44406-6 primerF：5’- cgtacaatattactcaccggatcct -3’，
下游引物DAS-44406-6 primerR：5’- tggtttggttcgaatttgttttac -‘3，
探针DAS-44406-6Probe：5’-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3’ BHQ。
2.实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的方法，其特征在于，依次包括下列步骤：
（1）待检样品DNA的提取
DNA 提取使用CTAB法；
（2）转基因大豆DAS-44406-6品系来源基因的实时荧光PCR扩增
A. 在装有24µL PCR扩增反应液A的反应管中加入1µL 待检样品DNA，混匀；
B. 将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃ 15min，1个循环预变性；
95℃ 15sec，59℃ 1min，40个循环。
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值；
有PCR扩增曲线且Ct值≤38判定为检出，无PCR扩增曲线或者PCR扩增曲线但有Ct值>38判定为未检出；
其中所述的PCR扩增反应液A包括1×PCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400 nmol/L上下游引物、200nmol/L探针；
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1；
所述上下游引物和探针的序列如权利要求1所述。
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